Nghiên cứu khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc

Với những ứng dụng trong thực tiễn của chitosan và nano bạc chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu luận văn với tiêu đề: “Nghiên cứu khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – n

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HỒNG LINH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MEN CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoá học : 2010 - 2014

Thái Nguyên, năm 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HỒNG LINH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MEN CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoá học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : ThS Lương Hùng Tiến : ThS Nguyễn Thị Đoàn Khoa CNSH - CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa hề sử dụng để bảo vệ một học vị nào Trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thiện luận văn mọi sự giúp đỡ đều đã được cám ơn và các trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Linh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều của các cá nhân và tập thể Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn ThS Lương Hùng Tiến – Khoa CNSH – CNTP, cô giáo hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Đoàn – Khoa CNSH – CNTP, người đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa CNSH – CNTP

đã giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các bạn trong nhóm sinh viên thực tập tại phòng Thí nghiệm vi sinh và các sinh viên thuộc lớp K42CNSH

đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn Khoa CNSH – CNTP cung cấp địa điểm thực tập để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Trong quá trình thực tập tôi xin cảm ơn sự động viên của gia đình và bạn bè

Dù cố gắng nhiều, xong bài khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế Kính mong nhận được sự chia sẻ và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy, cô giáo và các bạn

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Linh

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Hàm lượng chitin trong vỏ một số động vật giáp xác 4

Bảng 2.2: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích 13

Bảng 2.3: Số nguyên tử và năng lượng bề mặt của hạt nano bạc 17

Bảng 3.4: Phương pháp phối hợp chitosan - nano bạc 28

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến hiệu quả kháng S cerevisiae 31

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến hiệu quả kháng Pichia 32

Bảng 4.3: Kết quả kháng S cerevisiae của các nồng độ chitosan 34

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hiệu quả kháng Pichia 35

Bảng 4.5: Tỷ lệ phức hợp chitosan - bạc với S cerevisiae 36

Bảng 4.6: Kết quả kháng Pichia của phức hợp chitosan - nano bạc 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của Chitin 4

Hình 2.2: Cấu trúc hóa học của Chitosan 5

Hình 2.3: Hiện tượng cộng hưởng plasmon của hạt hình cầu 15

Hình 2.4: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc 18

Hình 2.5: Nấm men Pichia 21

Hình 2.6 : Nấm men S cerevisiae 22

Hình 3.4: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng VSV của nano bạc – chitosan 28 Hình 4.1: Khả năng kháng S cerevisiae của nano bạc 31

Hình 4.2: Khả năng kháng Pichia của nano bạc 32

Hình 4.3: Khả năng kháng S cerevisiae của chitosan 33

Hình 4.4: Khả năng kháng Pichia của chitosan 34

Hình 4.5: Khả năng kháng S cerevisiae của phức chất 36

Hình 4.6: Khả năng kháng Pichia của phức chất 37

Hình 4.7: Khả năng kháng S cerevisiae của chế phẩm kết hợp chitosan – nano bạc 39

Hình 4.8: Khả năng kháng Pichia của chế phẩm kết hợp chitosan – nano bạc 39

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

S cerevisiae Saccharomyces cerevisiae E.coli Escherichia coli

MIC Minimal Inhibitory concentrations

MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.Tổng quan về chitosan 3

2.1.1 Nguồn gốc của Chitin và chitosan 3

2.1.2 Cấu trúc hóa học của chitosan 4

2.2.3 Tính chất cơ bản của chitosan 5

2.2.4 Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn của chitosan 8

2.1.4 Ứng dụng của chitosan 9

2.2 Giới thiệu chung về nano bạc 11

2.2.1 Giới thiệu về công nghệ nano 11

2.2.2 Giới thiệu về bạc kim loại 12

2.2.3 Giới thiệu về hạt nano bạc 14

2.3 Tổng quan về nấm men 20

2.3.1 Nấm men Pichia 20

2.3.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 22

2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 23

2.4.1 Tình hình nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan, nano bạc trên thế giới 23

2.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 24

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Vật liệu nghiên cứu 25

3.1.1 Chủng nấm men 25

3.1.2 Môi trường nuôi cấy 25

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị 25

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

3.3 Nội dung nghiên cứu 26

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26

3.4.2 Phương pháp phân tích 29

3.4.3 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 30

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 31

4.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men 31

4.1.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với S cerevisiae 31 4.1.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với Pichia 32

4.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan đối với nấm men 33

4.2.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan đối với S cerevisiae 33

4.2.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan đối với Pichia 34

4.3 Lựa chọn công thức phối trộn nano bạc với chitosan kháng lại nấm men 35

4.3.1 Xác định khả năng kháng S cerevisiae của phức chất chitosan - nano bạc 35

4.3.2 Xác định khả năng kháng Pichia của phức hợp chitosan - nano bạc 36

4.4 Khả năng kháng nấm men của chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc theo thời gian 38

4.4.1 Khả năng kháng S cerevisiae của chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc theo thời gian 38

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

Bạc từ lâu đã được biết tới là một chất diệt khuẩn hiệu quả và được sử dụng để làm các dụng cụ sinh hoạt Tuy nhiên, trước đây đồ dùng bằng bạc không được sử dụng rộng rãi do giá thành cao Từ khi công nghệ Nano ra đời thì ứng dụng của bạc mới phát triển lên một tầm cao mới Sở dĩ nano bạc được nghiên cứu ứng dụng vào việc kháng khuẩn vì bạc là kháng sinh tự nhiên và không gây tác dụng phụ Nano bạc không gây phản ứng phụ, không gây độc cho người và vật nuôi khi nhiễm lượng nano bạc bằng nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ < 100ppm) Dạng phân tán với kích thước nanomet thì khả năng diệt khuẩn của bạc được tăng lên gấp bội nhờ diện tích bề mặt riêng (m2/g) tăng nhanh Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ở kích thước nano (từ

1 – 100 nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50000 lần so với bạc dạng khối, như vậy 1 g bạc Nano có thể sát khuẩn cho hàng trăm m2 chất nền Điều này sẽ giúp cho khối lượng bạc sử dụng trong các sản phẩm sẽ giảm rất mạnh nên tỷ trọng của bạc trong giá thành trở nên không đáng kể [3] Với những ứng dụng trong thực tiễn của chitosan và nano bạc chúng tôi

đã tiến hành nghiên cứu luận văn với tiêu đề: “Nghiên cứu khả năng kháng

nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc”.Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở dữ liệu cho việc nghiên cứu tạo ra một chế phẩm phối hợp kháng vi sinh vật hoàn thiện giữa chitosan – nano bạc ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm

-Đưa ra cơ chế kháng nấm men của chitosan, nano bạc

-Đưa ra nồng độ tối thiểu của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc để

ức chế nấm men

-Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các quy trình, các thao tác kỹ thuật trong thực tế Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học, sinh viên sẽ có những hiểu biết chuyên sâu và cái nhìn tổng quát hơn

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

-Ứng dụng sử dụng chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc trong việc chế tạo vật liệu kháng khuẩn, bảo quản

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.Tổng quan về chitosan

2.1.1 Nguồn gốc của Chitin và chitosan

Chitin được Bracannot phát hiện lần đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch chiết của một loại nấm và đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm

ra nó Năm 1823 Odier đã phân lập được một chất từ bọ cánh cứng và ông gọi

là chitin hay “chitine” có nghĩa là lớp vỏ nhưng ông không phát hiện sự có mặt của nitơ Cuối cùng cả Bracannot và Odier đều cho rằng cấu trúc của chitin giống cấu trúc của cellulose [9]

Năm 1929 Karrer đun sôi chitin 24h trong dung dịch KOH 5% và đun tiếp 50 phút ở 160oC với kiềm bão hòa và ông đã thu được sản phẩm có phản ứng màu đặc trưng của thuốc thử, chất đó chính là chitosan Việc nghiên cứu

về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX

Chitin là một polysaccharide tự nhiên quan trọng với số lượng lớn đứng thứ hai sau cellulose Chitin tồn tại trong động vật, một số loại nấm [9]

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của một số động vật không xương sống như: Côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong động vật bậc cao monomer của chitin là thành phần chủ yếu trong

mô da, nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da

Ngoài ra chitin còn có trong màng tế bào nấm họ Zygemycetes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo Trong nấm men Saccharomyces cerevisiae

chitin chiếm 5% trọng lượng khô của thành tế bào Hầu hết chitin nằm giữa các sẹo chồi, chỉ một phần nhỏ phân bố ở phần khác trên thành tế bào [3] Trong các loài thủy sản đặc biệt là vỏ tôm, cua, mực hàm lượng chitin khá cao khoảng 3 – 41% so với trọng lượng khô Vì vậy vỏ của chúng là nguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất chitin [9]

Bảng 2.1: Hàm lượng chitin trong vỏ một số động vật giáp xác [18] STT

Phân loại Hàm lượng chitin theo trọng

số giống nấm như Mucorales Tuy nhiên phần lớn chitosan hiện nay được thu

nhận và sử dụng lại chủ yếu từ quá trình deacetyl hóa chitin

2.1.2 Cấu trúc hóa học của chitosan

Chitosan thu được từ quá trình deacetyl hóa chitin, thay thế nhóm acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2

N-Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin [9]

Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit

2-amino-2-deoxy-β-D-Công thức cấu tạo của chitin và chitosan:

Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của Chitin

Hình 2.2: Cấu trúc hóa học của Chitosan

Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose

poly(1-4)-Công thức phân tử: [C6H11O4N]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp

2.2.3 Tính chất cơ bản của chitosan

nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của chitosan sau này [8] Mức độ deacetyl hóa của chitin vào khoảng trên 50% thì gọi là chitosan, nhỏ hơn 50% gọi là chitin Khi ở mức độ acetyl hóa thấp, chitosan có khả năng hút ẩm lớn hơn [20]

c) Trọng lượng phân tử

Chitosan là polymer sinh học có khối lượng phân tử cao Chitosan thương phẩm có khối lượng khoảng 100.000 – 1.200.000 Dalton, phụ thuộc vào quá trình chế biến và loại sản phẩm Trọng lượng phân tử khác nhau dẫn đến đặc tính của từng loại chitosan khác nhau, người ta thường phân loại chitosan dựa vào trọng lượng phân tử Khối lượng chitosan có thể xác định bằng phương pháp sắc kí, phân tán ánh sáng hoặc đo độ nhớt [22]

H H

C H2O H O

O H

H H O

H H

C H2O H

n

d) Độ nhớt

Độ nhớt là yếu tố quan trọng để xác định khối lượng phân tử của chitosan [5] Chitosan phân tử lượng cao thường làm cho dung dịch có độ nhớt cao Quá trình chế biến ảnh hưởng và quyết định đến độ nhớt của chitosan

e) Tính tan

Chitin tan hầu hết trong các dung môi hữu cơ, trong khi đó chitosan tan trong các dung dịch axit, dung dịch đệm có pH dưới 6 [22] Các axit hữu cơ như axit acetic, axit formic, axit lactic thường để hòa tan chitosan Ở pH cao,

có thể xảy ra hiện tượng kết tủa hoặc đông tụ, nguyên nhân là do hình thành hỗn hợp ply_ion với chất keo anion Tuy nhiên tính tan của dung dịch còn bị ảnh hưởng bởi mức độ acetyl hóa

f) Tỷ trọng

Tỷ trọng của chitin từ tôm và cua thường là 0,06 và 0,17g/ml, điều này cho thấy chitin từ tôm xốp hơn cua Như vậy do loài giáp xác hoặc phương pháp chế biến, mức độ acetyl hóa ảnh hưởng lớn đến tỷ trọng của chitosan [18]

g) Khả năng kết hợp với nước (WBC) và khả năng kết hợp với chất béo (FBC)

Khả năng kết hợp với nước của chitosan lớn hơn rất nhiều so với cellulose hay chitin Thông thường, khả năng hấp thụ nước của chitosan khoảng 581 – 1150% (trung bình là 702%) phụ thuộc vào từng sản phẩm Quá trình sản xuất chitosan có nhiều giai đoạn, thay đổi thứ tự sản xuất cũng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng giữ nước và giữ chất béo [18]

Khả năng kết hợp với chất béo của các chế phẩm chitosan trong khoảng 370,2 – 665,4%

2.2.3.2 Tính chất hóa học

Chitosan chứa nhiều nhóm –NH2 nên có thể tan trong dung dịch acid Khi tan trong dung dịch acid, chitosan tạo gel có thể tráng mỏng thành màng Ứng dụng tính chất này nên chitosan được dùng để tạo màng không thấm bảo quản rứng, trái cây hay dùng hỗ trợ trong điều trị viêm loét dạ dày, tá tràng (trong môi trường acid của dạ dày, chitosan tạo gel che phủ, bảo vệ niêm mạc) [20]

Trong phân tử chitin/chitosan có chứa các nhóm –OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-axetyl-D-glucozamin và nhóm –OH, nhóm –NH2 trong các mắt xích D-glucozamin có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là amit Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế -O, -N [18]

Mặt khác chitin/chitosan là những polyme mà các monomer được nối với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycozit, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học như: acid, bazơ, tác nhân oxy – hóa và các ezyme thủy phân Ngoài ra chitosan còn có khả năng hấp thụ tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp của chitin-chitosan Trong phân tử chitin/chitosan và một số dẫn xuất của chitin có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử oxy và nitơ của nhóm chức còn có cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+, Cd2+, Cu2+, Ni2+, Co2+… Tùy nhóm chức trên mạch polime mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau [18] Hơn nữa chitosan và các ion kim loại như Ag+, Cu2+, Ni2+, có tính chất khử trùng và diệt khuẩn, sau khi chitosan liên kết với các ion kim loại nhờ oxy hay nitơ, các liên kết ràng buộc làm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn, đây là một tính chất tốt, sẽ thuận lợi cho các ứng dụng trong nông nghiệp, y tế công nghiệp cũng như công nghiệp thực phẩm [22]

2.2.2.3 Tính chất sinh học

Chitosan không độc, dùng an toàn cho người [20] Chúng có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể [17], có khả năng tự phân huỷ sinh học [15] Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u [13]

Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ huyết áp [18], điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [20]

Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptit - insulin, kích thích việc tiết

ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường

hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa… của chitosan [22]

2.2.2.4 Độc tính của chitosan

Vào năm 1968, K Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không độc, chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn [19]

Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch, không thấy có tích luỹ ở gan Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân huỷ sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và

lá lách [12]

Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của chitosan: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những đối với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương [12]

2.2.4 Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn của chitosan

Khả năng kháng nấm:

-Hoạt tính kháng nấm của chitosan được chứng minh qua các nghiên

cứu với nhiều loại nấm khác nhau: Saccharomycodes ludwigii, Pseudomonas

fragi, Candida, Zygosaccharomyces bailii, Pyricularia grisea,…

Sự ức chế và làm ngưng hoạt động của nấm men, nấm mốc phụ thuộc vào nồng độ chitosan, pH, nhiệt độ, đặc điểm dinh dưỡng

b Khả năng kháng vi khuẩn

Chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của rất nhiều vi khuẩn như

E.coli, Samonella, Vibiro parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,…

Ngoài ra các thí nghiệm cũng cho thấy có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như: K+

, Na+, Mg2+, Ca2+… Nói chung các kết luận cơ chế chính xác về hoạt động kháng khuẩn của chitosan vẫn chưa được nghiên cứu và công bố rõ ràng, những cơ chế chính

đã được đề xuất như sau [21]:

-Tương tác giữa các ion tích điện dương trên các phân tử chitosan và các điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật dẫn đến thay đổi trong cấu trúc màng tế bào, thay đổi khả năng thẩm thấu gây rò rỉ protein và các thành phần khác trong tế bào, làm giảm chức năng sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn dẫn đến mất khả năng bảo vệ, trao đổi chất của tế bào

-Chitosan đóng vai trò như chất chọn lọc liên kết với các ion kim loại, sau đó ức chế các chất độc và sự phát triển của vi khuẩn

-Chitosan liên kết với nước, ức chế các enzyme khác nhau

-Chitosan thâm nhập vào bào tương của các vi khuẩn và thông qua các liên kết với DNA, ngăn cản sự tổng hợp RNA và protein

-Chitosan tạo thành một lớp cao phân tử không thấm nước trên bề mặt tế bào làm thay đổi tính thấm của tế bào ngăn các chất dinh dưỡng vào tế bào

-Chitosan có liên kết với các điện tích âm trong tế bào, làm chúng kết dính thành từng mảng, gây nhiễu loạn các hoạt động sinh lý của các vi sinh vật dẫn đến phá hủy tế bào

-Trong công nghệ sản xuất nước quả: Trong sản xuất nước quả việc bảo quản là yêu cầu bắt buộc Chitosan là tác nhân tốt loại bỏ độ đục và giúp điều chỉnh acid trong nước quả

-Do có khả năng giữ nước, làm dẻo các mắt xích trong chuỗi peptid, chitosan còn làm tăng tính dòn, dai nên chúng được thay thế hàn the trong sản xuất thực phẩm

2.1.4.2 Ứng dụng trong y học

-Chitosan là tác nhân hạ cholesterol: Đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng giảm cholesterol và mỡ trong máu của chitosan [18] Trong một nghiên cứu đã chứng minh chitosan hạ 5,8 – 42,6% lượng cholesterol trong huyết tương và 15,1 – 35,1% trong cơ thể

-Trong lĩnh vực dược phẩm chitosan được sử dụng như chất mang an toàn, có khả năng phóng thích thuốc dần dần vào trong cơ thể làm kéo dài tác dụng của thuốc và chitosan còn làm chất mang để gắn các enzyme trong sản xuất và điều trị [8]…

2.1.4.3 Ứng dụng trong mỹ phẩm

Chitosan là loại polymer tích điện dương tự nhiên duy nhất có khả năng chuyển thành dạng nhớt khi hòa tan trong môi trường acid Nhờ tính chất này

mà chitosan được ứng dụng trong sản phẩm chăm sóc tóc Ngoài ra còn được

sử dụng trong sản phẩm chăm sóc da, do có tính bảo vệ, giữ độ ẩm, tạo màng trên da đồng thời gắn kết với các dưỡng chất cần thiết tạo điều kiện cho các chất này hoạt động tích cực trên da [22]

2.1.4.4 Ứng dụng trong môi trường

-Chitosan có khả năng hấp thụ kim loại nặng trong xử lý nước thải: Chitosan tích điện dương nên kết hợp với các polymer đa điện tích điện âm, tạo phức với các ion kim loại và kết tủa Ngoài ra chitosan còn hấp phụ các chất phóng xạ

-Giảm mùi hôi khó chịu trong nước thải

Chitosan còn xử lý vết dầu loang, thu hồi protein và khoáng từ nước thải nông nghiệp…

Ngoài ra chitosan còn có tác dụng trong các ngành khác như [22]:

+ Trong nông nghiệp: Bảo quản quả, hạt, sử dụng như thành phần chính trong các thuốc diệt khuẩn

+ Làm tăng độ bền cơ học và độ mịn của giấy, tăng chất lượng in trên giấy do thấm mực in tốt…

2.2 Giới thiệu chung về nano bạc

2.2.1 Giới thiệu về công nghệ nano

2.2.1.1 Vật liệu nano

Vật liệu nano là vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thước cỡ nano

mét (1nm = 10 -9 m) Đây là đối tượng nghiên cứu của khoa học nano và công

nghệ nano, nó liên kết hai lĩnh vực trên với nhau Tính chất của vật liệu nano bắt nguồn từ kích thước của chúng, vào cỡ nanômét, đạt tới kích thước tới hạn của nhiều tính chất hóa lý của vật liệu thông thường Kích thước của vật liệu nano trải một khoảng từ vài nm đến vài trăm nm phụ thuộc vào bản chất vật liệu và tính chất cần nghiên cứu

2.2.1.2 Phân loại vật liệu nano

Có rất nhiều cách phân loại vật liệu nano Sau đây là một cách phân loại dựa vào hình dáng vật liệu [3]:

-Vật liệu không chiều là vật liệu mà ba chiều đều có kích thước nano, ví

dụ: chấm lượng tử

-Vật liệu một chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước nano, ví

dụ: dây nano,ống nano,…

-Vật liệu hai chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, ví

dụ: màng mỏng,…(Chiều ở đây có nghĩa là chiều chuyển động không bị hạn chế bởi kích thước của phần tử tải điện)

Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có các phần không chiều, một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau

2.2.1.3 Cơ sở khoa học của công nghệ nano

Công nghệ nano dựa trên ba cơ sở khoa học chính [14]:

a Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử:

Khác với vật liệu khối, khi ở kích thước nano thì các tính chất lượng tử được thể hiện rất rõ ràng Vì vậy khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần tính tới các

thăng giáng ngẫu nhiên Càng ở kích thước nhỏ thì các tính chất lượng tử càng thể hiện một cách rõ ràng hơn Ví dụ một chấm lượng tử có thể được coi như một đại nguyên tử, nó có các mức năng lượng giống như một nguyên tử

b Hiệu ứng bề mặt:

Cùng một khối lượng nhưng khi ở kích thước nano chúng có diện tích bề mặt lớn hơn rất nhiều so với khi chúng ở dạng khối Điều này, có ý nghĩa rất quan trọng trong các ứng dụng của vật liệu nano có liên quan tới khả năng tiếp xúc bề mặt của vật liệu, như trong các ứng dụng vật liệu nano làm chất diệt khuẩn Đây là một tính chất quan trọng làm nên sự khác biệt của vật liệu

có kích thước nanomet so với vật liệu ở dạng khối [14]

c Kích thước tới hạn:

Kích thước tới hạn là kích thước mà ở đó vật giữ nguyên các tính chất về vật

lý, hóa học khi ở dạng khối Nếu kích thước vật liệu mà nhỏ hơn kích thước này thì tính chất của nó hoàn toàn bị thay đổi Nếu ta giảm kích thước của vật liệu đến kích cỡ nhỏ hơn bước sóng của vùng ánh sáng thấy được (400-700 nm), theo Mie hiện tượng "cộng hưởng plasmon bề mặt" xảy ra và ánh sáng quan sát được sẽ thay đổi phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng xảy ra hiện tượng cộng hưởng Hay như tính dẫn điện của vật liệu khi tới kích thước tới hạn thì không tuân theo định luật Ohm nữa Mà lúc này điện trở của chúng sẽ tuân theo các quy tắc lượng tử Mỗi vật liệu đều có những kích thước tới hạn khác nhau và bản thân trong một vật liệu cũng có nhiều kích thước tới hạn ứng với các tính chất khác nhau của chúng Bởi vậy khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần xác định rõ tính chất sẽ nghiên cứu là gì Chính nhờ những tính chất lý thú của vật liệu ở kích thước tới hạn nên công nghệ nano có ý nghĩa quan trọng và thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà nghiên cứu [17]

2.2.2 Giới thiệu về bạc kim loại

Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1

Bán kính nguyên tử bạc: 0,288 nm

Bán kính ion bạc: 0,23 nm

Bảng 2.2: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích[14]

Kích thước của hạt nano Bạc (nm)

Số nguyên tử chứa trong đó

+ Cấu hình electron [Kr]4d105s1 , có số oxi hóa là +1 và +2, phổ biến nhất là trạng thái oxi hóa +1

+ Trong tự nhiên, bạc tồn tại hai dạng đồng vị bền là Ag-107(52%) và Ag-109(48%) Bạc không tan trong nước, môi trường kiềm nhưng có khả năng tan trong một số axit mạnh như axit nitric, sufuric đặc nóng v.v

Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này được thể hiện tối đa khi chúng được chế tạo bằng công nghệ nano Và trên thị trường cũng đã xuất hiện nhiều sản phẩm chứa nano bạc như băng gạc y tế, nước tẩy trùng bề mặt, hay hiện diện ngay trong gia đình bạn như tủ lạnh, máy giặt v.v

Bạc nano là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất lớn, có những đặc tính độc đáo sau [9]:

- Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi xa, chống tĩnh

- Không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao, không có phụ gia hóa chất

- Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong các dung môi phân cực như nước và trong các dung môi không phân cực như benzene, toluene)

- Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường

- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp

- Ổn định ở nhiệt độ cao

2.2.3 Giới thiệu về hạt nano bạc

Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn

Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano

Với cùng một điều kiện, phương pháp chế tạo khác nhau thì đỉnh hấp thụ của hạt nano bạc cũng khác nhau

Với cùng một phương pháp, khi thay đổi điều kiện phản ứng như nồng

độ chất tham gia phản ứng, tỉ lệ chất bao phủ, thời gian phản ứng và nhiệt độ phản ứng thì phổ hấp thụ cũng có sự thay đổi

b Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt

Tính chất quang học của hạt nano bạc trong thủy tinh làm cho các sản phẩm từ thủy tinh có các màu sắc khác nhau Các hiện tượng đó bắt nguồn từ

hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt (surface plasmon resonance) là hiện

tượng khi hạt ở kích thước nano, các điện tử tự do trong hạt nano bạc tương tác với trường điện từ ngoài dẫn đến sự hình thành các dao động đồng pha với một tần số cộng hưởng nhất định Các hạt nano bạc sẽ hấp thụ mạnh photon tới ở đúng tần số cộng hưởng này

Hình 2.3: Hiện tượng cộng hưởng plasmon của hạt hình cầu

Kim loại có nhiều điện tử tự do, các điện tử tự do này sẽ dao động dưới tác dụng của điện từ trường bên ngoài như ánh sáng Thông thường các dao động bị dập tắt nhanh chóng bởi các sai hỏng mạng hay bởi chính các nút mạng tinh thể trong kim loại khi quãng đường tự do trung bình của điện tử nhỏ hơn kích thước Nhưng khi kích thước của hạt nano bạc nhỏ hơn quãng đường tự do trung bình thì hiện tượng dập tắt không còn nữa mà điện tử sẽ dao động cộng hưởng với ánh sáng kích thích Do vậy, tính chất quang của hạt nano bạc có được do sự dao động tập thể của các điện tử dẫn đến từ quá trình tương tác với bức xạ sóng điện từ Khi dao động như vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano bạc làm cho hạt nano bạc bị phân cực điện tạo thành một lưỡng cực điện Do vậy xuất hiện một tần số cộng hưởng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng các yếu tố về hình dáng, độ lớn của hạt nano bạc và môi trường xung quanh là các yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất

Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM_transmission electron microcope) để quan sát hình dạng và kích thước hạt nano bạc và sử dụng thiết bị đo phổ hấp thụ UV-VIS để quan sát hiệu ứng cộng hưởng plasmon của hạt nano bạc Ngoài ra, mật độ hạt nano bạc cũng ảnh hưởng đến tính chất quang Nếu mật độ loãng thì có thể coi như gần đúng hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải tính đến ảnh hưởng của quá trình tương tác giữa các hạt

Khi kích thước của vật liệu giảm dần, hiệu ứng lượng tử do giam hãm làm rời rạc hóa cấu trúc vùng năng lượng Hệ quả của quá trình lượng tử hóa này đối với hạt nano bạc là I-U không còn tuyến tính nữa mà xuất hiện một hiệu ứng gọi là hiệu ứng chắn Coulomb (Coulomb blockade) làm cho đường I

- U bị nhảy bậc với giá trị mỗi bậc sai khác nhau một lượng e/2C đối với U và e/RC đối với I Trong đó e là điện tích của điện tử, C và R là điện dung và điện trở khoảng nối hạt nano với điện cực

2.2.3.1.4 Hiệu ứng bề mặt

Khi hạt bạc có kích thước nanomet, các số nguyên tử nằm trên bề mặt sẽ chiếm tỉ phần đáng kể so với tổng số nguyên tử Chính vì vậy các hiệu ứng có liên quan đến bề mặt, gọi tắt là hiệu ứng bề mặt sẽ trở nên quan trọng làm cho tính chất của vật liệu có kích thước nm khác biệt so với vật liệu bạc ở dạng khối Sự tăng cường khả năng diệt khuẩn bạc là một ví dụ của hiệu ứng bề mặt

Hiệu ứng bề mặt luôn có tác dụng với tất cả các giá trị của kích thước, hạt càng bé thì hiệu ứng càng lớn và ngược lại Vật liệu ở bất cứ kích thước nào cũng có hiệu ứng bề mặt, ngay cả vật liệu khối truyền thống cũng có hiệu ứng bề mặt, chỉ có điều hiệu ứng này nhỏ thường bị bỏ qua [3]

Bảng 2.3: Số nguyên tử và năng lượng bề mặt của hạt nano bạc [15]

2.2.3.2 Các phương pháp phân tích hạt nano bạc

Sử dụng phương pháp phân tích phổ UV-VIS

UV-VIS (Ultraviolet–visible spectroscopy) là phương pháp phân tích sử dụng phổ hấp thụ hoặc phản xạ trong phạm vi vùng cực tím cho tới vùng ánh sáng nhìn thấy được