Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tạo chế phẩm nattokinase từ bacillus subtilis natto 5

33 Hình 3.5 Ảnh hưởng của loại, tỉ lệ chất mang tới khả năng làm tan huyết khối của chế phẩm nattokinase được tạo từ enzyme trộn với chất mang sau đó đông khô.. 34 Hình 3.6 Ảnh hưởng củ

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-*_* -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tạo chế phẩm

nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5”

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-*_* -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tạo chế phẩm

nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5”

đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Viện đại học Mở Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, cảm ơn anh chị em, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Diệu Linh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về nattokinase 4

1.1.1 Nguồn gốc đặc tính của nattokinase 4

1.1.2 Cơ chế hoạt động của nattokinase 7

1.1.3 Ứng dụng của nattokinase 9

1.1.4 Nguồn gốc thu nhận nattokinase 10

1.2 Tình hình nghiên cứu nattokinase trên Thế giới và tại Việt Nam 11

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới 11

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 12

1.3 Giới thiệu về Bacillus Subtilis natto 5 14

1.3.1 Hệ thống phân loại và sự phân bố trong tự nhiên 14

1.3.2 Đặc điểm hình thái 15

1.3.3 Đặc điểm sinh hóa 16

1.3.4 Đặc điểm nuôi cấy 17

1.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ tới sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật 18

1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 18

1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 19

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận nattokinase 19

1.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 19

1.5.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường 20

1.5.3 Ảnh hưởng của pH môi trường 20

1.5.4 Ảnh hưởng thời gian lên men 20

1.5.5 Độ thông khí 21

PHẦN 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu 22

2.1.1 Chủng giống 22

2.1.2 Môi trường và hóa chất 22

2.1.3 Chất mang 23

2.1.4 Thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp xác định môi trường có nguồn carbon và nguồn nitơ tối ưu sử dụng trong lên men Baccilus subtilis natto 5 25

2.2.2 Phương pháp kết tủa nattokinase bằng muối ammonium sulphate 26 2.2.3 Phương pháp kết tủa nattokinase bằng acetone 27

2.2.4 Phương pháp đông khô để thu nhận enzyme tạo chế phẩm 28

PHẦN 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Lựa chọn môi trường lên men có nguồn carbon và nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp nattokinase của Bacillus Subtilis Natto 5 30

3.1.1 Nguồn carbon 30

3.1.2 Nguồn nitơ 31

3.2 Kết quả xác định điều kiện thu hồi enzyme nattokinase 32

3.2.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp để kết tủa nattokinase có trong dịch lên men 32

3.2.2 Xác định nồng độ acetone thích hợp để kết tủa nattokinase có trong dịch lên men 32

3.3 Xác định điều kiện và quy trình tạo chế phẩm nattokinase 34

3.3.1 Chất mang tạo chế phẩm 34

3.3.2 Quy trình công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm nattokinase từ B.subtilis natto 5 36

PHẦN 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm của nattokinase 6

Bảng 1.2 Phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis 17

Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.2 Thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.3 Thành phần nguồn carbon và nitơ của môi trường MT2 25

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Natto truyền thống Nhật Bản 5

Hình 1.2 Mô phỏng cấu trúc không gian của nattokinase 5

Hình 1.3 Huyết khối được hình thành thông qua các nút tiểu cầu 7

Hình 1.4 Các tác dụng sinh lý của nattokinase trên fibrin 8

Hình 1.5 Mô phỏng hệ thống phân loại của Bacillus subtilis natto 5 14

Hình 1.6 Hình thái của Bacillus subtilis 16

Hình 3.1 Ảnh hưởng của các nguồn carbon trong môi trường lên men đến hoạt tính nattokinase của B.subtilis natto 5 30

Hình 3.2 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ trong môi trường lên men đến hoạt tính nattokinase của B.subtilis natto 5 31

Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện hoạt tính của nattokinase sau khi tủa bằng (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau 32

Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện hoạt tính của nattokinase sau khi tủa bằng acetone ở các tỷ lệ khác nhau 33

Hình 3.5 Ảnh hưởng của loại, tỉ lệ chất mang tới khả năng làm tan huyết khối của chế phẩm nattokinase được tạo từ enzyme trộn với chất mang sau đó đông khô 34

Hình 3.6 Ảnh hưởng của loại, tỉ lệ chất mang tới khả năng làm tan huyết khối của chế phẩm nattokinase được tạo từ cặn enzyme đông khô sau đó trộn với chất mang 35

Hình 3.7 Quy trình công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5 38

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề

Trong thời gian gần đây, chúng ta nghe nhắc nhiều đến nattokinase với nhiều tác dụng khác nhau, đặc biệt có thể mang tới cho chúng ta một sức khỏe tốt hơn, nâng cao chất lượng sống của con người Vậy nattokinase là gì?

Nattokinase là một enzyme được tìm thấy trong sản phẩm “Natto” - một món ăn truyền thống của người Nhật Bản Nattokinase là protease chuỗi đơn chứa 275 amino acid đã được Hyroyuki Sumi phát hiện và thấy được khả năng làm tan huyết khối vào năm 1980 [11] Huyết khối là hiện tượng máu đông trong các động mạch hay tĩnh mạch nằm bên trong cơ thể Cục huyết khối là sản phẩm cuối cùng của quá trình đông máu Bình thường nó có tác dụng cầm máu trong các trường hợp chảy máu do tổn thương mạch máu (đứt rách) Khi quá trình đông máu xảy ra trong mạch máu không bị đứt rách thì được gọi là chứng huyết khối bệnh lý và có thể dẫn tới các bệnh tim mạch như: nhồi máu cơ tim, tắc nghẽn mạch máu não, đột quỵ…và nguy hiểm hơn

là dẫn đến tử vong đột ngột

Theo WHO mỗi năm có khoảng 17,5 triệu người tử vong do mắc phải các bệnh tim mạch và dự đoán đến 2020 con số này có thể đạt tới 25 triệu người, mà nguyên nhân là hậu quả của các cục máu đông (huyết khối) Theo ước tính thị trường toàn cầu về các thuốc làm tan huyết khối là gần 14 tỉ USD

[12] Các loại thuốc làm tan huyết khối như Alteplase, Streptokinase, Urokinase… có hiệu lực tức thì sau khi tiêm vào tĩnh mạch Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học của các loại thuốc này chỉ là tạm thời, tồn tại không lâu sau khi tiêm, giá cao mà chỉ tác động vào triệu chứng, không chữa được nguyên căn của bệnh, đồng thời cũng có nguy cơ biến chứng gây xuất huyết Trong khi đó nattokinase được coi như một thực phẩm chức năng hỗ trợ làm tan huyết khối sở hữu nhiều ưu điểm như an toàn, chi phí thấp dễ sử dụng kèm theo đó là khả năng ngăn ngừa được bệnh

Fibrin là protein dạng sợi không tan được hình thành do chuyển hóa của fibrinogen dưới tác động của thrombin Fibrin cùng với những tế bào tiểu cầu

là yếu tố chính phát triển nên cục máu đông Nattokinase không chỉ làm giảm hàm lượng fibrin một cách trực tiếp mà còn thúc đẩy các tế bào phát triển chất hoạt hóa plasminogen để phân hủy fibrin Hoạt tính làm tan huyết khối của nattokinase tương đối mạnh và kéo dài, có thể làm giảm chứng cao huyết áp, phân giải protein dạng amyloid liên quan đến bệnh alzhemer hay bệnh bò điên

[13]; tăng cường hoạt hóa plasminogen và làm bất hoạt chất ức chế hoạt hóa plasminogen [14] Chính vì tác dụng dược lý to lớn của nattokinase mà ngày nay, việc nghiên cứu thu nhận enzyme từ các nguồn khác nhau nhất là từ vi sinh vật đang được quan tâm

Một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh nattokinase có thể kể đến như

Bacillus spp Bacillus có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên Đây là vi khuẩn

Gram dương, hiếu khí và có cấu trúc bề mặt khá phức tạp, có đặc điểm kết dính, có khả năng chống chịu được điều kiện khắc nghiệt cao Một số chủng

Bacillus đã được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng

sinh enzyme nattokinase làm tan huyết khối cao có thể kể đến như: Bacillus

subtilis LSSE-22 từ Bắc Kinh, Trung Quốc [15]; Bacillus sp CK từ Chungkook- Jang và Bacillus sp DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc [16]; hay

B.natto từ Natto, Nhật Bản [17]

Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng chứa nattokinase dưới dạng viên nhộng nhập khẩu từ Nhật Bản, Hoa Kỳ như Nattospes (3000 FU/g), Japato (600 FU/g), Nattokinase plusTM (3000 FU/g), Dosaka (300 FU/g) với đơn giá rất cao (trên 10 triệu đồng/kg) Dạng thực phẩm truyền thống của Nhật Bản cũng được nhập khẩu nhưng không được dùng phổ biến vì nặng mùi, nhớt, rất khó ăn, không phù hợp với khẩu vị người Việt Nam, hoạt tính nattokinase cũng thấp [1]

Phòng Công nghệ Lên men, viện Công nghệ Sinh học, viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tuyển chọn và nghiên cứu thành công

điều kiện ban đầu thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinase

của chủng B.subtilis natto 5 lần lượt là: pH 7,5; nhiệt độ 37oC; tỉ lệ giống 5%;

độ thông khí 25% Ở thời điểm hoạt tính enzyme cao nhất theo phương pháp Astrup và Mullertz (1952) hoạt tính protease đạt 2700 U/ml

Tuy nhiên, để thu hồi được tối đa lượng enzyme nattokinase và ứng dụng vào làm chế phẩm phục vụ cho con người lại là một thách thức không nhỏ đối với các nhà nghiên cứu Chế độ lên men, điều kiện thu nhận enzyme hay cách thức tạo chế phẩm đều là những công đoạn có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất thu hồi và hoạt tính của enzyme Vì vậy đề tài “Nghiên cứu điều kiện thu

hồi và tạo chế phẩm nattokinase từ B.subtilis natto 5” được chúng tôi quan

tâm và đi sâu nghiên cứu

Mục tiêu chung

Xác định được điều kiện thích hợp để thu hồi và tạo chế phẩm

nattokinase từ B.subtilis natto 5 áp dụng cho sản xuất thực phẩm chức năng

Nội dung nghiên cứu

- Xác định môi trường nuôi cấy để thu nhận được nattokinase từ

B.subtilis natto 5 cao nhất;

- Xác định điều kiện thu hồi nattokinase từ B.subtilis natto 5;

- Xác định chất mang và chế độ sấy để tạo chế phẩm nattokinase có khả năng làm tan huyết khối tốt

PHẦN 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nattokinase

Nattokinase là một enzyme làm tan huyết khối được tìm thấy trong loại

đậu tương lên men Natto - món ăn truyền thống của người Nhật năm 1980 Nattokinase có tác dụng làm tan các cục máu đông vốn là nguy cơ gây tắc mạch máu dẫn đến tai biến, đột quỵ [18]

Hiện nay, tỉ lệ mắc bệnh tắc nghẽn động mạch do các cục máu đông như chứng nhồi máu cơ tim hay tắc nghẽn mạch máu não đang tăng nhanh tại Việt Nam và trên Thế giới Chính vì thế, nattokinase được quan tâm nghiên cứu sản xuất và sử dụng rộng rãi như một sản phẩm chức năng để phòng ngừa bệnh tắc nghẽn mạch máu do các cục máu đông [19]

1.1.1 Nguồn gốc đặc tính của nattokinase

Nattokinase là một enzyme chiết xuất từ natto – món đậu tương lên

men của Nhật Bản từ vi khuẩn B.subtilis Natto không chỉ nổi tiếng là món ăn

truyền thống của Nhật trong khoảng hơn 1.000 năm qua mà còn được dùng nhưng một phương thuốc dân gian hiệu quả cho những bệnh lý về tim và mạch máu [17] Cũng có một số tài liệu cho rằng món ăn này được du nhập từ Trung Hoa vào Nhật Bản với cái tên tan-shih

Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của natto là tiến sĩ K.Yabe, một chuyên gia về vi sinh học công bố những kết quả tìm tòi của ông

về sự lên men của natto vào năm 1894 [39] Đến năm 1980, Hiroyuki Sumi, nhà nghiên cứu tại Đại học Chicago qua nhiều năm nghiên cứu, thí nghiệm trên 173 mẫu thực phẩm khác nhau, ông đã thành công khi phát hiện ra một enzyme có hoạt tính cực kỳ mạnh mẽ giúp làm tan cục máu đông Ông đặt tên cho nó là “nattokinase”, nghĩa là “enzyme có trong natto” [20]

Trong quá trình lên men natto sẽ hình thành chất nhầy là chất gây liên kết cho đậu Trong các phương pháp truyền thống, người ta lên men đậu

tương từ vi khuẩn trên rơm rạ (hình 1.1) Trong quá trình sản xuất hiện đại,

các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên đậu tương, vì vậy mà việc sử dụng rơm rạ là không còn cần thiết [21]

Subtilisin là nhóm serine protease có khả năng thủy phân protein Nattokinase có sự tương đồng cao với các subtilisin và trình tự gen 16 rDNS cho thấy 99,5% và 99,3% tương đồng với subtilisin E và amylosacchariticus tương ứng [22]

Bảng 1.1 Đặc điểm của Nattokinase [16]

Đặc điểm của nattokinase

Tên protein

Tên đề xuất: Subtilisin NAT, EC = 3.4.21.62

Tên thay thế: Nattokinase; Cardiokinase

Hoạt động xúc tác

Thủy phân protein với nồng độ đặc hiệu rộng với peptide và một lượng dư trong thủy phân peptide amid

Trình tự tương đồng Thuộc nhóm S8 peptidase

Kết quả nghiên cứu động học của nattokinase cho thấy hoạt động làm giảm fibrin mạnh gấp 6 lần plasmin phân giải liên kết fibrin Nattokinase làm giảm fibrin gián tiếp ảnh hưởng đến hoạt động hoạt hóa của plasminogen [23]

1.1.2 Cơ chế hoạt động của nattokinase

Huyết khối là hiện tượng máu đông tại thành động mạch hay các tĩnh mạch nằm bên trong cơ thể gây ra các hiện tượng như: nhồi máu cơ tim, tắc nghẽn mạch máu não, đột quỵ…và nguy hiểm hơn là dẫn đến tử vong đột ngột Sự hình thành huyết khối liên quan đến tổn thương lớn lớp tế bào nội

mô, là sự kết dính – gần tiểu cầu và hoạt hóa thrombin Ngoài ra thành phần của tụ huyết khối còn phụ thuộc vào một số yếu tố khác như mức độ tổn thương mạch máu, áp lực bao sức, hiện diện của các thuốc kháng huyết khối

[24]

Hình 1.3 Huyết khối được hình thành thông qua các nút tiểu cầu

Huyết khối phát triển và được duy trì thông qua sự tích tụ dần dần của nhiều sợi fibrin hoặc lớp niêm mạc của các mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu

sẽ tập trung vào các vùng bị thương đó để tạo thành nút tiểu cầu (hình 1.3)

Các yếu tố đông máu trong cơ thể được kích hoạt, mạng lưới fibrin được hình thành và tạo nên cục máu đông Nhờ tác dụng phân giải sợi fibrin, nattokinase

đã ngăn chặn sự ngưng kết của các tiểu cầu giúp làm tan các cục máu đông

Vì vậy vai trò của nattokinase là làm tan sợi huyết fibrin Khi fibrin bị phân hủy thì sự đông máu trở nên khó khăn

Trong quá trình làm tan huyết khối, prokinase được chuyển đổi thành urokinase, một quá trình được tăng cường bởi nattokinase Phá vỡ fibrin thành các sản phẩm phân hủy cũng được nâng cao, khi lượng fibrin thấp tác dụng chuyển hóa plasminogen thành plasmin thấp Nattokinase tăng plasminogen tế bào và chất hoạt hóa, tăng cường phân hủy fibrin và giảm thời gian đông máu Qua giảm sự hình thành huyết khối, nattokinase làm chậm lại tiến triển của hình thành các mảng bám và ít gây tổn thương động mạch

Hình 1.4 Các tác dụng sinh lý của nattokinase trên fibrin [42]

Cơ chế làm tan huyết khối của nattokinase: Thành phần chính của huyết khối là các sợi fibrin Plasmin là enzyme nội sinh duy nhất trong cơ thể có tác dụng làm tan sợi fibrin Nattokinase có khả năng hoạt động mạnh gấp 6 lần plasmin nội sinh với cơ chế tương tự Đồng thời, thông qua quá trình làm bất hoạt PAI-1 làm tăng hoạt tính của tPA (chất hoạt hóa plasminogen mô) nên gián tiếp chuyển plasminogen thành plasmin, nattokinase cũng kích thích cơ thể sản xuất plasmin Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông, nattokinase cũng giúp tăng cường plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như urokinase [15]

1.1.3 Ứng dụng của nattokinase

Nattokinase là một loại enzyme được coi là một phương thuốc hứa hẹn cho chữa bệnh huyết khối do hoạt tính tiêu sợi huyết mạnh của nó [11] Nattokinase được sử dụng cho các bệnh liên quan đến hệ tuần hoàn máu bao gồm bệnh tim, cao huyết áp, đột qụy, đau ngực (đau thắt ngực), huyết khối tĩnh mạch sâu, xơ cứng động mạch (xơ vữa động mạch), bệnh trĩ, giãn tĩnh mạch, tuần hoàn kém, bệnh động mạch ngoại biên [18] Nattokinase cũng được sử dụng để giảm đau, đau xơ cơ, hội chứng mệt mỏi mãn tính, viêm màng dạ con, u xơ tử cung, co thắt cơ, vô sinh, ung thư và bệnh tê phù do thiếu vitamin B1 [24]

Theo một nghiên cứu, ta có thể sử dụng enzyme này thay thế aspirin với tác dụng xúc tác cao hơn một số enzyme khác Enzyme này tác động lên hệ tuần hoàn, làm quá trình lưu thông máu diễn ra dễ dàng hơn, tránh hiện tượng tắc nghẽn mạch máu [25] Đồng thời, enzyme này làm giảm nồng độ fibrinogen trong huyết tương [26] Các nhà khoa học đã nghiên cứu lâm sàng chứng minh khả năng của nattokinase làm giảm cục máu đông sau 8 giờ uống một liều Natto (khoảng 6000 đơn vị phân giải sợi fibrin) và euglobulin thể hiện khả năng làm giảm cục máu đông tăng một cách đáng kể sau 12 giờ uống [1] Một bệnh nhân đã sử dụng kết hợp aspirin và 400 mg nattokinase trong 7 ngày liên tục để ngăn chặn đột quỵ, xuất huyết tiểu não [28]

Song song với tác dụng làm tan huyết khối, nattokinase còn góp phần làm giảm áp lực của máu lên thành mạch Điều này đã được chứng minh trong một nghiên cứu của Juan, 2010 Nattokinase có chứa ACE ức chế hoạt động của chất làm đông máu, đồng thời làm giảm huyết áp tâm thu 11% và tâm trương 9,7% [29] Ngoài ra, nattokinase có thể ngăn chặn hiện tượng hẹp động mạch chủ và xơ vữa động mạch do khả năng ức chế cục máu đông Do

đó, nattokinase hứa hẹn tiềm năng chữa trị các bệnh tim mạch, đột quỵ, xơ vữa động mạch, huyết áp cao…[23]

Một nghiên cứu năm 2009 cho thấy nattokinase có thể có hiệu quả trong quá trình dị hóa các sợi amyloid độc hại liên quan đến bệnh Alzheimer , cũng như các sợi insulin liên quan đến tiểu đường và các sợi prion peptide gắn liền với các bệnh do prion [26]

Nattokinase cũng có khả năng hoạt hóa nhiều loại enzyme chuyển hóa trong cơ thể Sau khi vào cơ thể nhờ bổ sung trực tiếp qua đường tiêu hóa, nattokinase tách các enzyme chuyển hóa ra khỏi mình, tác động tới chúng làm tăng khả năng chuyển hóa của chúng trong cơ thể Có nghĩa là, nattokinase có khả năng hỗ trợ dinh dưỡng cho cơ thể [22]

1.1.4 Nguồn gốc thu nhận nattokinase

Gần đây, các nhà khoa học tìm thấy nattokinase ở vi sinh vật (nhân sơ và nhân thực) và giống như enzyme được sinh ra từ tụy tạng của người (tripsin

và chymotrypsin) Vi sinh vật thường sản xuất nattokinase đại diện cho nhóm

prokaryote là B.subtilis và ở nhóm eukaryote là Rhizomucor sp Nhiều chủng

vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân lập từ các loại thực phẩm lên men truyền

thống là nguồn giống quan trọng có khả năng sản xuất các enzyme làm tan

huyết khối, như B natto phân lập từ thực phẩm Natto, Nhật Bản[17]; Bacillus

subtilis LSSE-22 từ Bắc Kinh, Trung Quốc [15]; Bacillus sp CK 11-4 từ Chungkook-Jang và Bacillus sp DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc [16]

Nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng lên men bán rắn chủng Bacillus

subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể Thực tế

nattokinase được thu nhận từ cơ chất hay môi trường lỏng thường có hàm lượng không cao và hoạt tính ít ổn định Hiện nay đã có những nghiên cứu bước đầu tạo nattokinase tái tổ hợp có hoạt tính bằng hệ thống vi khuẩn

(Escherichis coli, Bacillus subtilis, Lactococcus sp.) Hướng nghiên cứu

nattokinase tái tổ hợp bước đầu cho thấy hiệu quả vì enzyme tái tổ hợp được biểu hiện có hoạt tính và tiết ngoại bào [30,31,32]

Nattokinase được tinh sạch từ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis natto B-12

(phân lập được từ natto) có độ tinh sạch gấp 51,6 lần và hiệu suất thu hồi 43,2% so với hoạt tính ban đầu, trọng lượng phân tử 29 kDa, hoạt động ở pH

và nhiệt độ tối ưu tương ứng là 8,0 và 40°C, enzyme được hoạt hóa bởi ion

Zn2+ nhưng bị ức chế bởi ion Fe3+ và Al3+ [33] Trong môi trường lỏng chứa

peptone từ đậu nành 8,28 g/l, CaCl2 0,64 g/l và cao nấm men 0,74 g/l, B.natto

NLSSE sinh tổng hợp nattokinase đạt 1300 UI/ml [34] B.subtilis LD-8 sinh

tổng hợp nattokinase cao trong môi trường lỏng chứa bột gạo 5%, bột đậu nành 4%, NH4NO3 0,5% và CaCl2 0,01% (w/w), pH 7 và tỷ lệ giống 5%, sau

72 giờ nuôi cấy, hoạt nattokinase đạt được là 4220 U/ml [35] B.subtilis được

nuôi cấy trên cơ chất bã bậu nành (độ ẩm 80%), ở 370C trong 20 giờ, hiệu suất nattokinase cao nhất là 0,108 g/150 g cơ chất (dạng ướt) [26]

1.2 Tình hình nghiên cứu nattokinase trên Thế giới và tại Việt Nam

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới

Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của Natto là tiến

sĩ K.Yabe, một chuyên gia về vi sinh học công bố những kết quả tìm tòi của ông về sự lên men của natto vào năm 1894, ghi lại rằng “Natto, một loại pho-mai thực vật” để giới thiệu với các nước phương Tây vốn rất quen thuộc với các loại pho-mai từ sữa bò hay sữa dê Trước Abe, chưa có một ai tìm hiểu nguyên nhân tại sao natto có thể lên men từ rơm rạ bọc quanh Với phương

pháp trích ly, Abe đã tìm thấy 4 loại vi khuẩn (ba loại thuộc họ Micrococci và một loại Bacillus) đã giúp cho đậu nành lên men dễ dàng [39]

Vào năm 1905, Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã thành công trong việc tách 2 loại vi khuẩn natto từ đậu nành nấu chín Đến năm 1907, ông đã phát hiện ra rằng natto có chứa enzyme protease hoạt hóa Tiếp đó K.Oshima báo cáo rằng protease này phân hủy fibrin và gelatin vào năm 1925 Năm

1956, S.Miyake đã xác định thành phần các acid amin của enzyme [39]

Năm 1986, Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng của nattokinase sau khi thử nghiệm gần 173 loại thực phẩm khác nhau

để so sánh Sumi đã xác định nattokinase là một loại enzyme có khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme,

nó có hoạt tính mạnh gấp 4 lần plasmin đồng thời tuyệt đối an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đường ăn uống [22]

Đến nay đã có nhiều nghiên cứu xoay quanh các đề tài về nattokinase Các nhà khoa học tại trường Y khoa Keck (Hoa Kỳ) đã tìm ra được nattokinase có khả năng làm giảm sự kết dính của các tế bào máu, do đó làm giảm độ nhầy của máu thông qua các nghiên cứu in vitro Các nhà khoa học này cũng đã tìm ra tác dụng làm giảm lipid máu của nattokinase khi kết hợp

với gạo nấm men đỏ đối với những người bị tăng lipid máu

Tại hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand 3/5/2006), Masafumi Kitakaze đã khẳng định Natto có tác dụng làm giảm rõ rệt các chứng Mỡ (Triglyceride và Cholesterols) trong máu cao qua nghiên cứu chung của 4 cơ quan y tế Nhật Bản, kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện nếp sinh hoạt và tiêu thụ Natto thiên nhiên trước nguy cơ béo phì do “thừa” dinh dưỡng và các chứng bệnh hiểm nghèo, nan y (tiểu đường, ung thư) ngày

(30/4-càng tăng khắp nơi trên thế giới

Theo kết quả nghiên cứu của 3 cơ quan y tế: Đại học bang Oklahoma (Mỹ), JCR Pharmaceuticals (Nhật Bản) và Trường Y khoa Miyazaki, phối hợp thử nghiệm trên cơ thể người (in vivo) bằng cách cho ăn natto 200g/ngày

và đã kiểm chứng được những hiệu ứng kể trên, đặc biệt phát hiện lượng plasmin nội sinh giảm sụt ở người cao tuổi không đủ để làm tan huyết khối,

gây vón cục trong động mạch, thì hiệu quả của Natto càng rõ rệt

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Trong nước đã có một số nghiên cứu sản xuất thuốc làm tan huyết khối

để điều trị các chứng tắc nghẽn mạch (thrombosis) như: Nhóm nghiên cứu của Lý Thị Bích Thủy (Viện Công nghệ sinh học) đã nghiên cứu và sản xuất

thành công chế phẩm Lumbrokinase (sản phẩm tách từ giun đất Nhật Bản có

tên khoa học là Lumbricus rubellus và từ giun quế Việt Nam có tên khoa học

là Perionyx escavatus) có tác dụng làm tan cục máu đông làm nghẽn động

mạch tạo ra vết thương bị tụ máu [2]

Nông Văn Hải và nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học đã nghiên cứu tạo thể hoạt hóa plasminogen dạng mô (tPA) tái tổ hợp trong vi

khuẩn E.coli Vũ Hồng Diệp và cộng sự (2008) cũng đã nghiên cứu sản xuất streptokinase tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli BL21 [3] Khuôn khổ đề tài KC 10.28 “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị”, Quyền Đình Thi và cộng sự (Viện Công nghệ sinh học) đã nhân dòng và biểu hiện thành công streptokinase (enzyme có chức năng tương

tự nattokinase) trong E.coli [4] Nhóm nghiên cứu của Quyền Đình Thi (Viện Công nghệ sinh học) cũng đã nhân dòng gen mã hóa subtilisin từ hai chủng

Bacillus subtilis có độ tương đồng 99% với trình tự amino acid của một

enzyme khác cũng đã được sử dụng làm thuốc chống tắc nghẽn mạch máu nattokinase [4]

Nhóm tác giả Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được

hai chủng Bacillus sp 7.2 và Bacillus sp NP3 có khả năng sinh tổng hợp 470

FU/g nattokinase trên môi trường đậu nành hạt hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên khay Lượng nattokinase này chiếm khoảng 85% so với protease toàn phần [1] Tuy nhiên đây cũng chỉ là những nghiên cứu ban đầu, quy mô phòng thí nghiệm, chưa có khả năng triển khai ứng dụng vào thực tế

sản xuất

Trong năm 2013-2014, Huỳnh Văn Minh và cộng sự (Đại học Y Dược Huế) đã có những nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về Natto đối với huyết áp cao Bằng việc nghiên cứu trên 71 người được phát hiện có HATT từ 130 đến

159 mmHg và/hoặc HATTr từ 85 đến 99 mmHg (tiền THA hoặc THA độ I) với liều 2010 FU/ngày trong 8 tuần liên tục, kết quả cho thấy giảm đồng thời

HATT và HATTr có ý nghĩa thống kê so với placebo ở người tiền THA và THA độ 1, giảm cứng động mạch thông qua hiệu quả làm giảm PWV và PP nhiều hơn có ý nghĩa thống kê so với placebo, có hiệu quả tốt lên một số thành phần lipid máu như làm giảm cholesterol toàn phần và LDL-Cholesterol

Trên thị trường Việt Nam đã có một số sản phẩm nattokinase dưới dạng thực phẩm chức năng được sản xuất trong nước kế thừa các thành tựu khoa học trong và ngoài nước nhưng chưa phổ biến và giá thành khá cao Do đó, việc nghiên cứu sâu về enzyme này là cần thiết và cần được chú trọng hơn

1.3 Giới thiệu về Bacillus Subtilis natto 5

1.3.1 Hệ thống phân loại và sự phân bố trong tự nhiên

Theo nghiên cứu, B.subtilis natto 5 nằm trong hệ thống phân loại như

sau:

Loài: Bacillus subtilis subsp Natto [12]

Hình 1.5 Mô phỏng hệ thống phân loại của Bacillus subtilis natto 5

Khi mới được phát hiện, B.subtilis natto 5 được coi như là một loài

vi sinh vật mới Từ kết quả phân tích DNA-nhiễm sắc thể B.nato và B.subtilis

của Seki năm 1975 và kết quả phân tích gen 16S rRNA của Tamang năm

2002, các khóa phân loại đã xếp B.subtilis natto là một dòng thuộc loài

B.subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác là có khả năng lên men tạo sản

phẩm Natto

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí

Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất

và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 106 – 107 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm [40]

Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon

trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các

hợp chất hữu cơ là vitamin và A.A cho sự sinh trưởng Đặc biệt các loài như

Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp,

chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: nutrient agar (NA), nutrient broth (NB) [3]

Bacillus subtilis còn phân bố trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm

được chế biến từ các loại hạt đó Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua)… cũng có mặt của chúng và

có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh học [5]

1.3.2 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+),

kích thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn (hình

1.6) Bề mặt tế bào được cấu tạo bởi các lớp giác mạc, lớp bề mặt có tính chất

protein, một vài lớp lót peptidoglycan và các protein trên mặt ngoài của màng

tế bào Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông Khuẩn lạc khô hoặc nhớt, không màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành màng mịn lan trên bề mặt thạch Như hầu hết các vi khuẩn Gram dương khác, cấu

trúc bề mặt của Bacillus khá phức tạp và có các đặc tính kết dính và chống

chịu điều kiện khắc nghiệt cao

Hình 1.6 Hình thái của Bacillus subtilis [16]

Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 –

0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan… Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non Đây là

đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis [6] Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid,

có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục

năm Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus

subtilis trong 200 – 300 năm [40]

1.3.3 Đặc điểm sinh hóa

Bacillus subtilis lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose,

maltose, saccharose, xylose và arabinose

Thử nghiệm indol là âm tính (-), các phản ứng nitrate, amylase, MR là

dương tính (+), có khả năng di động và hiếu khí (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis [37]

1.3.4 Đặc điểm nuôi cấy

B.subtilis natto 5 là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn

hydrocarbon: đường đơn như glucose, fructose…, đường đôi như maltose,