MỞ ĐẦU 1 Lý do chọn đề tài
Ngày nay, khi đời sống kinh tế xó hội của con người ngày càng được nõng cao và phỏt triển, vấn đề chăm súc sức khoẻ con người ngày càng được quan tõm chỳ ý Cỏc ứng dụng khoa học hiện đại trong y học đó giỳp phỏt hiện, chế tạo nhiều loại thuốc đặc trị những căn bệnh trước kia được xem là bệnh nan y Khụng chỉ dừng lại ở chữa trị, người ta cũn đi sõu tỡm hiểu nguyờn nhõn, cơ chế của bệnh đề đưa ra phương phỏp điều trị tối ưu Một trong những nguyờn nhõn chớnh gõy ra một số bệnh nguy hiểm ở người, động vật và thực vật đú là cỏc vi sinh vật
Hiện nay, chỳng ta đó sản xuất trờn quy mụ cụng nghiệp rất nhiều loại khỏng sinh tổng hợp cho hiệu quả chữa trị cao đối với cỏc bệnh do vi sinh vật gõy ra Nhưng, sự lạm dụng khỏng sinh tổng hợp lại làm gia tăng khả năng đề khỏng khỏng sinh của vi sinh vật Số khỏng sinh mới mà chỳng ta đưa vào để khắc phục vấn đề này cũn hạn chế Do đú, việc phỏt hiện ra cỏc hợp chất khỏng khuẩn mới cú nguồn gốc từ tự nhiờn trở thành một hướng nghiờn cứu rất đỏng quan tõm Mặt khỏc, việc sử dụng cỏc loại thuốc hoỏ học đang gõy ra cỏc vấn đề về mụi trường, về đột biến, về bảo vệ nguồn gen tự nhiờn Rất nhiều người quan ngại trong việc sử dụng cỏc tỏc nhõn vật lý, hoỏ học nhõn tạo trong việc chăm súc sức khoẻ Người ta bắt đầu hướng đến những sản phẩm cú nguồn gốc thiờn nhiờn, đặc biệt là cỏc chất chiết xuất từ thực vật
Từ lõu, nhiều hợp chất tự nhiờn từ thực vật đó được sử dụng theo kinh
Trang 2học hiện đại làm sỏng tỏ thực nghiệm khoa học lõu đời của nhõn dõn [7] Bằng khoa học thực nghiệm, người ta chỉ ra rằng một số hợp chất trong cõy đặc biệt là cỏc chất thứ sinh cú giỏ trị chữa bệnh Trong chố xanh, măng cụt chứa quercetin cú tỏc dụng diệt khuẩn chữa sõu răng mà khụng độc với con người Silymarin trong cõy kờ sữa cú tỏc dụng chống oxi hoỏ và ngăn ngừa ung thư [26] Catechin cú trong nhiều loài thực vật ngăn chặn và làm chậm sự phỏt triển của tế bảo khối u [30] Đồng thời, cỏc hợp chất tự nhiờn của nhiều loài thực vật khỏc cũng đó được chứng minh là cú hoạt tớnh khỏng sinh chống lại vi khuẩn và vi nắm Gần đõy, nhiều hợp chất tự nhiờn cũn được quan tõm và ứng dụng trong cỏc sản phõm thuốc và mỹ phẩm
Việc phỏt hiện, tỏch chiết và sử dụng cỏc loại hợp chất tự nhiờn thực vật bằng những phương phỏp đơn giản (nghiền, sao khụ và chiết lấy nước ) đó được tiến hành từ rất lõu trong y học Nhưng những nghiờn cứu để xỏc
định và tỏch chiết cỏc sản phẩm thứ sinh này bằng phương tiện và phương
phỏp hiện đại thỡ chỉ gần đõy mới được quan tõm và thực hiện Để tỡm hiểu thờm và tỡm ra cỏc chất thứ sinh trong một số loài thực vật phổ biến ở Việt Nam, ứng dụng trong việc khỏng lại một số vi sinh vật gõy bệnh, chỳng tụi lựa chọn vấn đề “Nghiờn cứu khả năng khỏng khuẩn của cỏc chất thứ sinh
từ một số loài thực vật Việt Nam ” làm đề tài nghiờn cứu trong luận văn Thạc
SĨ
2 Mục đớch nghiờn cứu
Nghiờn cứu hoạt tớnh khỏng khuẩn của cỏc chất thứ sinh chiết xuất từ
một số loài thực vật; phõn tớch thành phần và ứng dụng chỳng khỏng lại một
số vi khuẩn gõy bệnh ở thực vật, động vật và người
Trang 32.2 Khảo sỏt sơ bộ thành phần hoỏ học cơ bản trong dịch chiết từ cỏc đối tượng thực vật
2.3 Phõn lập cỏc nhúm hợp chất tự nhiờn cú hoạt tớnh trong cỏc mẫu thớ nghiệm
3 Nhiệm vụ nghiờn cứu
3.1 Đưa ra quy trỡnh chiết, tỏch cỏc phõn đoạn cỏc mẫu lỏ của 4 loài thuc vat: Ba chac (Euodia lepta (Spreng) Merr.); Ba dau (Croton tiglium L.); Bac thau (Argyreia acuta Lour.); Khụ sõm (Croton tonkinensis Gragnep.)
3.2 Đỏnh giỏ hoạt tớnh khỏng khuẩn của cỏc mẫu
3.3 Khao sỏt thành phần hoỏ học của cỏc phõn đoạn dịch chiết cỏc mẫu
thực vật
4 Đối tượng và phạm vi nghiờn cứu
4.1.Đối tượng 4.1.1.Mẫu thực vật
Bốn loài thực vật: Ba chạc (Euodia iepia (Spreng) Merr.); Ba đậu (Croton tiglium L.); Bac thau (Argyreia acuta Lour.); Khộ sam (Croton tonkinensis Gragnep.)
4.1.2.Mẫu vi sinh vật
Cỏc vi sinh vật thuộc một số chủng vi sinh vật kiểm định do phũng thớ
nghiệm bộ mụn VI sinh vật trường ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội và
Viện vệ sinh địch tễ TW Hà Nội cung cấp
4.2 Phạm vi nghiờn cứu
Trang 4ethylacetate) từ 4 mẫu lỏ cõy trờn mụ hỡnh nuụi cấy vi sinh vật kiểm định trong phũng thớ nghiệm
5 Phương phỏp nghiờn cứu
5.1 Nghiờn cứu hoạt tớnh khỏng khuẩn
Nuụi cấy vi sinh vật trong mụi trường thạch đĩa đỏnh giỏ hoạt tớnh khỏng khuẩn
5.2 Khỏo sỏt thành phần hoỏ học của 4 mẫu lỏ cõy
Định tớnh thành phần hoỏ học của 4 mẫu lỏ bằng cỏc phản ứng hoỏ học đặc trưng
5.3 Định lượng một số hợp chất tự nhiờn trong cỏc mẫu lỏ thực vật - Định lượng polyphenol tụng số theo phương phỏp Folin- Ciocalteau - Phõn lập cỏc hợp chất bằng kĩ thuật sắc kớ lớp mỏng
6 Những đúng gúp mới của đề tài
- Đưa ra quy trỡnh chiết, tỏch cỏc phõn đoạn từ lỏ thực vật - Phõn lập một số hợp chất bằng sắc kớ lớp mỏng
Trang 5Chương 1
TỎNG QUAN
1.1 VAI NET VE TINH HiNH NGHIEN CUU CAY THUỐC
1.1.1 Tỡnh hỡnh nghiờn cứu về cõy thuốc thế giới
Những năm gần đõy, khoa học thế giới đó cú những bước tiến dài trong nhiều lĩnh vực Trong đú, khoa học nghiờn cứu về dược phõm và chế phẩm
dựng trong điều trị bệnh rất phỏt triển, đặc biệt ở cỏc nước Mỹ, Anh, Nhật
Bản, Trung Quốc Họ đó đưa ra trờn thị trường rất nhiều sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng cú tỏc dụng điều trị cỏc bệnh nan y khụng chỉ đối với
người bệnh mà cũn tốt trong việc phũng chống bệnh cho cả người khoẻ mạnh
Bờn cạnh đú, người ta cũn đi sõu nghiờn cứu cỏc hợp chất thiờn nhiờn cú trong nhiều loài thực vật đề ngăn ngừa và điều trị cỏc bệnh, đặc biệt là một số bệnh hiểm nghốo như ung thư, đỏi thỏo đường, nhiễm trựng mỏu .Cỏc tạp chớ khoa học thế giới, cỏc phũng thớ nghiệm y được và ung thư quốc tế đó cụng bồ rất nhiều cỏc nghiờn cứu về cõy thuốc cú tỏc dụng ngăn ngừa và điều trị ung thư Người ta đó nghiờn cứu về cỏc chất cú hoạt tớnh chống ung thư trong nhiều loại cõy như kờ sữa (hợp chất sylimarin), chố xanh, trinh nữ hoàng cung [44] Một số hoạt chất cú tỏc dụng ngăn ngừa và điều trị đỏi thỏo đường trong cõy cỏ ngọt (hợp chất stevirosid), tam thất (gisenoid), nhõn sõm (panaxan), hoàng sõm, lược vàng Nhiều loài thực vật chứa cỏc hoạt chất khỏng khuẩn: trinh nữ hoàng cung (chứa lycorin), chố xanh, bạc hà, hành, tỏi, mựi tõy [28]
1.1.2 Nguồn cõy thuốc Việt Nam
Việc sử dụng cõy thuốc ở Việt Nam đó cú từ rất lõu đời Từ thực tiễn và
Trang 6sử dụng rất nhiều cỏc loại cõy thuốc Chỳng khụng chỉ chữa cỏc bệnh thụng thường như cảm mạo, sỏt khuẩn nhiễm trựng mà cũn sử dụng trong điều trị những bệnh nguy hiểm như ung thư, tim mạch
Nước ta - một quốc gia cú hệ khớ hậu nhiệt đới giú mựa núng am là điều kiện rất tốt cho sự phỏt triển của hệ thực vật vụ cựng đa dạng và phong phỳ Với khoang 11.000 loài thực vật bậc cao cú mạch, 800 loài rờu, 600 loài
nắm và trờn 2.000 loài tảo tạo nờn một nguồn nguyờn liệu phong phỳ cho
khoa học Đụng y [27] Nguồn thực vật này đó được cha ụng ta khai thỏc và chữa bệnh theo kinh nghiệm dõn gian từ ngàn xưa
1.1.3 Tỡnh hỡnh sử dụng và nghiờn cứu cõy thuốc ở Việt Nam
Đến nay, cỏc nghiờn cứu về cõy thuốc đó xỏc định ở Việt Nam cú hơn 3.800 loài thực vật và nắm được dựng làm thuốc Cõy thuốc nam cú thể chữa từ những bệnh đơn giản thường gặp đến cỏc bệnh hiểm nghốo thậm chớ như
bệnh ung thư, đỏi thỏo đường Trờn thực tế, nhiều bệnh nhõn đó được chữa
khỏi những căn bệnh này nhờ sử dụng thuốc nam
Ở nước ta, khi khoa học về được liệu và được phõm chưa phỏt triển mạnh, việc sử dụng thuốc đều dựa vào kinh nghiệm cha truyền con nối và
kinh nghiệm dõn gian Những năm gần đõy, nhu cầu chăm súc sức khoẻ của
Trang 7Cỏc nghiờn cứu về cõy thuốc được sưu tập và biờn soạn thành nhiều tài liệu tham khỏo [3, 7, 8, 9] Những nghiờn cứu về tỏc dụng của cỏc cõy thuốc Đụng y bao gồm bộ sỏch “Những cõy thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Đỗ Tất Lợi, Nxb Khoa học kỹ thuật, năm 1986; “999 bài thuốc đõn gian gia truyền”, Âu Anh Khõm, Nxb Y học Hà Nội, 1999; “Từ điển cõy thuốc Việt Nam”, Vừ Văn Chi, Nxb Y học Hà Nội, năm 1999; “Cõy thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, Viện dược liệu, Nxb Khoa học kỹ thuật, năm 2004; “Cõy thuốc trị bệnh thụng dụng”, Vừ Văn Chi, Nxb Thanh Hoỏ, 2005; “Nghiờn cứu thuốc từ thảo dược”, Bộ giỏo dục và đào tạo, Bộ y tế, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, năm 2006
Tại cỏc trường Đại học, cỏc phũng thớ nghiệm, cỏc viện nghiờn cứu, cỏc dộ tài nghiờn cứu về thảo được cũng đó và đang được tiến hành Một trong những nghiờn cứu mới và nỗi bật nhất hiện nay là nghiờn cứu về cõy Trinh nữ hoàng cung
1.2 KHÁI QUÁT Vẩ CÁC CHÁT Cể HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THỰC VẬT
1.2.1 Cỏc hợp chất thứ sinh và cỏc chất cú hoạt tớnh sinh học
Quỏ trỡnh trao đối chất của sinh vật bao gồm sự tạo thành cỏc hợp chất sơ cấp và hợp chất thứ cấp (cũn gọi là hợp chất thứ sinh)
Hợp chất sơ cấp được tạo thành của quỏ trỡnh đồng hoỏ và dị hoỏ, cú vai tro quan trong đối với cơ thộ sống Nú bao gồm những chất thiết yếu cho sự sống như cỏc axit amin, cỏc axit nuleic, cacbohidrat, lipit Chỳng là trung tõm của quỏ trỡnh trao đối chất, sinh trưởng và phỏt triển của sinh vật
Trang 8về hợp chất thứ sinh thay rằng những hợp chất này chỉ đơn thuần là sản phẩm thừa trong quỏ trỡnh trao đổi chất Nhưng sau nhiều cụng trỡnh đi sõu nghiờn cứu, người ta đó phỏt hiện và cú những khẳng định mới về vai trũ của hợp chất thứ sinh Khỏc với cỏc chất trao đối bậc nhất, hợp chất thực vật thứ sinh khụng phải là yếu tố đặc biệt cần thiết cho quỏ trỡnh sinh trưởng, phỏt triển,
quang hợp và sinh sản [50] Chỳng được tạo ra trong những tế bào chuyờn biệt với vai trũ điều hoà mối quan hệ qua lại giữa cỏc tế bao trong co thộ Đồng thời chỳng là cỏc hợp chất phũng thủ giỳp thực vật chống lại cỏc tỏc nhõn gõy bệnh xõm nhiễm thực vật từ mụi trường xung quanh [41]
Cơ chế bảo vệ của hợp chất thứ sinh được thể hiện rất đa dạng Chỳng tạo ra chất độc tỏc động trực tiếp hoặc giỏn tiếp đến hệ thần kinh, làm rối loạn hệ thống trao đổi chất của cỏc vi sinh vật gõy bệnh (như cỏc phytoalexin)
Một số khỏc lại cú mựi, vị khú chịu (đắng, chỏt, cay, hụi ) Cỏc hợp chất
thuộc nhúm terpen gõy độc đối với bọ cỏnh cứng ăn vỏ, ngăn cỏn sự phỏt triển của sõu bướm Tannin, polyphenol, alkanoid, flavonoid được coi là chất đề khỏng bệnh tật ở thực vật, gõy độc cho cỏc loại nắm gõy bệnh, ức chế sự sinh trưởng và phỏt triển của nhiều vi sinh vật Chất màu cũng cú vai trũ khỏ quan trọng Thực vật sử dụng chất này khụng chỉ để hấp dẫn động vật và cụn trựng thụ phan mà cũn bảo vệ cỏc mụ khỏi bị tổn thương bởi tỏc dụng của tia tử ngoại, quỏ trỡnh ion hoỏ hay quỏ trỡnh đột biến Vỡ vậy, ở một khớa cạnh nào đú cú thộ coi hợp chất thứ sinh này là những chất cú hoạt tớnh sinh học
Với sự phỏt triển của khoa học hiện đại, số lượng hợp chất thứ sinh
Trang 9- Terpen (gồm isoprenoid, terpenoid, carotenoid,) - Glycosid (gdm glycosid tro tim, )
- Cac phenylpropanoid (gồm flavonoid, tanin, lignin, )
- Cỏc hợp chất chứa nitơ (gồm alkaloid, hợp chất đị vũng thơm ) Hiện nay nhiều hợp chất thứ sinh đó được tỏch chiết và sử dụng đề phũng trỏnh và điều trị một số bệnh thụng thường và cả bệnh hiểm nghốo ở người Trong số đú cỏc hợp chất phenolic, flavonoid và alkaloid cú nhiều ứng dụng rất phố biến nhất Chỳng được bào chế thành cỏc dạng dược liệu hay được bồ sung vào thực phẩm nhằm nõng cao giỏ trị dinh dưỡng và tăng cường
khả năng phũng ngừa bệnh tật
1.2.2 Một số loại hợp chất thứ sinh cú hoạt tớnh sinh học
Chat thứ sinh được tổng hợp trong cơ thể nhiều loài thực vật Chỳng cú thể cú ở cõy này hoặc cõy khỏc Vai trũ của cỏc chất này đến nay vẫn chưa được tỡm hiểu cặn kẽ Song nhiều nghiờn cứu chỉ ra rằng chỳng cú thể tỏc động lờn nhiều quỏ trỡnh sinh học của cơ thể sinh vật, đặc biệt là cơ thể vi sinh vật và cụn trựng Núi cỏch khỏc, chỳng cú hoạt tớnh sinh học Nhiều nhúm hợp chất cú hoạt tớnh sinh học đó được phỏt hiện và đi sõu nghiờn cứu
1.2.2.1 Một số hợp chất thuộc nhúm carotenoid
Trang 1010
hoạt tớnh sinh học Đú là B-caroten, lycopen, lutein va zeaxanthin Day là những chất cú khả năng chống oxi hoỏ nờn được sử dụng đề điều trị và phũng chống lóo hoỏ và ung thư
*8- carofen
J-caroten được chiết suất từ củ cà rốt năm 1910 Đến nay, người ta cũn phỏt hiện rất nhiều cỏc đồng phõn khỏc của B - caroten và tỏc dụng của chỳng trong điều trị bệnh
B - caroten co tac dụng như tiền vitamin A cần thiết cho sự phỏt triển cơ thể, tham gia sự tạo mụ, da niờm mạc, vừng mạc mắt, làm tăng sức đề
khỏng của cơ thể chống lại sự nhiễm khuẩn Nú cũn giỳp bảo vệ chống lại ung
thư biểu mụ, B - caroten cú khả năng tạo mỏu nờn thường được dựng kết hợp với sắt protoxalat [37]
*Lycopen
Lycopen là tờn gọi bắt nguồn từ tờn phõn loại của cay ca chua Solanum Iycopersicum được dựng để tỏch ra nú năm 1910 bởi Willtatter và Escher Đõy là tờn thường của v, -caroten, một caroten điển hỡnh thuộc phõn lớp hydrocarotennoid
Cụng thức hoỏ học của Iycopen là CxoH:¿ được xỏc định năm 1928
Phõn tử cú cấu trỳc mạch hở, đối xứng cú 13 liờn kết đụi liờn hợp
Trang 1111
suất từ cõy cà chua cú khả năng làm giảm ung thư tuyến tiền liệt và ung thư phụi
*Lutein
Lutein là một loại sắc tố tự nhiờn tạo ra màu sắc cho rau quả Fremy và Stokes là người đầu tiờn đề xuất về sự tồn tại của những chất màu trong lỏ cõy xanh Nhưng 30 năm sau chỳng mới được nghiờn cứu nhiều và sõu hơn [44] Năm 1831, Kuhn và cộng sự đó tỏch thành cụng tỉnh thộ lutein [49]
Hoạt tớnh sinh học chủ yếu của lutein là khả năng chống oxi hoỏ Chỳng cú thể phản ứng với cỏc gốc tự do bảo vệ tế bào khỏi bị oxi hoỏ, chống ung thư đa, lóo hoỏ da, lóo hoỏ thuỷ tinh thể, làm giảm xơ vữa động mạch [3] Lutein cũng được xỏc định là cú tỏc dụng ngăn ngừa thoỏi hoỏ điểm vàng đo đú phũng được cỏc bệnh thoỏi hoỏ ở mắt
Sự kết hop lutein, zeaxanthin, B - caroten va lycopen sẽ tạo ra một sản phẩm chống oxi hoỏ đa trị vừa tốt cho mỏu vừa tốt cho mắt và nhiều cơ quan tổ chức khỏc của cơ thể Tỏc dụng này sẽ tăng lờn khi kết hợp thờm cỏc vitamin C và vitamin E
1.2.2.2 Một số hợp chất phenol và polyphenol (hợp chất phenolic)
“Hợp chất phenolic” là thuật ngữ dựng để chỉ một nhúm cỏc hợp chất cú ớt nhất một vũng thơm và một hoặc nhiều nhúm hydroxyl (OH) tự do (gọi là aglycol) hoặc kết hợp với cỏc nhúm chức khỏc như ether, esther hay glucosid Phần lớn cỏc phenolic tồn tại ở dạng kết hợp với đường (dạng glycosid) dễ tan trong nước Dựa vào đặc điểm cấu tạo, hợp chất phenolic được phõn loại thành:
Trang 1212
(đại diện là phenol), diphenol (đại diện là pyrocatechin, rezoxin ), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquinon)
- Nhúm hợp chất phenol phức tạp: gồm cỏc chất cú thành phần cấu tạo ngoải vũng benzen cũn cú dị vũng mạch nhỏnh Nhúm này được phõn thành cỏc nhúm sau:
+ Dẫn xuất của acid benzoic (Cạ — C,): cấu trỳc phõn tử chứa vũng benzen cú thờm nhúm carboxyl Chỳng tồn tại phố biến ở dạng tự do, cũng cú ở dạng kết hợp với esther (như acid salicylic) hay glycosid Một số dẫn xuất như acid procatechin, acid galic dang tự do và dạng esther là thành phần cấu
tạo nờn catechin và tannin.Chỳng thường gặp 6 hat nay mầm
O
Hộ OH
HO
Gallic acid Procatechuic acid
Hỡnh 1.1 Cấu trỳc một số polyphenolic điển hỡnh
+ Dẫn xuất của acid cinnamic (Ce — C3): gồm acid p—coumaric, acid caffeic, ferulic rat phộ biộn trong tự nhiờn, một số acid khỏc như acid ứ — coumarie, ứ — ferulic ớt gặp hơn Cỏc acid phenolic được giải phúng khi thuỷ phõn dịch chiết của cõy trong mụi trường acid và được tỏch chiết bằng dung mụi ether
Trang 1313
- Nhúm hợp chất polyphenol (phenol polymer): tanin, lignin, melenin, acid humic
*Tac dung:
Đối với thực vật, phenol và polyphenol cú vai trũ quan trọng trong hụ hấp Chỳng vận chuyển H”, hỡnh thành liờn kết hydro với cỏc protein và
enzyme tạo hiệu ứng di lập thể (hiệu ứng khụng gian) làm thay đối hoạt tinh
của cỏc enzyme Nú làm tăng hoặc giảm nồng độ enzyme Trong sinh trưởng và phỏt triển, phenol đúng vai trũ chất hoạt hoỏ AIA-oxydase và tham gia quỏ trỡnh tổng hợp enzyme này Nú như là chất điều khiến cỏc chất điều hoà sinh trưởng Cỏc phenol cú tớnh phytonxit cú đặc tớnh khỏng khuẩn Nú được hỡnh
thành như một phản ứng tự vệ khi cõy bị tụn thương do vi khuõn gõy bệnh
(như cơ chế phản ứng khỏng nguyờn — khang thể ở động vật và người) Cỏc
chất phenol cú tỏc dụng kớch thớch quỏ trỡnh tỏi sinh, bảo vệ chống bức xạ, gốc tự do, tỏc nhõn gõy đột biến và cú tỏc dụng chống oxy hoỏ Vỡ vậy, nú làm tăng nhanh quỏ trỡnh liền sẹo Khi được tiết ra mụi trường nú cú ý nghĩa to lớn trong việc cảm nhiễm qua lại của cõy
Đối với y học cỏc hợp chất phenol cú tỏc dụng chữa bệnh như là khỏng sinh, chất chống viờm Chẳng hạn arbutin được dựng để sỏt trựng đường niệu, cỏc hợp chất salycylate cú tỏc dụng chống viờm, cỏc esther của acid cinnamic trong actiso (như cynarin, cỏc acid phenolic) cú tỏc dụng bảo vệ gan [9] Cỏc hop chat phenol trong tế bào sống là một chất độc kỡm hóm sự phỏt triển của nắm, vi nấm, virus gõy bệnh Do đú, người ta cú thể dựng chỳng làm cỏc chế phẩm tăng tớnh chống chịu cho cõy như acid humic
Như vậy, phenol là một nhúm chất phức tạp cú rất nhiều ứng dụng mà ngày nay chỳng ta đang sử dụng và cũn tiếp tục phải nghiờn cứu Trong số
Trang 1414
là nhúm hợp chất quan trọng nhất cú nhiều ứng dụng nỗi trội về hoạt tớnh sinh học
1.2.2.3 Flavonoid (C5 — C; — Cy)
Flavonoid là một trong những nhúm chất phenol phức tạp thường gặp trong thực vật Flavonoid cú cấu trỳc đa dạng và nhiều tỏc dụng sinh học đó được nghiờn cứu và kiểm nghiệm Chỳng cú ở hầu hết cỏc bộ phận của cõy, đặc biệt trong cỏc tế bào thực vật quang hợp Đú là những sắc tố cú màu vàng, tan trong nước nờn gọi là “Flavonoid” (flavus: vàng) Một số sắc tố khỏc như xanh, tớm, đỏ cũng thuộc nhúm này Chỳng bao gồm nhiều loại trong đú hợp chất điển hỡnh nhất là biflavon, ngoài ra cũn cú flavon, flavonol và flavanonol
Đến nay, hơn 4000 flavonoid đó được tỡm thấy từ cỏc loài thực vật Ban đầu chỳng được phỏt hiện với vai trũ chỉ là sắc tố của thực vật vào mựa thu khi cỏc loại hoa, lỏ, cõy chuyển sang màu vàng, da cam, đỏ Sau này, cỏc flavonoid được phỏt hiện thấy trong quả, hạt, thõn cõy, chố, rượu vang đỏ Chỳng là cỏc thành phần nối bật nhất trong cỏc giống quả cam, quýt và phụ biến trong thức ăn của con người [5]
Trang 1515
Flavonoid cú cấu trỳc Cạ — C; — Cạ, trong đú phần Cạ là vũng benzen (A,B) va một vũng pyran C; (C) Trong đú vũng A kết hợp với vũng C tạo thành khung chroman
Trong cõy, flavonoid tồn tại dưới hai dạng: dạng tự do (aglycon) và
dạng liờn kết với đường (glycosid) Cỏc glycosid khi thuỷ phõn trong mụi
trường acid hoặc enzyme sẽ giải phúng ra đường và aglycon Trong tự nhiờn trừ catechin và leucoantocyanidin (flavan — 3,4 diol), phần lớn cỏc flavonoid đều tồn tại ở hai dạng glycosid: O — glycosid và C — glycosid Ef ‘eo 3 yw T Cyanidin - roe C) Glucose OH oO Saponin ~~ eu Í 7đằ = “OH 2 Dàn x 7% `W 0H On oH ệ Epicatechin Quercetin OH O - Rhamnose - glucose ° Rutin Hỡnh 1.3 Cấu trỳc một số flavonoid điển hỡnh * Tỏc dụng - Làm mềm thành mạch (hoạt tớnh vitamin P)
Trang 1616
lại cú hoạt tớnh vitamin P Chỳng tỏc dụng lờn tớnh chống chịu của mạch mỏu và gõy ra cỏc biểu hiện lõm sàng khi cơ thể bị nhiễm độc, sốt, rối loạn hoạt động của hệ tim mạch
- Tỏc dụng chống oxy hoỏ
Đõy là cơ sở quan trọng nhất thể hiện hoạt tớnh sinh học của cỏc flavonoid Cỏc flavonoid cú khả năng kỡm hóm cỏc quỏ trỡnh oxy hoỏ dõy chuyền sinh ra bởi cỏc gốc tự do Vi vay, flavonoid thộ hiện tớnh năng bảo vệ gan một cỏch tớch cực Trong gan thường diễn ra sự chuyờn hoỏ lipid của màng tế bảo gan Cỏc gốc acid bộo tự do bị oxy hoỏ thành peroxit Nhờ khả năng ngăn cản sự peroxit hoỏ, cỏc flavonoid cú khả năng ngăn cản sự hỡnh thành acid bộo và cholesterol Vỡ vậy, chức năng gan được tỏi sinh nhanh và phục hồi
Khụng những thế, flavonoid cũn cú khả năng ngăn cản cỏc chất độc hướng gan, ngăn chặn sự nhiễm mỡ trong gan Khi vào trong cơ thể, cỏc
flavonoid sẽ giải toả cỏc điện tớch trờn mạch vũng của nhõn thơm và hệ nối đụi liờn hợp của chỳng sinh ra cỏc gốc tự do bền vững hơn cỏc gốc tự do hỡnh thành do bệnh lý Vỡ vậy, nú làm triệt tiờu cỏc gốc tự do hoạt động Cỏc gốc tự do mà flavonoid tạo ra bền vững hơn nờn khụng tham gia cỏc phản ứng dõy chuyền, phản ứng oxy hoỏ Kết quỏ là hạn chế được quỏ trỡnh bệnh lý do cắt đứt dõy chuyền phản ứng Tuy nhiờn mức độ tỏc dụng của cỏc flavonoid phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo hoỏ học của từng flavonoide cụ thộ [33]
- Tỏc dụng đối với ung thư
Một số flavonoid khi tiếp xỳc với tế bào khối u thấy cú tỏc dụng trị liệu
dựa trờn cỏc cơ chế thường thấy:
Trang 1717
+ Kỡm hóm quỏ trỡnh hụ hấp của tế bào ung thư
+ Kỡm hóm hoạt động giảm phõn + Kỡm hóm trao đổi chất trong tế bảo
Cỏc cơ chế này cũng diễn ra khi cỏc flavonoid tiếp xỳc với cỏc tế bao vi sinh vật gõy bệnh
- Tỏc dụng với enzyme
Nhúm OH của flavonoid phản ứng với nhúm cacboxyl (COOH) của cỏc peptide tao thành liờn kết hydro Nhờ đú, flavonoid tương tỏc với cỏc enzyme và làm thay đổi hoạt tớnh của nhiều enzyme trong hệ thống sinh học, đặc biệt la hộ enzyme mang tộ bao Do dộ, cac flavonoid co kha nang gay bat hoat hệ thộng enzyme màng tế bào vi khuẩn Kết quả là ức chế quỏ trỡnh sinh trưởng và phỏt triển của vi khuẩn
- Tỏc dụng đối với chuyển hoỏ và trờn lõm sàng [4]
Cỏc flavonoid cú tỏc dụng sõu sắc lờn chức năng của tế bào miễn dịch và tế bào viờm Gay (1998) đó chỉ ra rằng quercetin cd thộ sir dung để điều trị hen suyễn và tốt cho bệnh nhõn tiờu đường và nhiễm HIV Flavonoid baicalin trong cỏc nghiờn cứu gần đõy cho thấy hoạt tớnh chống viờm và chống HIV theo cơ chế gõy cản trở sự tương tỏc giữa protein vỏ của HIV với cỏc recepter và ngăn chặn HIV tấn cụng vào tế bào đớch
1.2.2.4 Tannin
Trang 18*Tỏc dụng
Tannin cú khả năng tạo kết tủa với protein nờn cú tỏc dụng chữa bệnh tiờu chảy hay chống chảy mỏu Nú cú khả năng kết tủa với kim loại nặng và alkanoid nờn thường dựng để chữa ngộ độc kim loại và alkaloid Cỏc hợp chất
tanin cũn cú tỏc dụng ức chế và diệt vi khuẩn [9]
1.2.2.5 Couinanrin (C¿ — C3)
Là một nhúm cỏc hợp chất hữu cơ cú trong nhiều loại cõy Cấu trỳc dị vũng chứa oxy tạo nờn mựi thơm giống mựi thơm của vanilin hay cỏ mới khụ Coumanrin được phỏt hiện từ những năm 1820
Coumanrin là những œ-pyron cú cấu trỳc Cạ — C¿ Trong cỏc phõn tử
coumanrin đều cú nguyờn tử oxy liờn kết tại vị trớ C; nờn cú thộ coi nú là dan xuất của umbelliferon Coumanrin thuộc nhúm cỏc hợp chất phenol cú nhúm OH bị ether hoỏ bởi nhúm CHỊ; hay một terpennoid chứa từ một đến ba đơn vị isoprenoid
Về mặt hoỏ học, cỏc coumanrin tồn tại ở dạng tự do hay kết hợp với glucose tạo thành dạng coumanrin glycosid Mạch đường thường 1a glucose, d6i khi 1a glucose — glucose hoac glucose — xylose Phõn tử chứa vũng lacton
Trang 1919
*Tỏc dụng
Tỏc dụng dược lý chủ yếu là chống viờm, khỏng khuẩn và nấm Ngoài ra một số khỏc cú tỏc dụng chống sốt rột (daphnetin, dentatin và clausarin), chống đụng mỏu (dicoumanron), gõy gión mạch (othrol, seopron) [9]
1.2.2.6 Glycosid
Glycosid là cỏc carbohydrat cú nhiều trong lỏ, hạt, và vỏ cõy dạng kết tỉnh cú vị đắng Dưới tỏc dụng của enzyme hoặc acid cỏc glycosid bị thuỷ phõn tạo ra đường và phần khụng đường là aglycon Cỏc aglycon cú cấu trỳc kiểu cardenolid và bufadienolid Cardenolid thuộc loại steroid C›; cú chuỗi bờn là vũng œ, lacton 5 cạnh khụng no và một nhúm C,, hydroxyl nhu strophanthidin, oleandrigenin Bufadienolid là steroid C;¿, chuỗi bờn là vũng lacton 6 cạnh, hai lần khụng no và một nhúm hydroxyl 14, hướng j hoặc
nhúm tương tự như bufalin, marinobufagin
Trang 2020
*Tỏc dụng:
Nhiều nghiờn cứu cho thấy một số glycosid cú tỏc dụng ức chế sinh trưởng và phỏt triển của vi sinh vật Ngoài ra một số glycosid cũn được sử dụng làm thuốc trợ tim [9, 14]
1.2.2.7 Alkaloid
Alkaloid là thuật ngữ dựng đề chỉ nhúm cỏc hợp chất thiờn nhiờn cú cấu trỳc dị vũng chứa mtơ, cú tớnh bazơ cú trong một số loài thực vật nhất định, đụi khi cú cả trong động vật Alkaloid cú nghĩa là giống như (oid) chất kiềm (alcali)
Nguyờn tử nitơ trong alkaloid cú thể là một phần, hoặc khụng phải là
một phần của hệ thống dị vũng Chỳng cú cấu trỳc phõn tử phức tạp, cú hoạt
tớnh Sinh-được rừ rệt và phõn bố hạn chế trong giới thực vật [42] Hiện nay đó
cú hơn 12000 loại alkaloid khỏc nhau được phõn lập Trong cõy, alkaloid tồn tại dưới 3 dạng: dạng tự do, dạng muối của cỏc axit phổ biến như citric, lactic, oxalic, axetic, malic và dạng oxit nitơ Alkaloid khụng phổ biến ở tất cả cỏc loài thực vật mà chỉ tập trung ở một số ớt loài Chỳng chủ yếu được tỡm thấy trong cỏc loài thực vật cú hoa, nhưng chỉ cú khoảng 20% số loài thực vật cú hoa là cú thể sản sinh ra alkaloid Đa số alkaloid khụng cú mựi, vị đắng, một số Ít cú vị cay, ở dạng chất rắn cú màu trắng, trừ một vài chất cú màu vàng (berberin, palmatin) Về vai trũ sinh học, cỏc alkaloid được coi là một trong những “hàng rào phũng thủ hoỏ học hữu hiệu” bảo vệ cõy trước sự tấn cụng của vi sinh vật gõy bệnh và cỏc loại cụn trựng, sõu bệnh ăn lỏ [43] về y học, alkaloid được sử dụng rất đa dạng: làm thuốc gõy ức chế, hoặc kớch thớch hệ thần kinh trung ương, đựng làm thuốc điều hoà huyết ỏp, chữa loạn nhịp tim,
thuốc diột ky sinh trựng, khỏng khuẩn, thuốc chống ung thư và nhiều tỏc dụng
Trang 21` T" N ¿ | hở N ‹ 6 X“ N ) ⁄ N | a “CH; on N CH, 3 0 Ho"
Caffein Morphine Nicotine
Hỡnh 1.6 Cấu trỳc một số Alkaloid diộn hinh
1.3 CHẤT KHÁNG SINH Cể NGUềN GểC THỰC VẬT
1.3.1 Chất khỏng sinh
Chất khỏng sinh là chất hoỏ học do một số vi sinh vật tạo ra cú hoạt tớnh chống lại cỏc vi sinh vật khỏc Đú là cỏc nhõn tố hoỏ trị liệu đặc biệt Chỳng là những sản phẩm tự nhiờn mà khụng phỏi là những hoỏ chất tổng
hợp Khỏng sinh là cỏc sản phẩm của trao đụi chất bậc hai Chỳng là một
trong những nhúm chất quan trọng nhất được sản xuất nhờ cỏc quỏ trỡnh vi sinh vật ở quy mụ lớn Cỏc chất khỏng sinh như: penicillin, streptomycin, cỏc chất khỏng sinh thế hệ 2 và thế hệ 3 đó được sản xuất từ thế kỷ trước Hiện nay, khoảng hơn 8.000 chất khỏng sinh đó được biết đến và mỗi năm cú khoảng vài trăm khỏng sinh mới được phat hiộn [1]
Trang 2222
đặc hiệu đó hỡnh thành tớnh đề khỏng khỏng sinh Và những vấn đề mới về
khỏng sinh lại được đưa ra Người ta hướng đến những chất khỏng sinh cú nguồn gốc thực vật
1.3.2 Chất khỏng sinh cú nguồn gốc thực vật
Khỏi niệm chất khỏng sinh thực vật chỉ mới xuất hiện gần đõy Năm 1973, Ingham là người đầu tiờn đưa ra định nghĩa khỏng sinh thực vật “phytoalexin” Phytoalexin là cỏc chất khỏng khuẩn hỡnh thành trong cơ thờ thực vật thụng qua một chuỗi liờn tiếp cỏc quỏ trỡnh chuyờn hoỏ trước những biến đổi sinh ly hoc dộ phản ứng lại với điều kiện mụi trường nhằm thớch nghỉ với điều kiện sống tốt hơn hoặc chống lại sự tắn cụng của cỏc vi sinh vật gõy bệnh
Phytoalexin được tỡm thấy dưới nhiều đạng cú bản chất hoỏ học khỏc nhau như: alkaloid, flavonoid, glycosid, terpenoid [19] Chỳng được sản xuất bởi cơ thể thực vật như là cỏc chất độc với cỏc sinh vật tan cụng chỳng Cơ chế tỏc động của cỏc phytoalexin tương tự như cơ chế tỏc động của cỏc chất khỏng sinh Chỳng cú khỏ năng phỏ vỡ thành tế bào, làm trỡ hoón quỏ trỡnh sinh trưởng, phỏ vỡ quỏ trỡnh trao đổi chất của cỏc sinh vật cú hại Kết quả là cỏc phytoalexin ức chế sự sinh
CH,
trưởng, phỏt triển hoặc gõy độc cho tế bào vi sinh vật gõy bệnh
Những năm gần đõy, người ta đó phõn lập được nhiều phytoalexin cú khả năng chống lại cỏc tồn thương tới thực vật
Một vớ dụ tiờu biểu là Allixin (3-hydroxy-
5-methoxy-6-methyl-2-penthyl-4H-pyran- Hỡnh 1.7 Cấu tạo hoỏ học của
Trang 2323
pyrone đó được phõn lập đầu tiờn từ tỏi Alixin là một sản phẩm được sản
xuất bởi thực vật khi phản ứng với cỏc stress liờn tiếp Hợp chất này cú nhiều hoạt tớnh sinh học như chống oxi hoỏ, chống vi khuẩn, chống sự tăng sinh của khối u, ức chế quỏ trỡnh hỡnh thành ung thư da, ức chế quỏ trỡnh liờn kết của aflatoxin B2 với ADN Chớnh vỡ vậy, allixin hoặc cỏc dẫn xuất của nú cú thể là một tỏc nhõn tiềm tàng trong việc chữa trị bệnh ung thư và cỏc bệnh khỏc [34]
Trong lịch sử y học dõn gian, nhiều phytoalexin được sử dụng để chống lại cỏc tỏc nhõn bệnh lý vi sinh vật một cỏch hiệu quả như: emefine, quinin, berberine Ngày nay, việc tỡm ra bản chất của cỏc hợp chất tự nhiờn (là cỏc
alkaliod, flavonoid, glycosid, indole alkaloid, biflavonoid ) hứa hẹn những
phuong thuốc đặc trị cho những bệnh do vi sinh vật gõy nờn, thậm chớ cả
AIDS [38]
Cac phenolic trong thực vật trong đú cú flavonoid là cỏc chất thứ sinh được nghiờn cứu sõu rộng và phổ biến nhất Trong dịch chiết từ hầu hết cỏc bộ phận của cõy đều chứa loại hợp chất này Chỳng cú tiềm năng khỏng
khuõn rất lớn Một đại diện điển hỡnh trong số đú là quinon Khả năng khỏng
vi sinh vật của hợp chất tự nhiờn này đó được nghiờn cứu và chứng minh Nú tỏc dụng lờn vi sinh vật dựa trờn cơ chế tỏc động lờn bề mặt tế bào, phỏ hủy lớp vỏ peptidoglycol hoặc phỏ huỷ hệ thống enzyme màng và làm vi sinh vật chết Cỏc hydrophenolic và cỏc phenolic loại hydroxylcianic như caffeic acid,
ferulic acid, coumaric acid cú khả năng ức chế sự sinh trưởng của cỏc chỳng
Trang 2424
Trang 2525
Chương 2
ĐểI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1.ĐểI TƯỢNG NGHIấN CỨU
2.1.1 Đối tượng thực vật
Mau lỏ của 4 loài thực vật bao gồm: Cõy ba chạc (Euodia lepfa (Spreng) Merr.); Cõy ba đậu (Crofon tiglium L.); Cay bac thau (Argyreia acufa Lour.); Cõy khụ sõm (Croton fonkinensis Gragnep.) Mẫu được thu hỏi ở Tam Đảo — Vĩnh Phỳc và Trạm đa dạng Sinh học — Ngọc Thanh — Vĩnh Phỳc Người thắm định phõn loại cỏc mẫu thực vật nghiờn cứu cho đề tài này
là TS Vừ Văn Chi, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chớ Minh
2.1.1.1 Đặc điểm sinh học của cõy Ba chạc (Euodia lepta (Spreng) Merr)
Ba chac hay cũn gọi là Chố đắng, Chố cỏ, Cõy dầu dầu; cú tờn khoa hoc la Euodia lepta (Spreng) Merr, thuộc họ Cam Ba chạc thuộc loại cõy nhỡ cao 2 — 8m Lỏ cú 3 lỏ chột, với lỏ chột nguyờn Cụm hoa ở nỏch cỏc lỏ và ngắn hơn lỏ Quả nang, thành cụm thưa,
cú 1 - 4 hạch nhẫn, nhăn nheo ở cạnh ngoài, chứa mỗi
Hỡnh 2.1 Cõy Ba chạc
cỏi một hạt hỡnh cầu đường kớnh 2mm, đen lam, búng
Hoa nở thỏng 4 - 5 Quả thỏng 6 — 7 (Euodia lepta Spreng Merr)
Trang 2626
2.1.1.2 Đặc điểm sinh học của cõy Ba đậu (Croton tiglium L.)
Ba đậu hay cũn gọi là cay Man dộ, cộ tộn khoa hoe la Croton tiglium
L., thuộc ho Thau dau (Euphorbtuceae)
Cõy gỗ nhỏ cao 3 — 6m La moc so le, mộp khớa răng Lỏ non màu hồng đỏ Hoa mọc thành chựm ở đầu cảnh, hoa đực ở phớa ngọn, hoa cỏi ở phớa gốc Quả nang nhẫn màu vàng nhạt Hạt cú vỏ cứng màu vàng nõu xỏm Cõy ra hoa thỏng 5 — 7, cú
quả thỏng 8 — 10
Hinh 2.2 Cay Ba dau
Cay cua vung An D6 - Malaysia, moc hoang &
ye x ri (Croton tiglium L)
ven đụi, nương, rõy cũ va rừng õm Hạt thu hỏi ở
những quỏ chớn chưa nứt vú Để nguyờn quả, khi đựng mới gỡ hạt hoặc dap
lẫy hạt phơi khụ Rễ thu hỏi quanh năm, rửa sạch, thỏi phiến, phơi khụ dựng
Lỏ dựng tươi
2.1.1.3 Dac diộm sinh hoc ctia cộy Bac thau (Argyreia acuta Lour.) Bac thau hay con co tộn khỏc là Bạc
sau, Lỳ lớn hay Thảo bạc, cú tờn khoa học là Argyreia acufa Lour., thuộc họ Khoai lang (Concovulaceae) Than dang dõy leo bũ hoặc quấn Thõn cú nhiều lụng màu trắng bạc Lỏ nguyờn mọc so le, hỡnh bầu dục hay trỏi xoan,
mặt trờn nhẫn, xanh thẫm, mặt đưới (mặt sau)
Hỡnh 2.3 Cõy Bạc thau cú nhiều lụng mịn màu trắng bạc Cụm hoa ở
nỏch lỏ hay ngọn thõn, hỡnh đầu hoặc hỡnh tỏn, (Argyreia acuta Lour)
Trang 2727
hỡnh cầu, khi chớn màu đỏ, bao bởi đài hoa phỏt triển, cú mặt trong màu đỏ
Hạt hỡnh trứng, màu nõu Mựa hoa, qua thỏng 6 — 7 dộn thang 11
Cõy mọc hoang ở nhiều nơi, ven bờ bụi Cú thể thu lỏ và thõn quanh năm Lỏ thường dựng tươi Cành, lỏ, rễ đem về rửa sạch, thỏi nhỏ phơi khụ
Cú thờ tõm rượu sao qua rụi mới sử dụng
2.1.1.4 Đặc điểm sinh học của cõy Khổ sõm (ba dộu Bac kj) (Croton tonkinesis Gagnep.)
Khộ sam hay Khộ sam Bac bộ, cú tờn khoa học là Crofon tonkinesis Gagnep thuộc họ Thầu dầu (Euphobiaceae) Cõy cú kớch thước nhỏ, cao khoảng | — 1,5m, cành non mảnh Lỏ mọc so le, cú khi tụ hop 3 — 4 lỏ như kiểu mọc vũng, hai mặt cú lụng úng ỏnh như lỏ nhút, phủ dày hơn ở mặt đưới; phiến lỏ hỡnh ngọn giỏo, dài 5 — 9cm, rộng 1 - 3em, chúp nhọn dài thành mũi nhọn, mộp nguyờn, ba gõn toả từ gốc, cựng với hai tuyến dang rang cura Hoa
nhỏ trắng, mọc thành chựm ở nỏch lỏ hoặc đầu cảnh,
đơn tớnh, cựng gốc Quả cú 3 mỏnh vỏ Hạt hỡnh trứng mau nau
Cõy mọc hoang và được trồng ở khắp nơi, trong
cỏc vườn gia đỡnh hoặc vườn thuốc, chủ yếu ở cỏc tỉnh
phớa Bắc Việt Nam Thường trồng bằng gieo hạt hoặc ee
trồng bằng cành vào mựa xuõn Thu hỏi khi cõy đang Hỡnh 2.4 Cõy khổ sõm cú hoa, đem phơi hoặc sấy khụ Khi dựng sao vàng (Croton tonkinesis Gagnep)
Xứ lý mẫu: Cỏc mẫu thực vật sau khi được thu
Trang 2828
ngõm trong ethanol 90% Khối lượng khụ tuyệt đối của cỏc mẫu lỏ cũng được xỏc định
2.1.2 Đối tượng vi sinh vật
Để nghiờn cứu hoạt tớnh khỏng một số vi sinh vật kiểm đinh, chỳng tụi sử dụng cỏc chủng vi sinh vat: Bacillus subtilis, Cadida abbicans, E.coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Staphyylococcus aureus, Vibrio cholera
Cac chủng vi sinh vật do Bộ mụn Vi sinh vật trường ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện vệ sinh dịch tễ TW Hà Nội cung cấp
2.1.2.1 Bacillus subtilis
Bacillus subtilis: 1a vi khudn kiểm định đại điện của nhúm trực khuẩn Gram duong Chung sinh san bang bao tt, sộng hiộu khi B subtilis là tỏc nhõn gõy một số bệnh cho cõy trồng, khụng gõy bệnh cho người.[ I]
2.1.2.2 Cadida abbicans
Cadida abbicans là một loại nắm men đơn bào cú hỡnh trũn hoặc bầu dục, kớch thước nhỏ khoảng 2-5 Iuim, sinh sản thành chuỗi và sinh nội độc tố Nhiệt độ thớch hợp 20-37°C Candida abbicans thường sống hoại sinh trong đường tiờu húa của người, động vật
2.1.2.3 E.coli
Escherichia coli là vi khuõn Gram 4m, hinh que cú kớch thước (1,1 —
1.5)um x (2 - 6)um Là vi khuẩn yếm khớ tựy tiện, phỏt triển tốt ở 15 — 20°C,
Trang 2929
2.1.2.4 Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae con goi là phộ truc khuan Friedlander là trực khuẩn ngắn, Gram õm, bắt màu đậm ở hai cực Vi khuẩn này cú nhiều hỡnh thể, cú khi như cầu khuẩn, cú khi lại hỡnh dài, cú vỏ, khụng đi động, khụng
sinh nha bao Klebsiella pneumoniae 1a loai vi khuan rat phộ biộn trong thiờn nhiờn (nước, đất) Nú ký sinh ở đường hụ hấp trờn của người, là tỏc
nhõn “gõy bệnh cơ hội”
2.1.2.5 Pseudomonas aeruginosa
Vi khuan P.aeruginosa con goi 1a trực khuẩn mủ xanh Vi khuẩn P aeruginosa là trực khuẩn Gram õm, hỡnh que, kớch thước 0,6 x 2 m cú khả năng di động nhờ một tiờm mao đơn cực, khụng bào tử, đứng một mỡnh hay thành đụi hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn P zeruginosa là điển hỡnh của loại vi khuẩn gõy nhiễm trựng cơ hội (opportunistic pathogen): gõy nhiễm trựng đường niệu, đường hụ hấp, viờm da, nhiễm trựng mụ mềm, viờm màng nóo 2.1.2.6 Salmonella typhi
Salmonella typhi la trực khuõn Gram õm, kớch thước trung bỡnh 3,0 x 0,5 um, cú nhiều lụng ở xung quanh thõn Sống hiếu khớ hoặc ky khớ tựy tiện, phỏt triển được trờn cỏc mụi trường nuụi cấy thụng thường Sứlmonella typhi cú trờn cơ thể người, tập trung chủ yếu ở ống tiờu húa và gõy ra nhiều bệnh
nguy hiểm như thương hàn
2.1.2.7 Shigella flexneri
Shigella flexneri la trực khuẩn Gram õm cú dạng hỡnh que thẳng dài 1- 3um, khụng cú lụng, khụng đi động, khụng cú vỏ, khụng sinh bào tử, bat mau
Gram õm Vi khuẩn này cú thể nuụi cấy được trờn mụi trường hiếu khớ cũng
Trang 3030
người, rất dễ tỏi phỏt và cú thờ trở thành bệnh món tớnh Một số loài cú khả
năng sinh ngoại độc tụ tỏc động lờn hệ thần kinh, gõy cỏc triệu chứng: đau bụng quặn, đi ngoài nhiều lần, phõn cú nhiều mũi nhầy và thường cú mỏu 2.1.2.8 Staphyylococcus aureus (tụ cầu vàng)
Sfaphyylococeus aureus là vi khuõn Gram dương, cú đạng hỡnh cầu, ky
khớ tuỳ tiện, phỏ triển tốt trong điều kiện hiếu khớ, khụng sinh bào tử, khụng
di động S/aphyylococeus aureus thường sụng trong cỏc hốc tự nhiờn của cơ thộ, khoảng 30% cư trỳ trờn da hay mũi người khoẻ mạnh, gõy cỏc bệnh từ nhẹ (mụn nốt đỏ, apxe) đến nặng (viờm phối, viờm màng nóo, viờm màng tim, nhiễm trựng mỏu) ŠS/2phyylococewus aureus là nguyờn nhõn gõy ngộ độc thức ăn, gõy sốc phản vệ và gõy nhiễm trựng bệnh viện (do khử trựng dụng cụ y tế khụng sạch)
2.1.2.9 Vibrio cholerae
Vibrio cholerae (con goi la Kommabacillus) la vi khuan Gram õm, hỡnh que, hai đầu khụng bằng nhau, di động rất nhanh trong nước Khi xõm nhập vào cơ thể chỳng sản sinh choleratoxin là độc tố cú cường độ gõy bệnh mạnh
và cỏc độc tố khỏc như hemolysine gõy bệnh tả ở người
2.2 HOÁ CHÁT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM
2.2.1 Húa chất thớ nghiệm
Húa chất tỉnh khiết dựng để chiết xuất, định tớnh, định lượng như: EtOH > 90%, n-hexan > 95%, Chlorofom > 99,0%, Ethylacetate > 99,5%, Nước cất, Aceton > 99,5%, Toluen > 99,5%, Acid fomic > 88,0%, Methanol
> 99,5%, H;SO¿„ > 98%, NaOH, HCI, Pb(CH;COO); 10%, của cỏc hóng
Trang 3131
2.2.2 Thiột bi va dung cu thi nghiộm
Một số mỏy múc thiết bị tại Trung tõm hỗ trợ nghiờn cứu Khoa học và chuyền giao Cụng nghệ - ĐHSP Hà Nội 2; Phũng thớ nghiệm Húa sinh miễn dịch và Phũng thớ nghiệm Bộ mụn Vi sinh vat - DHKHTN, Dai hoc Quốc gia
Hà Nội
+ Mỏy múc: Mỏy cụ quay chõn khụng, mỏy cất nước, mỏy xỏc định
OD, bỡnh ổn nhiệt, nồi hấp khử trựng, buồng cấy vụ trựng, tủ ấm
+ Thiết bị thớ nghiệm: Tủ sấy, cõn điện tử, ống nghiệm, ống đong, bỡnh tam giỏc, đĩa petri, pipet, que cấy:
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.3.1 Quy trỡnh nghiờn cứu Mẫu lỏ thực vật khụ Tiến hành chiết phõn đoạn cỏc hợp chất tự nhiờn — Đỏnh giỏ hoạt tớnh khỏng vi sinh vat kiểm đỉnh Khảo sỏt thành phần húa học Thăm dũ thành phần hoỏ học cú hoạt tớnh khỏng khuẩn r Kết luận
Hỡnh 2.5 Sơ đồ quy trỡnh nghiờn cứu thành phần húa học và đặc tớnh khỏng vi
Trang 3232
2.3.2 Phương phỏp thử hoạt tinh khang vi sinh vật kiểm định
Mục đớch: Xỏc định khả năng khỏng khuẩn của cỏc mẫu cao chiết và chế phõm phõn đoạn đối với một số chủng vi khuẩn và nắm gõy bệnh theo
phương phỏp nhỏ dịch, xỏc định vũng khỏng khuẩn
Tiến hành: - Chuẩn bị mụi trường nuụi cấy, hấp khử trựng 3 lần trong 3
ngày liờn tiếp
- Nuụi cấy lắc khởi động vi sinh vật trong mụi trường dịch thể trong 24 giờ, nắm men trong 48 giờ
- Cay vi sinh vật đó khởi động trờn mụi trường dic trong dia petri, sau đú đục giếng
- Mẫu dịch chiết được pha theo ty lệ thớch hợp (thường là 1 mau: 19
nước cất) sẽ được tra vào cỏc giếng Đề đĩa petri trong 4°C cho mẫu khuyếch
tỏn đều vào thạch rồi đưa vào tủ ấm 37°C Đọc kết quả vũng khỏng khuẩn sau
24 giờ đối với vi khuõn và 48 giờ đối với nắm
2.3.3 Khảo sỏt thành phần cỏc hợp chất tự nhiờn bằng cỏc phỏn ứng húa học đặc trưng
Nguyờn tắc của phương phỏp là dựa trờn phỏn ứng của từng nhúm chất
với cỏc thuốc thử đặc trưng và cho màu hoặc dấu hiệu nhận biết khỏc nhau
Với một liều lượng xỏc định, việc so sỏnh cường độ màu cũng cú thể bước đầu đỏnh giỏ được hàm lượng của chỳng trong cỏc mẫu nghiờn cứu
2.3.3.1 Định tinh flavonoid
Mẫu thử được pha trong Ethanol với một lượng thớch hợp, thờm vài
giọt HCI đặc
Trang 3333
- Phan ứng với acid sunfuric: Cho dụng dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thờm vài giọt acid sunfuric đặc Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự cú mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nõu cho thõy sự cú mặt của chalcon và auron
- Phản ứng định tớnh catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lờn giấy lọc, nhỏ tiếp lờn một giọt dung dịch vanilin trong HCI đặc Kết quả cho màu
đỏ son là phản ứng dương tớnh 2.3.3.2 Định tớnh tannin
Mẫu thử cũng được pha như trờn và làm cỏc phản ứng:
- Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một
ống đối chứng, ống kia thờm vài giọt thuốc thử vanilin/H;SO, Phản ứng dương tớnh khi thu được màu đỏ đậm
- Phản ứng với gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng đương tớnh khi trong dung dịch xuất hiện van đục
- Phan ứng voi acetate chi: cho vai giot dung dich acetate chi 10% vào
dung dịch mẫu, phản ứng dương tớnh khi xuất hiện kết tủa
2.3.3.3 Định tớnh cỏc polyphenol khỏc
- Phản ứng với dụng dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử được pha như trờn
Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thờm vài
giọt NaOH 10% Phỏn ứng đương tớnh khi xuất hiện màu vàng, vàng cam - Phản ứng với FeCl;: Nhỏ dung dịch FeCl; trong HCI 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loóng bằng ethanol 96% Phản ứng cú kết quả dương tớnh khi dung dịch cú màu lục, tớa, lam, xanh đen hay đen
2.3.3.4 Dinh tinh glycosid Phan ung Keller-Killian:
Thuốc thử Keller-Killian:
Trang 3434
+ Dung dịch B: thờm 0,5ml dung dịch FeCl]; 5% vào 50ml acid sunfuric đặc Phương phỏp: Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm Thờm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiờng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào Phản ứng dương tớnh khi xuất hiện vũng nõu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng
2.3.3.5 Định tớnh alkaloid
Mẫu thử được pha trong dung địch acid acetic 2% với một lượng thớch hợp để làm cỏc phỏn ứng
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và 1, trong dung dịch HCI): phản ứng cho kết tua mau nau sam
- Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl; và KI trong
nước): phản ứng cho kết tủa màu trắng ỏnh vàng
- Phản ứng với thuốc thử Dragendroƒƒ (hỗn hợp Bi(NO)); và KI trong
dung dịch acid acetic): phản ứng cho màu vàng da cam đến đú 2.3.4 Xỏc định hàm lượng polyphenol tổng số
Nguyờn tắc: Dựa trờn phản ứng của cỏc hợp chất polyphenol với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam Đo độ hấp thụ của dung dịch sau phỏn ứng ở bước súng 765nm Hàm lượng polyphenol tổng số được tớnh theo mg acid gallic chuẩn
Chuẩn bị mẫu định lượng:
- Cõn chớnh xỏc 5 gam bột mẫu dược liệu và tiến hành chiết rỳt 3 lần
bằng Methanol (mỗi lần 50ml), lọc gom dịch lọc và thờm MeOH tới 150ml - Cõn chớnh xỏc 0,05 mg cao cỏc phõn đoạn hoà tan trong 10ml MeOH Phương phỏp tiễn hành:
Trang 3535
300ml dung dịch NazCO; bóo hoà, lắc đều và dộ trong tối trong 2h sau đú tiễn
hành đo ở bước súng 765nm
2.3.5 Sắc ký lớp mồng
Nguyờn tắc: Sắc ký lớp mỏng dựa trờn sự phõn chia hai pha: một pha đứng 1m gọi là chất hấp phụ là lớp mỏng Silicagen rải trờn một tắm thủy tinh, một pha di động là một dung mụi đựng trong một bỡnh cú nắp kớn Lớp hấp phụ nhỳng vào dung mụi Dung mụi di chuyển lờn làm chuyển dịch mẫu để phõn tỏch từ vị trớ chấm của nú trờn lớp mỏng Nếu mẫu là một hỗn hợp, mỗi chất trong đú cú hệ số hấp phụ và cú ỏi lực xỏc định đối với dung mụi sộ di
chuyển với tốc độ riờng
Vị trớ cỏc vết chuyển dịch cú thể soi dưới ỏnh sỏng tử ngoại, hoặc hiện màu bằng những thuốc thử thớch hợp Ta cú thể cạo cỏc vết, rửa được cỏc chat, tinh chế, đem phõn tớch bằng quang phụ kế đề xỏc định thành phần riờng
biệt
Cỏch tiến hành:
Sắc ký trờn bản mỏng trỏng sẵn silicagel DC - Alufolien 60 Faz¿ (Merck 5554) Hệ dung mụi chạy sắc ký là hệ đung mụi TEF theo tỷ lệ 5:4:1 (7oiuen ~ Enthylacetat — acid formic) Hiộn mau bang dung dich H,SO, 10%
- Chuẩn bị dung mụi chạy sắc ký hệ dung mụi TEF theo tỷ lệ 5:4:I - Hũa tan mẫu trong đung mụi thớch hợp và tiến hành lọc qua màng lọc
kớch thước lỗ 0,45m
Tiến hành chấm mẫu lờn bản mỏng và chạy sắc kớ (đặt trong dung mụi) - Hiện kết quả bằng thuốc thử
Xỏc định hệ số R¿ theo cụng thức: R¿= a/b
Trong đú: - a: khoảng di chuyển của chất nghiờn cứu - b: khoảng di chuyển của dung mụi
Trang 3636
Chương 3
KẫT QUÁ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Quy trỡnh tỏch chiết cỏc phõn đoạn hợp chất tự nhiờn từ cỏc mẫu thực vật Mẫu thực vật | Ngõm chiết 3 lần bằng Ethanol 90%,
lọc thu dịch lọc, cất loại dung mụi dưới ỏp suất giảm Cao tụng số Chiết phõn đoạn 3 lần với n -hexan
Phõn lớp hexan Phõn lớp nước
Cụ loại dung mụi 1 à Chiết phõn đoạn 3 lỏn voi chloroform Cao PD hexan
Phõn lớp nước Phõn lớp Chloroform
v2 1a 3 Cụ loại dung mụi Chiết phõn đoạn 3 lan
với ethylacetate Cao PD Chloroform
Phõn lớp ethylacetate Phõn lớp nước | Cụ loại dung mụi | Cao PD Ethylacetate Cao Pé nước
Hỡnh 3.1 Quy trỡnh tỏch chiết phõn đoạn cỏc chất tự nhiờn từ mẫu lỏ
Trang 3737
tỏch chiết, cần tiến hành ngõm chiết ba lần với mỗi loại dung mụi Sản phẩm thu được ở dạng cao khụ Kết quả được thộ hiộn trong bang 3.1
Bảng 3.1 Hiệu suất tỏch chiết cỏc phõn đoạn hợp chất tự nhiờn từ cỏc mẫu lỏ
Lỏ Ba chạc Lỏ Ba đậu Lỏ Bạc thau Lỏ Khổ sõm
Trang 3838 ẹCaotụngsú â Cao Hexan BCaoCHCA3 NCaoELOAc 16 14 12 10 14.43% 1.09% 1.08% 082%y 359, 0.11% 13% "66 6] 29, 35% 1.04% 0.05% oN FD oo Lỏ Ba chạc Lỏ Ba đậu Lỏ Bạc thau Lỏ Khỗ sõm
Hỡnh 3.2 Hiệu suất tỏch chiết cỏc phõn đoạn dịch chiết từ mẫu lỏ Ba chạc, Bạc thau, Ba đậu và Khụ sõm
Kết quả cho thấy, khi chiết suất bằng ethanol từ 500g mẫu dược liệu khụ ban đầu thu được lượng cao cồn trong lỏ Ba đậu là 72,13g và lỏ Khổ sõm là 37,92g Với lượng mẫu khụ như trờn, lỏ Bạc thau, lỏ Ba chạc thu được được cao tổng số ớt hơn lần lượt là: 16,75g và 8,175g Tuy nhiờn, đối với lỏ Bạc thau và lỏ Ba chạc tỷ lệ khối lượng cao cỏc phõn đoạn so với khối lượng cao cồn tong số lớn hớn so với 2 được liệu cũn lại Như vậy qua khối lượng cỏc cao phõn đoạn thu được chỳng ta cũng cú thể dự đoỏn được hàm lượng thành phần cỏc chất cú trong đú
3.2 Kết quả đỏnh giỏ hoạt tớnh khỏng một số vi sinh vật gõy bệnh
Trang 3939 Bảng 3.2 Kết quả thứ khả năng khỏng vi sinh vật của cỏc phõn đoạn mau lỏ Ba chạc Kớch thước vũng khỏng (mm)
st Vi sinh vat Nước
T EtOH | n-hexan | Clorofom | EtOAc cắt 1 Bacillus subtilis 20 10 13 0 0 2_ | Cadida abbicans 0 0 0 0 0 3| E.coli 0 0 0 0 0 4 | Klebsiella pneumoniae 30 12 12 20 0 5 | Pseudomonas aeruginosa 30 10 0 20 0 6 | Salmonella typhi 0 0 0 0 0 7 | Shigella flexneri 15 0 10 13 0 8 | Staphylococcus aureus 0 0 0 0 0 9 | Vibrio cholera 30 20 20 30 0
Từ kết quả thử khả năng khỏng vi sinh vật thấy được cỏc phõn đoạn dịch chiết lỏ cõy Ba chạc cú hoạt tinh khang 5 chung vi sinh vat: Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera, Bacillus subtilis, Shigella flexneri; cdc ching con lai sinh truộng, phat triển bỡnh thường Cụ thộ, chung vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa bi te chế bởi phõn đoạn dịch chiết cao cồn tổng số, phõn đoạn n-hexan và ethylacetate với đường kớnh vũng khỏng khuẩn lần lượt là: 30, 10, 20mm Hai chung Bacillus subtilis, Shigella flexneri bi ttc chộ bội 3 phan doan Con Klebsiella pneumoniae, Vibrio cholera bị khỏng bởi bốn phõn đoạn dịch chiết cao cồn tổng số, phõn
đoạn n-hexan, chloroform và ethylacetate với đường kớnh vũng khỏng khuẩn
lớn hơn so với Pseudomonas aeruginosa Qua kết quả ở bảng 3.2 chỳng tụi
thấy rằng, phõn đoạn cao cồn tổng số lỏ Ba chạc cú khả năng khỏng tốt nhất
đối với cả 5 chủng vi khuẩn Phõn đoạn ethylacetate cú hoạt tớnh khỏng tốt
Trang 4040
với phõn đoạn cao cồn tụng số) Đồng thời, phõn đoạn này ức chế tương đối mạnh với cỏc chủng cũn lại Như vậy, phần lớn cỏc phõn đoạn cao chiết từ lỏ
Ba chạc đều cú khả năng khỏng vi sinh vật (4 phõn đoạn) Nhưng hoạt tớnh khỏng vi sinh vật của mỗi phõn đoạn cú sự khỏc nhau rừ rệt Một số kết quả
khỏng khuõn được thờ hiện ở hỡnh 3.3
Vibrio cholera Bacillus subtilis
Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Hỡnh 3.3 Kột qua thir kha nang khang vi sinh vậtcủa cỏc phõn đoạn mẫu lỏ Ba chạc
(1: PD cao con; 2: PD n—hexan; 3: PP Chlorofom; 4: PD ethylacetate)
3.2.2 Mẫu lỏ cõy Ba đậu (Croton tiglium L.)