Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Nấm Và Tạo Chế Phẩm Sinh Học Từ TRICHODERMA

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ***000*** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM VÀ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ TRICHODERMA Giáo viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT x CHƯƠNG MỞ ĐẦU 12 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1 Sơ lược Trichoderma 14 1.1.1 Hệ gen Trichoderma 14 1.1.2 Môi trường sống 15 1.1.3 Đặc điểm hình thái 16 1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 16 1.1.5 Khả đối kháng nấm Trichoderma 17 1.1.6 Một số sản phẩm trao đổi nấm Trichoderma 18 1.1.7 Một số ứng dụng nấm Trichoderma 19 1.1.7.1 Bảo vệ thực vật[4] 19 1.1.7.2 Cải thiện suất trồng 21 1.1.7.3 Trong lĩnh vực xử lý môi trường 22 1.1.7.4 Trong lĩnh vực khác 23 1.2 Sơ lược số nấm gây bệnh thực vật 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2.1 Vật liệu 28 2.1.1 Chủng giống nghiên cứu 28 2.1.2 Vật liệu sử dụng 28 2.2 Dụng cụ, thiết bị 28 2.3 Các môi trường nuôi cấy 29 2.3.1 Môi trường PGA 29 2.3.2 Môi trường tăng sinh nấm mốc 29 2.4 Phương pháp 29 2.4.1 Phương pháp bảo quản giống thạch nghiêng 29 - ii - 2.4.2 Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng sợi nấm 29 2.4.3 Phương pháp khảo sát tính đối kháng Trichoderma nấm bệnh môi trường PGA 30 2.4.3.1 Nguyên tắc 30 2.4.3.2 Cách tiến hành 30 2.4.3.3 Chỉ tiêu theo dõi 30 2.4.3.4 Cách xác định hiệu đối kháng chủng Trichoderma nấm bệnh 30 2.4.4 Phương pháp xác định số lượng bào tử nấm mốc phương pháp đo OD660 nm đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu 31 2.4.4.1 Xác định số lượng bào tử nấm mốc buồng đếm hồng cầu 31 2.4.4.2 Phương pháp đo OD660 n 32 2.4.5 Phương pháp nuôi cấy bán rắn để thu nhận bào tử 32 2.5 Các phương pháp nghiên cứu 33 2.5.1 Phương pháp chọn chủng Trichoderma có khả đối kháng tốt với nấm bệnh 33 2.5.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng số điều kiện lên trình tăng sinh cấp nấm Trichoderma môi trường bán rắn 33 2.5.2.1 Ảnh hưởng loại chất riêng lẻ 33 2.5.2.2 Ảnh hưởng kết hợp loại chất 33 2.5.2.3 Ảnh hưởng độ ẩm 33 2.5.2.4 Ảnh hưởng tỷ lệ thành phần chất môi trường nuôi cấy 33 2.5.2.5 Ảnh hưởng bổ sung dung dịch khoáng vi lượng 34 2.5.3 Phương pháp tăng sinh thu bào tử cấp hai nấm Trichoderma môi trường bán rắn 34 2.5.4 Phương pháp xác định tỷ lệ sử dụng chế phẩm bào tử cấp hai phòng thí nghiệm 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 36 3.1 Tốc độ tăng trưởng môi trường PGA chủng Trichoderma chủng nấm bệnh 36 3.1.1 Tốc độ tăng trưởng môi trường PGA chủng Trichoderma 36 3.1.2 Tốc độ tăng trưởng môi trường PGA chủng nấm bệnh 37 - iii - 3.2 Khảo sát hiệu đối kháng chủng Trichoderma chủng nấm bệnh môi trường PGA 37 3.2.1 Khả đối kháng chủng Trichoderma với chủng NB01 38 3.2.2 Khả đối kháng chủng Trichoderma với NB02 40 3.2.3 Khả đối kháng chủng Trichoderma với NB03 42 3.3 Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường chọn lọc điều kiện thích hợp cho sản xuất bào tử cấp nấm Trichoderma 44 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả tạo bào tử cấp Trichoderma 44 3.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng loại chất riêng lẻ lên sản xuất nấm Trichoderma 44 3.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp loại chất 45 3.3.2 Ảnh hưởng lượng nước bổ sung vào môi trường nuôi cấy 48 3.3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ thành phần chất môi trường nuôi cấy 49 3.3.4 Ảnh hưởng khoáng vi lượng 51 3.4 Nuôi cấy thu nhận chế phẩm canh trường bào tử cấp hai chủng Trichoderma chọn lọc 53 3.4.1 Xác định lượng bào tử có chế phẩm canh trường bào tử cấp hai chủng Trichoderma 53 3.5 Khảo sát liều dùng mức độ phòng thí nghiệm chế phẩm 55 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.1.1 Khả đối kháng chủng Trichoderma chủng nấm bệnh 59 4.1.2 Thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp để thu nhận bào tử chủng Trichoderma chọn lọc 59 4.1.3 Thu nhận chế phẩm bào tử cấp hai chủng Trichoderma đánh giá hiệu chế phẩm 60 4.2 Đề nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 27 - iv - DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Một số đặc điểm nguồn nấm bệnh bệnh Sclerotium solfsii[12] 24 Bảng 1.2: Một số đặc điểm nguồn nấm bệnh bệnh Rhizoctonia[12] 24 Bảng 1.3: Một số đặc điểm nguồn nấm bệnh bệnh Phytophthora[12] 25 Bảng 1.4: Một số bệnh Hồ tiêu Việt Nam nấm có đất gây ra[30] 26 Tên bệnh 26 Triệu chứng 26 Tác nhân 26 Bảng 1.5: Một số bệnh lúa Việt Nam nấm có đất gây ra[30] 26 Bảng 1.6: Một số bệnh ngô Việt Nam nấm có đất gây ra[30] 27 Bảng 2.1: Các giống Trichoderma giống nấm bệnh dùng nghiên cứu 28 Bảng 3.1: Tốc độ tăng trưởng chủng Trichoderma môi trường PGA 36 Bảng 3.2: Tốc độ tăng trưởng chủng nấm bệnh môi trường PGA 37 Bảng 3.3: Kết đối kháng với NB01 Sclerotium rolfsii 38 Bảng 3.4: Kết đối kháng với NB02 Rhizoctonia solani 40 Bảng 3.5: Kết đối kháng với NB03 Phytophthora capsici 42 Bảng 3.6: Ảnh hưởng loại chất riêng lẻ lên tạo thành bào tử chủng Trichoderma chọn lọc 44 Bảng 3.8: Ảnh hưởng kết hợp loại chất lên tạo thành bào tử chủng T12 47 Bảng 3.9: Sự tạo thành bào tử chủng Trichoderma môi trường có lượng nước bổ sung 48 Bảng 3.10: Lượng bào tử Trichoderma thu sau nuôi cấy môi trường có tỷ lệ nguồn chất khác 50 Bảng 3.11: Lượng bào tử thu nuôi cấy chủng Trichoderma môi trường có bổ sung dung dịch khoáng khác 52 Bảng 3.12: Lượng bào tử cấp chủng Trichoderma thu chế phẩm canh trường 53 -v- Bảng 3.14: Hiệu đối kháng nấm bệnh chế phẩm canh trường bào tử cấp hai Trichoderma nấm bệnh chọn lọc tương ứng (thời gian xác định: ngày) 57 Bảng 4.1: Thành phần môi trường thích hợp để nuôi cấy nuôi cấy chủng Trichoderma 59 - vi - DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1: Hiệu ức chế chủng Trichoderma với NB01 3, ngày ủ 39 Biểu đồ 3.2: Hiệu ức chế chủng Trichoderma với NB02 3, ngày ủ 41 Biểu đồ 3.3: Hiệu ức chế chủng Trichoderma với NB03 3, ngày ủ 43 Biểu đồ 3.4: Lượng bào tử tạo thành chủng Trichoderma chất riêng lẻ 45 Bảng 3.7: Ảnh hưởng kết hợp loại chất lên tạo thành bảo tử chủng T02, T21 T27 46 Biểu đồ 3.5: Lượng bào tử tạo thành chủng T02, T21 T27 loại chất kết hợp 46 Biểu đồ 3.6: Lượng bào tử tạo thành chủng T12 loại chất kết hợp 47 Biểu đồ 3.7: Sự tạo thành bào tử chủng Trichoderma môi trường có lượng nước bổ sung khác 49 Biểu đồ 3.8: Lượng bào tử Trichoderma thu sau nuôi cấy môi trường có tỷ lệ nguồn chất khác 50 Biểu đồ 3.9: Lượng bào tử Trichoderma thu nuôi cấy môi trường có thành phần khoáng khác 52 Biểu đồ 3.11: Hiệu đối kháng chủng T27 chủng nấm bệnh 55 Biểu đồ 3.12: Hiệu đối kháng tương ứng với liều lượng sử dụng chủng T02, T12 T21 đối kháng với nấm bệnh tương ứng 57 - vii - DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1: Cấu trúc quan sinh bào tử (A) sợi tơ (B) Trichoderma [27], [31] Error! Bookmark not defined Hình 1.2: Khuẩn lạc số chủng Trichoderma môi trường Potato Glucose Agar (PGA) A: T parceromosum; B: T viride; C: T hamatum D: T resei sau ngày nuôi cấy nhiệt độ phòng (Nguyễn Xuân Ánh Nguyệt cộng sự, 2009) Error! Bookmark not defined Hình 1.3: Chu trình sống Trichoderma[32] Error! Bookmark not defined Hình 1.4: Khuẩn lạc số chủng Trichoderma môi trường Potato Glucose Agar (PGA) A: T longibrachiatum; B: T harzianum; C: T aureoviride sau ngày nuôi cấy D: T longibrachiatum sau ngày nuôi cấy nhiệt độ phòng (Nguyễn Xuân Ánh Nguyệt cộng sự, 2009) Error! Bookmark not defined Hình 1.5: Các chế kiểm soát sinh học Trichoderma[28] 17 Hình 1.6: Các hoạt động điều hòa tăng trưởng thực vật Trichoderma:[17] Error! Bookmark not defined Hình 1.9: Tỷ phần loài Trichoderma có khả kiểm soát sinh học [22] 19 Hình 1.11: Thử nghiệm ứng dụng Trichoderma để phòng trị bệnh nấm R solani quy trình trồng rau Diếp sạch[24] Error! Bookmark not defined Hình 1.12: Mầm lúa không xử lý với Trichoderma T-22[14] Error! Bookmark not defined Hình 1.13: Chu trình sống Sclerotium Error! Bookmark not defined Hình 1.14: Chu trình sống gây bệnh Rhizoctonia Error! Bookmark not defined Hình 1.15: Chu trình gây bệnh thối rễ chồi Phytophthora sp Error! Bookmark not defined Hình 1.16: Khuẩn lạc Sclerotium rolfsii hạch nấm môi trường PGA sau ngày nuôi cấy (Nguyễn Xuân Ánh Nguyệt cộng sự, 2009) Error! Bookmark not defined - viii - Hình 1.17: Khuẩn lạc Rhizoctonia solani hạch nấm môi trường PGA sau ngày nuôi cấy (Nguyễn Xuân Ánh Nguyệt cộng sự, 2009) Error! Bookmark not defined Hình 1.18: Khuẩn lạc Phytophthora capsici môi trường PGA sau ngày nuôi cấy (Nguyễn Xuân Ánh Nguyệt cộng sự, 2009) Error! Bookmark not defined Hình 2.1: Hình minh họa vị trí cấy Trichoderma nấm bệnh 30 Hình 2.2: Hình minh họa cho quy ước hiệu đối kháng 31 Hình 2.3: Sơ đồ tóm tắt bước nghiên cứu 35 Hình 3.1: Môi trường BKM-R trước sau nuôi cấy chủng T12 46 Hình 3.2: Khả kiểm soát sinh học nấm bệnh NB03 chế phẩm canh trường bào tử cấp hai chủng T21 56 - ix - -x- A B C D E F G H Hình 3.2: Khả kiểm soát sinh học nấm bệnh NB03 chế phẩm canh trường bào tử cấp hai chủng T21 A, B, C, D, E, F, G H tương ứng với tỷ lệ 0, 101, 102, 103, 104, 105, 106 107 bào tử/ml môi trường - 56 - Bảng 3.14: Hiệu đối kháng nấm bệnh chế phẩm canh trường bào tử cấp hai Trichoderma nấm bệnh chọn lọc tương ứng (thời gian xác định: ngày) Số lượng bào tử/ml PGA Chủng Trichoderma T02+NB01 T12+NB02 H (%) 60,67 51,56 10 65,11 64,44 102 62,89 71,11 103 68,89 79,11 104 81,56 83,06 105 80,56 88,44 106 81,78 88,52 107 87,50 88,89 Hiệu đối kháng (%)) H (%) T21+NB03 T27+NB01 - Không xác định đường kính khuẩn lạc - Ở tỷ lệ thấp 104 bào tử/ml môi trường PGA, nấm bệnh không phát triển mạnh khuẩn ty dinh dưỡng phát triển khuẩn ty khí sinh, dày lan rộng khắp đĩa Petri - Ở tỷ lệ từ 104 bào tử/ml trở lên, tạo thành khuẩn ty khí sinh bị ức chế Khuẩn ty khí sinh thưa dần lượng bào tử đưa vào tăng theo tỷ lệ H (%) 58,44 61,56 64,44 65,83 57,78 56,44 75,33 80,37 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 T02+NB01 T12+NB02 T21+NB03 101 102 103 104 105 106 107 108 Chủng Trichoderma đối kháng với chủng nấm bệnh tương ứng Biểu đồ 3.12: Hiệu đối kháng tương ứng với liều lượng sử dụng chủng T02, T12 T21 đối kháng với nấm bệnh tương ứng  Nhận xét Các số liệu thu cho thấy: - 57 -  Chỉ cần diện Trichoderma với lượng bào tử/ml môi trường cho khả đối kháng ức chế phát triển nấm bệnh Tuy nhiên hiệu ức chế  Khi tăng tỷ lệ sử dụng hiệu kiểm soát sinh học tăng theo Khi tăng đến tỷ lệ định hiệu kiểm soát sinh học không tăng  Tất chế phẩm từ T02, T12 T27 cho hiệu kiểm soát sinh học ổn định từ tỷ lệ 10 bào tử/ml môi trường PGA nấm bệnh chọn lọc tương ứng Riêng NB03 (hình 3.2), chế phẩm Trichoderma chọn lọc tương ứng (canh trường nuôi cấy bào tử cấp từ chủng T21) sau ngày chưa thể rõ hiệu kiểm soát sinh học, sau ngày, tỷ lệ sử dụng từ 104 bào tử/ml PGA trở lên cho thấy tơ khí sinh chủng nấm bệnh bị phân hủy dần theo thời gian tỷ lệ sử dụng chế phẩm  Các số liệu bảng 3.14 cho thấy với chế phẩm từ T02, hiệu đối kháng với NB01 thể mức tốt đến cực tốt lượng bào tử môi trường tương ứng 10 bào tử/ml môi trường 104 bào tử/ml môi trường Với chế phẩm từ T12 kết tương ứng NB02 đạt tỷ lệ 10 bào tử/ml môi trường 103 bào tử/ml môi trường Riêng chế phẩm từ chủng T27, để đối kháng NB01 mức tốt cần liều lượng 10 bào tử/ml môi trường Tuy nhiên, để đạt mức cực tốt phải dùng đến 106 bào tử/ml môi trường  Kết thu cho thấy bước đầu xác định khoảng tỷ lệ sử dụng có hiệu chế phẩm từ chủng Trichoderma sau: o Chế phẩm bào tử cấp hai T02: 10-104 bào tử/ml môi trường o Chế phẩm bào tử cấp hai T12: 10-103 bào tử/ml môi trường o Chế phẩm bào tử cấp hai T21: > 104bào tử/ml môi trường o Chế phẩm bào tử cấp hai T27: 10-106 bào tử/ml môi trường - 58 - CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Trải qua trình tìm hiểu nghiên cứu, rút kết luận sau: 4.1.1 Khả đối kháng chủng Trichoderma chủng nấm bệnh Dựa vào đặc điểm phát triển chủng nấm bệnh khảo sát đĩa petri môi trường PGA  Đối với NB01 (Sclerotium rolfsii): phần lớn chủng Trichoderma thể tính đối kháng tốt với nấm bệnh (trừ T26) Trong số chủng Trichoderma nghiên cứu, sau ngày ủ, nhận thấy chủng T11, T27, T15 T02 có mức đối kháng tốt với NB01 với hiệu suất tương ứng 61,11%; 62,44%; 63,70% 65,78 %  Các chủng T02, T12, T21 T27 thể khả đối kháng tốt với chủng NB02 (Rhizoctonia solani) xác định sau ngày ủ Trong T27 có hiệu suất cao (65,11%)  Ngược với nấm bệnh Rhizoctonia solani Sclerotium rolfsii nấm bệnh Phytophthora capsici phát triển nhanh, gây khó khăn cho chủng Trichoderma cạnh tranh mặt dinh dưỡng không gian môi trường sống lại dễ bị ức chế bị hầu hết chủng Trichoderma đối kháng tốt thời điểm 5-7 ngày (trừ T26) 4.1.2 Thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp để thu nhận bào tử chủng Trichoderma chọn lọc Bảng 4.1: Thành phần môi trường thích hợp để nuôi cấy chủng Trichoderma T02 CM XD H2 O MS4 : : : : Thành phần môi trường nuôi cấy chủng Trichoderma T12 T21 T27 6,3g 2,7g 6g 5g BKM R H2 O MS4 : : : : 6,3g 2,7g 6g 5g CM XD H2 O MS4 : : : : 6,3g 2,7g 6g 5g CM XD H2 O MS4 : : : : 8g 2g 5g 5g (Tỷ lệ bào tử ban đầu 105 bào tử/10g môi trường; thời gian nuôi cấy ngày) - 59 - 4.1.3 Thu nhận chế phẩm bào tử cấp hai chủng Trichoderma đánh giá hiệu chế phẩm Các chế phẩm bào tử cấp hai chủng Trichoderma chọn lọc thu có hiệu đối kháng không thay đổi đáng kể so với bào tử cấp bào tử từ ống nghiệm Thí nghiệm đánh giá mức độ phòng thí nghiệm cho thấy tỷ lệ sử dụng tối thiểu để kiểm soát nấm bệnh chọn lọc tương ứng 10 bào tử/ml môi trường PGA chế phẩm bào tử cấp hai từ chủng Trichoderma T02, T12 T27 104 bào tử/ml môi trường PGA chế phẩm bào tử cấp hai từ chủng Trichoderma T21 4.2 Đề nghị Qua trình nghiên cứu, nhận thấy rằng, để kết thí nghiệm có ý nghĩa thiết thực hơn, cần phải tiếp tục giải nhiều vấn đề như:  Ngoài nguồn chất mà khảo sát có số chất khác như: bã mía, mạt cưa, than bùn… Những loại chất đáng để quan tâm khảo sát Bên cạnh đó, việc khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến tạo bào tử chủng Trichoderma điều kiện sấy khô, bảo quản chế phẩm bào tử cần thiết  Như biết, nguồn gen chủng Trichoderma phong phú Vì vậy, cần phải khảo sát nhiều nguồn phân lập khác để tận dụng tối đa ưu điểm chúng việc kiểm soát nấm bệnh  Các chủng Trichoderma chọn lọc có khả ức chế tốt ba chủng nấm bệnh nghiên cứu Tuy nhiên, chủng Trichoderma có hiệu đối kháng khác với chủng nấm bệnh nguồn phân lập nấm bệnh Vì vậy, cần khảo sát khả ức chế chủng Trichoderma với số loại nấm bệnh gây hại trồng khác  Thử nghiệm thực tế khả ức chế nấm bệnh chế phẩm thu đồng ruộng Khảo sát khả gây bệnh thời gian ảnh hưởng lên thực vật chủng nấm bệnh nhằm xác định thời điểm phù hợp nâng cao hiệu sử dụng chế phẩm - 60 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Lester W Burgess, Timothy E Knight, Len Tesoriero Phan Thúy Hiền, 2009 Cẩm nang chuẩn đoán bệnh Việt Nam NXB Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc tế Australia (ACIAR), trang 106-130 Bùi Xuân Đồng, 1982 Nhóm nấm Hyphomycetes Việt Nam, tập NXB Đại học khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Mùi, 2001 Thực hành hóa sinh học NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Ngọc Phúc, 2005 Khảo sát phân bố chủng Trichoderma tỉnh miền Đông Nam Bộ đánh giá khả đối kháng số loài nấm gây bệnh trồng Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Nông lâm, Tp Hồ Chí Minh Đỗ Hoành Quân, 2007 Khảo sát khả sinh tổng hợp cellulase từ số chủng nấm mốc Trichoderma Khóa luận cử nhân khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp Hồ Chí Minh Từ Thị Tân Xuân, 2009 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm sinh học từ Trichoderma ứng dụng phòng trừ nấm bệnh thực vật Khóa luận cử nhân khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng nước Abou-Zeid A.M., Altalhi A.D and Abd El-Fattah R.I., 2008 Fungal control of pathogenicfungi isolated from some wild plants in Taif Governorate, Saudi Arabia Mal J Microbiol., Vol 4: 30-39 Amira M Abu-Taleb and Amal A Al-Mousa, 2008 Evaluation of antifungal activity of vitavax and Trichoderma viride against two wheat root rot pathogens Journal of Applied Biosciences, Vol 6: 140–149 A Sivan, Y.Elad and I Chet, 1984 Biological control effects of a new isolate of Trichoderma harzianum on Pythium aphanidermatum Phytopathology, Vol 74: 498-501 10 A T Adekunle, T Ikotun, D.A Florini and K.F Cardwell, 2006 Field evaluation of selected formulations of Trichoderma species as seed treatment to control damping-off of cowpea caused by Macrophomina phaseolina African Journal of Biotechnology, Vol 5: 419-424 11 Emma W Gachomo and Simeon O Kotchoni, 2008 The use of Trichoderma harzianum and T viride as potential biocontrol agents against peanut microflora and their effectiveness reducing aflatoxin contamination of infected kernels Biotechnology, Vol 7:439-447 - 61 - 12 Emmanuel Bourguignon, 2008 Ecology and diversity of indigenous Trichoderma species in vegetable cropping systems Lincoln University, Canterbury, New Zealand 13 Enrique Monte, 2001 Understanding Trichoderma: between biotechnology and microbial ecology Int Microbiol, Vol 4: 1-4 14 Gary E Harman, Charles R.Howelf, Ada Viterbo, Ilan Chet and Matteo Lorito, 2004 Trichoderma species – opportunistic, avirulent plant symbionts, Vol 2: 4356 15 Gary E Harman, Thomas Björkman, Kristen Ondik and Michal Shoresh, 2008 Changing Paradigms on the mode of action and uses of Trichoderma spp for biocontronl Outlooks on Pest Management, p 1-5 16 L.L Burpee, 1990 The influence of abiotic factors on biological control of soilborne plant pathogenic fungi Canadian Journal of Plant Pathology, Vol 12: 308-317 17 Mausam Verma, Satinder K Brar, R.D Tyagi, R.Y Surampalli and J.R Valéro, 2007 Antagonistic fungi, Trichoderm spp.:Panoply of biological control Biochemical Engineering Journal, Vol 37: 1-20 18 M Badri, M R Zamani and M Motallebi, 2007 Effect of plant growth regulators on in vitro biological control of Fusarium oxysporum by Trichoderma harzianum (T8) Pakistan Journal of Biological Sciences, Vol 10: 2850-2855 19 M Benuzzi and A Minuto e M.L Gullino, 2004 Biological agents for the control of soil-borne pathogens International Workshop: “The Production in Greenhouse after the Era of the Methyl Bromide”, Comiso, Italy 20 N.H Aziz, M.Z El-Fouly, A.A El-Essawy and M.A Khalaf, 1997 Influence of bean seddling root exudates on the rhizophere colonization by Trichoderma lignorum for the control of Rhizoctonia solani Bot Bull Acad., Vol 38: 33-39 21 Paul K Taurus, Sumesh C Chhabra, Caroline Lang’at-Thoruwa and Alphonse W Wanyonyi, 2004 Fermentation and antimicrobial activities of extracts from different species of fungus belonging to genus Trichoderma African Journal of Health Sciences, Vol 11: 33-42 22 Quirico Mighell and Giovanni Antonio Farris, 2007 Biodiversity of the genus Trichoderma and identification of marker genes involved in the antagonism between Trichoderma spp and plant pathogenic fungi Universita’ degli studi di sassari 23 Radwan M Barakat, Fadel Al-Mahareeq and Mohammad I Al-Masri, 2006 Biological control of Sclerotium rolfsii by using indigenous Trichoderma spp isolates from Palestine Hebron University Research jourmal, Vol 2: 27-47 24 Research institute of vegetable crops instytut warzywnictwa skierniewice, 2007 Vegetable crops reaearch bulletin Printed in RIVC – Skierniewice, Poland 25 Rita Noveriza and Tricita H Quimio, 2004 Soil mycoflora of black pepper Rhizosphere in the Philippines and their in vitro antagonism against - 62 - Phytophthora capsici L University of the Philippines Los Banos, Laguna 4031, Philippines 26 Ronghua Cao, Xiaoguang Liu, Kexiang Gao, Kurt Mendgen, Zhensheng Kang, Jainfeng Gao, Yang Dai and Xue Wang, 2009 Mycoparasitism of endophytic fungi isolated from reed and soilborne phytopathogenic fungi and production of cell wall-degrading enzymes in vitro Curr Microbiol, Springer Science 27 Tahía Benítez, Ana M Rincón, M Carmen Limón and Antonio C Codón, 2004 Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains International Microbiology, Vol 7: 249-260 28 Zamir K Punja and Raj S Utkhede, 2003 Using fungi and yeasts to manage vegetable crop diseases TRENDS in Biotechnology, Vol 21: 400-405 Tài liệu từ internet 29 http://sokhoahoccn.angiang.gov.vn/xemnoidung.asp?maidtt=1634 30 http://www.ctu.edu.vn/colleges/agri/gtrinh 31 http://images.google.com.vn/imgres?imgurl 32 http://www.vcharkarn.com/uploads/70/70435.gif - 63 - PHỤ LỤC Phụ lục 3: Tương quan DOD log10 lượng bào tử chủng Trichoderma chọn lọc Bảng phụ lục 3.1: Kết số lượng bào tử T02 đếm tương ứng với OD OD 0,108 0,2 0,307 0,402 0,498 a 9,5 13,9 23,5 40,6 50,4 N 2375000 3475000 5875000 10150000 12600000 logN 6,375664 6,540955 6,769008 7,006466 7,100371 7,4 7,2 logN R = 0.9948 6,8 6,6 6,4 6,2 0,1 0,2 0,3 DOD 0,4 0,5 0,6 Đồ thị phụ lục 3.1: Đồ thị tương quan OD log số lượng bào tử chủng T02 Bảng phụ lục 3.2: Kết số lượng bào tử T12 đếm tương ứng với OD OD 0,100 0,205 0,297 0,394 0,507 a 3,6 6,7 11,2 22,2 32,2 N 900000 1675000 2800000 5550000 8050000 5,954243 6,224015 6,447158 6,744293 6,905796 logN 7,2 R = 0,9888 logN 6,8 6,6 6,4 6,2 5,8 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 DOD Đồ thị phụ lục 3.2: Đồ thị tương quan OD log số lượng bào tử chủng T12 Bảng phụ lục 3.3: Kết số lượng bào tử T21 đếm tương ứng với OD OD 0,203 0,302 0,402 0,501 a 8,1 12,8 20,9 31,7 59,6 N 2025000 3200000 5225000 7925000 14900000 logN 6,306425 6,505150 6,718086 6,898999 7,173186 logN 0,099 7,2 7,1 6,9 6,8 6,7 6,6 6,5 6,4 6,3 R = 0.9872 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 DOD Đồ thị phụ lục 3.3: Đồ thị tương quan OD log số lượng bào tử chủng T21 Bảng phụ lục 3.4: Kết số lượng bào tử T27 đếm tương ứng với OD OD 0,100 0,206 0,305 0,393 0,495 a 12,3 23,9 43,9 61,0 97,3 N 3.075.000 5.975.000 10.975.000 15.250.000 24.325.000 logN 6,487845 6,776338 7,040405 7,183270 7,386053 7,6 7,4 R = 0,9894 logN 7,2 7,0 6,8 6,6 6,4 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 D OD Đồ thị phụ lục 3.4: Đồ thị tương quan OD log số lượng bào tử chủng T27 Phụ lục 2: Công thức loại dung dịch khoáng bổ sung Bảng phụ lục 2.1: Công thức loại môi trường khoáng bổ sung vào môi trường tăng sinh chủng Trichoderma chọn lọc TT MT Công thức Tác giả Thành phần A T Adekunle MS1 cộng (2006) M Badri cộng MS2 (2007) Ronghua Cao MS3 cộng (2009) Ronghua Cao MS4 cộng (2009) KNO3 KH2PO4 MgSO4 khan FeCl3 Nước cất đủ Urea KH2PO4 (NH4)2SO4 CaCl2.H2O MgSO4 khan FeSO4.7H2O ZnSO4.H2O CoCl2.6H2O Nước cất đủ NH4NO3 K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O KCl CaCl2 FeSO4.7H2O ZnSO4.7H2O Nước cất đủ (NH4)2SO4 Peptone Cao men K2HPO4 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O Tween 20 Nước cất đủ ĐVT g g g mg ml g g g g g g mg mg ml g g g g g g g g ml g g g g g g g ml TLTK Số lượng 10,00 5,00 1,30 20,00 250,00 0,60 4,00 2,80 0,60 0,20 0,01 2,80 3,20 250,00 1,00 0,87 0,68 0,20 0,20 0,20 0,002 0,002 250,00 2,00 3,00 0,50 0,40 0,30 0,30 0,200 250,00 10 18 26 26 Phụ lục 1: Công thức loại môi trường bán rắn Bảng phụ lục 3.1: Công thức loại môi trường dùng nghiên cứu MT PGA BR01 BR02 BR03 BR04 BR05 BR06 BR07 BR08 BR09 BR10 BR11 BR12 Công thức Thành Số ĐVT phần lượng Khoai tây Glucose Agar Bã khoai mì Nước Cám gạo Nước Cám mì Nước Rơm Nước Trấu Nước Xơ dừa Nước Cám mì Trấu Nước Cám mì Rơm Nước Cám mì Xơ dừa Nước Bã khoai mì Rơm Nước Bã khoai mì Trấu Nước Bã khoai mì Xơ dừa Nước g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 200,00 20,00 20,00 8,00 12,00 8,00 12,00 8,00 12,00 8,00 12,00 8,00 12,00 8,00 12,00 4,00 4,00 12,00 4,00 4,00 12,00 4,00 3,50 12,50 3,50 3,50 13,00 3,50 3,50 13,00 3,50 3,50 13,00 MT BR13 BR14 BR15 BR16 BR17 BR18 BR19 BR20 BR21 BR22 BR23 Công thức Thành Số ĐVT phần lượng Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 5,50 5,50 9,00 5,00 5,00 10,00 4,50 4,50 11,00 4,00 4,00 12,00 3,50 3,50 13,00 6,00 4,00 10,00 7,00 3,00 10,00 8,00 2,00 10,00 9,00 1,00 10,00 5,40 3,60 11,00 6,30 2,70 11,00 BR24 BR25 BR26 BR27 BR28 BR30 BR31 BR32 BR33 BR34 BR35 Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Bã khoai mì Rơm Nước Bã khoai mì Rơm Nước Bã khoai mì Rơm Nước Cám mì Xơ dừa Nước MS1 Cám mì Xơ dừa Nước MS2 Cám mì Xơ dừa Nước MS3 Cám mì Xơ dừa Nước MS4 Cám mì Xơ dừa Nước MS1 Cám mì Xơ dừa Nước MS2 g g g g g g g g g g g g g g g g g g ml g g g ml g g g ml g g g ml g g g ml g g g ml 7,20 1,80 11,00 8,10 0,90 11,00 4,00 4,00 12,00 4,50 4,50 11,00 5,00 5,00 10,00 8,00 2,00 5,00 5,00 8,00 2,00 5,00 5,00 8,00 2,00 5,00 5,00 8,00 2,00 5,00 5,00 6,30 2,70 6,00 5,00 6,30 2,70 6,00 5,00 BR36 BR37 BR38 BR39 BR40 BR41 BR42 BR43 BR44 BR45 BR46 Cám mì Xơ dừa Nước Cám mì Xơ dừa Nước Bã khoai mì Rơm Nước Bã khoai mì Rơm Nước Bã khoai mì Rơm Nước Cám mì Xơ dừa Nước MS3 Cám mì Xơ dừa Nước MS4 Bã khoai mì Rơm Nước MS1 Bã khoai mì Rơm Nước MS2 Bã khoai mì Rơm Nước MS3 Bã khoai mì Rơm Nước MS4 g g g g g g g g ml g g ml g g g g g g ml g g g ml g g ml ml g g ml ml g g ml ml g g ml ml 6,00 6,00 8,00 3,00 3,00 14,00 6,00 6,00 8,00 3,00 3,00 4,00 5,50 5,50 9,00 6,30 2,70 6,00 5,00 6,30 2,70 6,00 5,00 4,50 4,50 6,00 5,00 4,50 4,50 6,00 5,00 4,50 4,50 6,00 5,00 4,50 4,50 6,00 5,00 [...]... khả năng kháng nấm và tạo chế phẩm sinh học từ Trichoderma với mục tiêu sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma có khả năng kiểm soát nấm gây bệnh thực vật và gồm các nội dung nghiên cứu sau:  Đánh giá khả năng đối kháng của một số chủng Trichoderma đối với một vài nấm bệnh tiêu biểu  Chọn lọc và nghiên cứu điều kiện thích hợp để sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma có khả năng kiểm soát nấm bệnh -... nghiệp và cây hoa kiểng… Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế Trong đó chủ yếu là cơ chế phòng trừ nấm bệnh của nấm đối kháng Trichoderma là tại những điểm tiếp xúc trực tiếp của Trichoderma với nấm bệnh sẽ làm cho nấm bệnh teo đi và chết, đây là hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma Ngoài ra, nấm Trichoderma còn có khả năng sinh các chất kháng sinh nên dù không tiếp xúc trực tiếp nấm. .. Brian và Mc Growan cô lập Viridian Dennis và Webster ghi nhận Trichoderma spp có sản phẩm kháng khác với Gliotoxin và Viridian, sản phẩm đó là chất kháng sinh - 18 - Ngoài chất độc là chất trao đổi và kháng sinh ra, Trichoderma còn có thể tiết ra nhiều enzyme khác như exo và endoglucanase, cellulase và chitinase có khả năng phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh Trong quá trình ký sinh trên nấm bệnh, Trichoderma. .. vật[4] Một trong những nghiên cứu về ứng dụng của Trichoderma spp được quan tâm nhiều nhất đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số nấm bệnh ở thực vật Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loài Trichoderma spp khác nhau để kiểm soát nhiều loại nấm bệnh khác nhau Hình 1.9: Tỷ phần các loài Trichoderma có khả năng kiểm soát sinh học [22] Hiện nay các chủng Trichoderma spp đã được... phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Phương pháp chọn chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các nấm bệnh Tiến hành xác định hiệu quả đối kháng của 8 chủng Trichoderma với 3 loài nấm bệnh theo mục 2.4.4 Dựa vào hiệu quả đối kháng, chọn được các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các nấm bệnh 2.5.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện lên quá trình tăng sinh cấp một nấm Trichoderma. .. trong nấm gây bệnh bị phân hủy và dẫn đến nấm bệnh chết Sau đó, quan sát dưới kính hiển vi, hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma được mô tả như sau: tại những điểm nấm Trichoderma tiếp xúc với nấm gây bệnh đã làm cho nấm gây bệnh teo lại và chết (Dubey, 1995; Rousscu và cộng sự, 1996) Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma, nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho... Trichoderma thuộc loại nấm có khả năng đối kháng, nhóm nấm này thuộc hệ vi sinh vật đất (Pomsch và cộng sự 1920), chúng thường tiết ra các men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc nấm mà chúng kháng, cạnh tranh điều kiện sống với nấm gây bệnh Sự phân bố của các loài nấm đối kháng này phụ thuộc vào vùng địa lý, loại đất, điều kiện khí hậu và thảm thực vật ở từng khu vực Trichoderma là vi nấm ưa ẩm, chúng... chuyển gen Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hóa các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh L.Grange và cộng sự đã nghiên cứu biểu hiện gen  – xylanase (XYN2) của Trichoderma reesei ở... sợi nấm bệnh, ký sinh trên nấm bệnh và cạnh tranh dinh dưỡng, không gian với chúng Tuy nhiên, việc ứng dụng các sản phẩm vào nông nghiệp vẫn còn hạn chế do nhiều nguyên nhân như thiếu nguồn cung cấp chế phẩm, chế phẩm không đa dạng, chi phí đầu tư ban đầu cao cũng như thói quen sử dụng các sản phẩm hóa học của người nông dân Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu khả năng. .. triển của Trichoderma Sự phụ thuộc của sự phát triển cũng như hiệu quả đối kháng này vào môi trường là một trong những khó khăn để đưa vào ứng dụng các chế phẩm Trichoderma 1.1.6 Một số sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma[ 4] Trichoderma là một trong số những nhóm vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại kháng sinh khác nhau Weindling là tác giả đầu tiên công bố được sản phẩm trao đổi của Trichoderma ... đề tài: Nghiên cứu khả kháng nấm tạo chế phẩm sinh học từ Trichoderma với mục tiêu sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma có khả kiểm soát nấm gây bệnh thực vật gồm nội dung nghiên cứu sau: ... xuất chế phẩm sản phẩm điều nhà nghiên cứu quan tâm sâu sắc.[19] Ứng dụng chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma vào nông nghiệp nói bước đầu đáp ứng yêu cầu Số liệu thống kê cho thấy số chế phẩm sinh. .. nấm bệnh khác Hình 1.9: Tỷ phần loài Trichoderma có khả kiểm soát sinh học [22] Hiện chủng Trichoderma spp sử dụng rộng rãi chế phẩm sinh học thương mại như: chế phẩm sinh học BIMA (có chứa Trichoderma)