Nattokinase tu bacillus subtilis natto 5

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu chung 1.3 Mục tiêu cụ thể PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu nattokinase 2.1.1 Nguồn gốc đặc tính nattokinase 2.1.2 Cơ chế hoạt động nattokinase .5 2.1.3 Ứng dụng nattokinase 2.1.4 Nguồn gốc thu nhận nattokinase 2.2 Tình hình nghiên cứu nattokinase nước .9 2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước .9 2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 10 2.3 Giới thiệu Bacillus subtilis 11 2.3.1 Hệ thống phân loại 11 2.3.2 Sự phân bố tự nhiên Bacillus subtilis 11 2.3.3 Đặc điểm hình thái 12 2.3.4 Đặc điểm sinh học 12 2.3.5 Đặc điểm nuôi cấy 13 2.3.6 Bào tư .14 2.4 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis khả thu nhận enzyme .14 2.5 Giới thiệu chung quy trình thu nhận tạo chế phẩm nattokinase từ vi khuẩn Bacillus subtilis các yếu tố ảnh hưởng 16 2.5.1 Giới thiệu chung quy trình thu nhận tạo chế phẩm nattokinase .16 2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận nattokinase 16 PHẦN THỨ BA – VẬT LIỆU – NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 3.1 Vật liệu 19 3.1.1 Chủng giống .19 3.1.2 Môi trường 19 3.1.3 Chất mang 20 3.2 Nội dung nghiên cứu .20 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp nattokinase từ chủng Bacillus subtiilis natto 21 3.3.2 Phương pháp công nghệ 21 3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 22 3.3.4 Phương pháp thực phân tích 24 PHẦN THỨ TƯ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Lựa chọn mơi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp nattokinase vi khuẩn Bacillus subtilis Natto 30 4.2 Kết xác định điều kiện thu hồi enzyme nattokinase 31 4.2.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 kết tủa nattokinase cho chất lượng tốt 31 4.2.2 Xác định nồng độ aceton kết tủa nattokinase cho chất lượng tốt 32 4.2.3 Xác định hàm lượng aceton tồn dư enzyme nattokinase 33 4.3 Xác định điều kiện tạo chế phẩm nattokinase 34 4.3.1 Chế phẩm tạo từ cặn enzyme trộn với chất mang đem đông khô 34 4.3.2 Chế phẩm tạo từ cặn enzyme đem đông khô trộn với chất mang 35 4.4 Quy trình cơng nghệ thu chế phẩm enzyme nattokianse 36 PHẦN V –KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Đề nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm nattokinase Bảng 2.2 Một số đặc điểm Bacillus subtilis 13 Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ muối bổ sung để kết tủa enzyme tới khả làm tan huyết khối nattokinase 30 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ aceton đến khả làm tan huyết chế phẩm enzyme nattokinase 31 Bảng 4.3 Ảnh hưởng loại, tỉ lệ chất mang làm đông khô sau tới khả làm tan huyết chế phẩm enzyme nattokinase 33 Bảng 4.4 Ảnh hưởng tỉ lệ bột enzyme đông khô với các loại chất mang khác tới khả làm tan huyết chế phẩm enzyme nattokinase 34 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Mô cấu trúc không gian nattokinase Hình 2.2 Các tác dụng sinh lý nattokinase fibrin Nattokinase làm tan fibrin trực tiếp Hình 3.1 Quy trình ni cấy thu hồi tạo chế phẩm nattokinase 22 Hình 2.1 Đường chuẩn plasmin (Sigma) 28 Hình 4.1 Khả sinh nattokinase Bacillus subtilis natto số môi trường khác 29 Hình 4.2 Quy trình cơng nghệ thu hồi nattokinase từ Bacillus subtilis natto 36 PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nattokinase enzyme có sản phẩm natto Nhật Bản Nattokinase protease chuỗi đơn chứa 275 amino acid Hyroyuki Sumi phát thấy khả làm tan huyết khối vào năm 1980 Theo Tổ chức Y tế giới (WHO), hàng năm có khoảng 17 triệu người chết các bệnh tim mạch (nhồi máu tim, đột quỵ), mà nguyên nhân hậu chứng huyết khối Theo ước tính thị trường tồn cầu các thuốc làm tan huyết khối gần 14 tỉ USD (Wang et al., 2009) Các loại thuốc làm tan huyết khối alteplase, streptokinase, urokinase… có hiệu lực tức sau tiêm vào tĩnh mạch Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học các loại thuốc tồn không lâu sau tiêm, giá đắt, đồng thời có nguy biến chứng gây xuất huyết Trong nattokinase coi thực phẩm chức hỗ trợ làm tan huyết khối sở hữu nhiều ưu điểm an tồn, chi phí thấp, dễ sư dụng (Agrebi et al., 2009) Nattokinase không làm giảm hàm lượng fibrin trực tiếp mà thúc đẩy các tế bào để phát triển chất hoạt hóa plasminogen để phân hủy fibrin Hoạt tính làm tan huyết khối nattokinase tương đối mạnh kéo dài, làm giảm chứng cao huyết áp, phân giải protein dạng amyloid liên quan đến bệnh alzhemer, bệnh bò điên Tăng cường hoạt hóa plasminogen làm bất hoạt chất ức chế hoạt hóa plasminogen (Sumi et al.,1990) Chính tác dụng dược lý to lớn nattokinase mà ngày nay, việc nghiên cứu thu nhận enzyme từ các nguồn khác từ vi sinh vật quan tâm Một số chủng vi sinh vật có khả sinh enzyme nattokinase kể đến Bacillus spp Bacillus có mặt khắp mọi nơi tự nhiên, Đây loại vi khuẩn Gram dương, hiếu khí có cấu trúc bề mặt khá phức tạp, có đặc điểm kết dính, có khả chống chịu điều kiện khắc nghiệt cao Một số chủng Bacillus phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống có khả sinh enzyme làm tan huyết khối cao kể đến như: Bacillus subtilis LSSE-22 từ Bắc Kinh, Trung Quốc, Bacillus sp CK từ Chungkook- Jang Bacillus sp DJ-4 từ Doe-Jang Hàn Quốc hay B.natto phân lập từ natto, Nhật Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam nghiên cứu thành cơng điều kiện ban đầu thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis natto là: pH 7,5, nhiệt độ 35 oC, tỉ lệ giống 5%, độ thông khí 25% Ở thời điểm hoạt tính enzyme cao theo phương pháp Astrup Mullertz (1952) hoạt tính protease đạt 2700 U/ml Tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam tuyển chọn xác định chủng Bacillus subtilis natto có khả sinh enzyme nattokinase Tuy nhiên, để xác định mơi trường ni cấy có khả sinh nhiều enzyme, điều kiện thu hồi tối đa lượng enzyme nattokinase ứng dụng vào làm chế phẩm phục vụ cho người lại thách thức không nhỏ các nhà nghiên cứu Chế độ lên men, điều kiện thu nhận enzyme hay cách thức tạo chế phẩm cơng đoạn có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme Vì đề tài “Nghiên cứu điều kiện thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5” quan tâm nghiên cứu 1.2 Mục tiêu chung Nghiên cứu điều kiện thích hợp để thu hồi tạo chế phẩm nattokinse từ Bacillus subtilis natto áp dụng cho sản xuất thực phẩm chức 1.3 Mục tiêu cụ thể - Xác định môi trường nuôi cấy để thu nhận nattokinase từ Bacillus subtilis natto cao nhất; - Xác định điều kiện thu hồi nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5; - Xác định chất mang chế độ sấy để tạo chế phẩm nattokinase có khả làm tan huyết khối tốt PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu nattokinase Nattokinase enzyme làm tan huyết khối tìm thấy loại đậu tương lên men Natto - ăn truyền thống người Nhật năm 1980 Nattokinase có tác dụng làm tan cục máu đơng vốn nguy gây tắc mạch máu dẫn đến tai biến, đột quỵ Enzyme làm giảm nguy gây tắc mạch máu dẫn đến tai biến, đột quỵ (Peng et al., 2005) Hiện nay, tỉ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch các cục máu đông chứng nhồi máu tim hay nhồi máu não tăng nhanh Việt Nam giới Vì vậy, nattokinase quan tâm nghiên cứu sản xuất sư dụng rộng rãi để phòng ngừa bệnh nghẽn động mạch các cục máu đơng 2.1.1 Nguồn gốc đặc tính nattokinase Nattokianse phát vào năm 1980 tiến sĩ Hiroyuki Sumi, nhà nghiên cứu Đại học Chicago sau thư nghiệm 173 loại thực phẩm tự nhiên các tác nhân tiêu sợi huyết đặc hiệu, ơng tìm kiếm tác nhân tự nhiên mà hiệu hòa tan huyết khối tim mạch máu gây bệnh nhồi máu tim hay tắc mạch máu (Deepak ,2008) Nattokinase phát natto, dạng thực phẩm mát lên men sư dụng Nhật Bản 1000 năm Natto ăn truyền thống người Nhật Bản làm từ đậu tương Để chuẩn bị cho đậu tương nấu chín sau tác động các loại vi khuẩn Bacillus subtilis natto lên men (Fujita et al., 1995) Trong các phương pháp truyền thống, người ta lên men đậu tương từ vi khuẩn rơm rạ Trong quá trình sản xuất đại, các chủng vi khuẩn nuôi cấy đậu tương mà việc sư dụng rơm rạ không cần thiết, xuất loại bột mịn màu trắng vàng (Meruvu, 2011) Nattokinase loại enzyme coi phương thuốc hứa hẹn cho chữa bệnh huyết khối hoạt tính tiêu sợi huyết mạnh Nattokinase sư dụng cho các bệnh tim mạch bao gồm bệnh tim, cao huyết áp, đột quỵ, đau ngực (đau thắt ngực), huyết khối tĩnh mạch sâu, xơ cứng động mạch, bênh trĩ, giãn tĩnh mạch, tuần hồn kém, bệnh động mạch ngoại biên Nó sư dụng để giảm đau, đau xơ cơ, hội chứng mệt mỏi mãn tính, viêm màng con, u xơ tư cung, co thắt cơ, vô sinh, ung thư bệnh tê phù thiếu vitamin B1 (Wang, 2006) Hình 2.1 Mơ cấu trúc khơng gian nattokinase Nattokinase (EC 3.4.21.62) serine protease gồm 275 acid amin, hoạt động pH từ 7-10, nhiệt độ từ 30-70 °C, có trọng lương phân tư từ 27,7 – 44 kDa, điểm đẳng điện (pI) 8,0 cấu trúc tương subtilisin Cơ chế hoạt động Nattokinase trực tiếp cắt fibrin huyết khối gián tiếp cách hoạt động sản xuất urokinase plasmin mô (Meruvu, 2011) Nattokinase enzyme tiêu sợi huyết, có nghĩa phá vỡ fibrin, protein khơng hòa tan màu trắng sản xuất các chuyển đổi fibrinogen (một protein huyết tương máu đơng) thrombin (một enzyme đơng máu) Nattokinase có tương đồng cao với các subilisin trình tự gen 16rDNS cho thấy 99,5% 99,3% tương đồng với subtilisin enzyme tương ứng Nattokinase làm giảm cục máu đông fibrin trực tiếp gián tiếp (Trần Văn Lài, 1996) Bảng 2.1 mô tả đặc điểm natttokinase Bảng 2.1 Đặc điểm nattokinase Tên protein Tên hệ gen Vi sinh vật Phân loại Giống Đặc điểm nattokinase Tên đề xuất: Subtilisin NAT, EC = 3.4.21.62 Tên thay thế: Nattokinase, cardiokinase aprN Bacillus subtilis subsp.natto 86092 Bacteria> Fimicutes> Bacillales> Bacillaceae> Bacillus Cấu trúc protein Trình tự 275 AA (Amino acid) Trạng thái trình tự Hồn thành Quá trình hình thành Các trình tự hiển thị quá trình hình thành từ trình tự tự nhiên Sự tồn protein Bằng chứng cấp đội protein Chú thích chung Chức Subtilisin protease ngoại bào, xúc tác cho quá trình thủy phân protein peptide amid, Subtilisin NAT có hoạt tính tiêu sợi huyết Hoạt động xúc tác Thủy phân protein với nồng độ đặc hiệu rộng với peptide lượng dư thủy phân peptide amid Đơn vị cấu trúc Monomer Vị trí tế bào Huyết khối Trình tự tương đồng Thuộc nhóm S8 peptidase Tình chất vật lý K=0,48mM cho chuỗi Suc-Ala-Pro-Phe-pNA (Kim et al.,1996) Kết nghiên cứu động học nattokinase, cho hoạt động làm giảm fibrin mạnh gấp lần plasmin phân giải liên kết fibrin Nattokinase làm giảm fibrin gián tiếp ảnh hưởng đến hoạt động hoạt hóa plasminogen Các tên khác nattokinase BSP, Natto extract, nattokinasam, NK, lên men đậu nành, đậu nành natto subtilisin NAT 2.1.2 Cơ chế hoạt động nattokinase Nattokinase có tác dụng phân giải sợi fibrin Do đó, việc ngăn chặn ngưng kết các tiểu cầu, làm tiêu hủy sợi frbrin, giúp làm tan các cục máu đơng Vì chức nattokinase làm tiêu sợi fibrin Khi fibrin bị phân hủy, thời gian đông máu bị chậm Nattokinase tìm thấy các mối gắn sợi fibrin chất plasmin trực tiếp Huyết khối tượng máu đông thành động mạch hay các tĩnh mạch nằm sâu bên thể gây các tượng như: nhồi máu tim, đột quỵ…và nguy hiểm dẫn đến tư vong đột ngột Sự hình thành huyết khối liên quan đến tổn thương lớn lớp tế bào nội mơ, kết dính – gần tiểu cầu hoạt hóa thrombin Ngồi thành phần tụ huyết khối phụ thuộc vào số yếu tố khác mức độ tổn thương mạch máu, áp lực bao sức, diện các thuốc kháng huyết khối (Sumi, 1987) Hình 2.2 Các tác dụng sinh lý nattokinase fibrin Nattokinase làm tan fibrin trực tiếp Tắc nghẽn mạch (thrombosis) tình trạng ứ đọng mạch máu với cục máu đơng, dẫn tới nhồi máu tim cấp tính đột quỵ thiếu máu cục bộ, hai dẫn tới tư vong Khác với việc can thiệp phẫu thuật để lấy thông tắc nghẽn tạo mạch phụ để cấp máu mới, có cách xư lý uống thuốc thông tắc để làm tan cục máu đông, streptokinase lựa chọn Ngoài nattokinase quan tâm nghiên cứu sản xuất sư dụng rộng rãi để phòng ngừa bệnh nghẽn động mạch các cục máu đơng (Sumi, 1987) Xác định hoạt tính nattokinase chế phẩm thu cách lấy 0,5ml dịch cho vào 3g huyết khối ủ 370C loại bỏ dịch Cân lại trọng lượng tiết đơng lại 3.3.4.3 Phương pháp kết tủa nattokinase bằng muối sulphat amon Nguyên lý: Ở nồng độ muối cao, protein giảm tính hòa tan, loại protein kết tủa nồng độ muối định Vì vậy, tượng tủa muối dùng để phân đoạn protein (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Dịch lên men thu hồi vào ống fancol 15ml ly tâm 6000 vòng/phút phút để loại bỏ sinh khối Sau dịch bổ sung muối (NH 4)2SO4 nồng độ : 5% , 10%, 15% … 80% nhiệt độ 40C 24 Ly tâm 8000 vòng 30 phút, thu enzyme kết tủa, loại bỏ dịch Bổ sung 2ml đệm photphat đem ủ nhiệt độ - 0C Xác định khả làm tan huyết khối enzyme 3g tiết 0,5 ml dịch Chọn nồng độ phần trăm muối cho hoạt tính enzyme lại cao 3.3.4.4 Phương pháp chạy côt gel loại bỏ muối thu nhận enzyme Nguyên lý: Sau thêm dịch vào cột gel, phân tư có kích thước lớn cột chảy nhanh trước Phân tư có kích thước trung bình, vào bên hạt rời khỏi cột vị trí giữa; phân tư nhỏ phải qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sau hoắc mắc lại cột (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Các bước bao gồm: - Chuẩn bị cột thủy tinh , nhồi thủy tinh vào cột nén chặt xuống đáy cột - Giữ thẳng cột giá, đổ đầy đệm photphat cho thủy tinh lắng xuống đáy - Mở van ½ đệm cột bổ sung gel từ từ cho gel lắng xuống khoảng 40cm đợi gel đệm 26 - Bổ sung 2ml mẫu vào cột, đổ đệm photphat đến protein chạy xuống đáy thu dịch vào ống eppendoff - Thư hoạt tính làm tan huyết khối enzyme 3.3.4.5 Phương pháp kết tủa nattokinase bằng aceton - Aceton cho vào ống fancol 50ml làm lạnh nhiệt độ -200C 24h - Chuyển dịch lên men ly tâm 12000 vòng 10 phút loại bỏ sinh khối vào ống eppendoff thích hợp - Thêm lần thể tích aceton vào dịch lên men - Vortex đến xuất cặn, ủ nhiệt độ -200C 60 phút - Ly tâm 12000 vòng 10 phút - Cẩn thận loại bỏ dịch Tránh chạm tới phần cặn protein - Mở lắp ống eppendoff cho aceton bay hết khoảng 30-45 phút 3.3.4.6 Xác định hàm lượng aceton có enzyme nattokinase Cân bình tam giác thể tích 50ml chứa sẵn 25 ml nước cất, thêm vào 1,5 ml mẫu, đẩy nhanh nút vào cân lại Chuyển tồn dung dịch cân vào bình định mức 500ml thêm nước đến vạch định mức, lắc Lấy 10ml dung dịch từ bình định mức vào bình tam giác dung tích 250ml chứa sẵn 20ml dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1N, thêm vào 50ml dung dịch iot (I2) 0,1N đậy nút lắc để tĩnh tối 15 phút Sau vừa lắc vừa thêm nhanh vào bình 20ml dung dịch acid sulfuric 1N (H2SO4|) Chuẩn độ lượng iot dư tự bình dung dịch natri thiosunfat (Na 2SO3.5H2O) đến lúc dung dịch có màu vàng rơm Thêm 5ml dung dịch tinh bột tan vào chuẩn độ tiếp đên lúc dung dịch màu xanh (V) Đồng thời tiến hành chuẩn độ mẫu trắng điều kiện mẫu thư với tất các loại thuốc thư khơng chưa mẫu thư (Vo) Kết tính theo công thức: X= X : Hàm lượng aceton (%) V : Thể tích Na2SO3.5H2O để chuẩn độ iot có mẫu thư 27 V0: Thể tích dung dịch Na2SO3.5H2O dùng để chuẩn độ lượng iot mẫu trắng 0,000968 lượng aceton tương ứng với 1ml dung dịch iot 0,1N m : Lượng mẫu thư 3.3.4.7 Phương pháp định tinh, định lượng protease và nattokinase Protease tổng bao gồm nattokinase các protease khác, hoạt tính protease tổng cao hoạt tính nattokinase có khả cao Do hóa chất phân tích nattokinase đắt tiền, nên số thí nghiệm gián tiếp định tính định lượng protease (1) Định tính protease theo phương pháp đục lỗ thạch môi trường casein 1%, agar 2% Cho 0,1 ml các dịch chiết enzyme vào các lỗ, ủ 37oC thời gian 20 giờ, đo đường kính vòng phân giải casein; (2) Định lượng hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến; (3) Định tính nattokinase dựa vào khả hòa tan huyết khối lợn Phương pháp cho thấy kết trực tiếp khả làm tan cục huyết khối: Cho ml dịch chiết enzyme (ở các độ pha loãng lần) vào g huyết lợn đông, ủ 37 oC Cân trọng lượng cục huyết đông lại sau ủ So sánh khả hòa tan cục huyết khối các mẫu lên men (Lê Thị Bích Phượng, 2012.); (4) Định tính nattokinase theo phương pháp đĩa fibrin Astrup Mullertz (1952), sư dụng plasmin (yếu tố thủy phân fibrin có sẵn thể người) làm chuẩn (Astrup et Mullertz, 1952) Hình 2.1 Đường chuẩn plasmin (Sigma) 28 Đường chuẩn có phương trình: y= 22,61x + 2,762 Trong đó, y diện tích vòng phản ứng (mm2) x hoạt độ enzyme (mU) 29 PHẦN THỨ TƯ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Lựa chọn mơi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp nattokinase vi khuẩn Bacillus subtilis natto Chất dinh dưỡng bao gồm các nguồn cacbon, nguồn nitơ các muối khoáng vitamin nguyên liệu cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp các chất, các enzyme tạo các thành phần tế bào phục vụ cho các quá trình trao đổi lượng vi sinh vật Do vậy, việc tìm mơi trường thích hợp với nồng độ các chất quan trọng tìm tỷ lệ cacbon/nitơ để quá trình lên men thu lượng enzyme nattokinase cao mục đích đề tài Trong đề tài này, 10 môi trường lựa chọn để thư nghiệm quá trình sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis natto Kết thể hình 4.1 Lượng khối huyết tan (g /ml) MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 Mơi trường Hình 4.1 Khả sinh nattokinase B.subtilis natto số mơi trường khác Kết hình 4.1 cho thấy, thành phần mơi trường có tác động lớn đến khả làm tan huyết khối enzyme nattokinase thu từ chủng Bacillus subtilis natto Chúng có khả tổng hợp enzyme tất các mơi trường thí nghiệm, nhiên tổng hợp nattokinase cho hoạt tính cao mơi trường MT2 Kết cho thấy ml dịch enzyme nattoinase làm tan 30 7,2 g huyết khối Do vậy, môi trường MT2 lựa chọn môi trường dùng để nuôi Bacillus subtilis natto để thu nhận nattokinase 4.2 Kết quả xác định điều kiện thu hồi enzyme nattokinase Trong phần phương pháp trình bày cách thu nhận cặn enzyme thông qua việc sư dụng muối dùng aceton Kết thể chất lượng cặn enzyme thông qua khả làm tan huyết khối 4.2.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 kết tủa nattokinase cho chất lượng tốt Việc tủa muối để tách riêng các protein khỏi hỗn hợp chúng Để đánh giá kết chọn nồng độ muối thích hợp để đem lại hoạt tính cao cho nattokinase, dịch bổ sung nồng độ muối (NH 4)2SO4: 5%, 10%, 15% 80% votex, sau đem ly tâm 8000 vòng 30 phút loại bỏ phần dịch thu cặn bổ sung thêm 2ml đệm photphat ta có bảng số liệu sau, hoạt tính thư 3g huyết khối / 0,5 ml dịch ủ 37oC Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ muối bổ sung để kết tủa enzyme tới khả làm tan huyết khối nattokinase Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 CT11 CT12 CT13 CT14 CT15 CT16 Dịch enzyme muối Dịch enzyme + 5% muối Dịch enzyme + 10% muối Dịch enzyme + 15% muối Dịch enzyme + 20% muối Dịch enzyme + 25% muối Dịch enzyme + 30% muối Dịch enzyme + 35% muối Dịch enzyme + 40% muối Dịch enzyme + 45% muối Dịch enzyme + 50% muối Dịch enzyme + 55% muối Dịch enzyme + 60% muối Dịch enzyme + 65% muối Dịch enzyme + 70% muối Dịch enzyme + 75% muối Dịch enzyme + 80% muối Lượng huyết khối còn lại (%) 89 92 86 84 77 83 78 78 75 63 70 73 80 79 83 80 31 Đối chứng Tiết tự tan 92 Qua bảng kết trên, ta nhận thấy, sư dụng nồng độ 50% (NH4)2SO4 để kết tủa thu enzyme nattokinase có hoạt tính cao Lượng huyết khối lại chứng tỏ enzyme nattokinase hoạt động mạnh Công thức 10, tỉ lệ huyết khối lại sau nhiệt độ 37 oC 63% Ở mức nồng độ muối thấp 50% enzyme thu có hoạt tính khơng cao, cụ thể nồng độ 10% muối tủa emzym có hoạt tính khơng cao lượng huyết lại 92% với lượng huyết khối để tự tan sau 37 oC, trường hợp enzyme khơng có tác dụng việc làm tan huyết Ở nồng độ muối cao 50% hoạt tính enzyme không cho kết tốt nhất, nồng độ muối cao enzyme bị biến tính nên hoạt tính không giữ mức ổn định 4.2.2 Xác định nồng độ aceton kết tủa nattokinase cho chất lượng tốt Dịch lên men sau thu hồi có hoạt tính đem cho vào ống eppendoff 2ml đem ly tâm 12000 vòng 10 phút loại bỏ dịch thu lại phần cặn lại bổ sung aceton theo các cơng thức bố trí phần 3.2.2 Kết thu thể bảng 4.2 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ aceton đến khả làm tan huyết chế phẩm enzyme nattokinase Dịch enzyme(g) Aceton (ml) Tỉ lệ huyết khối lại (%) CT17 CT18 CT19 CT20 CT21 10 67 15 27 41 51 Đối chứng 81 Qua bảng số liệu ta thấy CT18 phần trăm khối lượng tiết lại thấp (15%) Phương pháp tủa aceton phương pháp thu nhận enzyme đem lại kết cao, giúp giữ lại hoạt tính enzyme tốt Khối lượng huyết khối sau bổ sung enzyme tủa aceton 32 mức thấp, aceton dung mơi có khả hòa tan các hợp chất hữu vô khác tốt Ở các tỉ lệ aceton khác thể khả nó, CT17 lượng aceton so với khối lượng cặn nên không đủ để tủa protein, CT19, CT20, CT21 phần trăm khối lượng huyết khối lại tăng dần theo tỉ lệ aceton bổ sung, lượng aceton nhiều hoạt tính enzyme bị lỗng Như vậy, tỉ lệ dịch enzyme/ aceton thích hợp để tủa enzyme nattokinase 1:4 Qua kết hai phương pháp, ta kết luận rằng, tủa aceton giữ hoạt tính cao so với tủa muối, thể qua phần trăm khối lượng lại huyết khối Để đáp ứng nhu cầu kinh tế chất lượng sản phẩm, aceton dung môi cho giá thành rẻ so với muối (NH4)2SO4 lại cho hoạt tính mức ổn định Vì tiến hành thu hồi enzyme nattokinase phương pháp tủa aceton chọn phương pháp 4.2.3 Xác định hàm lượng aceton tồn dư enzyme nattokinase Sau tủa thu nattokinase, aceton đuổi cách để bay 30 phút nhiên đuổi hồn tồn, lượng aceton dư lại gây nên mùi ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme, việc xác định hàm lượng aeton tồn dư cần thiết Tiến hành thí nghiệm xác định hàm lượng aceton tồn dư enzyme nattokinase thu từ CT18 theo mục 3.3.3.6 Kết thu X = = 0.0061333% Trong X : Hàm lượng aceton (%) V : Thể tích Na2SO3.5H2O để chuẩn độ iot có mẫu thư V0: Thể tích dung dịch Na2SO3.5H2O dùng để chuẩn độ lượng iot mẫu trắng 0,000968 lượng aceton tương ứng với 1ml dung dịch iot 0,1N m : Lượng mẫu thư Qua kết ta nhận thấy rằng, lượng aceton tồn dư lại 33 enzyme thấp 0,0061333% hàm lượng không gây ảnh hưởng đến chất lượng hoạt tính mùi enzyme, dễ dàng bay hết khoảng thời gian ngắn sau Vì vậy, dùng phương pháp tủa aceton thích hợp 4.3 Xác định điều kiện tạo chế phẩm nattokinase Để thu nhận chế phẩm sinh học nattokianse từ Bacillus subtilis ta sư dụng phương pháp đông khô, để đánh giá khả phương pháp đơng khơ có giữ hoạt tính enzyme mức ổn định thích hợp cho việc trộn chế phẩm không ta đánh giá qua cách thức: Cách 1: Cặn enzyme trộn với chất mang đem đơng khơ, sau thư hoạt tính với huyết khối Cách 2: Cặn enzyme đơng khơ, sau trộn với chất mang Thư hoạt tính với huyết khối 4.3.1 Chế phẩm tạo từ cặn enzyme trộn với chất mang đem đông khô Dịch lên men sau thu hồi cách tủa aceton với tỉ lệ 1:4 đem trộn với chất mang bột đậu tương, bột sắn dây theo các tỉ lệ khác Kết chế phẩm enzyme đánh giá thông qua khả làm tan huyết khối Kết thể bảng 4.3 Bảng 4.3 Ảnh hưởng loại, tỉ lệ chất mang làm đông khô sau tới khả làm tan huyết chế phẩm enzyme nattokinase Công thức CT22 CT23 CT24 CT25 Đối chứng Bột đậu tương 1ml cặn enzyme : gam bột đậu tương 2ml dịch enzyme : gam bột đậu tương 1ml dịch enzyme : gam bột sắn dây 2ml dịch enzyme : gam bột sắn dây g huyết để tự tan Huyết khối còn lại (%) 56 28 43 92 Thông qua kết thể bảng 4.3 thấy việc tạo chế phẩm cách trộn enzyme với bột sắn dây (CT24, CT25) cho hiệu tan huyết tốt chế phẩm enzyme trộn với bột đậu tương (CT22, CT23) Việc giữ lại hoạt tính sau đơng khơ chất mang tương đối tốt tỉ lệ 1:2 có 34 thể đánh giá qua phần trăm khối lượng huyết khối lại Ở tỉ lệ 1ml dịch các cơng thức lượng dịch khơng đủ để kết hợp với chất mang nên hoạt tính thấp phần trăm khối lượng tan mức xấp xỉ 40% Đặc biêt, CT25 sư dụng gam bột sắn dây trộn với 2ml dịch enzyme nattokinase cho hiệu tan huyết tốt, lượng huyết khối lại sau bổ sung chế phẩm qua nhiêt độ 37oC 8% 4.3.2 Chế phẩm tạo từ cặn enzyme đem đông khô trộn với chất mang Để thấy rõ khả giữ hoạt tính sau trộn với chất mang dịch lên men sau tủa muối aceton thu hồi đem đông khô nhiệt độ 37oC thu dạng sệt đem trộn với chất mang với tỉ lệ theo bố trí thí nghiệm phần 3.2.2 Kết thể bảng 4.4 Bảng 4.4 Ảnh hưởng tỉ lệ bột enzyme đông khô với các loại chất mang khác tới khả làm tan huyết chế phẩm enzyme nattokinase Công thức Bột đậu tương Tỉ lệ huyết khối còn lại (%) CT26 1gam bột enzyme: gam bột đậu tương 50 CT27 2gam bột enzyme: gam bột đậu tương 27 CT28 1gam bột enzyme: gam bột sắn dây 39 CT29 gam bột enzyme: gam bột sắn dây 10 Đối chứng g huyết để tự tan 94 Qua bảng 4.4 thấy sau dịch lên men sau đông khô đem trộn với chế phẩm giữ hoạt tính enzyme, CT29 cơng thức cho kết tốt Sau đông khô, hoạt tính enzyme khơng giữ mức ổn định.Bột sắn dây cho lại hiệu tốt khả nặng giữ lại hoạt tính enzyme Tóm lại, qua hai phương pháp ta thấy bột sắn dây chất mang phù hợp cho việc giữ lại hoạt tính enzyme cách tốt Chế phẩm enzyme nattokinase thu cách trộn dịch enzyme bột enzyme nattokinase với bột sắn dây theo các tỉ lệ 2ml dịch enzyme: gam bột sắn dây đem đông khô gam bột enzyme đông khô: gam bột sắn dây, cho tác dụng làm tan huyết khối chế phẩm tốt Vì dang bột 35 hay dạng dịch enzym không bị giảm hoạt tính nên tuỳ mục đích mà chọn cách tạo chế phẩm 4.4 Quy trình cơng nghệ thu chế phẩm enzyme nattokianse Chủng Bacillus subtilis natto lên men môi trường với thành phần gồm (g/l): Sữa đậu nành 10,0; Glucose 10,0; K 2HPO4 1,0; MgSO4 0,5; Agar 20,0; H2O 1000ml; pH 7-7,7 Sau đó, enzyme nattokinase thu hồi theo quy trình sau: Dịch enzyme nattokynase thô Kết tủa aceton Tỉ lệ dịch enzyme:aceton 1:4 Đuổi aceton Để bay 30 phút Cặn enzyme Kết hợp với bột sắn dây Tỉ lệ 2ml dịch enzyme:1 g bột sắn dây Đông khô Đông khô Kết hợp với bột sắn dây Tỉ lệ gam bột enzyme: gam bột sắn dây Chế phẩm nattokinase Chế phẩm nattokinase Hình 4.2 Quy trình cơng nghệ thu hồi enzyme nattokinase từ Bacillus subtilis natto 36 PHẦN V –KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau hồn thành thí nghiệm, phân tích, đánh giá kết xư lý số liệu, rút kết luận sau:  Môi trường lên men thích hợp chủng Bacillus subtilis Natto để tạo enzyme nattokinase xác định gồm các thành phần (g/l): Sữa đậu nành 10,0; Glucose 10,0; K2HPO4 1,0; MgSO4 0,5; Agar 20,0; H2O 1000ml; pH 7-7,7  Enzym nattokinase từ Bacillus subtilis natto thu hồi tốt tủa aceton tỉ lệ cặn enzym/aceton 1:4  Chất mang thích hợp để tạo chế phẩm nattokinase bột sắn dây Có thể trộn dịch enzym với bột sắn dây sau đem sấy đơng khơ theo tỉ lệ 2ml dịch enzym: gam bột sắn dây sấy đông khô để thu bột enzym nattokinase trộn với bột sắn dây theo tỉ lệ gam bột enzym đông khô: gam bột sắn dây để tạo chế phẩm nattokinase, chế phẩm thu theo hai cách cho hiệu làm tan huyết 5.2 Đề nghị Trong quá trình tiến hành đề tài, hạn chế thời gian điều kiện nghiên cứu.Vì vậy, chúng tơi đưa số đề nghị sau:  Nghiên cứu thêm ảnh hưởng điều kiện môi trường nhiệt độ, độ ẩm, thời gian đến việc bảo quản chế phẩm enzyme nattokinase từ Bacillus subtilis  Nghiên cứu tạo chế phẩm nattokinase từ Bacillus subtilis để hướng tới thực phẩm chức 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzyme NXB Đại học quốc gia thành phố HCM,2004 Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ Vi Sinh vật, tập NXB Đại học quốc gia thành phố HCM,2004 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phufngg Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty,1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập Lý Bích Thủy, Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Dao, 2006 Tinh xác định số tính chất enzyme thủy phân fidrin tách chiết từ lồi giun quế Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạch Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê thị Hương, 2012 Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase Tạp chí sinh học 99-104 Lý Thị Bích Thủy, Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Dao,2004 Tinh xác định số tinh chất enzyme thủy phân fibrin tách chiết từ loài giun quế Nghiên cứu Cơ Khọc học Sự sống định hướng Y Dược học, Hà Nội Lê Ngọc Tú, Lê Doãn Diên, Phạm Quốc Thắng, La Văn Chứ, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Lợi,1997 Hóa sinh học cơng nghiệp Vũ Hồng Diệp, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Quyền Đình Thi,2008 Nhân giống phân tích trình tự gen mã hóa SK từ chủng Streptococus pyogenes DT7 Tạp chí Cơng nghệ sinh học.6(4A):757-763 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 38 Astrup T.,Mullertz S., 1952 The frbrin plate method for estimating fibrinolytic activity Archives of biochemistry and biophysics 40(2): 346351 10.Bao Y., Chen J., Qian., Ni M., Wang P., 2004 Optimization of the technique of solid fermentation of nattokinase Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 21(6): 468-471 11.Chang YY., Liu JS., Lai SL.,Wu HS., Lan MY.,2008 Cerebellar hemorrhage provoked by combined use od nattokinase and aspirin in a patient with cerebral microbleeds Intern Med(5): 9-467 12.Chen PT., Chiang CJ.,Chao YP., 2007 Strategy to approach stable production of recombinant nattokianase in Bacillus subtilis Biotechnol.23(4):808-813 13.Chen PT., Chiang CJ.,Chao YP., 2006 Enhanced production of recombinanat nattokianase in Bacillus subtilis by the elimination of limiting factors Biotechlogy letters 28 (19): 1595-1600 14.Cong W., Ming D., Dongmei Z , Fandong K., Guoren Z., Yibing F., 2009 Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B12, J.Agric.Food Chem.57:9722-9729 15.Deepak V., Kalishwaralal K., Ramkumarpandian S., Babu SV., Senthilkumar SR., Sangiliyandi G., 2008 Optimization of media composition for nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology, Bioresour Technol, 99(17): 8170-8074 16.Fujita M., Hong K., Ito Y., Misawa S., Takeuchi N., Kariya K., Nishimuro S.,1995 Transport of nattokinase across the rat intertinal tract Biol Pharm Bull., 18:1194-1196 17.Futie BC., 2008 Mechanisms of thrombus formation N Engl J Med, 359: 938-949 18.Hymowitz, Theodore 1995 Evaluation of Wild Perennial Glycine Species and CrossesFor Resistance.to Phakopsora Trong Sinclair, J.B.Hartman, G.L Proceedings of the Soybean Rust Workshop 33-37 19.Martin M., Kouhei M, 2002 Natto and it active ingredient nattokinase Altenative and complementary therapies, 157-164 39 20.Meruvu H., Vangalpati M., 2011 Nattokinase: A review on Fibrinolytic Enzyme International Journal of chemical, 2(1): 61-66 21.Kim W, Choi K, Kim Y, Park H, Choi J, Lee Y, 1996 Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp Strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang Appl.Environ.Microbiol.62 22.Kim SH., Choi Sh., 2000 Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp Strain Dj-4 screened from Doen-Jang Biotechnol Biochem, 64:1722-1725 23.Ku TW., Tsai RL., Pan TM., 2009 A simple and cost-saving approach to optimize the production od subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis natto Jagric Food Chem 57(1): 6-292 24.Lyden P, 2005 Thrombotylic Therapy for Acute Stroke Second Edition Humana press Inc 25.Lee J., Park S., Choi Won A., Lee KuyngHee., Jeong YK., Kong In-Soo., 1999, Production of a fibrinolytic enzyme in bioreactor culure by Bacillus subtilis BK-17 J.Microbiol Biotechnol.9(4): 443-449 26.Liu JG., Xinh JM., Chang TS.,2004 Optimization of medium composition for the production of nattokinase by Bacillus natto NLSSE Annual AICHE meeting, 1-11 27.Peng Y, Huang Q, Zhang R H, Zhang Y Z, 2003 Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquejaciens DC-4 screened from douche, a traditional Chinese soybean food Comp Biochem Physiol., 134: 45-52 28 Wu FC., Chang CW.,Shil IL.,2013 Optimization of the production and characeterization of milk clotting enzymes by Bacillus subtilis natto Sringer plus,2(33):1-10 40 ... thu nhận nattokinase từ Bacillus subtilis natto cao nhất; - Xác định điều kiện thu hồi nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5; - Xác định chất mang chế độ sấy để tạo chế phẩm nattokinase. .. nghệ thu hồi nattokinase từ Bacillus subtilis natto 36 PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nattokinase enzyme có sản phẩm natto Nhật Bản Nattokinase protease chuỗi đơn chứa 2 75 amino acid... tạo chế phẩm nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5 quan tâm nghiên cứu 1.2 Mục tiêu chung Nghiên cứu điều kiện thích hợp để thu hồi tạo chế phẩm nattokinse từ Bacillus subtilis natto áp dụng