PHÂN LẬP, ĐỊNH TÍNH, NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG CỦA QUERCETIN RHAMNOPYRANOSIDE GALLATE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ KHOA HÓA HỌC - - TIỂU LUẬN Đề tài: PHÂN LẬP, ĐỊNH TÍNH, NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG CỦA QUERCETIN-3-O-α-LRHAMNOPYRANOSIDE-2’’-GALLATE (Tác giả: R Manivannan, K Prabakaran, S Ilayaraja) Môn: Một số vấn đề chọn lọc hóa hữu Huế, tháng 12 năm 2016 NỘI DUNG Giới thiệu Flavonoid nhóm hợp chất phong phú đa dạng thiên nhiên Nó coi “chất bổ sinh học tự nhiên” thực nghiệm, flavonoid chứng minh có khả hoạt động trực tiếp thuốc kháng sinh cách phá vỡ cấu trúc chức vi rút, vi khuẩn; làm thay đổi phản ứng thể chất gây dị ứng, chất gây ung thư Việc điều trị bệnh nhiễm trùng cho hiệu rõ rệt từ phát loại thuốc kháng sinh, nhiên xuất số mầm kháng thuốc tác dụng phụ không mong muốn sô loại thuốc kháng sinh dẫn đến nhu cầu tìm kiếm nguồn kháng sinh mới, đắc biệt từ thuốc Trái với loại thuốc tổng hợp, kháng sinh có nguồn gốc thực vật không gây nhiều tác dụng phụ có tiềm điều trị bệnh lây nhiễm lớn Nhiều nghiên cứu thuốc sản sinh lượng lớn chất chuyển hóa thứ cấp với tác dụng kháng khuẩn mầm bệnh Vì vậy, việc nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn thuốc cổ truyền Ấn Độ ứng dụng chúng trở thành mối quan tâm thách thức lớn Vết thương tổn thương làm rách da mô Các tổn thương bị gây tai nạn, vết mổ sau phẫu thuật chấn thương khác Quá trình chữa lành vết thương trình sinh hóa để tái lập lại toàn vẹn cấu trúc, lấy lại sức mạnh mô bị thương Các phương pháp chọn để điều trị phương pháp cải thiện hay nhiều giai đoạn chữa lành vết thương mà không gây tác dụng phụ có hại cách lý tưởng Từ lý trên, nghiên cứu thực nhằm đánh giá hoạt động kháng khuẩn điều trị vết thương cao chiết clorofom Salvia leucantha Thực nghiệm 2.1 Phân lập định tính Hoa tươi (2kg) S leucantha thu thập từ đoạn đường dốc vùng Kodaikanal, Dindugul,Tỉnh Tamilnadu, Ấn Độ định danh Prof N Ramakrishnan (Khoa thực vật học); mẫu gửi đến Khoa thực vật học Trường đại học Bharathidasan, Ấn Độ Hoa S leucantha chiết với metanol 90% phương pháp hồi lưu Dịch chiết ancol cô đặc chân không thu cao chiết Sau cao chiết phân đoạn ete cloroform Hình Sơ đồ phân lập Phân đoạn ete cô đặc chân không làm lạnh khoảng tuần, thu chất rắn màu vàng Đem lọc, kết tinh lại với metanol thấy tinh thể hình kim màu vàng nhạt tách ra, có nhiệt độ nóng chảy: 313 - 315 0C (kí hiệu Chất 1) Nó tan dễ dàng dung môi hữu tan nước nóng Chất khử AgNO3/NH3 làm lạnh thuốc thử Fheling đun nóng Ngoài ra, chất tác dụng với thuốc thử Horhammer-Hansal, Wilson’s boric acid Gibb’s Quá trình sắc kí liệu phổ UV tương tự aglycone flavonoid Chất xác định quercetin, định tính sắc kí mỏng nhiệt độ nóng chảy (so sánh với chất chuẩn quercetin phân lập từ Physalisminima) Giá trị Rf trình bày bảng Bảng Giá trị Rf (x100) thành phần hoa Salvia leucantha Hợp chất: 1) Aglycone - Quercetin 2) Glycoside - Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside-2”-gallate Hệ dung môi: a) Dung dịch acid actic 15% b) Dung dịch acid actic 30% c) Dung dịch acid actic 60% d) n-Butanol : acid acetic : nước = 4:1:5 e) Dung dịch phenol bão hòa Phân đoạn cloroform cô đặc chân không làm lạnh vài ngày thu chất rắn màu vàng Kết tinh lại với metanol tách tinh thể màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy: 316 - 318 0C (kí hiệu Chất 2) Chất khử AgNO3/NH3 không tác dụng với thuốc thử Fheling Nó vết màu tím tia UV màu vàng xanh với NH Chất phản ứng với thuốc thử Wilson’s boric acid, Molisch, Gibb’s không phản ứng với thuốc thử Horhammer-Hansal Dựa vào liệu phổ UV NMR cho thấy chất có cấu trúc glycoside flavonol 2.2 Thủy phân Glycoside Glycoside thủy phân toàn phần dung dịch H 2SO4 5% 1000C khoảng tiếng thủy phân phần acid formic 10% cyclohexane (mục đích việc thủy phân glycoside để tách phần phi đường phần đường, sau xác định cấu trúc phần) 2.3 Thử hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch Hoạt động kháng khuẩn hợp chất phân lập từ cao chiết cloroform thực phương pháp khuếch tán đĩa thạch (National Committee for Clinical Laboratory Standards) hai nồng độ khác Chất sau đưa vào đĩa cấy vi khuẩn ủ 24h; nhiệt độ 37 0C; đường kính vùng bị ức chế đo mm Chất chuẩn để so sánh chất kháng sinh Novobiocin (30μg), Chloramphenicol (30μg) 2.4 Điều chế Gel Từ 1gam chất phân lập từ dịch chiết cloroform điều chế 100gam Vaselin 2.5 Hoạt động chữa lành vết thương mô hình Lựa chọn vật có trọng lượng phù hợp với thí nghiệm chia thành nhóm Chúng gây mê gây vết thương tương đương nhau, có kích thước 2,5cm ×0,2cm Nhóm để lành tự nhiên điều kiện bình thường Nhóm 2, nhóm điều trị chất phân lập với liều lượng 100 mg 200 mg Nhóm điều trị thuốc kháng sinh Soframycin Theo dõi nhóm 16 ngày, diện tích vùng bị thương đo ngày 0,4, 8, 12, 16 cho tất nhóm 2.6 Phân tích thống kê Các số liệu thực nghiệm xử lý phương pháp thống kê (trung bình, anova) Kết thảo luận Hoa cấy S leucantha có chứa quercetin quercetin-3-O-α-Lrhamnopyranoside-2”-gallate  Quercetin Phổ UV quercetin có hai pic 370nm 250 nm, điều cho thấy chất có khung flavonoid Sự phân hủy xảy thêm NaOMe vào aglycone Flavonoid mà có chứa nhóm -OH tự vị trí C-3, C-3’ C-4’ không bền NaOMe pic hấp thụ bị suy biến vài phút; điều chứng tỏ có nhóm -OH vị trí C-3, C-3’, C-4’ hợp chất Có gia tăng bước sóng +58 nm thêm AlCl3/HCl chứng tỏ có mặt nhóm -OH tự vị trí C-5 vòng A Sự dịch chuyển +30nm quan sát thấy trường hợp thêm AlCl mặt HCl cho thấy vòng B có nhóm O-dihydroxyl Khi thêm NaOAc có gia tăng bước sóng + 20nm chứng tỏ có nhóm -OH vị trí C-7 Ngoài nhóm dihyroxyl vòng B xác định bở dịch chuyển bước sóng +16 nm thêm H 3BO3 Quercetin có cấu trúc:  Glycoside flavonol Phổ UV glycoside flavonol từ phân đoạn cloroform cho thấy có pic hấp thụ 255 nm 340 nm Sự gia tăng bước sóng +54 nm thêm NaOMe có mặt nhóm -OH tự so vị trí C-4’ Khi thêm AlCl 3/HCl bước sóng dịch chuyển +60 nm chứng tỏ có nhóm -OH tự C-5 Dải hấp thụ I phổ AlCl tăng +30nm suy có nhóm O-dihydroxyl vòng B Sự có mặt -OH tự C-7 xác định gia tăng bước sóng +17 thêm NaOAc Nhóm dihydroxyl vòng B xác định gia tăng bước sóng +27 nm thêm H3BO3 Trong phổ 1H-NMR hơp chất phân lập xuất pic δ 5,9 ppm δ 6,2 ppm tương ứng với hiđro C-6, C-8 Hidro nhóm 5-OH cộng hưởng δ 12,7 ppm singulet δ 7,3 ppm tương ứng với hiđro C-2’ C-6’ Các hiđro C-5’ xuất δ 6,8 ppm Hiđro vị trí 1” đường rhamnose cộng hưởng δ 4,4 ppm Ba hiđro nhóm -CH3 rhamnose xuất hiên δ 0,9 ppm Các hiđro lại đường xuất khoảng δ 3,2 - 3,9 ppm Dữ liệu phổ 13C-NMR cho thấy có 27 cacbon hợp chất, có 15 cacbon điển hình cho khung flavone, cacbon lại glycoside Các pic δ: 102,0; 71,9; 71,7; 71,3; 70,6, 17,3 đường đối chiếu với α-Lrhamnopyranoside Phổ 1H-NMR cho thấy có mặt H anome δ 5,30 ppm suy có liên kết α-glycoside Mặt khác phổ 13C-NMR có C-3 δ 133,4 ppm chứng tỏ có axyl hóa C-3 Căn vào liệu trên, chất phân lập từ cao chiết cloroform có cấu trúc là: 3.2 Nghiên cứu hoạt động kháng khuẩn Nhiều loài thành phần chúng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn Quercetin sử dụng để ức chế loại vi khuẩn - nguyên nhân gây bệnh hô hấp, đường tiêu hóa, rối loạn da đường tiết niệu Trong nghiên cứu này, tác giả khảo sát hoa S leucantha hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch Thử nghiệm với cao chiết cloroform nồng độ khác nhau: 50, 100, 200 μg Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cloroform so sánh với chất kháng sinh chuẩn Novobiocin Chloramphenicol (bảng 2) Thông thường, miền ức chế thuốc kháng sinh thương mại từ 26,0 36,0 mm 50μg; ức chế quercetin glycosides từ 2,0 đến 28 μg Căn vào kết trên, nồng độ 200 μg, cao chiết cloroform có vùng ức chế cao nhất, ức chế hầu hết vi sinh vật thử nghiệm (trừ C albicans) Bảng Kết khả kháng khuẩn quercetin glycoside (Vùng bị ức chê - mm) 3.3 Hoạt động chữa lành vết thương Hệ thống thuốc cổ truyền Ấn Độ, đặc biệt hệ thống Ayurveda, Siddha Unani có số lượng lớn thuốc để điều trị tổn thương da bao gồm vết cắt bỏng Cuộc điều tra khảo sát khả chữa lành vết thương hợp chất quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside-2”-gallated chiết từ S leucantha so sánh với thuốc chuẩn (Soframycin) Kết trình bày bảng sau: Nghiên cứu mô hình vết thương bị cắt cho thấy nhóm giảm vùng bị thương qua ngày hợp chất phân lập có tác dụng điều trị vết thương (khi so sánh với với nhóm để tự nhiên nhóm điều trị thuốc) Kêt luận Nghiên cứu chứng minh hợp chất quercetin-3-O-α-Lrhamnopyranoside-2”-gallated phân lập từ S leucantha có khả kháng khuẩn chữa lành vết thương Những thuốc có khả ức chế sinh trưởng vi sinh vật Vùng có hiệu ức chế cao quan sát thấy khuẩn S aureus (28mm) E coli (24mm) Từ xác định giá trị S leucantha thấy hướng nghiên cứu cần quan tâm để phát triển loại thuốc -TÀI LIỆU THAM KHẢO R Manivannan, K Prabakaran, S Ilayaraja (2014), “Isolation, Identification and Antibacterial and Wound Healing Studies of Quercetin-3-O-α-L-Rhamnopyranoside2”-Gallate”, International Journal of Applied Science and Engineering, 99-106 10 ... hay nhiều giai đoạn chữa lành vết thương mà không gây tác dụng phụ có hại cách lý tưởng Từ lý trên, nghiên cứu thực nhằm đánh giá hoạt động kháng khuẩn điều trị vết thương cao chiết clorofom Salvia... axyl hóa C-3 Căn vào liệu trên, chất phân lập từ cao chiết cloroform có cấu trúc là: 3.2 Nghiên cứu hoạt động kháng khuẩn Nhiều loài thành phần chúng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn Quercetin... vết thương Hệ thống thuốc cổ truyền Ấn Độ, đặc biệt hệ thống Ayurveda, Siddha Unani có số lượng lớn thuốc để điều trị tổn thương da bao gồm vết cắt bỏng Cuộc điều tra khảo sát khả chữa lành vết