PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Thời gian: Từ 07/12/2013 đến 01/06/2014
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc với nấm men.
- Nội dung 2: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan với nấm men.
- Nội dung 3: Nghiên cứu lựa chọn nồng độ kết hợp chitosan với nano bạc kháng nấm men.
- Nội dung 4: Theo dõi theo thời gian khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan - nano bạc.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với nấm men
Nồng độ ức chế tối thiểu (The Minimal Inhibitory Concentration – MIC) là nồng độ thấp nhất chất kháng khuẩn mà sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật có thể quan sát sau một thời gian đủ dài thường là ủ qua đêm (24h hoặc 36h).
Ống chứa 0,5 ml dung dịch Hansen đã được chuẩn bị, hấp tiệt trùng ở 121ºC.
Nấm men hoạt hóa 16h, đo OD, sau đó pha loãng huyền dịch nấm men theo phương pháp pha loãng liên tiếp đến khi mật độ nấm men đạt 10-5 CFU/ml.
Tiến hành trộn 0,1ml huyền dịch nấm men, 0,4ml nano bạc ở các nồng độ khác nhau 25ppm, 12,5 ppm, 6,25 ppm, 3,125 ppm… (đối chứng là nước deion) với 0,5 ml môi trường Hansen trong ống nghiệm. Sau 24h nuôi cấy tiến hành định lượng mật độ vi sinh vật còn sống sót trong dịch trộn.
Thí nghiệm 2: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan đối với nấm men
Các ống chứa 0,5ml dung dịch Hansen đã được chuẩn bị, hấp tiệt trùng ở 121ºC.
Nấm men hoạt hóa 16h, đo OD, sau đó pha loãng huyền dịch nấm men theo phương pháp pha loãng liên tiếp đến khi mật độ nấm men đạt 10-5 CFU/ml.
Tiến hành trộn 0,1ml huyền dịch nấm men, 0,4 ml chitosan ở các nồng độ 1%; 0,75%; 0,5%; 0,25%; 0,125%; 0,0625%; 0,0375%;… (đối chứng là các dung dịch đệm acetat) với 0,5ml môi trường Hansen trong ống eppendorf.
Nồng độ chitosan sau khi trộn được tính lại là 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 500, 250 ppm. Sau 24h nuôi cấy tiến hành định lượng mật độ vi sinh vật còn sống sót trong dịch trộn.
Thí nghiệm 3: Xác định hoạt tính kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc.
a) Phương pháp phối trộn nano bạc và chitosan Nano Bạc:
Sử dụng 0,2 ml dung dịch nano bạc, tính toán để nồng độ nano bạc trong hỗn hợp = . Ký hiệu mẫu là: Na.
Sử dụng 0,2 ml dung dịch nano bạc, tính toán để nồng độ nano bạc trong hỗn hợp là MIC. Ký hiệu mẫu là: Nb.
Chitosan:
Sử dụng 0,2 ml dung dịch chitosan, tính toán để nồng độ chitosan trong hỗn hợp = . Ký hiệu mẫu là: Ca.
Sử dụng 0,2 ml dung dịch chitosan, tính toán để nồng chitisan trong hỗn hợp là MIC. Ký hiệu mẫu là: Cb.
Bảng 3.4: Phương pháp phối hợp chitosan/nano bạc
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4
Chitosan MIC/2 MIC/2 MIC MIC
Nano bạc MIC/2 MIC MIC/2 MIC
b) Phương pháp đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của hỗn hợp
Hình 3.4: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng VSV của nano bạc/chitosan Thí nghiệm 4: Theo dõi khả năng kháng nấm men của chế phẩm kết hợp chitosan – nano bạc theo thời gian
0,1 ml VSV mật độ 105cfu/ml
0,2 ml nano bạc (nồng độ Na, Nb)
Eppendoff chứa 0,5 ml môi trường Hansen trộn đều
1 ml dịch đối kháng, trong 24h ở 300C
Lấy 15 àl dịch, nhỏ trờn môi trường hansen, sau 24 - 48h ở 300C
Đọc kết quả, xác định nồng độ phù hợp
0,2 ml chitosan (nồng độ Ca, Cb)
Nano bạc kết hợp chitosan được bổ sung 0,4 ml vào 0,5ml môi trường Hansen cùng với 0,1ml huyền dịch nấm men. Sau thời gian 4, 12, 24, 36 giờ kể từ thời điểm bắt đầu trộn, định lượng mật độ nấm men còn sống sót.
3.4.2. Phương pháp phân tích
3.4.2.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp đối kháng trong dịch nuôi cấy lỏng
- Dung dịch nano bạc sau khi được tổng hợp có nồng độ 100 ppm.
- Tiến hành pha loãng bằng nước deion (DI) theo các nồng độ: C1 = 25 ppm; C2 = 12,5 ppm; C3= 6,25 ppm; C4=3,125 ppm; C5= 1,5625 ppm, C6=
0,71825ppm;
- Quy trình xác định 0,1ml dịch nấm
men hoạt hóa 24h,định lượng
mật độ vi sinh vật
- 0,4 ml nano bạc ở các nồng độ
(Đối chứng: 0,4 ml nước DI)
Sau 48h, quan sát, đọc kết quả
3.4.2.2. Phương pháp quan sát hình thái tế bào và xác định mật độ tế bào.
Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc - Cấy chính xác một thể tích mẫu, dịch pha loãng vào trong bề mặt thạch.
Eppendorf chứa 0,5 ml môi trường Hansen lỏng, trộn đều
1 ml dịch đối kháng, nuôi ở 30oC, 24h
- Mỗi độ pha loãng cấy lặp lại ít nhất hai hộp.
- Mỗi mẫu làm ít nhất hai độ pha loãng liên tiếp.
- Đếm tất cả số khuẩn lạc trên đĩa.
Tính kết quả:
N= (CFU/g/ml )
∑C: Tổng số khuẩn lạc trên các đĩa
n1 : Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1
n2: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 v: Thể tích nuôi cấy trên mỗi đĩa
f1: Độ pha loãng thứ 1
3.4.3. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Sử dụng phương pháp bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng: Vi sinh vật được hoạt hóa trong môi trường Hansen, sau đó được cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, nuôi 24h, trong 37ºC, giữ trong tủ lạnh để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ 2 tuần 1 lần.
v f n n
C
1 2 1 0,1 ).
( +
∑