Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và ức chế tế bào ung thư của ricin tinh sạch từ hạt thầu dầu (ricinus communis)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thơ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ CỦA RICIN TINH SẠCH TỪ HẠT THẦU DẦU (Ricinus communis) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thơ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ CỦA RICIN TINH SẠCH TỪ HẠT THẦU DẦU (Ricinus communis) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Ts.Nguyễn Đình Thắng Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới người thầy yêu quý, Ts Nguyễn Đình Thắng Thầy người ln tận tình dìu dắt, hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Thầy người thắp lửa, truyền cho cảm hứng niềm đam mê khoa học từ ngày đầu bước chân vào đường nghiên cứu Xin cảm ơn thầy tiếp nhận, ln quan tâm, động viên khích lệ bao dung tới Tôi xin chân thành cảm ơn tới Phòng Sinh học nano ứng dụng, thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzyme protein Phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào động vật giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơnTs Ngô Ngọc Trung, thầy cô, anh chị bạn nhóm nghiên cứu Phòng sinh học Nano ứng dụng, nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm bên cạnh ủng hộ hỗ trợ tơi q trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơnđến thầy cô cán Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy cô Bộ môn Sinh lý thực vật hóa sinh Bộ mơn Sinh học tế bào ln tận tình truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn thành viên Tổ chức SYSDO Việt Nam, thành viên Nhóm phát triển Dự án 88 bạn bè thân hữu ln bên cạnh, khích lệ, niềm động lực để thay đổi trở thành người trẻ tốt đẹp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bên tôi, động viên lúc khó khăn tạo điều kiện thuận lợi cho tơi để tiếp tục học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng 10 năm 2017 Nguyễn Thị Thơ i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH .v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT……………… vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu ung thƣ 1.1.1.Ung thư 1.1.2.Đặc tính tế bào ung thư 1.1.3.Ung thư da 1.2.Giới thiệu ricin 1.2.1.Cấu trúc phân tử ricin 1.2.2.Cơ chế gây độc Ricin 11 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1.Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu 16 2.2.Hóa chất, dụng cụ thiết bị nghiên cứu 16 2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1.Phương pháp tách dịch chiết thô từ hạt thầu dầu 17 2.3.2.Phương pháp tách chiết protein tổng số 17 2.3.3.Phương pháp tách chiết tinh Ricin 18 2.3.3.1.Phương pháp tinh ricin phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE – sepharose 18 2.3.3.2.Phương pháp tinh ricin sử dụng sắc ký lọc gel sephadex G-100 18 2.3.3.3.Sử dụng phương pháp Bradford để định lượng nồng độ protein 19 2.3.3.4.Phương pháp thẩm tách miễn dịch 19 2.3.3.5.Phương pháp xác định độ tinh ricin 20 2.3.3.6.Phương pháp khối phổ 20 ii 2.3.4.Phương pháp thử khả kháng khuẩn vi khuẩn 20 2.3.5.Phương pháp đánh giá khả chống tế bào ung thư 21 2.3.5.1.Phương pháp nuôi cấy tế bào 21 2.3.5.2.Phương pháp khảo sát độc tính ricin tinh lên tế bào 21 2.3.5.3.Phương pháp khảo sát tác động ricin lên khả tạo khối u in-vitro 22 2.3.5.4.Phương pháp đánh giá tác động ricin tới mức độ biểu số protein marker tế bào 23 2.3.5.5.Phương pháp đánh giá tác động ricin tới trình apoptosis tế bào 24 2.3.6.Phân tích kết 24 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1.Kiểm tra hoạt tính hạt thầu dầu 25 3.2.Thu dịch tách chiết tinh ricin từ hạt thầu dầu 28 3.2.1.Tách chiết protein tổng số 28 3.2.2.Tinh ricin từ protein tổng số 30 3.3.Khả kháng khuẩn ricin tinh 36 3.4.Khả ức chế ricin tinh lên tế bào in vitro 37 3.4.1.Độc tính Ricin lên tế bào ung thư da SKMEL28 tế bào HaCaT 38 3.4.2.Khả ức chế trình tạo khối ricin lên tế bào SKMEL28 in vitro…………………… …………………………………………………………39 3.4.3.Tác động ricin tới mức độ biểu số protein marker tế bào .42 KẾT LUẬN 47 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Cấu trúc protein ricin Bảng 1.2: Amino axit nội phân tử ricin 10 Bảng 1.3: Vùng chức phân tử ricin 11 Bảng 3.1: Hiệu suất phân tách protein muối (NH4)2SO4 29 Bảng 3.2: Quy trình bước phân tách tinh ricin từ hạt thầu dầu 33 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh ung thư da [67] .5 Hình 1.2: Con đường truyền tín hiệu MAPK tế bào động vật [64] Hình 1.3: Hình ảnh Thầu dầu (Ricinnus communis) [63] Hình 1.4: Hình ảnh hạt thầu dầu [63] Hình 1.5: Cấu trúc phân tử ricin [52] Hình 1.6: Quá trình nhập bào đường di chuyển ricin tế bào động vật [55] 12 Hình 1.7: Cơ chế hoạt động ricin [55] 13 Hình 1.8: Hai đường chết theo lập trình tế bào [58] 14 Hình 3.1: Kiểm tra khả kháng khuẩn dịch chiết hạt thầu dầu lên vi khuẩn gram âm…… .26 Hình 3.2: Kiểm tra khả kháng khuẩn dịch chiết hạt thầu dầu lên vi khuẩn gram dương… 27 Hình 3.3: SDS-PAGE kiểm tra protein sau tủa với nồng độ khác (NH4)2SO4…… 30 Hình 3.4: Hàm lượng protein qua phân đoạn sau chạy sắc ký trao đổi ion DEAE - sepharose .31 Hình 3.5: Thẩm tách miễn dịch kiểm tra độ tinh ricin sau qua sắc ký lọc gel Sephadex G100 32 Hình 3.6: Trình tự ricin từ EST gi|255587301 34 Hình 3.7: Phổ SFIICIQMISEAAR khối phổ (B), đoạn peptide HEIPVLPNR SAPDPSVITLENSWGR (C) (A), LSTAIQESNQGAFASPIQLQR (D) 35 Hình 3.8: Tác động ricin lên khả sống sót chủng vi khuẩn sau xử lý với ricin 24 .36 v Hình 3.9: Độc tính ricin lên dòng tế bào HaCaT 38 Hình 3.10: Độc tính ricin lên dòng tế bào SKMEL28 39 Hình 3.11: Hình ảnh thể tác động ricin lên khả tạo khối tế bào SKMEL28 40 Hình 3.12: Kiểm tra khả tạo khối tế bào sau xử lý với ricin .41 Hình 3.13: Biểu mức độ phosphoryl hóa ERK tế bào SKMEL28và HaCaT nồng độ 3µg/ml 43 Hình 3.14: Kiểm tra tác động ricin lên trình apoptosis tế bào SKMEL28 HaCaT sau 36 44 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ Viết đầy đủ viết tắt Nghĩa tiếng việt - ME 2-Mercaptoethanol 2-Mercaptoethanol BSA Bovine serum albumin Albumine huyết bò CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc DEAE Diethylaminoethanol ERK Extracellular signal regulated kinase Kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào FBS Fetal bovine serum Huyết thai bò HPR Horseradish Peroxidase Peroxidase cải ngựa International Association for Hiệp Hội Nghiên Cứu Mật Mã Cryptologic Research Quốc Tế IACR IC50 The half maximal inhibitory Nồng độ gây chết 50% concentration LB Luria-Bertani broth Môi trường LB LD50 Lethal dose Liều lượng gây chết trung bình MAPK Mitogen-activated protein kinase Protein kinase hoạt hóa phân chia MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis Điện di gel polyacrylamide PBS Phosphate buffered saline Dung dịch muối đệm phosphat PI Propidium iodide Propidium iodide RIP Ribosome inactivating protein Protein bất hoạt ribosome RPMI Roswell Park Memorial Institute Môi trường RPMI medium RTA Ricin toxic A chain Ricin chuỗi A RTB Ricin toxic B chain Ricin chuỗi B SDS Sodium dodecyl sulfate TKR Tyrosine kinase receptor Thụ thể Tyrosine kinase UPR Unfolded protein response Phản ứng mở protein WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới vii MỞ ĐẦU Ung thư nguyên nhân gây tử vong thứ toàn giới với hàng triệu ca mắc bệnh phát hàng năm Theo thống kê WHO, suốt thập niên vừa qua số ca bệnh nhân ung thư tăng 70% xu hướng tăng mạnh năm gần Nguyên nhân gây ung thư thói quen sống, tác nhân độc hại từ môi trường di truyền Hiện nay, ngồi số bệnh ung thư có khả ngăn ngừa sử dụng vắc xin, việc điều trị ung thư chủ yếu phụ thuộc vào khả phát sớm điều trị kết hợp phương pháp hóa trị, xạ trị, miễn dịch để tiêu diệt tế bào ung thư Tại nước phát triển, ung thư bệnh đáng lo ngại sở vật chất khơng đầy đủ gây khó khăn cho việc chuẩn đoán sớm dẫn tới tỉ lệ tử vong cao Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc điều trị nhập ngoại có giá thành cao gánh nặng kinh tế cho người nhà bệnh nhân xã hội Ricin glycoprotein thuộc họ lectin, tách chiết từ hạt thầu dầu Ricin cấu tạo từ chuỗi A B liên kết với qua cầu đisunfit Khi vào thể người, ricin tác động thông qua chế ức chế q trình tổng hợp protein ribosome.Ricin có độ độc tính cao xếp vào chất độc nguy hiểm Trong năm gần đây, việc ứng dụng chất độc từ nguồn gốc tự nhiên điều trị hóa trị ung thư ý Một số nghiên cứu định hướng phát triển sử dụng ricin điều trị ung thư giới khẳng định ricin có tác dụng ức chế q trình sinh trưởng phát triển số dòng tế bào ung thư.Tại Việt Nam, ngành công nghiệp sản xuất dầu thầu dầu thải bỏ hàng bã thầu dầu năm Những sản phẩm thừa yêu cầu phải có quy trình thải bỏ đặc biệt chứa hàm lượng lớn ricin có độc tính cao có khả nguy hại tới sức khỏe cộng đồng Với mong muốn tận dụng sản phẩm từ thiên nhiên bên cạnh tiềm ứng dụng cao hoạt tính ricin, định tiến hành đề tài ―Nghiên cứu khả kháng khuẩn ức chế tế bào ung thƣ ricin tách chiết tinh từ hạt thầu dầu (Ricinus communis)‖ Với vai trò nghiên phương thức điều trị ung thư, đặc biệt loại tế bào ung thư có khả hình thành khối u melanoma 3.4.3 Tác động ricin tới mức độ biểu số protein marker tế bào Sau xác định ảnh hưởng ricin lên khả tăng sinh hình thành khối u tế bào, tiến hành nghiên cứu nhằm tìm hiểu kỹ đường tác động ricin lên tế bào động vật Chúng thực đánh giá ảnh hưởng ricin lên đường MAKP/ERK, đường nội bào quan trọng sinh trưởng phát triển tế bào ung thư.Trong thí nghiệm này, tế bào HaCaT SKMEL28 khỏe mạnh nuôi môi trường bổ sung ricin với nồng độ cuối 3ng/ml điều kiện 37oC, 5% CO2 Sau 24 xử lý với ricin, tiến hành thu tế bào phân tích thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng ERK, p-ERK tubulin đối chứng Sự thay đổi biểu ERK p-ERK dòng tế bào ghi nhận thể Hình 3.13 Kết SDS-PAGE thẩm tách miễn dịch (Hình 3.13) cho thấy biểu ERK p-ERK sau xử lý tế bào với ricin giảm với dòng tế bào SKMEL28 biểu protein không thay đổi với dòng tế bào HaCaT Cụ thể, độ đậm băng protein ERK tế bào SKMEL28 sau xử lý với ricin (đường chạy 1,Hình 3.13A) giảm 2,38 lần so với độ đậm băng ERK tế bào SKMEL28 bình thường (đường chạy 2,Hình3.13A) Biểu protein p-ERK giảm 3,12 lần chịu tác động ricin hàm lượng tubulin khơng có chênh lệch rõ rệt 42 Hình 3.13: Biểu mức độ phosphoryl hóa ERK tế bào SKMEL28và HaCaT nồng độ 3µg/ml Thẩm tách miễn dịch kiểm tra biểu ERK, p-ERK Tubulin tế bào SKMEL28 (A) HaCaT (C) Tỉ lệ biểu ERK, p-ERK Tubulin tế bào SKMEL28 (B) HaCaT (D) so với đối chứng Kết thẩm tách miễn dịch với dòng tế bào HaCaT (Hình3.13C) cho thấy khơng có chênh lệch rõ rệt vềđộ đậm băng protein ERK p-ERK tế bào xử lý với ricin (đường chạy số1) tế bào không xử lý với ricin (đường chạy số 2) Từ kết trên, nhận định ricin tác động kìm hãm lên q trình phosphoryl hóa ERK dòng tế bào ung thư SKMEL28 không ảnh hưởng đến trình dòng tế bào da thường HaCaT Kết hợp với nghiên cứu trước đó, kết luận ricin giảm khả tạo khối dòng tế bào SKMEL28 thơng qua kìm hãm mức độ biểu ERK/p-ERK 3.4.4 Ảnh hưởng ricin lên trình apoptosis Từ kết thu được, chúng tơi tiếp tục đánh giá tác động ricin lên chu trình tế bào Cụ thể, đánh giá ảnh hưởng ricin lên chu trình chết tế bào HaCaT SKMEL28 thí nghiệm appotosis annexin V Tế bào HaCaT SKMEL28 sau xử lý với ricin 36 giờ, rửa PBS nhuộm với thuốc nhuộm annexin V-FITC PI (Invitrogen), tín hiệu huỳnh quang 43 đếm máy FACSCanto II (cung cấp BD Bioscience) Tỉ lệ tế bào vào chương trình chết (apoptosis) xác định dựa tín hiệu annexin V Cụ thể, biểu đồ chấm (Hình 3.14) với giá trị FITC (trục tung) PI (trục hoành) thể giai đoạn khác trình chết theo chương trình giai đoạn sớm (Q1), giai đoạn (Q2), giai đoạn muộn (Q3) hoại tử (Q4) Lượng tế bào vào giai đoạn chết theo chu trình tính tổng số tín hiệu tế bào xuất Q1 Q2 Hình 3.14: Kiểm tra tác động ricin lên trình apoptosis tế bào SKMEL28 HaCaT sau 36 Các kết cho thấy, sau xử lý với ricin nồng độ 1ng/ml 3ng/ml tỉ lệ tế bào SKMEL28đi vào giai đoạn apoptosis ( tế bào ô Q1 Q2) tăng so với dòng tế bào khơng xử lý với ricin Cụ thể, với nồng độ 1ng/ml, tỉ lệ tế bào SKMEL28 chết theo chương trình cao đối chứng 32,72% Khi xử lý với ricin 44 3ng/ml 36h, tỉ lệ tế bào SKMEL28 giai đoạnapoptosis tăng 89% so với tế bào không xử lý với ricin Đối với dòng tế bào HaCaT,tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis dòng tế bào HaCaT 3ng/ml chênh lệch không đáng kể, cao đối chứng 16,38%.Từ đó, chúng tơi kết luận ricin tinh có khả kích thích tế bào ung thư sắc tố da SKMEL28 vào đường apoptosis mà khơng có tác động tương tự với dòng tế bào HaCaT Trong nghiên cứu này, tiến hành tách chiết tinh thành công ricin từ hạt thầu dầu phương pháp tủa amoni sulphate kết hợp với cột sắc ký trao đổi ion sắc ký lọc gel, với hiệu suất tách chiết tinh lên tới 9% Để tìm hiểu hoạt tính ricin tinh thu được, tiến hành kiểm tra tác động ricin thu lên khả kháng khuẩn ảnh hưởng ricin lên tế bào động vật Nghiên cứu rằng, ricin tinh có tác động kháng khuẩn tới chủng vi khuẩn E.coli, Staphylococcus aureus, Bacilus cereus Vibrio vulnificus Mặt khác, kết đánh giá độc tính ricin tinh lên hai dòng tế bào ung thư melanoma SKMEL28 dòng tế bào keratinocye HaCaT thể qua số IC50 cho thấy rằng, ricin tinh gây chết tế bào nồng độ thấp (5 – 34 ng/ml) Nghiên cứu ricin tinh làm giảm khả tạo khối tế bào SKMEL28 mà không gây ảnh hưởng đến kích thước gây ung thư dòng tế bào HaCaT Thơng thường, suốt q trình phát triển phân chia, khối tế bào SKMEL28 có hình dạng tròn sáng khu vực phía ngồi khối thể khối phát triển bình thường tế bào bên ngồi sống sót Tuy nhiên, sau xử lý với ricin tinh sạch, tượng tế bào phía ngồi khối tế bào SKMEL28 tối không bắt sáng, điều thể tế bào chết theo đường apoptosis necrosis Kết nghiên cứu phát ricin làm giảm khả hình thành khối u thơng qua đường kìm hãm biểu protein ERK p-ERK tế bào Q trình phosphoryl hóa/ kích hoạt đường tín hiệu MAPK (RAS/RAF/MEK/ERK) đường có vai trò quan trọng phát triển tế bào ung thư nói chung tế bào melanoma nói riêng ERK ERK phosphoryl hóa (p-ERK) có vai trò quan trọng 45 điều hòa q trình phân chia, biệt hóa xâm lấn tế bào ung thư Tăng biểu ERK ghi nhận 90% trường hợp bệnh nhân ung thư melanoma Các nghiên cứu trước (của McCubrey et al., 2007) rằng, ức chế biểu ERK/p-ERK trình phosphoryl hóa ERK dẫn đến giảm khả hình thành khối u tế bào ung thư So sánh kết thu nghiên cứu trước đó, kết mối quan hệ giảm biểu ERK/p-Erk giảm kích thước khối tế bào SKMEL28 môi trường agar Bên cạnh đó, kết cho thấy nồng độ thấp không ảnh hưởng đến tế bào (1 ng/ml), ricin tinh có tác động thúc đẩy tế bào SKMEL28 vào đường apoptosis mà khơng có tác động tương tự lên dòng tế bào HaCaT Nhìn chung, thấy ricin tinh từ hạt thầu dầu thu có hoạt tính kháng khuẩn, giảm khả tạo khối thúc đẩy tế bào melanoma (SKMEL28) vào đường chết theo lập trình nồng độ thấp Điều cho thấy ricin tinh nghiên cứu ứng dụng phát triển thuốc điều trị ung thư Tuy nhiên, cần tiếp tục thực nghiên cứu sâu chếtác động ricin lên tế bào ung thư phương án nhằm tăng độ đặc hiệu với tế bào (như bao gói thuốc liposome hợp chất polymer…) 46 KẾT LUẬN Từ kết thí nghiệm phân tích đây, chúng tơi rút số kết luận sau: Đã tách chiết tinh thành công ricin từ hạt thầu dầu Việt Nam thông qua phương pháp tách chiết, sắc ký lọc gel sắc ký trao đổi ion Xác định điều kiện muối (NH4)2SO4 tủa protein thích hợp nồng độ 60% Hiệu suất tách chiết ricin từ bã thầu dầu lên tới 9% Xác định khả kháng khuẩn ricin tinh lên chủng vi khuẩn E.coli,Staphylococcus aureus, Bacilus cereus Vibrio vulnificus.Cụ thể, ricin tinh kháng hoàn toàn chủng Vibrio vulnificustại nồng độ 20 µg/ml Tạinồng độ 100 µg/ml, ricin có tính kháng khuẩn nhẹ lên chủng vi khuẩn E.coli, Staphylococcus aureus Bacilus cereus Xác định độc tính ricin tinh lên dòng tế bào HaCaT SKMEL28, cụ thể IC50 HaCaTđạt giá trị 5,2ng/ml IC50 SKMEL28 đạt giá trị 34,1ng/ml.Tại nồng độ ricin không ảnh hưởng đến khả sống sót tế bào (1ng/ml đến 3ng/ml), ricin có khả làm giảm hình thành khối u thúc đẩy tế bào SKMEL28 bước vào chết theo lập trình thơng qua đường tín hiệu ERK/p-ERK mà khơng có ảnh hưởng đến tế bào HaCaT 47 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu tác động ricin tinh lên tính chất khác tế bào ung thư khả di chuyển xâm lấn, di tạo thành mạch máu… Nghiên cứu đường tác động ricin lên tính chất dòng tế bào ung thư Phát triển nghiên cứu nhằm tăng độ đặc hiệu ricin dòng tế bào ung thư 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phạm Kiên Cường (2015), Nhân dòng biểu bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 virus gây bện đốm trắng tôm, Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Thiard Franck, Tất Tố Trinh, Nguyễn Thụy Vy, Nguyễn Hoài Nghĩa, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), ―Khảo sát hoạt tính ức chế tăng trưởng thuốc việt nam dòng tế bào ung thư cổ tử cung hela‖, Tạp chí phát triển kh&cn, 11 (1), tr 74-81 Phí Thị Cẩm Miện (2012), Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý, Luận văn thạc sĩ khoa học Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Đạt (2006), ―Nghiên cứu thu nhận, tinh urease từ đậu nành‖, Tạp chí phát triển kh&cn, (7), tr 57-64 Nguyễn Thị Minh Phương, Trần Thái Thượng, Nguyễn Bích Nhi, Đặng Minh Hải, Đỗ Dỗn Lợi, Phan Văn Chi (2013), ―Phân tích mức độ biểu protein bền nhiệt huyết bệnh nhân đái tháo đường type có biến chứng mạch vành cấp‖, Tạp chí sinh học, 35(3), tr 212-219 Nguyễn Thị Như Trang (2013), Nghiên cứu khả ức chế hoạt tính aurora kinaza in vitro deronne phân lập từ vông nem Erythrina orientalis L.Murr, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Vân (2014), Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) kháng bệnh bạc lúa Xanthomonas oryzae, Luận văn thạc sĩ khoa học Trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 49 Tiếng Anh Bahrami B., et al (2017), "Nanoparticles and Targeted Drug Delivery in Cancer Therapy",Immunology Letters, 190, 64-83 Bozza W P., Tolleson W H., Rivera Rosado L A., and Zhang B (2015), "Ricin Detection: Tracking Active Toxin",Biotechnology Advances, 33, 117123 10 Chad J Roy, K S., Satheesh K Sivasubramani, Donald J Gardner, Seth H Pincus (2012), "Animal Models of Ricin Toxicosis",Curr Top Microbiol Immunol, 357, 243-257 11 Chao-Ting Wang, A E J., Ju-Shun Cheng and Wendie S Cohick (2011), "Inhibition of the Unfolded Protein Response by Ricin a-Chain Enhances Its Cytotoxicity in Mammalian Cells",Toxins, 3, 453-468 12 Cheville A L., et al (2017), "Cancer Rehabilitation: An Overview of Current Need, Delivery Models, and Levels of Care",Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America, 28, 1-17 13 ChoudharyS., Mathew M., and Verma R S (2011), "Therapeutic Potential of Anticancer Immunotoxins",Drug Discovery Today, 16, 495-503 14 Dorsey R., Emmett G., and Salem H (2015), "Chapter 27 - Ricin A2 Gupta, Ramesh C", in Handbook of Toxicology of Chemical Warfare Agents (Second Edition), Boston: Academic Press, pp 347-360 15 Prakash V.S (2014), "Extraction, Purification and Analysis of Anti cancer activity of Ricin on Colon Cancer Cell Lines and Testing its Efficacy using Insilco Docking",Helix, 6, 613-616 16 Fitzmaurice C., Dicker D., Pain A., Hamavid H., Moradi-Lakeh M., MacIntyre MFv (2015), "The Global Burden of Cancer 2013", JAMA Oncol, 1, 505–27 50 17 Fu, L L., et al (2011), "Plant Lectins: Targeting Programmed Cell Death Pathways as Antitumor Agents",The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 43, 1442-1449 18 García-Maldonado E., Cano-Sánchez P., and Hernández-Santoyo A (2017), "Molecular and Functional Characterization of a Glycosylated GalactoseBinding Lectin from Mytilus Californianus",Fish & Shellfish Immunology, 66, 564-574 19 Griffiths G D (2011), "Understanding Ricin from a Defensive Viewpoint",Toxins, 3, 1373-1392 20 Hashem RahmatiS S., Abdorrasoul Malekpour and Farzaneh Farhangi (2015), "Antimicrobial Activity of Castor Oil Plant (Ricinus Communis) Seeds Extract against Gram Positive Bacteria, Gram Negative Bacteria and Yeast",International Journal of Molecular Medicine and Advance Sciences, 11, 9-12 21 Huitink J M., and Teoh W H L (2013), "Current Cancer Therapies – a Guide for Perioperative Physicians",Best Practice & Research Clinical Anaesthesiology, 27, 481-492 22 Irith Wiegand, K H R E W H (2008), "Agar and Broth Dilution Methods to Determine the Minimal Inhibitory Concentration (Mic) of Antimicrobial Substance",Nature Protocols, 23 Inamdar G S., Madhunapantula S V., & Robertson G P (2010),"Targeting the MAPK Pathway in Melanoma: Why some approaches succeed and other fail", Biochemical Pharmacology, 80(5), 624–637 24 Jetzt A E., Cheng J.-S., Li X.-P., Tumer N E., and Cohick W S (2012), "A Relatively Low Level of Ribosome Depurination by Mutant Forms of Ricin Toxin a Chain Can Trigger Protein Synthesis Inhibition, Cell Signaling and 51 Apoptosis in Mammalian Cells",The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 44, 2204-2211 25 Jetzt A E., Li X.-P., Tumer N E., Cohick W S (2016), "Toxicity of Ricin a Chain Is Reduced in Mammalian Cells by Inhibiting Its Interaction with the Ribosome",Toxicology and Applied Pharmacology, 310, 120-128 26 Jeyaseelan E C., and Jashothan P T J (2012), "In Vitro Control of Staphylococcus Aureus (Nctc 6571) and Escherichia Coli (Atcc 25922) by Ricinus Communis L",Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2, 717721 27 Karnchanatat A (2012), Antimicrobial Activity of Lectins from Plants 28 Leite M L., da Cunha N B., and Costa F F (2017), "Antimicrobial Peptides, Nanotechnology, and Natural Metabolites as Novel Approaches for Cancer Treatment",Pharmacology & Therapeutics 29 Lopez-Bergami P., Boris F., and Ze’ev R (2008), ―Understanding Signaling Cascades in Melanoma‖,Photochemistry and photobiology, 84.2, 289–306 30 Luengo A., Gui D Y., and Vander Heiden M G (2017), "Targeting Metabolism for Cancer Therapy",Cell Chemical Biology, 24, 1161-1180 31 McCain Combinations J (2013), for the "The MAPK Treatment (ERK) Of Pathway: Investigational BRAF-Mutated Metastatic Melanoma",Pharmacy and Therapeutics, 38(2), 96–108 32 Mantis N J (2005), "Vaccines against the Category B Toxins: Staphylococcal Enterotoxin B, Epsilon Toxin and Ricin",Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 1424-1439 33 Manzo-Merino J., et al (2014), "The Role of Signaling Pathways in Cervical Cancer and Molecular Therapeutic Targets",Archives of Medical Research, 45, 525-539 52 34 Mateus G Godoy, K V F., Melissa L.E Gutarra, Edésio J.T Melo, Aline M Castro,, and Olga L.T Machado, D M G F (2012), "Use of Vero Cell Line to Verify the Biodetoxification Efficiency of Castor Bean Waste",Process Biochemistry, 47 35 May K L., Yan Q., and Tumer N E (2013), "Targeting Ricin to the Ribosome",Toxicon, 69, 143-151 36 McGaw, L J., Van der Merwe, D., and Eloff, J N (2007), "In Vitro Anthelmintic, Antibacterial and Cytotoxic Effects of Extracts from Plants Used in South African Ethnoveterinary Medicine", The Veterinary Journal, 173, 366372 37 Ning Jiang, Xiao-Peng D., Suo-Lin Zhang, Qing-Yong You, Xing-Tao Jiang, Xiao-Gang Z (2016), "Triptolide Reverses the Taxol Resistance of Lung Adenocarcinoma by Inhibiting the Nf-Κb Signaling Pathway and the Expression of Nf-Κb-Regulated Drug-Resistant Genes",Molecular Medicine Reports, 13, 153-159 38 Azwanida NN (2015), "A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal Plants, Principle,Strength and Limitation",Med Aromat Plants, 39 Odell E W., Sarra R., Foxworthy M., Chapple D S., and Evans R W (1996), "Antibacterial Activity of Peptides Homologous to a Loop Region in Human Lactoferrin",FEBS Letters, 382, 175-178 40 Olsnes S., and Pihl A (1978), "Abrin and Ricin — Two Toxic Lectins",Trends in Biochemical Sciences, 3, 7-10 41 Olsnes S., Pihl A (1973), "Different biological properties of the two constituent polypeptide chains of ricin, a toxic protein inhibiting protein synthesis",Biochemistry, 12 (16): 3121–6 42 Om Kumar,Nashikka A B., Jayaraj R.,Vijayaraghavan R., "Purification and Biochemical Characterisation of Ricin from Castor Seeds",Defence Science, 54 53 43 Padma V V (2015), "An Overview of Targeted Cancer Therapy," Biomedicine 44 Pandey M K., Gupta S C., Nabavizadeh A., and Aggarwal B B (2017), "Regulation of Cell Signaling Pathways by Dietary Agents for Cancer Prevention and Treatment",Seminars in Cancer Biology, 46, 158-181 45 Peluso I., Yarla N S., Ambra R., Pastore G., and Perry G (2017), "Mapk Signalling Pathway in Cancers: Olive Products as Cancer Preventive and Therapeutic Agents",Seminars in Cancer Biology 46 Rao P V L., et al (2005), "Mechanism of Ricin-Induced Apoptosis in Human Cervical Cancer Cells",Biochemical Pharmacology, 69, 855-865 47 Reuven R., Xiao H., Mendel F (2012), "Milk Inhibits the Biological Activity of Ricin",The Journal of Biological Chemistry, 287 48 Sandvig K., Torgersen M L., Engedal N., Skotland T., and Iversen T.-G (2010), "Protein Toxins from Plants and Bacteria: Probes for Intracellular Transport and Tools in Medicine",FEBS Letters, 584, 2626-2634 49 Schep L J., Temple W A., Butt G A., and Beasley M D (2009), "Ricin as a Weapon of Mass Terror — Separating Fact from Fiction",Environment International, 35, 1267-1271 50 Schieltz D M., et al (2011), "Analysis of Active Ricin and Castor Bean Proteins in a Ricin Preparation, Castor Bean Extract, and Surface Swabs from a Public Health Investigation",Forensic Science International, 209, 70-79 51 Sehgal P., Khan M., Kumar O., and Vijayaraghavan R (2010), "Purification, Characterization and Toxicity Profile of Ricin Isoforms from Castor Beans",Food and Chemical Toxicology, 48, 3171-3176 52 Shapira A., Benhar I, (2010), Approaches",Toxins, 2(11), 2519-2583 54 "Toxin-Based Therapeutic 53 Torre L A., Bray F., Siegel R L., Ferlay J., Lortet-Tieulent J., Jemal A (2015), " Global cancer statistics, 2012", CA Cancer J Clin, 65, 87–108 54 TusharDhanani S., Gajbhiye N.A., SatyanshuKumar (2017), "Effect of Extraction Methods on Yield, Phytochemical Constituents and Antioxidant Activity of Withania Somnifera",Arabian Journal of Chemistry, 10 55 Tyagi N., Tyagi M., Pachauri M., and Ghosh P C (2015), "Potential Therapeutic Applications of Plant Toxin-Ricin in Cancer: Challenges and Advances",Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, 36, 8239-8246 56 Tyagi N., and Ghosh P C (2011), "Folate Receptor Mediated Targeted Delivery of Ricin Entrapped into Sterically Stabilized Liposomes to HumanEpidermoid Carcinoma (Kb) Cells: Effect of Monensin Intercalated into Folate-Tagged Liposomes",European Journal of Pharmaceutical Sciences, 43, 343-353 57 Urruticoechea A R., Balart J., Villanueva A., Viñals F., Capellá G (2010), "Recent Advances in Cancer Therapy: An Overview",Recent advances in cancer therapy: an overview, 16, 58 Weaver B A (2014), "How Taxol/Paclitaxel Kills Cancer Cells," Molecular Biology of the Cell, 25, 2677-2681 59 Weston S A., Tucker A D., Thatcher D R., Derbyshire D J., Pauptit R A (1994) "X-ray structure of recombinant ricin A-chain at 1.8 A resolution",J.Mol Biol, 244 (4): 410–422 60 Wilson C R., Mnd Mengel M C (2017), "Ricin☆", in Reference Module in Biomedical Sciences, Elsevier 61 Zhang X., Hu X., and Rao X (2017), "Apoptosis Induced by Staphylococcus Aureus Toxins",Microbiological Research, 205, 19-24 55 62 Zhang X., Li X., You Q., and Zhang X (2017), "Prodrug Strategy for Cancer Cell-Specific Targeting: A Recent Overview",European Journal of Medicinal Chemistry, 139, 542-563 Nguồn tham khảo web: 63 http://faculty.ucc.edu/biology-ombrello/pow/castor_bean.htm 64 http://www.esmo.org/Conferences/Past-Conferences/ESMO-2014Congress/News-Articles/Pathway-of-the-Day-RAS-RAF-MEK-ERK 65 http://www.microscopy-uk.org.uk 66 http://www.uniprot.org/uniprot/P02879#PRO_0000030742 67 https://www.cancer.org/cancer/skin-cancer/galleries/skin-cancer-imagegallery.html 56 ... KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Thơ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ CỦA RICIN TINH SẠCH TỪ HẠT THẦU DẦU (Ricinus communis) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm... sản phẩm từ thiên nhiên bên cạnh tiềm ứng dụng cao hoạt tính ricin, định tiến hành đề tài Nghiên cứu khả kháng khuẩn ức chế tế bào ung thƣ ricin tách chiết tinh từ hạt thầu dầu (Ricinus communis) ... ricin từ protein tổng số 30 3.3 .Khả kháng khuẩn ricin tinh 36 3.4 .Khả ức chế ricin tinh lên tế bào in vitro 37 3.4.1.Độc tính Ricin lên tế bào ung thư da SKMEL28 tế bào HaCaT