Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và thành phần hóa học trong cao chiết ethanol nhân trần tía (adenosma bracteosum bonati)

Đồng thời để tạo ra sản phẩm dễ dàng sử dụng nên qui trình sản xuất bột hòa tan từ Nhân Trần thông qua kỹ thuật sấy phun được xác lập với các thông số về chất trợ sấy, nhiệt độ đầu vào đ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là hoàn toàn trung thực

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành đồ án này đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong đồ án này đã được ghi rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin cảm ơn ban chủ nhiệm Viện Khoa Học Ứng dụng Hutech của trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt các kiến thức cho tôi trong thời gian còn ngồi trong ghế giảng đường để làm hành trang vững chắc nhờ vậy tôi mới đủ kiến thức và sự tự tin để thực hiện đồ án tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn đến Cha Mẹ và gia đình tôi, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể học tập tại Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM Cảm ơn Cha

Mẹ đã luôn động viên tôi để tôi có thể hoàn thành tốt khoá học của mình

Xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến cô T.S Nguyễn Ngọc Hồng và KS Phạm Quang Thắng đã tạo điều kiện cho tôi cũng là người đồng hành trong mọi bước

đi của tôi Nhờ Cô chỉ bảo, hướng dẫn và tiếp lửa để tôi vượt qua mỗi khi gặp vấn đề khó khăn trong lúc thực hiện đề tài

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để tôi đạt được kết quả như ngày hôm nay

TÓM TẮT

Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới và chịu ảnh hưởng sâu sắc của khí hậu ẩm thấp, nóng kéo dài quanh năm Đây là điều kiện thuận lợi cho các loại vi khuẩn gây bệnh phát triển Mặt khác, do việc sử dụng thuốc kháng sinh tuỳ tiện và do nhận thức chưa đầy đủ của người dân về cách sử dụng thuốc đã dẫn đến một thực tế là thuốc kháng sinh tổng Kết quả nhận được sau khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao

chiết Nhân Trần thì cao chiết có khả năng kháng 3 chủng là: Staphylococcus aureus, Shigella sp., Salmonella sp Còn chủng Escherichia coli không bị kháng bởi 2 loại

cao chiết Định lượng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số trong cao cồn cao hơn trong cao nước Mẫu cao chiết cồn sau khi phân tích GC-MS cho kết quả có 15 chất được định danh Đồng thời để tạo ra sản phẩm dễ dàng sử dụng nên qui trình sản xuất bột hòa tan từ Nhân Trần thông qua kỹ thuật sấy phun (được xác lập) với các thông

số về chất trợ sấy, nhiệt độ đầu vào đã được xác định

Hình 2.9 Hình cấu tạo seselin

Hình 2.17 Hệ thống sắc ký khí ghép nối khối phổ liên tục

Hình 4.9 Khả năng kháng khuẩn Salmonella sp của kháng sinh ampicillin

Hình 4.17 Bột Nhân Trần hòa tan

Bảng 4.3 Hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus của 2 loại cao chiết

Bảng 4.7 Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số

48 Bảng 4.8 Kết quả hàm lượng flavonoid tổng số

49 Bảng 4.9 Kết quả phân tích GC-MS từ cao ethanol Nhân Trần

50

Bảng 4.10 Khảo sát chất trợ sấy và phần trăm chất trợ sấy thích hợp Mục Lục LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH iv

DANH MỤC BẢNG x

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 1

1.3 Ý NGHĨA NGHIÊN CỨU 2

1.4 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 2

1.5 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

1.6 BỐ CỤC ĐỀ TÀI 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

2.1 Tổng quan về cây Nhân Trần 1

2.1.1 Nguồn gốc 1

2.1.2 Đặc điểm hình thái 1

2.1.3 Đặc điểm sinh thái 2

2.1.4 Thành phần hóa học 2

2.1.5 Tính vị 2

2.1.6 Nghiên cứu ứng dụng 3

2.2 Những nghiên cứu của nhóm nghiên cứu Hutech 4

2.2.1 Khái niệm 4

2.2.2 Cơ chế kháng khuẩn 4

2.3 Thành phần hóa học 5

2.3.1 Nhóm tinh dầu 5

2.3.2 Nhóm triterpenoid 6

2.3.3 Nhóm alkaloid 7

2.3.4 Nhóm coumarin 7

2.3.5 Nhóm anthraquinon 10

2.3.6 Nhóm flavonoid 10

2.4 Tổng quan về một số loại vi sinh vật trong nghiên cứu 11

2.4.1 Staphyloccous aureus 11

2.4.2 Escherichia coli 12

2.4.3 Salmonella sp 14

2.4.4 Shigella sp 15

2.5 Tổng quan về sấy phun 16

2.5.1 Giới thiệu về công nghệ sấy phun 16

2.5.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động 17

2.6 Tổng quan về GC-MS (sắc ký khí ghép khối phổ) 19

2.6.1 Giới thiệu và đặc điểm 19

2.6.2 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống sắc ký khí khối phổ 20

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thiết bị và vật liệu thí nghiệm 22

3.1.1 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: 22

3.1.2 Hóa chất sử dụng: 22

3.1.3 Vật liệu thí nghiệm 22

3.2 Phương pháp nghiên cứu 23

3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 23

3.2.2 Cao chiết 24

3.2.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Nhân Trần 27

3.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng cao thu được 28

3.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 28

3.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng số 29

3.2.7 Phương pháp sấy phun cao chiết ethanol từ Nhân Trần 30

3.2.8 Phương pháp chuẩn bị mẫu để phân tích GC – MS (sắc ký khí ghép khối phổ) 32

3.3 Phương pháp xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Hiệu suất chiết cao 34

4.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Nhân Trần 34

4.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng Staphylococcus aureus 35

4.2.2 Khảo sát hoạt tính kháng Shigella sp 38

4.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng Salmonella sp 41

4.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng Escherichia coli 44

4.3 Kết quả định lượng polyphenol tổng số 47

4.4 Kết quả định lượng flavonoid tổng số 48

4.5 Kết quả chạy GC-MS của cao cồn Nhân Trần 50

4.6 Bước đầu nghiên cứu qui trình sản xuất bột hòa tan từ Nhân Trần 54

4.6.1 Khảo sát một số thông số kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình sấy phun cao chiết ethanol Nhân Trần tía 54

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Kiến nghị 59

Tài liệu tham khảo 60

Phụ lục 61

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

đó có tác dụng diệt khuẩn mạnh và điều trị được các bệnh do vi khuẩn gây ra rất hiệu

quả Nhân Trần (Adenosma bracteosum Bonati) sinh trưởng tốt trong môi trường

nóng ẩm, vì thế cho nên ở Việt Nam loài thực vật này rất phổ biến

Nhân trần là một vị thuốc thường dùng trong nhân dân chữa bệnh vàng da, bệnh về đường mật và bệnh của phụ nữ sau khi sinh Xuất phát từ thực tế trên, cùng với tình hình nhiễm khuẩn tại Việt Nam

Đặc biệt là tình hình kháng các loại thuốc kháng sinh tổng hợp của vi khuẩn đang lan rộng, "Bước đầu nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Nhân Trần

(Adenosma bracteosum Bonati) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người" được thực

hiện Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của 2 loại cao chiết

(cao chiết nước, cao chiết cồn) từ Nhân Trần (Adenosma bracteosum Bonati) đối với

4 chủng vi khuẩn gây bệnh viêm nhiễm điển hình và kháng thuốc phổ biến hiện nay

là tụ cầu vàng (Staphylococus aureus), Salmonella sp, Shigella sp, trực khuẩn đường ruột (Escheriechia coli)

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol và cao chiết nước từ cây

Nhân Trần tía (Adenosma bracteosum Bonati)

Định lượng flavonoid tổng số và polyphenol tổng số

Phân tích sự hiện diện của một số chất trong cao chiết qua cao cồn

Bước đầu xây dựng qui trình từ sản xuất bột hòa tan Nhân Trần tía

1.3 Ý NGHĨA NGHIÊN CỨU

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết nhằm biết được mức độ kháng khuẩn của loại cao chiết nào cao hơn Trong thí nghiệm kháng khuẩn 2 loại cao chiết

là cao nước và cao ethanol được đánh giá để chọn ra loại cao nào có hiệu quả kháng khuẩn tốt hơn Từ đó tiến hành phân tích GC-MS để biết được một số thành phần hóa học góp phần hỗ trợ kháng được vi khuẩn

Trong dân gian, Nhân Trần được dùng như trà để chữa bệnh gan mật, vàng da,… để việc dùng sản phẩm được thuận tiện cũng như để bảo quản, cao chiết có hiệu quả sinh học tốt hơn được áp dụng kỹ thuật sấy phun để tạo dạng bột hòa tan Nhân Trần

1.4 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Hiện nay trên thế giới đang có xu hướng quay về với các hoạt chất từ thiên nhiên, đặc biệt là các cao chiết hoạt chất được dùng để làm thuốc, làm thực phẩm chức năng và làm mỹ phẩm Trong số các cây có các hoạt chất thiên nhiên, cây Nhân

Trần tía (Adenosma bracteosum Bonati) được chọn làm vật liệu thí nghiệm cho đề tài

này

Theo các bài thuốc dân gian truyền lại thì cây Nhân Trần tía (Adenosma bracteosum

Bonati) được dùng để nấu nước uống như một loại nước giải khát mang tính chất thanh nhiệt cơ thể Trong đó còn dùng để nấu thuốc để chữa các bệnh như nhiễm khuẩn đường ruột Thấy được như vậy, tôi muốn khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết cây Nhân Trần tía như thế nào, và tiếp đó phân tích GC-MS xem trong cây Nhân Trần có những hoạt chất nào mà có thể kháng khuẩn và ứng dụng vào quá trình sấy phun để tạo ra sản phẩm bột hòa tan từ cao chiết Nhân Trần

1.5 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tượng: cây Nhân Trần (Adenosma bracteosum Bonati)

Thí nghiệm được tiến hành từ ngày: 5/2018-7/2018

Địa điểm: được thí nghiệm tại phòng thí nghiệm của Viện khoa học ứng dụng HUTECH ở trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

1.6 BỐ CỤC ĐỀ TÀI

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương IV: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây Nhân Trần

Hiện nay thị trường nguyên liệu đông dược có 4 loại thảo mộc được gọi với tên giống nhau là Nhân Trần, thuộc nhóm các thảo dược thanh nhiệt táo thấp Có thể tạm chia

4 loại dược thảo này thành 2 nhóm theo xuất xứ [1]

Nhóm dược thảo thu hái tại Việt Nam gồm 3 loại cùng loài có tên dược liệu là: Herba Adenosmatic Bracteosi, Herba A.Indiani và Herba A.Caerulei Ba loại nam dược này

được y học cổ truyền nước ta coi như cùng tính vi, công dụng [1]

Nhóm nhập khẩu từ Trung Quốc có 1 loại là Herba Artemisiae Capillaris, khác với

3 loại nam dược kể trên Loại đông dược này đã được y học Trung Quốc đã được sử dụng từ lâu nhưng chúng tôi chưa thấy có nghiên cứu ứng dụng ở Việt Nam [1] Tuy nhiên cả 4 loại thảo mộc nói trên đều được nhân dân ta sử dụng với cách tự phát như là nguyên liệu nấu nước mát, giúp thanh nhiệt, giải độc cơ thể

2.1.1 Nguồn gốc

Họ: Hoa mõm sói Scrophulariaceae

Tên khoa học: Adenosma bracteosum Bonati

Tên khác: Nhân Trần tía, Nhân Trần Tây Ninh, Nhân Trần nhiều lá bắc, Tuyến hương

lá hoa

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Cây Nhân Trần tía thuộc loại cây thân thảo, rất thơm, cao 20-30 cm; ít phân nhánh, thân có 4 cạnh, nhẵn hoặc có lông tuyến rải rác, cành màu tím đỏ

Lá cây có hình phiến thon, dài 2-2,5 cm, rộng 6-8 mm, nửa ôm thân, mép hơi có rang nhọn ở nửa trên, mặt dưới có ít lông và có tuyến

Cụm hoa Nhân Trần Tía có hình trụ, mọc ở đầu cành Đài hoa có 5 lá đài hình tim nhọn, kích thước không đều, rời nhau, có lông rậm và có tuyến ở mép Tràng hoa cao

5 mm, màu lam, có lông rải rác ở mặt ngoài, môi trên tròn, môi dưới dài bằng môi trên và chia thành 3 thùy hình trứng

Cây có quả dạng quả nang, hình nón tròn, cao 3 mm Quả không lông, màu nâu và có nhiều hạt [1]

Hình 2.1 Cây Nhân Trần tía

2.1.3 Đặc điểm sinh thái

Đối với loài đang được trồng và mọc hoang tại Campuchia, Lào và Việt Nam: cây thường mọc vào mùa mưa trên đất sét ẩm, các bờ ruộng ở độ cao từ 300-800m; mọc tốt trên đất có phèn ở vùng thấp và dọc đường đi một số nơi Kontum, Đắc Lắc tới Tây Ninh, Thành phố Hồ Chí Minh [1]

2.1.5 Tính vị

Adenosma bracteosum Bonati đã được dùng trong y học cổ truyền đề phòng ngừa và

chữa bệnh các loại bệnh lý về tiêu hóa và gan mật Đây là loại thực vật gân được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới do khả năng phòng chống viêm gan, chữa viêm gan virus, bảo vệ gan trước các hóa chất độc hại

Cây được sử dụng trong dân gian với tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, lợi mật, lợi tiểu, chữa cảm cúm, táo bón, bệnh vàng da,…[1]

Bộ phận dùng: toàn cây Tên dược liệu là: Herba Adenosmatic Bracteosi

2.1.6 Nghiên cứu ứng dụng

Công trình “ Nghiên cứu thành phần phenolic trong Adenosma bracteosum Bonati”

của viện dược liệu Việt Nam đã phân lập và tách chiết các hợp chất polyphenol trong Nhân Trần tía Ngoài ra bằng cách sử dụng phổ UV, IR và MNR, họ đã phân lập và xác định được cấu trúc của 1 flavon lạ là scutellarein-6-O-glycoside Scutellarein đã được biết đến trong tự nhiên nhưng đây là lần đầu tiên các nhà khoa học đã phân lập

và xác định được scutellarein-6-O-glycoside hiện diện trong Nhân Trần tía ở Việt Nam

Protecliv là một sản phẩm thuốc được bào chế từ 50% cao Nhân Trần tía và 50% tảo Spirulina có tác dụng chống nhiễm độc gan do tác dụng phụ của Rifampicin và các dẫn xuất Rifampicin (INH và RIF) ở các bệnh nhân điều trị bệnh lao bằng các loại thuốc này

Tác dụng tiết mật: thí nghiệm trên chuột lang cho thấy dịch chiết Nhân Trần Tây Ninh làm tăng tiết mật 24,7% so với lô đối chứng

Độc tính cấp: toán cây Nhân Trần tía chặt nhỏ, phơi khô, chiết cồn 400 rồi cô cách thủy đến dịch đậm đặc Cho chuột uống tương đương với vật liệu khô là 300 g/kg chuột không chết

Chữa viêm gan virus trên lâm sàng: Bệnh viện chợ quán Thành phố Hồ Chí Minh đã từng dùng Nhân Trần tía chữa bệnh viêm gan virus cho các bệnh nhân, kết quả số bệnh nhân khỏi hẳn là 24%, số bệnh nhân có chuyển biến khá và tốt là 46,6% So sánh đối chiếu thành phần hóa học với nhóm dược liệu chữa bệnh gan như Artichoke, Sylybum marianum (cây khế),… có thể dự đoán thành phần hóa học giúp chữa bệnh gan chủ yếu ở cây Nhân Trần tía là nhóm flavonoid, acid nhân thơm, Các nhóm hydroxyl phenolic trong hợp chất này làm tăng cường khả năng chống oxy hóa tế bào

ở gan Mặt khác, các saponin có vai trò chính trong kích thích ăn uống, hỗ trợ tiêu hóa [1]

2.2 Những nghiên cứu của nhóm nghiên cứu Hutech

2.2.1 Khái niệm

Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có tác dụng tiêu diệt hay kiềm hãm sự phát triển của các vi sinh vật Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ

Những tính chất này có thể thuộc nhiều cấu trúc hóa học khác nhau như nhóm tinh dầu, triterpenoid, alkaloid, coumarin, flavonoid,…

2.2.2 Cơ chế kháng khuẩn

Các hợp chất kháng khuẩn ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn Gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu

Các hợp chất ức chế chức năng của màng tế bào Gồm có: colistin, polymycin, gentamicin, amphoterricin Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử

có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài

Cơ chế ức chế quá trình tổng hợp protein:

- Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác

- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amine mới vào chuỗi polypeptide

- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amine ban đầu của chuỗi polypeptide

Cơ chế ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic:

- Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA

- Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho 2 mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA

- Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleic

- Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic

2.3 Thành phần hóa học

Các hợp chất thiên nhiên, nhất là hợp chất thứ cấp, chính là đối tượng trong nghiên cứu, sản xuất dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu do tác dụng sinh lý, dược lý của chúng Vì vậy, việc nhận diện các nhóm hoạt chất đó đã được xây dựng thành quy trình chuẩn thế giới cũng như tại Việt Nam Bên cạnh đó, kiến thức về hóa học cây thuốc luôn đóng vai trò quan trong trong mọi mục đích sử dụng dược thảo

2.3.1 Nhóm tinh dầu

Thành phần của tinh dầu có thể là hydrocarbon béo hoặc thơm và các dẫn xuất của chúng (alcol, ceton, ester, ) Thành phần trong tinh dầu chia thành 2 nhóm chính là terpenoid (chủ yếu là monoterpen) và dẫn xuất phenol

Hình 2.2 Cấu tạo carvacrol

Đại học Dublin đã nghiên cứu và thấy rằng, với nồng độ từ 0,025-0,05%, carvacrol

có thể ức chế Escherichia coli O157: H7 trong môi trường dịch thể ở các nhiệt độ

khác nhau từ 40C - 370C [4] Carvacrol ngăn cản sự hình thành và phát triển roi bơi

của các chủng E coli O157: H7 và Salmonella spp, đồng thời kích thích vi khuẩn

sản xuất một lượng đáng kể các protein sốc nhiệt 60 (heat shock protein-HSP60) Vì vậy, carvacrol có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn này

Hình 2.3 Cấu tạo 1,8-cineol

Nghiên cứu trên các bệnh nhân hen suyễn nặng cho thấy, 1,8-cineol có khả năng làm giảm các cơn hen suyễn ngay cả khi di chuyển bằng đường hàng không Nguyên nhân

là do 1,8-cineol ức chế quá trình chuyển hóa acid rachidonic và sản xuất cytokine trong các tế bào monocyte ở người Do đó, nó kìm hãm sự tăng tiết các chất gây viêm

ở bệnh nhân hen suyễn [1]

2.3.2 Nhóm triterpenoid

Triterpenoid thuộc nhóm terpenoid, là nhóm hợp chất tự nhiên có phân tử cấu tạo bởi

1 hoặc nhiều đơn vị isoprene Chúng là những chất tan trong dầu có tác dụng ngăn ngừa và kìm hãm sự phát triển của các tế bào ung thư Triterpenoid được chia thành

3 nhóm dựa và cấu trúc: không vòng, 4 vòng, 5 vòng [1]:

Hình 2.4 Cấu tạo morphin

2.3.4 Nhóm coumarin

Coumarin được xem là dẫn xuất lacton của acid ortho-hydroxycynamic, C9H6O2

Hình 2.5 Cấu tạo coumarin

Hầu hết các coumarin tự nhiên đã biết (trên 700 chất) tồn tại trong cây dưới dạng tự

do, một số ít có dạng glycoside Coumarin phổ biến nhất ở thực vật là Umbelliferin (7-hydroxycoumarin)

Hình 2.6 Cấu tạo umbelliferin

Mỗi loại coumarin có tác dụng dược lý khác nhau như chống đông máu, làm giãn động mạch vành và mạch ngoại vi, chống co thắt, làm giãn cơ… Tính chất này có liên quan đến nhóm –OH ở vị trí C4 trong cấu trúc phân tử

Khả năng chống đông máu của coumarin và dicoumarin có được do chúng có cấu tạo tương tự vitamin K Tính chất này sẽ mất đi nếu nhóm –OH ở C4 bị thay thế bởi nhóm chức khác [1]

Hình 2.7 Cấu tạo vitamin K

Dựa vào cấu tạo hóa học, có thể chia coumarin thành 4 nhóm chính:

- Coumarin đơn giản: là dẫn xuất của umbelliferon; chỉ thayb đổi nhóm thế ở vòng benzen (hydroxyl, methoxyl, prenyl), ví dụ: osthol

Hình 2.8 Cấu tạo osthol

- Pyranocoumarin: vòng pyran gắn với hệ benzopyron có nguyên tử oxy ở vị trí

C7, ví dụ seselin

Hình 2.9 Cấu tạo seselin

- Furocoumarin: có vòng furan gắn với nhân benzen Nhóm thế là những đuôi methoxy và prenoid Ví dụ: marmesin

Hình 2.10 Cấu tạo marmesin

- Coumarin khác thường là: những coumarin có nhóm thế ở vòng pyron Ví dụ: 7-hydroxy 4 methyl coumarin

Hình 2.11 Cấu tạo 7-hydroxy 4 methyl coumarin

Flavonoid thuộc nhóm acid polyphenolic có cấu tạo khung 15 carbon, dạng C6-C3

-C6 Sự biến đổi dạng oxy của phần giữa liên kết C3 quy định tính chất, lớp, hạng của các hợp chất trong nhóm Các lớp hợp chất đó gồm: Flavon, Flavanol, Flavonol, Flavanonol, Isoflavon, Chalcon, Dyhydrochalcon, Auron, Anthocyanidin, Catechin, Flavan-3,4-diol

Flavonoid thường ở dạng glycosid, trong đó một hoặc nhiều nhóm hydroxyl phenolic hóa hợp với phần đường

Flavonoid chống oxy hóa mạnh và hữu ích trong việc lưu thông máu, kháng nấm, kháng virus, chống dị ứng, bảo vệ hoạt động của gan, làm bền thành mạch, ngăn xuất huyết, chống co giật, giảm đau, giảm các triệu chứng thời kỳ mãn kinh ở phụ nữ [1]

2.4 Tổng quan về một số loại vi sinh vật trong nghiên cứu

2.4.1 Staphyloccous aureus

a Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Gram (+) , hình cầu, không di động, không sinh nha bào

Hình 2.12 Staphylococcus aureus

b Đặc điểm sinh hóa sinh dưỡng

S aureus có phản ứng Dnase, Catalase (+), phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng S aureus đều mẫn cảm với

Novobiocine

Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (beta – lactamase) Men này phá hủy vòng beta – lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như: Penicillin G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng

Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ 70C - 480C (thích hợp nhất là 370C) và pH 4 – 9,3 (thích hợp nhất là pH 7 – 7,5) [2]

c Đặc điểm gây độc và gây bệnh của S aureus

Nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn do tụ cầu là do ăn phải thức ăn đã nhiễm ngoại độc

tố ruột A, B, C, D và E của tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Ngoại độc tố này

có tính chịu nhiệt cao (ở 1000C phải cần 1 – 2 giờ mới phá hủy), chịu được môi trường acid (pH= 5), rượu Ở nhiệt độ thấp, độc tố ruột có thể duy trì được tính độc trên 2

tháng và độc tố này không làm thay đổi mùi vị thức ăn do đó khó phát hiện và dễ gây bệnh Chế biến sử dụng nhiệt độ và đun thức ăn thông thường có thể diệt được vi khuẩn nhưng không phá hủy được các ngoại độc tố [2]

2.4.2 Escherichia coli

a Đặc điểm hình thái

E coli thuộc loại trực khuẩn Gram (-), kích thước khoảng 0,5µm x 1 - 3µm Chúng

di động bằng tiên mao quanh tế bào, không tạo bào tử, một số loài có chu mao Những

loài E coli có độc lực thì có giáp mô, loài không có độc lực không có giáp mô [2]

Hình 2.13 Escherichia coli

b Đặc điểm sinh hóa và sinh dưỡng

Lên men các đường glucose, lactose, levulose, galactose, xylose, ramnose, manit kèm theo sinh hơi Không lên men được đường adonit và inozit

Thử nghiệm IMVIC dùng để phân biệt E coli với các vi khuẩn đường ruột khác, gồm

các phản ứng:

- Phản ứng sinh indol (I): E coli có indol (+)

- Phản ứng đỏ methyl (M): E coli có phản ứng đỏ methyl (+)

- Phản ứng Voges Proskauer (V): E coli có phản ứng Voges Proskauer (-)

- Phản ứng tìm khả năng sử dụng carbon của citrat (C): E coli cho phản ứng

citrat âm tính

Phản ứng kiểm tra lên men đường inozitol (I): Trong thực tế không làm

E coli không phân giải được ure, không sinh H2S sau 48 giờ

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích

hợp 370C , phát triển được ở nhiệt độ từ 5 – 400C, pH thích hợp từ 7 – 7,2 Chúng thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy nghi [2]

c Đặc điểm gây độc và gây bệnh của Escherichia coli

Escherichia coli là vi khuẩn cộng sinh ở đường tiêu hóa, nhưng E coli có thể gây viêm dạ dày, ruột thường gặp ở trẻ nhỏ đang bú mẹ, có thể phát thành dịch E coli có

+ ST (Stabile toxin): Độc tố bền vững với nhiệt độ Tác dụng của nó lên guanylcyclase, làm tăng GMP vòng dẫn đến hút nước và điện giải vào lòng ruột như tác dụng của AMP vòng Chẩn đoán vi khuẩn này bằng cách xác định sự có mặt của độc tố ruột bền vững với nhiệt

- EIEC (Enteroinvasive E coli): Gây bệnh bằng sự xâm nhập của E coli vào đại tràng

và gây bệnh bằng nội độc tố như Shigella, triệu chứng lâm sàng như bệnh ly trực

khuẩn, có thể xác định vi khuẩn này bằng thử nghiệm xâm nhập, được thực hiện bằng cách nhỏ 1 giọt chất nuôi cấy vào mắt chuột lang

- EPEC (Enterophathogenic E coli): Trong thực nghiệm, vi khuẩn thuộc nhóm này tạo ra độc tố tác động trên tế bào vero (từ đó có tên là độc tố vero) Độc tố này tương

tự như độc tố của Shigella dysenteriae, tác động vào tế bào biểu mô ruột và phá hủy

nhung mao của tế bào này

- EHEC (Enterohaemorhagic E coli): Cơ chế gây bệnh của nhóm này chưa được biết rõ Nhưng người ta khẳng định rằng nó có một độc tố của Shigella shiga E coli nằm

trong nhóm này

- EAEC (Enteroadherent E coli): Gây bệnh do bám vào niêm mạc

2.4.3 Salmonella sp

a Đặc điểm hình thái

Đây là những trực khuẩn Gram (-), hiếu khí tùy nghi, hầu hết Salmonella đều có lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum) vì vậy có khả

năng di động, không sinh nha bào, kích thước khoảng 0,4 – 0,6 x 2 - 3µm [2]

Hình 2.14 Salmonella sp

b Đặc điểm môi trường sống

Trong môi trường canh thang, mọc nhanh, sau 10 giờ và làm đục môi trường Môi

trường thạch thường, Salmonella phát triển tốt sau 24 giờ, tạo khuẩn lạc dạng S màu

trắng xám Trên môi trường canh lỏng như canh thang, pepton, vi khuẩn mọc sớm và

làm đục đều môi trường Khuẩn lạc Salmonella có thể mọc trên các môi trường EMB,

MacConkey, Endo, Hettoen, SS agar Trên môi trường thạch Istrati, SS, sau 24 giờ cho khuẩn lạc dạng S (nhẵn bóng, bờ đều hơi lồi), trong và nhỏ hơn khuẩn lạc của

Salmonella Khuẩn lạc Salmonella có đường kính khoảng 2mm [2]

c Đặc điểm sinh hóa và sinh dưỡng

Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa Salmonella sp

Phản ứng sinh hóa Biểu hiện

Bệnh thương hàn do S typhi và S paratyphy A, B, C gây ra Bệnh viêm dạ dày ruột

do các loài: S typhimurium, S enteritidis, S anatum, S pudapest gây ra [2]

2.4.4 Shigella sp

a Đặc điểm hình thái

Shigella spp thuộc nhóm trực khuẩn Gram (-), dài từ 1 - 3µm, không có lông, không

có vỏ và không sinh bào tử [2]

Hình 2.15 Shigella sp

b Đặc điểm sinh hóa sinh dưỡng

Shigella sp lên men glucose không sinh hơi (ngoại trừ S frexneri, S boydii), không

lên men lactose, galactose, maltose, sucrose tuy nhiên có một số type lên men chậm; chúng không sinh H2S và cho các kết quả manitol (+), indol (-), citrate (-), ure (-), LDC (-), di động (-), manit (+) (ngoại trừ nhóm A – S dysenteria) Shigella không có men phân giải được ure, không làm lỏng gelatin

Chúng sống trong điều kiện hiếu khí, kỵ khí tùy nghi, sống được ở nhiệt độ 8 – 400C,

pH từ 6,5 – 8,8 thích hợp nhất ở nhiệt độ 370C , pH 7 – 8 Kém chịu đựng đến điều kiện ngoại cảnh Điều kiện khô, nhiệt độ dưới 50C vi khuẩn khó tồn tại Nhiệt độ

1000C/2 phút hoặc 600C/10 phút đã giết chết vi khuẩn [2]

c Độc tố của Shigella sp

Vi khuẩn xâm nhập qua đường tiêu hóa, chỉ cư trú và phát triển nhân lên trong tế bào

biểu mô thành ruột non, gây tổn thương niêm mạc ruột Vi khuẩn Shihgella spp

không di chuyển vào hệ thống hạch mạch máu đến cư trú ở múi mật hay các phụ tạng

khác trong cơ thể nên không có dạng người lành mang vi khuẩn Shigella [2]

2.5 Tổng quan về sấy phun

2.5.1 Giới thiệu về công nghệ sấy phun

Sấy phun là một trong những công nghệ sấy công nghiệp chính do khả năng sấy một bậc nguyên liệu từ dạng lỏng sang dạng bột khá đơn giản, dễ dàng kiểm soát nhiệt độ

và định dạng hạt sản phẩm một cách chính xác

Thiết bị sấy phun dùng để sấy các dạng dung dịch và huyền phù trong trạng thái phân tán nhằm tách ẩm ra khỏi vật liệu giúp tăng độ bền cho bảo quản sản phẩm được lâu hơn

Sản phẩm của quá trình sấy phun là dạng bột mịn như bột đậu nành, bột trứng, bột sữa hoặc các chế phẩm sinh học, dược liệu,… [5]

2.5.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động

Buồng sấy: là nơi hòa trộn mẫu sấy (dạng sương mù) và tác nhân sấy (không khí nóng) Buồng sấy phun có thể có nhiều hình dạng khác nhau nhưng phổ biến nhất là buồng sấy dạng trụ đứng, đáy côn Kích thước buồng sấy (chiều cao, đường kính,…) được thiết kế phụ thuộc vào kích thước các hạt lỏng và quỹ đạo chuyển động của chúng, tức phụ thuộc vào loại cơ cấu phun sương sử dụng [5]

Tác nhân sấy: không khí nóng là tác nhân sấy thông dụng nhất Hơi là tác nhân gia nhiệt phổ biến nhất Nhiệt độ hơi sử dụng thường dao động trong khoảng 150 – 2500C Nhiệt độ trung bình của không khí nóng thu được thấp hơn nhiệt độ hơi sử dụng là

100C [5]

Hệ thống thu hồi sản phẩm: bột sau khi sấy phun được thu hồi tại cửa đáy buồng sấy

Để tách sản phẩm ra khỏi khí thoát, người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: lắng xoáy tâm, lọc, lắng tĩnh điện,… [5]

Quạt: để tăng lưu lượng tác nhân sấy, người ta sử dụng quạt ly tâm Ở quy mô công nghiệp, các thiết bị sấy phun được trang bị hệ thống hai quạt Quạt chính được đặt sau thiết bị thu hồi bột sản phẩm từ dòng khí thoát Còn quạt phụ đặt trước thiết bị gia nhiệt thông khí trước khi vào buồng sấy Ưu điểm của việc sử dụng hệ thống hai quạt là người ta có thể kiểm soát dễ dàng áp lực trong buồng sấy [5]

Hình 2.16 Thiết bị sấy phun

b Nguyên tắc hoạt động

Nguyên liệu từ thùng chứa được bơm vào buồng sấy, khi vào buồng sấy được phân

bố mẫu thành hạt nhỏ li ti (dạng mù) nhờ cơ cấu phun Một lít dung dịch có thể được phun thành 1,5*1010 giọt với tổng diệt tích bề mặt lên đến 120 m2 Không khí nóng thổi qua caloriphe được đưa vào buồng sấy Không khí nóng và nguyên liệu ở dạng

mù tiếp xúc với nhau trong vài giây tại cơ cấu phun mẫu đặt trong buồng sấy, nước

từ nguyên liệu bốc hơi sau đó thoát ra ngoài, sản phẩm khô được thu gom tại đáy

cyclon, được làm nguội và thu hồi Một phần bụi mịn theo không khí qua cyclon, sau

đó qua bộ lọc vải nhằm thu lại các hạt bụi mịn còn sót lại và thải ra ngoài [5]

lẻ Bằng cách kết hợp hai kỹ thuật, nhà hóa học phân tích có thể khảo sát định tính và định lượng một dung dịch chứa một số hóa chất với nồng độ thấp đến 1 picogram hoặc nhỏ hơn nữa – đây là nồng độ rất khó phát hiện ở các phương pháp phân tích công cụ khác như phương pháp đo phổ UV – VIS [3]

Hình 2.17 Hệ thống sắc ký khí ghép nối khối phổ liên tục

b Đặc điểm

Thời gian phân tích rất ngắn: những mẫu không bền trong thời gian bảo quản lâu cũng

có thể phân tích một cách thuận lợi, đặc biệt là phân tích các hỗn hợp phức tạp Nhờ

đó, có thể tiết kiệm được khá nhiều thời gian thực nghiệm vì phân lập mẫu theo

nguyên tắc điều chế trước khi đưa vào khối phổ do vậy giảm nhẹ yêu cầu kỹ thuật đối với các kỹ thuật viên [3]

GC-MS được sử dụng rất phổ biến Chúng được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực

y tế, dược phẩm, môi trường và luật môi trường [3]

b Nguyên tắc hoạt động của khối phổ

Ion hóa các nguyên tử muốn xác định khối lượng trong bộ phận ion hóa Rồi cho dòng ion dương thu được đi qua bộ phận chọn lọc để sau đó chỉ còn lại những ion có tốc độ giống nhau tiếp tục hoạt động Những ion này tiếp tục đi qua điện trường để được tăng tốc độ và cuối cùng đi qua từ trường Khi đi qua từ trường dòng ion này sẽ chuyển động theo đường cong

Có thể giải thích theo một cách dễ hiểu hơn, khi một chất ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron để trở thành các ion mang điện tích 1 hoặc 2 và cũng có thể

quá trình va chạm này làm phân tử chất tiếp nhận thêm electron để thành ion âm, gọi

là ion hóa phân tử Khi va chạm mạnh hơn các phân tử có thể bị phá vỡ ra thành nhiều phần khác nhau mang điện tích dương hay âm Sự phá vỡ này phụ thuộc hoàn toàn vào lực va chạm, dẫn đến các cách phá vỡ khác nhau Các ion này sẽ được tách và ghi trên phổ đồ [3]

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thiết bị và vật liệu thí nghiệm

3.1.1 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Máy đo quang phổ

- Máy cô quay chân không

Vật liệu thí nghiệm là cây Nhân Trần tía (Adenosma bracteosum Bonati) được thu

hái từ núi Bà Đen (Tây Ninh) Cây Nhân Trần được định danh bởi PGS TS Trần Hợp trường Đại học Khoa học tự nhiên

Các dòng vi khuẩn được sử dụng trong thử nghiệm được cung cấp bởi Viện khoa học ứng dụng Hutech, trường đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh là:

- Escherichia coli

- Staphylococcus aureus

- Salmonella sp

- Shigella sp

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Nhân Trần khô

Xay Trích ly

Khảo sát khả năng kháng khuẩn

Shigella

Chiết phân đoạn

Định lượng polyphenol tổng số

Định lượng flavonoid tổng số