Journal of Chromatography B, 766, pp.289- 294 F Zeeshan, (2008), "Simultaneous Determination of Loratadine and Pseudoephedrine Using High Performance Liquid Chromatography Method", 22^^ MSPPscientific meeting 2008, Oral 48 U.S Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evalution and Research (2001), Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation Chiết tách Enzym Protease ngoại bào từ Bacillus subtìlìs natto Đàm Thanh Xuân, Đinh Thị Thanh Thảo, Đỉnh Thu Hương, Lê Ngọc Khánh TrườngĐại họcDượcHàNội SUMMARY Study on extracellular protease enzyme extraction from the cultured medium o f Bacillus subtilis natto Results show that 60% ammonium sulfate saturation concentration is the optimal concentration to precipitate enzyme with highest activity o f protease (172.54 nKat) and also prevent the present o f other enzymes in the B subtilis natto culture medium (amylase and cellulose) Electrophoresis results o f some segments obtained after purified with column chromatography and gel filtration through Sephadex G - 75 showed that the highest protease activity segment might contain nottokinase enzyme with a molecular weight in the range o f 27 - 28 KDa and also capable o f fibrinolytic action Từ khóa: Bacillus subtilis natto, enzym ngoại bào, proteose Đặt vấn đề Bệnh tim mạch trở thành vấn để thời gia tăng bệnh cộng đồng với phát triển xã hội Hiện nay, thuốc tiêu huyết khối thị trường Urokinase, Streptokinase, Alteplase, sử dụng chủ yếu cấp cứu tai biến, chi phí đắt tiền gây nhiều tác dụng phụ Nattokinase enzym có khả tiêu huyết khối lên men nhờ vi khuẩn BacillussubtiHsnatto [2] Nhiểu nghiên cứu chứng minh khả làm giảm lượng fibrinogen huyết tương Nattokinase Nghiên cứu nhằm mục tiêu tách chiết tinh chế enzym protease từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto, xác định tính chất enzym thu trọng lượng phân tử, hoạt tính protease, khả tiêu fibrin để hướng tới việc chủ động tạo nguồn nguyên liệu enzym nattokinase phương pháp lên men sinh học Nguyên liệu, thiết bị phương pháp nghiên cúu Nguyên liệu Chủng Bacillus subtiiis natto - nguồn gốc Nhật Bản nuôi cấy íưu giữ Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Pepton, cao thịt Merck; Sephadex G75 Sigma; casein, tinh bột, thạch, CMC số hóa chất cẩn thiết khác đạt tiêu chuẩn phân tích Enzym nattokinase Đài Loan (20.000 FU/g) Thiết bị Tủ cấy, tủ ấm nuôi vi sinh vật, máy lắc ổn nhiệt, máy ly tâm Phương pháp nghiên cứu Phương pháp lên men Nuôi cấy Bacillus subtilis natto bình tam giác dung tích 250 ml với 150 ml môi trường thạch - cao thịt - pepton (NB) chứa 0,5% cao thịt, 1% peptone 0,5% NaCI, ủ máy lắc 100 vòng/ phút nhiệt độ 37“C Phương pháp tách chiết tinh chếenzym Sau 24 nuôi cấy, đem ly tâm dịch lên men 4.000 v/ph thu dịch Enzym chiết từ 100 ml dịch dung môi hữu (aceton ethanol 96%) - 5“C 24 với tỉ lệ dung môi/dịch 3/1 Enzym chiết amoni sulfat bão hòa để lạnh đến 4“C nồng độ khác vòng Tủa enzym hòa tan ml dung dịch đệm phosphate pH 7,6 phân tích định tính enzym amylase, protease cellulase [5] - [9] Tinh enzym phương pháp sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G75 [4], [7] Gel Sephadex G -75 ngâm dung dịch đệm 24 cho trương nở hoàn toàn, sau đưa vào cột từ từ với dung dịch đệm cột gel cao khoảng 15 cm (tránh tạo bọt khí phân lớp) Cho dung dịch đệm chảy qua cột với tốc độ khoảng ml/giờ vài để ổn định cột Mẫu cẩn tinh chế đưa vào cột, để yên 30 phút để mẫu ngấm hết xuống Cho dung dịch đệm chảy qua cột thu phân đoạn ml Xác định trọng lượng phân tử protein enzym phương pháp điện di với marker Invitrogen (Ấn Độ) Phươngpháp đánh giá hoạt tính cácenzym thu Định tính enzym amylase, protease cellulase theo phương pháp giếng thạch môi trường chứa 2% agar tinh bột casein Na CMC 1% Nhỏ 0,05 ml dịch chiết enzym vào giếng thạch (0 = mm), ủ 37°c thời gian 24 giờ, xác định đường kính vòng phân giải chất tương ứng Xác định hoạt tính tiêu fibrin enzym protease dựa vào khả tiêu fibrin máu lợn môi trường thạch chứa fibrin Định lượng protein toàn phẩn xác định hoạt tính protease theo phương pháp Biuret phương pháp Anson cải tiến [1] Kết nghiên cứu Lựa chọn dung môi chiết enzym Tiến hành kết tủa enzym aceton, ethanol 96% amoni Sulfat bão hòa 60% [3], [4], [6] Kết thử hoạt tính phân giải casein tinh bột (biểu thị giá trị đường kính trung bình vòng phân giải chất tướng ứng) thời gian tiêu fibrin tủa enzym thu chiết dung môi khác trình bày bảng Kết từ bảng cho thấy tủa enzym chiết dung môi khác đểu có hoạt tính protease (thể khả phân giải casein) Giá trị đường kính vòng phân giải casein chiết dung môi giảm theo thứtự: amoni Sulfat 60% > aceton > ethanol 96% cho thấy sử dụng amoni Sulfat bão hòa thu nhiều protease Mặt khác việc xác định khả phân giải tinh bột tủa enzym thể có mặt số protein tạp khác Thời gian tiêu fibrin tủa enzym từamoni Sulfat 60% bão hòa ngắn (100 phút) Như sơ kết luận hoạt độ protease thời gian tiêu fibrin tủa enzym chiết amoni Sulfat bão hòa cao so với chiết hai dung môi hữu Bỏng 1: Kết thửhoợt tính phân giâi casein CÙQenzym protease ngoại bào tủa thu chiâ băng dung moi khóc nhũu Dung môi chiết Đường kính vòng phân giải (mm) Thời gian tiêu fibrin (phút) Casein Tinh bột Amoni Sulfat 60% bão hòa 23,7 12,8 100 Aceton 20,3 11,0 117 Ethanol 96% 18,3 8,1 135 Lựa chọn nồng độ amoni sulfat bào hòa dùng chiết enzym từ dịch lên men Bacillus subtilis natto Sử dụng nổng độ amoni sulfat bão hòa từ 20 80% để chiết protein enzym từ dịch lên men Bacillus subtilis natto nhằm lựa chọn nổng độ thích hợp cho thu nhiều protease giảm bớt protein tạp Hòa tan tủa thu ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6 Định tính sơ định lượng enzym protease, amylase cellulase nồng độ protein tổng hoạt độ protease tủa thu Kết thể bảng Nổng đô amoni Sulfat bão hòa (%) Dường kính vòng phân giải (mm) Protein tổng (mg) Hoạtđộprotease (nKat) Casein Tỉnh bột CMC 20 16,97 10,83 11,10 93,70 70,77 30 17,30 11,50 11,70 109,32 84,25 40 18,17 11,63 12,40 142,19 105,14 50 20,37 12,23 13,13 152,88 118,62 60 23,90 12,73 13,20 213,70 172,54 70 23,30 13,43 14,43 214,52 168,50 80 23,20 14,37 16,30 216,16 162,43 Dựa vào kết nghiên cứu bảng sơ kết luận dịch chiết với amoni Sulfat bão hòa nổng độ từ 20 đến 60% đểu có mặt enzym protease, amylase cellulase Với nồng độ amoni Sulfat 60% bão hòa, tủa enzym cho hoạt tính protease cao nhất, hoạt tính amylase cellulase cao nồng độ amoni Sulfat bảo hòa đạt 80% Kết xác định lượng protein tổng hoạt độ protease dịch enzym cho thấy tăng nổng độ amoni Sulfat bâo hòa, lượng protein enzym thu từ dịch lên men B subtilìs natto tăng dần đạt giá trị cao nổng độ 60,70 80% Hoạt độ protease dịch enzym 60% lớn nhất: 172,54 nKat Theo số kết nghiên cứu giới B subtilìs natto, nổng độ amoni Sulfat khoảng 60% bão hòa nhiều tác giả sử dụng để kết tủa số protease ngoại bào nghiên cứu Tetsuya Kato (1992) [5], Fujita năm 1993 [3], Muramatsu năm 2000 [6], Huang Jun năm 2005 [4], Cong Wang năm 2009 [7] Kết thí nghiệm cho thấy nồng độ thích hợp để chiết tách protease ngoại bào amoni Sulfat 60% bão hòa, thuận lợi cho bước tinh chế so với kết tủa protein enzym amoni Sulfat 70% hay 80% bão hòa (lượng muối sử dụng, amylase cellulase thấp hơn) Sơ tinh chế xác định số đặc tính protease thu Tủa enzym thu chiết amoni Sulfat 60% bão hòa từ dịch nuôi cấy B subtilis natto tinh phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G - 75 nhằm mục đích loại muối lẫn protein enzym sơ tách loại amylase cellulase theo phương pháp Cong Wang [7] Định lượng protein, xác định hoạt độ protease phân đoạn Thí nghiệm lặp lại lẩn Mẫu trắng sử dụng dung dịch đệm phosphat pH 7,6 sau chảy qua cột sắc kí lúc chưa cho mẫu vào Sau chạy sắc kí lọc gel thu 12 phân đoạn loại amoni sulfat Kết thử khả phân giải casein 12 phân đoạn thể hình Mầu trắng không cho vòng phân giải casein nên loại trừ ảnh hưởng nển mẫu đến kết thí nghiệm Trên đồ thị hình xuất đỉnh có hoạt tính enzym protease cao tương ứng với ba phân đoạn 3,6,10; phân đoạn 10 có hoạt tính enzym protease cao Kết phân tích cho thấy nồng độ protein tổng phân đoạn 10 11,15 mg/ml hoạt độ protease đạt giá trị 27,22 nKat Sử dụng hai phân đoạn 10 (hai phân đoạn xuất đỉnh đồ thị hình 2) để điện di xác định protein có mặt mẫu Các phân đoạn rửa giải M 2: Mói liên hệ giữũ hoợt tính enzỵm proteơse phân đoợn tích rửa giài(VJ Điện di đồ (hình 3) phân đoạn xuất băng tương ứng với trọng lượng phân tử protein khoảng 66 kDa 35 kDa Điện di đổ phân đoạn 10 xuất băng tương ứng với trọng lượng phân tử protein khoảng 35 kDa 27 - 28 kDa Cả hai phân A đoạn 10 đểu cho vòng phân giải tinh bột Do băng protein 35 kDa amylase (theo K Yamane -1974, amylase B subtilis nam có TLPT 34 kDa [8]) 66 kDa45 kDa30 kDa22 kDa- Hình3:KếtquũđiệndiSDS-PAGE IMơrker 2:Phônđoạn6 ì Phán đoạn 10 Băng protein 66 kDa phân đoạn chưa có báo cáo nghiên cứu, phân đoạn có hoạt tính phân giải CMC - thể có mặt cellulase chưa có báocáo vểTLPT cellulase ngoại bào B subtìlis natto Kết so sánh hoạt tính tiêu fibrin phân đoạn 10 với mẫu bột nattokinase nguyên liệu cho thấy phân đoạn 10 có hoạt tính tiêu fibrin, có đường kính vòng phân giải fibrin lớn so với mẫu nattokinase nguyên liệu có hoạt tính khoảng 60 FU/ml (16,9 mm so với 16,1 mm) Bàng 4: Khá tiêu fibrin phân đoợtì w Mẫu d (mm) Phân đoạn 10 16,9 Nattospes 16,1 Ghi Tương đương 60 FU/ml Bàn luận Dựa vào số nghiên cứu giới nghiên cứu tách chiết enzym ngoại bào B subtilìs natto, sơ đưa số bàn luận sau: Với phương pháp kết tủa amoni Sulfat 60% bão hòa; protein enzym ngoại bào B subtilìs natto chiết từ môi trường lên men hỗn hợp enzym có protease, amylase cellulase Kết điện di phân đoạn có hoạt độ protease cao thu sau tinh chế phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G - 75 cho thấy có phân đoạn 10 xuất băng protein khoảng 27 - 28 kDa (gẩn với trọng lượng phân tử nattokinase) Kết thử khả phân giải fibrin phân đoạn 10 cho thấy protease phân đoạn có hoạt tính tiêu fibrin tương đương với nattokinase thị trường Tuy nhiên để tách riêng protease cẩn có bước tinh chế Các quy trình chiết tách protease từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto quy mô phòng thí nghiệm thường có nhiểu bước tinh chế như: nghiên cứu Tetsuya Kato (1992) Fujita (1993) có bước tinh chế [3], [5]; nghiên cứu Muramatsu (2000) Cong Wang (2009) có bước tinh chế [6], [7] Trong nghiên cứu thực bước tinh chế phân đoạn 1C thu sau tinh chế nattokinase protein TLPT 35kDa Muốn tách riêng nattokinase từ môi trường nuôi cấy B subtiHs natto cẩn tiến hành thêm số bước tinh chế khác như: thẩm tích, sắc kí lọc gel Sephadex G- 75, sắc kí kị nước Phenyl Sepharose [7], Kết luận Các nghiên cứu cho thấy sử dụng amoni Sulfat bão hòa 60% để kết tủa enzym protease từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto thu tủa enzym có hoạt độ protease cao nhất: 172,54 nKat; thời hạn chế lượng tối đa enzym khác có mặt môi trường nuôi cấy B subtilis natto (amylase cellulase) Phân đoạn có hoạt độ protease cao tiến hành tinh chế tủa protein enzym thu phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G - 75 phân đoạn 10 Kết điện di, xác định hoạt độ đánh giá khả tiêu fibrin phân đoạn 10 cho thấy có enzym nattokinase với trọng lượng phân tử khoảng 27 - 28 kDa, có hoạt độ protease 27,22 nKat có khả phân giải mạnh chất fibrin Kết mở khả sử dụng nattokinase làm nguyên liệu nghiên cứu sản xuất thuốc điểu trị sổ bệnh lý có liên quan đến huyết khối bệnh nghẽn mạch máu, huyết áp Số 5/2013 Nghiên cúuduợclhồng tin th u ố c 1177 t Ai liệu th am khảo Lê Thanh Mai (2009), Cácphương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 186 -190 R Dubeỵ, J Kumar, D Agrawala, T Char, p Pusp (2011), "Isolation, production, purification, assay and characterization of fibirnolytic enzyms (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources”, African Journal of Biotechnology, 10(8), p 1408 -1420) M Fujita et al (1993), "Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan", Biochemical and Biophysical research communication, 197(3), p 1340 -1347 H Jun, Mel Le-he (2005), "Screening of Bacillus subtilis natto from traditional Japanese Food Natto and separation of Nattokinase", Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 19(4), p 518 -522 T Kato et al (1992), "Purification of a new extracellular 90- kDa serine proteinase with isoelectric point of 3.9 from Bacillus subtilis (natto) and elucidation of its distinct mode of action", Bioscience biotechnology and biochemistry, 56 (7), p n 66 -1168 K Muramatsu, N Yamawake (2000), "Purification and crystallization of a new Bacillus subtilis elastase", Journal of Home Economics of Jopon, 5MU), p 1127-1135 c Wang, Ming Du (2009), "Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B -12", Journal of Agricultural and food chemistry article, 57, p 9722 - 9729 K Yamane, Hiroshi M (1974), "Hybrid a - amylases produced by transformants of Bacillus subtilis - Purification and characterization of extracellular a - amylases produced by the parental strains and transformants", Biochimica etBiophysicaActa, 365, p 235 - 247 LÜ Ying, Zhang Lu, Feng Lei (2004), "Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis", Food and Fermentation Industries, ... amoni sulfat bào hòa dùng chiết enzym từ dịch lên men Bacillus subtilis natto Sử dụng nổng độ amoni sulfat bão hòa từ 20 80% để chiết protein enzym từ dịch lên men Bacillus subtilis natto nhằm... giới nghiên cứu tách chiết enzym ngoại bào B subtilìs natto, sơ đưa số bàn luận sau: Với phương pháp kết tủa amoni Sulfat 60% bão hòa; protein enzym ngoại bào B subtilìs natto chiết từ môi trường... tủa enzym protease từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto thu tủa enzym có hoạt độ protease cao nhất: 172,54 nKat; thời hạn chế lượng tối đa enzym khác có mặt môi trường nuôi cấy B subtilis natto