Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn gram dương của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN LÂM THÁI Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GRAM DƯƠNG CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN LÂM THÁI Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GRAM DƯƠNG CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : ThS Lương Hùng Tiến ThS Nguyễn Thị Đoàn Khoa CNSH - CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, em nhận giúp đỡ nhiều từ cá nhân tập thể Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn giáo viên hướng dẫn, thầy Lương Hùng Tiến cô Nguyễn Thị Đoàn giảng viên Khoa CNSH – CNTP, tin tưởng giao đề tài, tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo làm việc quản lí phòng Thì nghiệm vi sinh thường xuyên giúp đỡ em thực hoàn thành kháo luận tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn toàn thể người thân gia đình bạn bè quan tâm, ủng hộ tạo điều kiện để em hoàn thành tốt khóa luận Dù cố gắng nhiều, xong khóa luận thiếu xót hạn chế Kính mong nhận chia sẻ ý kiến đóng góp quý báu thầy, cô giáo bạn Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên ngày 29 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Lâm Thái MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn .2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN .3 2.1.1 Nguồn gốc cấu trúc hóa học chitosan 2.1.2 Tính chất chitosan 2.1.3 Đặc tính kháng vi sinh vật chitosan yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn chitosan 2.1.4 Các ứng dụng chitosan sống 13 2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NANO BẠC 14 2.2.1 Lịch sử hình thành công nghệ nano 14 2.2.2 Cơ sở khoa học công nghệ nano .14 2.2.3 Giới thiệu hạt nano bạc .15 2.2.4 Ứng dụng nano bạc sống 20 2.3 GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN 22 2.3.1 Khái niệm chung vi khuẩn 22 2.3.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 22 2.3.3 Vi khuẩn Bacillus cereus 24 2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .26 2.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 26 2.4.2 Tình hình nghiên cứu giới 27 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .29 3.1.1 Vật liệu 29 3.1.2 Chủng vi sinh vật thí nghiệm 29 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị môi trường sử dụng thí nghiệm 29 3.2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 29 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 30 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30 3.4.2 Phương pháp phân tích 31 3.4.3 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 32 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM DƯƠNG 33 4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA CHITOSAN ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM DƯƠNG 34 4.3 LỰA CHỌN CÔNG THỨC PHỐI TRỘN CHITOSAN VỚI NANO BẠC .36 4.3.1 Xác định khả kháng B cereus phức chất chitosan/nano bạc 36 4.3.2 Xác định khả kháng S aureus phức chất chitosan/nano bạc 37 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 KẾT LUẬN 39 5.2 ĐỀ NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Số nguyên tử lượng bề mặt hạt nano bạc .19 Bảng 3.1 Công thức phối trộn chitosan nano bạc .31 Bảng 4.1 Kết kháng B cereus S aureus nano bạc 34 Bảng 4.2: Kết kháng B cereus S aureus nồng độ 35 Bảng 4.3: Hiệu kháng vi khuẩn B cereus công thức phối trộn chitosan nano bạc 36 Bảng 4.4: Hiệu kháng vi khuẩn S aureus công thức phối trộn chitosan nano bạc 38 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Một số loài giáp xác chứa chitin Hình 2.2: Công thức cấu tạo chitin Hình 2.3: Cấu trúc hóa học chitosan Hình 2.4: Hiện tượng cộng hưởng plasmon hạt hình cầu 17 Hình 2.5: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy vi khuẩn 19 Hình 2.6 Nồng độ khác dung dịch hạt nano bạc 21 Hình 2.7: Vi khuẩn Staphylococcus aureus 23 Hình 2.8 : Vi khuẩn Bacillus cereus 25 Hình 4.1: Khả kháng 36 Hình 4.2: Khả kháng 36 Hình 4.3: Khả kháng 38 Hình 4.4: Khả kháng chitosan khác 35 Hình 4.5: Khả kháng B cereus phức chất 36 Hình 4.6: Khả kháng S aureus phức chất 37 BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Từ viết tắt DD Degree of deacetylation MIC Minimum inhibitory concentration TSC Trisodium Citrate UV-Vis Ultraviolet-Visible DI Deionized PVA Polyvinyl acetat PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chitosan chế phẩm sinh học, hình thành từ trình deacetyl hóa chitin, có nhiều loại giáp xác Sản xuất chitosan góp phần làm giảm ảnh hưởng đến môi trường từ phế liệu thủy sản mà tạo giá trị kinh tế lớn Chitosan có tính chất quan trọng, chất phụ gia thực phẩm, tạo màng bao gói, khả kháng khuẩn, làm giảm trình thoát nước sản phẩm điều kiện bảo quản đặc biệt không gây ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng, chitosan ứng dụng nhiều lĩnh vực Bạc biết đến nguyên tố có khả khử trùng mạnh tồn tự nhiên Các 200 năm nhà khoa học xem huyết người dịch keo, keo bạc sử dụng làm chất kháng khuẩn thể người Kể từ keo bạc sử dụng rộng rãi để chữa bệnh nấm da, điều trị vết thương, vết bỏng, bệnh miệng, làm thuốc nhỏ mắt Tuy nhiên, sau thuốc kháng sinh phát minh (giữa kỉ 20) với hiệu lực khử trùng mạnh hơn, keo bạc bị thay dần Nhưng 30 năm sau người ta nhận có nhiều loài vi khuẩn có khả chống lại tác dụng thuốc kháng sinh vấn đề ngày trở nên đáng lo ngại Lúc tính kháng khuẩn bạc lại ý có phổ tác dụng rộng không bị hạn chế hiệu ứng kháng thuốc [31, 23] Ngày nay, việc tạo vật thể kích thước nano trở nên phổ biến, kích thước hạt vật chất thể nhiều tính chất lý-hóa khác thường so với vật chất trạng thái khối, khả kháng khuẩn cao 20-60 ngàn lần so với ion Ag+ [10] Các hạt nano bạc với lượng bề mặt lớn có khả giải phóng từ từ ion bạc vào dung dịch, nhờ nano bạc có hiệu lực khử khuẩn mạnh nhiều lần kéo dài so với bạc dạng keo, dạng ion hay dạng rắn [31, 24] Chính tính chất lượng tử đặc biệt nên nano bạc bị biến thể gian bảo quản, để ổn định cần phải có phương pháp chế tạo đặc biệt giúp cho khả sử dụng triệt để Dựa vào đặc tính quý giá trên, ý tưởng kết hợp hai loại vật liệu hình thành Chitosan loại chế phẩm có khả kháng khuẩn, không gây độc có khả tạo thành lớp màng mỏng bao quanh thực phẩm Nano bạc, vật liệu có khả kháng khuẩn cực mạnh với nồng độ nhỏ, lại dễ bị oxi hóa Khi sử dụng kết hợp với cho hỗn hợp dung dịch bền vững có hoạt tính mạnh để ứng dụng rộng rãi sản xuất Vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus vi khuẩn Gram dương hai loài vi khuẩn phân bố rộng rãi tự nhiên (Đất, nước, thể người, động vật …), loài vi khuẩn tồn phổ biến nông sản thực phẩm Chúng tác nhân gây vụ ngộ độc thực phẩm khắp nước thời gian qua Chính phổ biến tác hại nguy hiểm người nên tập trung toàn thời gian làm khóa luận “Nghiên cứu khả kháng vi khuẩn Gram dương chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc” 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục đích - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nano bạc vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chitosan vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus - Nghiên cứu kết hợp chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc kháng vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus 1.2.2 Yêu cầu - Tìm kết hợp tối ưu kháng vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc - Đánh giá kết kháng vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc 1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên có hội tiếp cận với thao tác kỹ thuật thực tế Qua kết hợp với kiến thức lý thuyết học sinh viên có hiểu biết chuyên sâu nhìn tổng quát 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Hiện nano bạc chitosan ứng dụng nhiều y học, thực phẩm, nông nghiệp, xử lí môi trường… - Chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc ứng dụng bảo quản loại thực phẩm 31 Thí nghiệm 3: Xác định hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc Phối trộn 0,2 ml Chitosan nồng độ MIC, MIC/2 với 0,2 ml nano bạc nồng độ MIC, MIC/2 theo công thức sau: Bảng 3.1 Công thức phối trộn chitosan nano bạc Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 Chitosan MIC/2 MIC/2 MIC MIC Nano bạc MIC/2 MIC MIC/2 MIC Tiến hành trộn 0,1ml huyền dịch vi khuẩn, 0,4 ml hỗn hợp Chitosan nano bạc theo công thức (kiểm chứng dung dịch đệm acetate) với 0,5ml môi trường MP ống eppendoff Sau 24h nuôi cấy tiến hành định lượng mật độ vi sinh vật sống sót dịch trộn 3.4.2 Phương pháp phân tích 3.4.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 0,1ml vi sinh vật hoạt hóa 24h, định lượng mật độ vi sinh vật 0,4ml chế phẩm kháng khuẩn, kiểm chứng ống chứa 0,5ml MP Dịch A, nuôi 37oC Sau 24h, quan sát, pha loãng định lượng vi sinh vật 3.4.2.2 Phương pháp quan sát hình thái tế bào xác định mật độ tế bào a Phương pháp quan sát hình thái tế bào tiêu nhuộm Gram 32 Khuẩn lạc vi khuẩn sau làm tiêu nhuộm tím tinh thể 60s sau nhuộm lugol 60s tẩy cồn 30s, rửa nước cất, nhuộm bổ sung Fuchsin Safranin 30s, làm khô soi tiêu kính hiển vi để quan sát hình thái tế bào b Phương pháp xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc - Nguyên tắc + Để xác định số lượng khuẩn lạc mẫu: • Cân 1g mẫu pha loãng 10-5 đếm số khuẩn lạc cấy môi trường sau thời gian số vi khuẩn + Cấy xác thể tích mẫu dịch pha loãng vào lên bề mặt môi trường thạch Mỗi độ pha loãng cấy lặp lại hộp petri Mỗi mầu cần làm độ pha loãng liên tiếp Đếm tất số khuẩn lạc đĩa (30 ÷ 300 khuẩn lạc/1 đĩa) - Cách tính kết + Công thức: ∑C => đơn vị: khuẩnlạc/g (ml) CFU/g (ml) N= (n1 + 0,1n2).f1.v Trong đó: ∑ C : Tổng số khuẩn lạc/các đĩa n1 : Số đĩa cấy nồng độ pha loãng thứ n2 : Số đĩa cấy nồng độ pha loãng thứ hai v : Thể tích mẫu cấy/mỗi đĩa f1 : Độ pha loãng thứ N : Nồng độ khuẩn lạc 3.4.3 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Sử dụng phương pháp bảo quản giống môi trường thạch nghiêng: Vi sinh vật hoạt hóa môi trường MP, sau cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, nuôi 24h, 37oC, giữ tủ lạnh để thực nghiên cứu Cấy chuyền giữ giống thạch nghiêng định kỳ tuần lần 33 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM DƯƠNG Nồng độ ức chế tối thiểu MIC định nghĩa nồng độ nhỏ chất kháng khuẩn ức chế phát triển 104 CFU/ml vi sinh vật so với kiểm chứng [4] Để xác định MIC chế phẩm nano bạc tiến hành theo thí nghiệm Nồng độ nano bạc sau đối kháng lại là: 25ppm, 12,5ppm, 6,25ppm, 3,125ppm, 1,5625ppm, 0,78125ppm, đối chứng nước deion Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc với vi khuẩn B cereus S aureus Xuất khuẩn lạc Không xuất khuẩn lạc Hình 4.1: Khả kháng Hình 4.2: Khả kháng S aureus bạcnano bạc B cereus nano 34 Bảng 4.1 Kết kháng B cereus S aureus nano bạc Nồng độ C1 C2 C3 C4 25 12,5 6,25 3,125 B cereus - - - + + + + 6,25 S aureus - - - + + + + 6,25 (ppm) Vi khuẩn C5 C6 1,5625 0,78125 Nước deion MIC(ppm) Ký hiệu: “+”: Xuất khuẩn lạc “-”: Không xuất khuẩn lạc Dựa vào hình 4.1; 4.2 bảng 4.1 cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu nano vi khuẩn B cereus S aureus 6,25ppm Nồng độ dung dịch nano bạc để ức chế hai loại vi khuẩn Gram dương cao vi khuẩn Gram dương có lớp màng phía peptidoglucan tương đối dày, khoảng 20 – 80nm nên phân tử nano bạc khó xâm nhập qua màng Ion Ag+ có tương tác mạnh với peptidoglycan gây ức chế khả vận chuyển oxy vào bên tế bào, thay đổi điện tích tế bào dẫn đến tê liệt vi khuẩn Vì S P xuất nhiều màng tế bào nên hạt nano bạc tương tác với S chứa protein bên bên màng tế bào biến đổi chức tế bào Đồng thời hạt bạc có kích thước nhỏ chui vào tế bào, kết hợp với enzym hay ADN có chứa nhóm sunfuahydrin – SH phốt phát gây bất hoạt enzym hay ADN dẫn đến gấy chết tế bào Vi khuẩn B cereus sinh bào tử S aureus không sinh bào tử nano bạc có tính đâm xuyên lớn không bị ảnh hưởng cấu tạo bên tế bào nồng độ tối thiểu B cereus S aureus 6,25ppm 4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA CHITOSAN ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM DƯƠNG Để xác định MIC chitosan tiến hành theo thí nghiệm Nồng độ chitosan sau trộn tính lại là: 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 500, 250 ppm (kiểm chứng dung dịch đệm acetate) 35 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan với vi khuẩn B cereus S aureus Xuất khuẩn lạc Không xuất khuẩn lạc Hình 4.3: Khả kháng Hình 4.4: Khả kháng B cereus chitosan S aureus chitosan Bảng 4.2: Kết kháng B cereus S aureus nồng độ chitosan khác Nồng độ C1 C2 C3 C4 C5 C6 Nước (ppm) Vi khuẩn MIC (ppm) 3000 2000 1500 1000 500 250 acetat B cereus - - - - + + + 1000 S aureus - - - - - + + 500 Kí hiệu : « + » : Xuất khuẩn lạc « - » : Không xuất khuẩn lạc Dựa vào hình 4.3; 4.4 bảng 4.2 cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc loại vi khuẩn khác Với B cereus 1000ppm, với S aureus 500ppm Tương tác ion tích điện dương phân tử chitosan điện tích âm màng tế bào vi sinh vật dẫn đến thay đổi cấu trúc màng tế bào, thay đổi khả thẩm thấu gây rò rỉ protein thành phần khác tế bào, làm giảm chức sinh lý sinh hóa vi khuẩn dẫn đến khả bảo vệ, trao đổi chất tế bào, chitosan liên kết với ion kim loại, sau ức chế chất độc phát triển vi khuẩn 36 Nồng độ ức chế chitosan bị ảnh hưởng cấu tạo bên vi khuẩn màng sinh học, lớp nhày,…Vi khuẩn B cereus có khả tạo bào tử nồng độ ức chế B cereus chitosan 1000ppm cao S aureus 500ppm 4.3 LỰA CHỌN CÔNG THỨC PHỐI TRỘN CHITOSAN VỚI NANO BẠC - Phương pháp phối trộn trình bày thí nghiệm 4.3.1 Xác định khả kháng B cereus chế phấm chitosan/nano bạc MIC hai loại vật liệu B cereus là: MIC chitosan: 1000ppm MIC nano bạc: 6,25ppm Hình 4.5: Khả kháng B cereus chế phẩm phối hợp Từ hình 4.5 ta có công thức phối trộn tương ứng với ô: CT1 ô số CT3 ô số có khuẩn lạc xuất hiện, CT1 ô số CT4 ô số khuẩn lạc xuất Mức độ kháng B cereus thống kê theo bảng đây: Bảng 4.3: Hiệu kháng vi khuẩn B cereus công thức phối trộn chitosan/nano bạc Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 Chitosan (ppm) 500 500 1000 1000 Nano bạc (ppm) 3,125 6,25 3,125 6,25 Hiệu + - + - Kí hiệu: “+”: Xuất khuẩn lạc “-“: Không xuất khuẩn lạc Theo bảng 4.3 ta có kết quả: - Chitosan/nano bạc: 500/6,25 1000/6,25: B cereus không xuất khuẩn lạc 37 - Chitosan/nano bạc: 500/3,125 1000/3,125: B cereus xuất khuẩn lạc B cereus không phát triển nồng độ có MIC nano bạc 6,25ppm Trong phát triển nồng độ MIC chitosan 1000ppm Qua thấy mức độ kháng B cereus phụ thuộc nhiều vào thay đổi nồng độ nano bạc chitosan, chứng tỏ ảnh hưởng nano bạc mạnh chitosan phức lợp ức chế B cereus Điều nghiên nhân chitosan hòa tan hình thành dạng mạch phân tử polymetrong dung dịch, tạo phức chất với ion kim loại chuyển tiếp Bạc kim loại chuyển tiếp, dạng nano, hạt ion bạc giải phóng hỗn hợp, phần bị chitosan giữ lấy tạo thành phức chất, nên lượng chitosan dung dịch giảm đáng kể so với nguyên trạng nên lượng chitosan lại chi phối mức độ kháng khuẩn hỗn hợp Đối với bạc hình thành dạng nano, số lượng ion hạt nano lên đến hàng trăm nghìn, có tham gia liên kết phức chất số lượng lại tác động đến khả sinh trưởng B cereus S aureus Vậy, để tiết kiểm chi phí chất nên chọn tỷ lệ phối trộn MIC loại vật liệu nên chọn là: - Chitosan: 500ppm - Nano bạc: 6,25ppm 4.3.2 Xác định khả kháng S aureus phức chất chitosan/nano bạc MIC hai loại vật liệu S aureus là: MIC chitosan: 500ppm MIC nano bạc: 6,25ppm Hình 4.6: Khả kháng S aureus phức chất 38 Từ hình 4.6 có công thức phối trộn chitosan/nano bạc tương ứng với ô: CT1 ô C8/5, CT3 ô C7/5, CT2 ô C8/4, CT4 ô C7/4 Mức độ kháng S aureus thống kê theo bảng đây: Bảng 4.4: Hiệu kháng vi khuẩn S aureus công thức phối trộn chitosan/nano bạc Công thức CT1 Chitosan (ppm) 250 Nano bạc (ppm) 3,125 Hiệu + Kí hiệu: “+”: Xuất khuẩn lạc CT2 250 6,25 - CT3 500 3,125 + CT4 500 6,25 - “-“: Không xuất khuẩn lạc Từ bảng 4.4 ta có kết quả: - Chitosan/nano bạc: 250/6,25 500/6,25: S aureus không xuất khuẩn lạc - Chitosan/nano bạc: 250/3,125 500/3,125: S aureus xuất khuẩn lạc S aureus không phát triển nồng độ có MIC nano Bạc 6,25ppm Trong S aureus phát triển nồng độ có MIC chitosan 500 ppm Qua ta thấy rằng, mức độ kháng S aureus phụ thuộc nhiều vào thay đổi nồng độ nano bạc thay đổi nồng độ chitosan, chứng tỏ ảnh hưởng nano bạc mạnh chitosan phức hợp lên S aureus Vậy tỷ lệ phối trộn MIC loại vật liệu nên chọn là: - Chitosan: 250 ppm - Nano bạc: 6,25 ppm 39 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc với loại vi khuẩn S aureus B cereus 6,25ppm - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan loại vi khuẩn S aureus 500ppm B cereus 1000ppm - Xác định công thức kết hợp hiệu chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc ức chế vi khuẩn B cereus chitosan: 500ppm/ nano bạc: 6,25ppm ức chế vi khuẩn S aureus chitosan: 250 ppm/nano bạc : 6,25ppm 5.2 ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan, nano bạc chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc - Tiếp tục nghiên cứu khả kháng loại vi khuẩn khác 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Trần Thị Luyến số cộng sự, 2000 Hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua Báo cáo khoa học, Đề tài cấp bọ, Nha Trang Đặng Văn Phú, Bùi Duy Du, Nguyễn Triệu, Võ Thị Kim Lăng, Nguyễn Quốc Hiến, Bùi Duy Cam “Chế tạo keo nano bạc nano phương pháp chiếu xạ sử dụng Polyvinyl Pyrolidon/Chitosan làm chất ổn định” Tạp chí khoa học công nghệ, tập 46, số 3, 2008 Tr 81-86 Đặng Văn Luyến, 1995 Chitin/Chitosan Các giảng báo cáo chuyên đề tập 2, 27 – 35 Đào Tố Quyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Đào cộng Nghiên cứu thử nghiệm PDP (chitosan) làm chất phụ gia sản xuất giò lụa, bánh Viện dinh dưỡng Trung tâm kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm Việt Nam Lê Thanh Hà, Nguyễn Thị Tuyết Mai, 2011 Nghiên cứu ảnh hưởng đặc tính Chitosan đến khả kháng khuẩn Tạp chí Khoa học Công nghệ 49 (6A), 51-57 Lưu Văn Chính, Châu Văn Minh, Phạm Hữu Điền, Vũ Mạnh Hùng, Ngô Thị Thuận, 2000 Tổng hợp nghiên cứu tác dụng hạ Cholesterol máu N,N,Ntrimethyl chitosan Tạp chí Dược học số 9, mục Nguyễn Thị Ngọc Tú (2003), Nghiên cứu dùng vật liệu chitosan làm phụ gia thực phẩm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu sở chọn lọc, Viện Hóa Học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ quốc gia Phạm Thị Trân Châu, 1992 Thực hành hóa sinh học Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Hoàng Hải.“Các hạt nano kim loại (metallic nanoparticles)” Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 41 10 Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo số cộng “Hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua” Báo cáo khoa học, Đề tài cấp Nha Trang, 2000 11 Đặng Văn Luyến, 1995 Chitin/Chitosan Các giảng báo cáo chuyên đề tập 2, 27 – 35 12 Đặng Văn Phú, Bùi Duy Du, Nguyễn Triệu, Võ Thị Kim Lăng, Nguyễn Quốc Hiến, Bùi Duy Cam “Chế tạo keo nano bạc nano phương pháp chiếu xạ sử dụng Polyvinyl Pyrolidon/Chitosan làm chất ổn định” Tạp chí khoa học công nghệ, tập 46, số 3, 2008 Tr 81-86 13 Nguyễn Hoàng Hải.“Các hạt nano kim loại (metallic nanoparticles)” Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 14 Trần Linh Thước, 2009 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB giáo dục 15 Vương Thị Việt Hoa, 2002, Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM 74 trang 16 Nguyễn Minh Trí, Một phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn Chitosan 17 Nguyễn Thị Đoàn, Bài giảng môn học Kiểm nghiệm chất lượng thực phẩm, 2009 18 Trương Thu Hiền, Nguyễn Như Lâm, Nghiên cứu nồng độ diệt khuẩn tối thiểu dung dịch Nano bạc số chủng vi khuẩn 19 Đỗ Quỳnh My, Phan Diệu Phương, Nghiên cứu chế tạo vật liệu tổ hợp AgNano/Carbon nanotubes (CNTs)/Cotton ứng dụng xử lý nước nhiễm khuẩn, Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học Đại học Đà Nẵng, lần 8, 2012 20 Nguyễn Thị Ngọc Tú (2003), Nghiên cứu dùng vật liệu chitosan làm phụ gia thực phẩm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu sở chọn lọc, Viện Hóa Học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ quốc gia 21 Lê Huy Chính(chủ biên), Vi sinh y học, Nhà xuất y học, 2003 Tiếng Anh 42 22 Abdelbasset El Hadrami, et al, 2010 Chitosan in Plant protection Marine Drugs 2010, 8, 968-987 23 Sondi Salopek-Sondi - Silver nanoparticles as antimicrobial agent: "a case smdy on E.coli as a model for gram-negative bacteria" J.Colloid Interface Science 275 (2004) 177-182 24 Liau S Y., D C Read W J., Pugh J R et al ''The antibacterial action of silver ions'' Let.Application Microbiology 25 (1997) 279-283 25 Sucdeb Pal, Yu K T., Joon M S ''Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on theshape of the nanoparticle'' Application & Environement, Microbiology 73 (6) (2007) 1712-1720 26 Feredoon Shahidi, et al, 1999 Food applications of chitin and chitosans Trends in Food Science & Technology 10, 37-51 27 Morimoto M and Shigemasa Y , 1997 Charaterization and bioactivities of chitin and chitosan regulated by their degree of deacetylation Kobunshi Ronbunshu 54, 621-631 28 Hsyue-Jen Hsieh, et al, 2007 Improvement in the properties of chitosan membranes using natural organic acid solutions as solvents for chitosan dissolution Journal of Medical and Biological Engineering 27, 23 – 28 29 Purnama Darmadji, Masathoshi Izumimoto, 1996 Effect of Chitosan on Meat Preservation Indonesian Food and Nutrition Progress 3, 51-56 30 Pradip Kumar Dutta, et al Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications Journal of Scientific & Industrial Research 63, 20 – 31 31 Lin Jiang, 2009 Comparison of disk difusion, agar dilution, and broth microdilution for antimicrobial susceptibility testing of five chitosan Fujian Agricultural and Forestry University, China 32 Inui Hiroshi Application Biology Science., 1997; Vol 2, N02, p 55 – 65 33 Liu X.F., et al, 2001 Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan Journal of Applied Polymer Science 79, 1324-1335 34 Abdelbasset El Hadrami, et al, 2010 Chitosan in Plant protection Marine Drugs 2010, 8, 968-987 35 Mohamed E.I.Badawy and Entsar I.Rabea, 2011 "A Biopolymer chitosan and its derivatives as promising antimicrobial agents against plant pathogen and 43 their application in crop protection" International Journal of Carbohydarate Chemistry 2011, Article ID 460381, 29 pages 36 Dasheng Liu, Yuanan Wei, Pingjia Yao and Linbin Jiang, 2006 "Determination of the degree of acetylation of chitosan by UV spectrophotometry using dual standards" Carbohydrate Research 341 (2006), 782-785 37 Joseph Goldstein, Dale E Newbury, David C Joy, Charles E Lyman, Patrick Echlin, Eric Lifshin, L.C Sawyer, J.R Michael (2003) "Scanning Electron Microscopy and X-ray Microanalysis" Springer; 3rd ed ISBN-13 9780306472923 38 Gerasimenko D.V., Avdienko I.D., et al, 2004 Antibacterial effects of watersoluble low-molecular-weight chitosans on diffirent microorganisms Applied Biochemistry and Microbiology 40, 253-257 39 Jeon Y.J., et al, 2001 Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor Carbohydrate Polymers 44, 71-76 40 Shimojoh M , et al, 1996 Bactericidal effects of chitosan from squid pens on oral streptococci Nippon Nogeikagaku Kaishi 70, 787-792 41 Feredoon Shahidi, et al, 1999 "Food applications of chitin and chitosans" Trends in Food Science & Technology 10, 37-51 42 Feredoon Shahidi, et al, 1999 Food applications of chitin and chitosans Trends in Food Science & Technology 10, 37-51 43 Liau S Y., D C Read W J., Pugh J R et al ''The antibacterial action of silver ions'' Let.Application Microbiology 25 (1997) 279-283 44 PHỤ LỤC Bảng 4.5: Hiệu kháng vi khuẩn Bacillus cereus chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc theo thời gian Mật độ Bacillus cereus (CFU/ml) Nồng độ (ppm) 500/6,25 Đệm 8,3 ± 0,05 8,02 ± 0,05 6,12 ± 0,04 8,12 ± 0,05 5,75 ± 0,04 8,45 ± 0,03 12 3,13 ± 0,04 8,61 ± 0,03 16 1,23 ± 0,03 8,79 ± 0,03 20 0,85 ± 0,03 8,82 ± 0,04 24 8,85 ± 0,04 Thời gian (h) Bảng 4.6: Hiệu kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc theo thời gian Mật độ Bacillus cereus (CFU/ml) Nồng độ (ppm) 250/6,25 Đệm 7,32 ± 0,05 7,20 ± 0,05 6,85 ± 0,04 7,56 ± 0,05 4,56 ± 0,04 7,89 ± 0,03 12 2,89 ± 0,04 8,43 ± 0,03 16 1,11 ± 0,03 8,67 ± 0,03 20 0,76 ± 0,03 8,72 ± 0,04 24 8,79 ± 0,04 Thời gian (h) 45 [...]... hình nghiên cứu chitosan Chitosan /nano bạc (CS/Ag-NPs) được nghiên cứu ứng dụng trong vi c kháng khuẩn trong dung dịch nhờ đặc tính kháng khuẩn đặc biệt của hạt nano bạc Khả năng kháng khuẩn của vật liệu trên đã được khảo sát với một số vi khuẩn như vi khuẩn Gram âm ( E.coli), vi khuẩn Gram dương (S aureus) và nấm Khảo sát đã chứng minh khả năng ứng dụng của vật liệu (CS/Ag-NPs) trong kháng khuẩn của. .. của chitosan 2.1.3.1 Đặc tính kháng vi sinh vật - Gần đây những nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan đã chỉ ra rằng chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật [33]: a Khả năng kháng virus, kháng nấm Khả năng kháng virus: - Chitosan ức chế hệ thống sinh sản của virus thực vật đã được nghiên cứu [34], mức độ ngăn cản sự truyền nhiễm virus khác nhau theo trọng lượng phân tử 9 của chitosan, ... hạt nano (nm) 10 5 2 1 30000 4000 250 30 20 40 80 90 4,08×1011 8,16×1011 2,04×1012 9,23×1012 7,6 14,3 35,3 82,2 Số nguyên tử Tỉ số nguyên tử bề mặt (%) Năng lượng bề mặt (erg/mol) Năng lượng bề mặt /Năng lượng tổng (%) 2.2.3.5 Tính kháng khuẩn của nano bạc a Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc Nano bạc được nghiên cứu ứng dụng vào vi c kháng khuẩn vì bạc là kháng sinh tự nhiên và không gây tác dụng phụ Nano. .. khoảng 5ppm cho vi c diệt vi khuẩn Esherichia Coli hiệu quả đến 99,9% và khuẩn Staphylococcus aureus là hơn 99% b Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của nano bạc Kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố là các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến tính kháng khuẩn của keo nano bạc [22] Kích thước hạt nano bạc: Yếu tố quan trọng quyết định khả năng diệt khuẩn của chúng Hạt nano bạc có kích thước... sunfuahydrin – SH hoặc phốt phát gây bất hoạt enzym hay DNA dẫn đến gấy chết tế bào [34] Hình 2.5: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn 20 Trước sự gia tăng của dòng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh điển hình là S.aureus hay các loại vi nấm gây bệnh thực vật thiếu thuốc đặc trị thì vi c lựa chọn các chế phẩm chứa nano bạc đang rất được quan tâm Thông thường nồng độ bạc sử dụng cho vi c kháng khuẩn. .. hạt nano 2.2.3.4 Tính chất lý học của hạt nano bạc a Tính chất quang • Phổ hấp thụ của hạt nano bạc: Phổ hấp thụ của hạt nano bạc nằm trong khoảng từ 400 - 460 nm[29] Phổ hấp thụ của hạt nano bạc phụ thuộc vào kích thước của hạt nano bạc Khi kích thước hạt tăng thì cường độ đỉnh tăng và dịch về phía bước sóng dài Kích thước hạt nano bạc phụ thuộc vào các yếu tố trong quá trình chế tạo hạt nano bạc. .. deacetyl hóa [37] h Khả năng kết hợp với nước và khả năng kết hợp với chất béo: Sự hấp thụ nước của chitosan lớn hơn rất nhiều so với cellulose hay chitin Thông thường khả năng hấp thụ nước của chitosan khoảng 581-1150% Sự thay đổi trong thứ tự sản xuất như quá trình khử khoáng, khử protein cũng ảnh hưởng đến khả năng giữ nước 7 và giữ chất béo Khả năng kết hợp với chất béo của các chế phẩm chitosan trong... thể do vi khuẩn Gram âm có lớp màng chắn bên ngoài Theo một số nghiên cứu tất cả các vi khuẩn Gram âm đều có lớp màng ngoài là lipopolysaccharide (LPS), trong đó đóng góp vào sự ổn định của lớp LPS thông qua tương tác tĩnh điện với các cation, chitosan loại bỏ các cation đó Vi c giải phóng LPS làm mất sự ổn định của màng ngoài [7] - Cơ chế hoạt động kháng khuẩn của chitosan khác nhau ở vi khuẩn Gram. .. nguồn gốc và vi sinh vật đích Để các ứng dụng của hợp chất chitosan có hiệu quả cần phải nắm rõ các yếu tố này [17] a Trọng lượng phân tử - Ảnh hưởng của trọng lượng phân tử chitosan đến hoạt động kháng khuẩn đã được nghiên cứu Chỉ có một vài nghiên cứu về hoạt động diệt khuẩn của chitosan có thể so sánh được tùy thuộc vào vi khuẩn thử nghiệm, điều kiện thử nghiệm và trọng lượng phân tử của chitosan, ... kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa hạt nano bạc như: 21 Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm hạt nano bạc có tác dụng khử trùng Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt 99.9% vi khuẩn Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử mùi Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3 - 4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp vật liệu tẩm nano bạc ... ngoi t ú dn n tiờu dit vi sinh vt [7] - Hot tớnh khỏng khun ca chitosan i vi vi khun Gram õm mnh hn vi khun Gram dng Trong ú vi khun Gram dng li nhy cm hn, cú th vi khun Gram õm cú lp mng chn... ging vi sinh vt 32 PHN 4: KT QU V THO LUN 33 4.1 KT QU XC NH NNG C CH TI THIU CA NANO BC I VI VI KHUN GRAM DNG 33 4.2 KT QU XC NH NNG C CH TI THIU CA CHITOSAN I VI VI KHUN... hot ng khỏng khun ca chitosan khỏc vi khun Gram õm v Gram dng Trong nghiờn cu ny h phõn bit tỏc ng ca chitosan lờn Staphylococcus aureus (Gram dng) v E.coli (Gram õm) i vi Staphylococcus aureus