Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 207-214 Biểu gen mã hóa cho β-galactosidase tế bào sinh dưỡng vi khuẩn Bacillus subtilis Nguyễn Quỳnh Uyển*, Trần Thị Trang, Phan Thị Hà, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, ĐHQGHN, 144 Xuân Thủy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 16 tháng năm 2012 Tóm tắt Bacillus subtilis Hiệp hội Thuốc Thực phẩm Mỹ (FDA) đánh giá vật chủ an toàn Hơn nữa, dựa trình tự gen nghiên cứu đầy đủ, vi sinh vật sử dụng mô hình nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng Tuy nhiên, thời điểm (theo thông tin mà có được) nghiên cứu biểu gen tế bào sinh dưỡng vi sinh vật này, đặc biệt biểu không dùng chất cảm ứng, chưa tiến hành rộng rãi Việt Nam Trong báo biểu thành công gen mã hóa cho β-galactosidase gen mô hình tế bào sinh dưỡng vi khuẩn B subtilis để phát triển ứng dụng vi sinh vật an toàn Việt Nam Từ khóa: Bacillus subtilis, tế bào sinh dưỡng, biểu hiện, β-galactosidase Mở đầu∗ hướng phát triển vacxin hệ mới, B subtilis phát nghiên cứu công cụ chuyển kháng nguyên an toàn tiềm [4-6] Mặc dù hệ gen B subtilis nghiên cứu đầy đủ [7-10], việc chuyển gen vào B subtilis vấn đề nan giải vector để chuyển gen vào B subtilis chưa thương mại hóa đòi hỏi số yêu cầu đặc biệt để cài nhập gen đích vào nhiễm sắc thể vi khuẩn Bacillus subtilis, đại diện tiêu biểu nhóm vi sinh vật Gram dương, đối tượng trọng nghiên cứu từ lâu ưu điểm bật so với Escherichia coli Khả không gây bệnh (B subtilis Hiệp hội Thuốc Thực phẩm Mỹ FDA coi „genereally regarded as safe“ - GRAS) khả chịu đựng điều kiện nuôi cấy, bảo quản khắc nghiệt [1, 2] B subtilis ưu điểm trội vi sinh vật so với E coli Trong nghiên cứu bản, B subtilis sử dụng mô hình để nghiên cứu khả biệt hoá chế điều hoà hoạt động gen tế bào [3] Trong Theo thông tin mà có được, Việt Nam có công trình nghiên cứu biểu gen B subtilis biểu gen vỏ bào tử [11], biểu gen vi khuẩn cách sử dụng chất cảm ứng IPTG [12] chưa có công trình nghiên cứu biểu gen tế bào sinh dưỡng vi sinh vật mà không cần dùng chất cảm ứng Vì vậy, _ ∗ Tác giả liên hệ ĐT: 84-4-37547694 E-mail: uyennq@vnu.edu.vn 207 208 N.Q Uyển nnk / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 207-214 báo biểu gen mã hóa cho β-galactosidase gen mô hình tế bào sinh dưỡng B subtilis điều khiển promoter gen mã hoá cho rRNA (PrrnO) Môi trường LB cho nuôi cấy E coli DH5α, môi trường DSM để nuôi cấy chủng B subtilis mua từ hãng Difco (USA) Các cặp mồi sử dụng (phần gạch chân vị trí cắt enzyme giới hạn): PrrnO-F-EcoRI: Nguyên liệu phương pháp 2.1 Các chủng vi sinh vật, môi trường nuôi cấy cặp mồi sử dụng: 5’-CCGGAATTCGCATGACCATTATGACTAG-3' lacZ-R-HindIII: 5’-CCGAAGCTTTTATTTTTGACACCAGACCAACTGG-3’ Các chủng sử dụng báo trình bày bảng Bảng Các chủng vi sinh vật sử dụng báo Tên chủng E coli DH5α B subtilis PY79 Nguồn gốc Thương phẩm Thương phẩm pUL1 Được tạo nghiên cứu pUL2 Được tạo nghiên cứu pUL3 Được tạo nghiên cứu pUL4 Được tạo nghiên cứu 2.2 Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn E coli B subtilis: Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E coli biến nạp DNA vào vi khuẩn thực theo tài liệu tham khảo [13] Phương pháp tạo tế bào khả biến B subtilis biến nạp DNA vào tế bào thực theo tài liệu tham khảo [14] Vắn tắt là, B subtilis PY79 nuôi đến pha bão hòa môi trường SpC (T base có bổ sung glucose 50%, MgSO4 1.2%, bacto yeast extract 10%, casamino acid 1%) sau nuôi tiếp môi trường SpII (thành phần tương tự SpC có bổ sung CaCl2 0.1M) Sau Đặc điểm Biến nạp, nhân dòng biến đổi di truyền Dùng phòng thí nghiệm, để nhân dòng biến đổi di truyền E coli DH5α chứa vector pUL1 mang đoạn chèn PrrnO-RBS gen sspA-lacZ E coli DH5α chứa vector pDG364 mang đoạn chèn PrrnO-RBS gen sspA-lacZ Thể biến nạp B subtilis PY79 có đoạn PrrnO-RBS gen sspA-lacZ cài nhập locus amyE nhiễm sắc thể Thể biến nạp B subtilis PY79 có đoạn PrrnO-RBS gen sspA-lacZ cài nhập locus amyE nhiễm sắc thể glycerol bổ sung để đạt đến nồng độ cuối 10% chia vào ống (200 µl/ống), giữ -80oC đến sử dụng DNA sau bổ sung vào tế bào khả biến B subtilis làm rã đông, lắc 37oC 30-45 phút trải đĩa chứa môi trường kháng sinh sàng lọc thích hợp 2.3 Phương pháp kiểm tra cài nhập đánh giá hoạt tính gen lacZ vi khuẩn B subtilis Vector pDG 364 có chứa gen lacZ duỗi thẳng cách sử dụng enzyme giới hạn PstI Gen lacZ cài nhập theo phương pháp trao đổi chéo kép gen amyE vector pDG364 (chứa hai phần gen amyE, N.Q Uyển nnk / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 207-214 gen mã hóa cho chloramphenicol acetyltransferase chúng, xem hình 1) gen amyE nhiễm sắc thể vi khuẩn B subtilis nên thể tái tổ hợp mang gen lacZ cài nhập kiểm tra theo hai tiêu chí: - Kiểm tra khả kháng kháng sinh chloramphenicol: Sàng lọc thể biến nạp môi trường có bổ sung chloramphenicol (50 µg/ml) để lựa chọn thể tái tổ hợp - Kiểm tra hoạt tính amylase: Do trao đổi chéo kép, gen amyE bị tính ngyên vẹn dẫn đến hoạt tính amylase Do đó, thể tái tổ hợp khả phân giải tinh bột Nhỏ dịch nuôi thể biến nạp đĩa thạch đục lỗ có bổ sung tinh bột (0.1%), ủ 37oC 8h, nhuộm đĩa dung dịch lugol, thể biến nạp khả phân giải tinh bột (không có vòng sáng đĩa) lựa chọn 209 nitrophenol giải phóng chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng bị hấp thụ bước sóng 420nm Một đơn vị hoạt độ (U) βgalactosidase lượng enzyme cần thiết để giải phóng µmol o-nitrophenol phút 300C theo điều kiện thí nghiệm đơn vị (U) = OD420 *1000 (Thoi gian)* (Thê tích)*(OD600 ) Trong đó: OD420: OD phản ứng màu đo 420 nm Thời gian: Thời gian phản ứng (phút) Thể tích: Thể tích dịch nuôi cấy phản ứng (ml) OD600: Mật độ tế bào sử dụng phản ứng đo 600 nm 2.4 Một số quy trình thường quy sử dụng tách dòng tinh plasmid, điện di kiểm tra sản phẩm PCR, cắt kiểm tra đoạn gen chèn thêm plasmid… Kết thảo luận 3.1 Tách dòng đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS gen sspA-lacZ vector pUL1 Tách dòng đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS gen sspA-lacZ thực ttheo sơ đồ hình Hình Cài nhập gen lacZ theo phương pháp trao đổi chéo kép vào nhiễm sắc thể vi khuẩn B subtilis Hoạt độ β-galactosidase xác định cách cho enzyme phản ứng với chất tổng hợp o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) Dưới tác dụng β-galactosidase, ONPG thủy phân thành galactose o-nitrophenol o- Hình Sơ đồ tách dòng đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS gen sspA-lacZ vector pUL1 210 N.Q Uyển nnk / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 207-214 Vector pUL1 cung cấp từ Phòng Công nghệ Enzyme-Protein (Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, ĐHQGHN) có chứa promoter rrnO (PrrnO), RBS gen sspA Gen lacZ khuếch đại thành công từ khuôn pDG268 có chứa gen (kết không trình bày đây) Sản phẩm PCR gen lacZ (được cắt với BamHI HindIII) chèn vào vector pUL1 (đã xử lý với BamHI HindIII) biến nạp vào tế bào khả biến E coli Các thể biến nạp trải môi trường chọn lọc chứa kanamycin (30 µg/ml) Plasmid khuẩn lạc thu cắt với enzyme giới hạn BamHI HindIII để kiểm tra đoạn DNA chèn Kết cắt plamid pUL1 có chứa gen lacZ chèn thêm thể hình Hình Kết cắt plamid pUL1 có chứa gen lacZ chèn thêm 1: sản phẩm PCR có kích thước kb, plamid pUL1 có chứa gen lacZ chèn thêm, M: DNA marker (Express DNA ladder) Kết cho thấy sau cắt enzyme giới hạn, plasmid văng băng có kích thước kb dự đoán Điều chứng tỏ nhân dòng thành công gen lacZ vector pUL1 3.2 Tách dòng đoạn ADN bao gồm promoter PrrnO-RBS gen sspA-lacZ vector pDG364 Tách dòng đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS gen sspA-lacZ vector pDG364 thực theo sơ đồ hình N.Q Uyển nnk / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 207-214 211 EcoRI HindIII Hình Sơ đồ tách dòng đoạn ADN bao gồm promoter PrrnO-RBS gen sspA-lacZ vector pDG364 Đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS gen sspA-lacZ khuếch đại thành công từ pUL1 có chứa gen lacZ cách sử dụng cặp mồi phần „Nguyên liệu Phương pháp“ (kết không trình bày đây) Sản phẩm PCR gen lacZ (được cắt với EcoRI HindIII) chèn vào vector pDG364 (đã xử lý với EcoRI HindIII) biến nạp vào tế bào khả biến E coli Các thể biến nạp trải môi trường chọn lọc chứa ampicillin (50 µg/ml) Các khuẩn lạc thu tách plasmid cắt với enzyme giới hạn EcoRI HindIII để kiểm tra đoạn DNA chèn Kết cắt plamid pUL2 có chứa promoter PrrnO-RBS gen sspA-lacZ chèn thêm thể hình Hình Cắt kiểm tra plamid pUL2 có chứa đoạn DNA gồm PrrnO-RBS gen sspA-lacZ 1: sản phẩm PCR có kích thước kb, plamid pUL2 có chứa đoạn PrrnO-RBS gen sspA-lacZ, M: DNA marker (Express DNA ladder) 212 N.Q Uyển nnk / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 207-214 Kết cho thấy sau cắt hai enzyme giới hạn, plasmid pUL2 văng băng có kích thước kb (PrrnO-RBS gen sspA-lacZ có kích thước dự đoán khoảng 3.3 kb) Sau plasmid tách chiết kit hãng Roche theo hướng dẫn nhà sản xuất gửi đến hãng Macrogen (Hàn Quốc) để xác định trình tự Kết là, đoạn PrrnO-RBS gen sspA-lacZ có trình tự xác đoạn khuôn mà từ PrrnO, RBS gen sspA lacZ khuếch đại đoạn nối đoạn DNA chèn thêm hoàn toàn khung (kết không trình bày đây) Điều chứng tỏ nhân Đối chứng dương dòng thành công đoạn PrrnO-RBS gen sspA-lacZ vector pDG364 3.3 Cài nhập biểu gen lacZ vi khuẩn B subtilis Như phần phương pháp, chủng B subtilis cài nhập gen lacZ theo phương pháp trao đổi chéo kép mọc môi trường chứa chloramphenicol (50 µg/ml) hoạt tính amylase Vì vậy, sau sàng lọc môi trường chứa kháng sinh, thể tái tổ hợp nuôi cấy môi trường lỏng dịch nuôi cấy xác định hoạt tính amylase đĩa có chứa chất tinh bột 0.1% (hình 6) B subtilis PY79 pUL3 pUL4 Đối chứng âm Hình Kết xác định hoạt tính amylase chủng B subtilis PY79 biến nạp với vector pUL2 Dựa kết hình 6, hai chủng pUL3 pUL4 đáp ứng đầy đủ hai tiêu chí sàng lọc (phát triển môi trường chứa chloramphenicol bị hoạt tính amylase) lựa chọn Hai chủng nuôi cấy môi trường DSM lỏng dịch nuôi cấy thu sau 24h để xác định hoạt độ β-galactosidase Kết thể hình Hình Xác định hoạt độ β-galactosidase chủng pUL3 pUL4 N.Q Uyển nnk / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 207-214 Dựa hoạt độ β galactosidase chủng pUL3 pUL4 (khác biệt rõ rệt so với chủng B subtilis PY79), khẳng định biểu thành công gen mã hóa cho β galactosidase tế bào sinh dưỡng vi khuẩn B subtilis hoạt độ gen cao [6] [7] Kết luận [8] Dựa vào kết đạt đây, có hai kết luận sau: - Đã tách dòng thành công gen mã hóa cho β galactosidase điều khiển PrrnO RBS gen sspA vi khuẩn B subtilis vector pDG364 - Đã cài nhập biểu thành công gen mã hóa cho β galactosidase tế bào sinh dưỡng vi khuẩn B subtilis [9] [10] Lời cảm ơn Nghiên cứu thực nhờ hỗ trợ kinh phí từ đề tài QG.10.22 [11] Tài liệu tham khảo [1] [2] [3] [4] [5] Driks A., Bacillus subtilis spore coat, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63 (1999) Glick R Bernard, Pasternak J Jack, Molecular Biotechnology: Principle and Application, Washington, ASM Press, 2003 Errington J., Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis, Nature Reviews Microbiology (2003) 117 Duc L.H., and Cutting S.M., Bacterial spores as heat stable vaccine vehicles, Expert Opin Biol Ther (2003) 1263 Duc L.H., Hong H.A., Fairweather N., Ricca E., and Cutting S.M., Bacterial spores as vaccine [12] [13] [14] 213 vehicles, Infection and Immunity 71 (2003) 2810 Drabner B., and Guzman C.A, Elicitation of predictable immune responses by using live bacterial vectors, Biomolecular Engineering 17 (2001) Isticato R., Cangiano G., Tran H.T., Ciabattini A., Medaglini D., Oggioni M.R., De Felice M., Pozzi G., and Ricca E., Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores, Journal of Bacteriology 183 (2001) 6294 Krásný Libor and Gourse L Richard, An alternative strategy for bacteria ribosome synthesis: B rRNA transcription regulation, BMBO Journal 23 (2004) 4473 Mauriello E.M.F., Duc L.H., Isticato R , Cangiano G., Hong H.A., De Felice M., Ricca E., and Cutting S.M (2004), Display of Heterologous Antigens on the Bacillus subtilis Spore Coat Using CotC as a Fusion Partner, Vaccine 22 (2004) 1177 Perehines M Tania, Qazi NA Saara, Gaddipati R Sanyasi, Salisbury Vyvyan, Rees ED Catherine and Hill J Philip, Construction and evaluation of multisite recombinatorial (Gateway) cloning vector for Gram-positive bacteria, BMC Molecular Biology (8:80) (2007) 1471 Bùi Thu Thủy, Hoàng Văn Tổng, Phan Hương Trang, Phan Tuấn Nghĩa, Huỳnh Ánh Hồng, Simon Cutting, Nguyễn Thị Vân Anh, Cloning and expression of streptavidin on the outer coat of Bacillus subtilis PY79 spores, VNU Journal of Science, Natural Science and Technology 27, No 2S (2011) 285 Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn Thị Hiền, Quyền Đình Thi, Biểu gene mã hóa streptokinase từ Streptococcus pyogenes Bacillus subtilis, Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện KH&CN Việt Nam, Hà Nội, (2010) 262 Sambrook, J., and Russell, D.W., Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd Ed, Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 2001 Cutting S.M., and Vander-Horn P.B., Genetic Analysis, In Molecular Biological Methods for Bacillus, Harwood, C.R and Cutting, S.M (eds) Chichester, England: John Wiley & Sons Ltd., 1990 214 N.Q Uyển nnk / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 207-214 Expression of the gene, encoded for β-galactosidase in the vegetative cells of Bacillus subtilis Nguyen Quynh Uyen, Tran Thi Trang, Phan Thi Ha, Nguyen Huynh Minh Quyen VNU Institute of Microbiology and Biotechnology, ĐHQGHN, 144 Xuan Thuy, Hanoi, Vietnam Bacillus subtilis is considered as a GRAS (“genereally regarded as safe“) by the FDA (Food and Drug Administation of the US) Moreover, based on completely sequenced genome of this bacterium, B subtilis has been used as a model for basic and application studies However, to date, (to the best of our knowledge) the gene expression, especially without inducer, in vegetative cells of this bacterium has not been widely performed in Vietnam yet In this article we successfully expressed the gene encoded for β-galactosidase as a gene model in the vegetative cells of B subtilis in order to develop the application of this safe bacterium in Vietnam Keywords: Bacillus subtilis, vegetative cells, expression, β-galactosidase ... công gen mã hóa cho β galactosidase điều khiển PrrnO RBS gen sspA vi khuẩn B subtilis vector pDG364 - Đã cài nhập biểu thành công gen mã hóa cho β galactosidase tế bào sinh dưỡng vi khuẩn B subtilis. .. nnk / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 207-214 báo biểu gen mã hóa cho β- galactosidase gen mô hình tế bào sinh dưỡng B subtilis điều khiển promoter gen mã hoá cho rRNA... pUL4 (khác biệt rõ rệt so với chủng B subtilis PY79), khẳng định biểu thành công gen mã hóa cho β galactosidase tế bào sinh dưỡng vi khuẩn B subtilis hoạt độ gen cao [6] [7] Kết luận [8] Dựa vào