ĐẶC điểm VI SINH vật của yếu tố NGUY cơ HPV TRONG UNG THƯ KHOANG MIỆNG – HỌNG MIỆNG

HPV cóvai trò quan trọng trong sự hình thành ung thư cổ tử cung, âm hộ, âm đạo, hậumôn, dương vật, ung thư phổi và một số loại ung thư vùng hầu họng trong đó có ung thư khoang miệng – họ

TRẦN QUANG LONG

ĐẶC ĐIỂM VI SINH VẬT CỦA YẾU TỐ NGUY CƠ HPV TRONG UNG THƯ KHOANG MIỆNG – HỌNG MIỆNG

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2018

-TRẦN QUANG LONG

ĐẶC ĐIỂM VI SINH VẬT CỦA YẾU TỐ NGUY CƠ HPV TRONG UNG THƯ KHOANG MIỆNG – HỌNG MIỆNG

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Lương Thị Minh Hương

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

NỘI DUNG 3

I PHÂN LOẠI HPV 3

II ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, CẤU TRÚC, HỆ GEN CỦA HPV 4

2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của HPV 4 2.2 Đặc điểm hệ gen HPV 4 III HPV TRONG UNG THƯ KHOANG MIỆNG – HỌNG MIỆNG 9

KẾT LUẬN 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Hình 1 Cấu trúc của HPV 4 Hình 2 Hệ gen HPV 5

ĐẶT VẤN ĐỀ

Human Papillomavirus (HPV) là một nhóm các virus gây bệnh ở ngườivới hơn 170 loại, là một trong các tác nhân phổ biến gây ung thư [1] HPV cóvai trò quan trọng trong sự hình thành ung thư cổ tử cung, âm hộ, âm đạo, hậumôn, dương vật, ung thư phổi và một số loại ung thư vùng hầu họng trong đó

có ung thư khoang miệng – họng miệng [2]

Ung thư họng khoang miệng và họng miệng là một trong những ungthư hay gặp nhất vùng đầu cổ, đồng thời cũng là một trong mười loại ung thưhay gặp nhất ở Việt Nam, chiếm tỷ lệ từ 6 đến 10% các bệnh ung thư nóichung Loại ung thư này cũng khá phổ biến trên thế giới, có mặt trong sáu loạiung thư thường gặp nhất [3] Các nghiên cứu cho thấy khoảng 25% các loại ungthư ở đầu và cổ và 60% các trường hợp ung thư miệng thực quản đều có biểuhiện dương tính với HPV Hầu hết, nhưng không phải tất cả, ung thư khoangmiệng – họng miệng là do HPV gây ra HPV gây ra 70% trường hợp ung thưkhoang miệng – họng miệng ở Hoa Kỳ, HPV type 16 gây ra 60% các trường hợpung thư khoang miệng – họng miệng [4] Do đó, HPV là một marker quan trọngtrong chẩn đoán và điều trị ung thư khoang miệng – họng miệng

Trên thế giới, hơn 640.000 trường hợp mới được phát hiện hàng năm[5] Trong năm 2013, ung thư miệng đã gây ra 135.000 trường hợp tử vongtăng so với 84.000 ca tử vong vào năm 1990 [6] Trong một nghiên cứu vềung thư khoang miệng – họng miệng ở Hoa Kỳ cho thấy tỷ lệ sống sót sau 5năm của những bệnh nhân ung thư khoang miệng – họng miệng là 63% nếuđược chẩn đoán sớm [7]

Tỷ lệ sống sót đối với ung thư miệng phụ thuộc vào vị trí chính xác vàgiai đoạn của ung thư khi chẩn đoán Đặc biệt, trong phần lớn nghiên cứu,bệnh nhân HPV dương tính có tiên lượng tốt hơn và sống sót 5 năm so vớibệnh nhân HPV âm tính với HNSCC [8] Dữ liệu của SEER cho thấy tỷ lệ

sống sót trên 5 năm khoảng 57% đối với tất cả các giai đoạn của chẩn đoánban đầu, tất cả các giới tính, mọi sắc tộc, mọi nhóm tuổi và các phương phápđiều trị Tỷ lệ sống sót của ung thư giai đoạn 1 khoảng 90%, do đó nhấn mạnhđến việc phát hiện sớm để tăng tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân [9]

Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu chuyên đề “Đặc điểm vi sinh vật của yếu tố nguy cơ HPV trong ung thư khoang miệng - họng miệng” nhằm thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đánh giá kết quả phẫu thuật ung thư khoang họng – miệng có sử dụng laser CO2” với mục đích tổng quan về các đặc điểm yếu tố

nguy cơ HPV trong ung thư họng khoang miệng và họng miệng

NỘI DUNG

I PHÂN LOẠI HPV

Hơn 170 type HPV đã được giải trình tự hoàn toàn Chúng được chiathành 5 chi: Alpha-papillomavirus, Beta-papillomavirus, Gamma-papillomavirus, Mupa-pillomavirus và Nupa-pillomavirus Có ít nhất 200 loạivirus được biết đến đang chờ giải trình tự và phân loại Khoảng 100 genotype

đã được xác định Mỗi genotype bao gồm các phân type khác nhau (subtype)

và các phân type được chia thành các biến thể (variant) còn được gọi là cácchủng virus [10]

Việc định type, phân type và chủng virus dựa vào sự phân tích về mức

độ giống và khác nhau của thành phần nucleotide của gen virus, ở đoạn genquy định cấu trúc vỏ của virus có tên L1, sự khác nhau của các nucleotide từ10% trở lên, 2 – 10% và từ 2% trở xuống giúp phân loại về type, phân type và

chủng virus [11] Cách phân loại này dựa trên sự tương đồng về trình tự

nucleotide gen L1, E6, E7 Việc xác định genotype HPV không dựa vào huyếtthanh như các loại virus khác mà dựa trên mức độ giống nhau của thành phầnnuccleotide và mức độ tương đồng giữa các thành phần acid amin trên các chuỗigen E6, E7 và L1 do đó, các type HPV thường được gọi là các genotype [12]

Ngoài ra còn dựa vào đặc điểm gây bệnh để phân loại như: loại gâybệnh ở da hay niêm mạc, loại gây nguy cơ ung thư cao hay thấp

Phân loại theo khả năng tác động của HPV đến tế bào chủ: HPV đượcchia thành 3 nhóm: Nhóm genotype HPV “nguy cơ thấp”: chỉ gây mụn cóhoặc khối u lành tính Nhóm genotype HPV “nguy cơ cao”: gồm nhữnggenotype HPV có khả năng tích hợp ADN vào hện gen người, làm rối loạnquá trình nhân lên của tế bào chủ, gây ra hiện tượng tăng sinh và bất tử hóa tếbào hình thành khối u ác tính Nhóm genotype HPV “chưa xác định nguy cơ”:gồm đa số các genotype chưa xác định rõ khả năng gây ung thư [13]

II ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, CẤU TRÚC, HỆ GEN CỦA HPV

2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của HPV

Papillomaviruses là một thành viên của họ Papovaviridae với đặc trưng

là một nhóm các virus có kích thước nhỏ, không có vỏ bọc, hình cầu, đườngkính virion xấp xỉ 55 nm Vỏ capsid có cấu tạo gồm 72 đơn vị capsomer, mỗiđơn vị capsomer gồm một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp vớiprotein L2 Protein L1 do gen L1 mã hóa có kích thước khoảng 55 kDa chiếm80% tổng số protein của virus Protein L2 do gen L2 mã hóa kích thướckhoảng 70 kDa chiếm khoảng gần 20% [14]

Hình 1 Cấu trúc của HPV 2.2 Đặc điểm hệ gen HPV

ADN của HPV là một chuỗi xoắn kép, dạng vòng, kích thước hệ genchỉ khoảng 8000bp [15] Chủ yếu mã hóa 8 protein chính, 6 protein nằm trongkhu vực "sớm" và 2 protein ở khu vực "muộn" Các protein "sớm" đóng vaitrò điều hòa Ví dụ, chúng đóng vai trò trong việc nhân bản và sao chép gencủa HPV, chu trình tế bào, tín hiệu tế bào và kiểm soát quá trình apoptosis,

điều khiển quá trình miễn dịch và cải biến cấu trúc của tế bào bị nhiễm bệnh.Hầu hết các protein này được biểu hiện trong suốt chu kỳ truyền nhiễm giảmbiểu hiện ở những thời điểm cuối E4 là protein virus đầu tiên biểu hiện trongnhóm protein “muộn” trong quá trình truyền nhiễm, sau đó là các proteinmuộn, L1 và L2 [16].

Hình 2 Hệ gen HPV

Bộ gen của HPV bao gồm 3 vùng quan trọng [17]:

Vùng điều hòa thượng nguồn URR (Upstream Regulatory Region) haycòn được gọi là vùng điều hòa dài LCR (Long Control Region), chứa ADNkhông mã hóa, có chức năng điều hòa quá trình sao chép ADN và quá trìnhphiên mã Đây là vùng biến động nhất, chiếm khoảng 10% chiều dài của bộgen, tương đương 800-1000 bp Trình tự vùng URR bao gồm: Trình tự tăngcường – là nơi gắn các nhân tố phiên mã như AP-1, NF1, otc1, TEF1,TEF2, ; Promoter bao gồm cấu trúc TATA box và vùng khởi đầu cho quátrình phiên mã; điểm khởi đầu sao chép ORI, các tiểu phần kích hoạt và một

số gen câm [17]

Vùng gen sớm (Early Region): Gồm 6 gen, ký hiệu là E1, E2, E4, E5,E6, E7 và các khung đọc mở ORF Sản phẩm của các gen này đóng vai tròtrong quá trình sao chép ADN, gây tăng sinh tế bào, biến đổi tế bào, hìnhthành tế bào bất tử [17].

Vùng gen muộn (Late Region): Gồm 2 gen tổng hợp protein L1 và L2 –

2 protein cấu trúc vỏ capsid của virus Đây là vùng gen mã hóa muộn hơn sovới các vùng gen khác của virus nên gọi là vùng gen muộn [17]

Chức năng các gen và các sản phẩm của gen HPV

Mỗi gen HPV đều góp phần vào quá trình gây bệnh của virus E1 cầnthiết cho quá trình nhân bản của virus và được liên quan đến việc duy trì bộ gen,chúng đóng vai trò như một ATP-dependent DNA helicase [18, 19] Gen E1 làmột trong 2 vùng gen bảo tồn nhất của HPV (cùng với L1) Gen E1 gắn vào vịtrí khởi đầu quá trình nhân lên (ori), thực hiện quá trình chia tách ADN (helicase)

và giúp các chuỗi gen của virus duỗi ra trong quá trình sao chép [20]

E2 có liên quan đến việc điều hòa quá trình nhân lên, phiên mã và dịch

mã của virus Đồng thời E2 còn đóng vai trò trong việc phân chia, đóng góivirus; điều hòa biểu hiện của gen, chu kỳ tế bào và quá trình apotosis [19].Ngoài ra, E2 còn đóng vai trò duy trì chuỗi gen của virus ngoài nhiễm sắc thể

Sự điều hòa có thể là “tích cực” hoặc “tiêu cực”, đạt được thông qua sựtương tác với promoter ở vùng URR [18] Chức năng điều hòa giải mã của E2được thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gen của virus có ái lựcvới gen E2 và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của E2 trong quátrình giải mã Ở chuỗi gen của nhóm HPV “nguy cơ cao” gen E2 có khả năngthúc đẩy sự bộc lộ của các gen sớm của virus, do đó khi gen HPV nhóm nguy

cơ cao xâm nhập vào nhiễm sắc thể vật chủ làm tăng khả năng bộc lộ gen gâyung thư E6 và E7 [20]

Mặc dù E4 là một phần của vùng sớm, nhưng nó được biểu hiện sautrong chu kỳ sống của virus [18] E4 đóng vai trò cải biến mạng lưới

cytokeratin, bắt giữ chu trình tế bào và đóng gói các Virion [19] Protein E1

và E4 là sản phẩm được tạo ra từ mRNA đóng vai trò trong quá trình trưởngthành và phóng thích virus ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ GenE1 và E4 chứa 3 dạng chính tác động vào chu kỳ sống của virus: Dạng genchứa nhiều leucine ở đầu N liên quan đến keratin và cần thiết cho quá trìnhnhân lên của virus; Vùng chứa nhiều proline ở đoạn trung tâm, chứa vị tríthreonine cần thiết cho khoảng nghỉ của chu kỳ tế bào tại giai đoạn G2/M vàgiải mã phức hợp cyclinB/cdk1 ở bào tương; Đầu tận cùng C chứa domainđơn dạng kiểu niêm mạc và điều hòa khả năng gen E1 và E4 tạo ra sựolimerize, gắn với DEAD-box RNA helicase và tạo ra sự phá vỡ hệ thống sợikeratin [20]

E5 tương tác với các yếu tố tăng trưởng trên màng tế bào và được liênkết với vùng điều hòa dưới, đóng vai trò điều khiển sự sinh trưởng và biệt hóacủa tế bào, điều tiết hệ thống miễn dịch của tế bào chủ [18, 19] Do vậy, E5cần thiết cho quá trình xâm nhập và tồn tại của virus trong tế bào chủ Ngoài

ra, E5 còn đóng vai trò trong việc ngăn cản sự chết theo chương trình(apoptosis) của tế bào khi có sự sai hỏng do chính virus gây ra [20]

E6 và E7 là các gen gây ung thư có liên quan đến tăng sinh tế bào chủ.Gen E6 mã hóa cho protein E6 là một Oncoprotein gồm 150 acid amin GenE6 có 3 chức năng chính: Protein E6 của nhóm nguy cơ cao liên kết hoặckhông liên kết với protein E7 gây kích thích tế bào chủ phân chia mạnh mẽ và

sự phân chia này là mãi mãi, gây bất tử hóa tế bào Protein E6 có khả nănggây quá sản bằng cách ức chế chu kỳ nghỉ của vòng tế bào do sự phá hủyADN và gây thúc đẩy tiến triển của tế bào [20]; chúng quy định hình dạng của

tế bào, tính phân cực, tính di động và tín hiệu tế bào [19] Khả năng gây ungthư của E6 được điều hòa bởi khả năng hoạt động như giá đỡ và điều hòatương tác protein với protein Tương tác protein được mã hóa trên trên E6đáng chú ý là p53 Tương tác với p53 thông qua sự liên kết giữa E6 và E6AP

bằng liên kết ligand, tạo ra sự thoái triển của p53 – yếu tố giải mã và ức chếung thư, có vai trò điều hòa chính hoạt động ức chế tổng hợp ADN thông quachu kỳ nghỉ của tế bào Bình thường khi có tín hiệu phá hủy tế bào hoặc có sựnhân lên sai hỏng của ADN, gen ức chế ung thư p53 sẽ chuyển vòng tế bào sangchu kỳ nghỉ hoặc gây chết theo chương trình thông qua hoạt động giải mã củagen Hơn nữa E6 còn có khả năng liên kết với protein PDZ dẫn đến sự thoái triểncủa protein này – protein cần thiết cho sự phát triển, kết dính, tăng sinh, biệt hóa,

và duy trì chu kỳ sống của tế bào E6 liên kết với gen ras trong quá trình bất tử

hóa tế bào, đồng thời hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus [20]

Protein E7 đóng vai trò điều khiển chu trình tế bào, kiểm soát sự nhânlên của trung thể [19], do gen E7 mã hóa gồm 98 acid amin, có vùng bảo tồnvùng tận cùng N và Domain gắn Kẽm ở đầu C giúp E7 liên kết chặt chẽ vớiE6, hỗ trợ nhau trong cơ chế gây bất tử hóa tế bào; E7 chứa motif gắn proteinpocket giúp E7 gắn kết với các gen gây ức chế khối u (như pRb) hoặc gắn với

2 protein pocket khác là p107 và p130 làm giải phóng một số lượng lớn yếu tốE2F tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào Thôngthường, pRb bị thủy phân sớm ở chu kỳ tế bào Ở giai đoan phosphorin hóa,pRb gắn với yếu tố sao chép E2F/DP – phức hợp hoạt hóa sao chép điềukhiển sự bộc lộ các gen ở giai đoạn S gây ức chế quá trình hoạt hóa phức hợpsao chép Trong trường hợp nhiễm HPV, sự bộc lộ gen E7 không cần quá trìnhphosphorin hóa pRb để hoạt hóa phức hợp sao chép E2F/DP [20]

L1 mã hóa các thành phần chính và L2 mã hóa các tiểu phần phụ củacapsid [21, 22] Gen L1 là vùng gen bảo tồn nhất của virus được ứng dụngtrong phát hiện và phân loại Papillomavirus [20] L2 được biểu hiện trước L1

để cho phép sự phù hợp về cấu trúc vỏ capsid L1 được bộ lộ hình thành cáchạt giống như virus, nhưng L2 được cho rằng có thể nâng cao khả năng lâynhiễm hoặc đóng gói của virus [19, 21, 22]

III HPV TRONG UNG THƯ KHOANG MIỆNG – HỌNG MIỆNG

Ung thư biểu mô tế bào vảy vùng đầu cổ (HNSCC) có tỷ lệ mắc và tửvong cao, tỷ lệ nhiễm khác nhau trên toàn thế giới, tỷ lệ cao ở Đông Nam Á

và Đông Âu [23] Ung thư biểu mô tế bào vảy ở đầu và cổ HNSCC là mộtthuật ngữ chung bao gồm các ung thư của khoang mũi, xoang, môi, miệng,tuyến nước bọt, cổ họng và thanh quản Ung thư khoang miệng – họng miệng

là một trong những loại ung thư ở vùng đầu cổ thường gặp nhất [24] Theoước tính, hơn 45.000 người Mỹ được chẩn đoán ung thư khoang miệng vàhọng miệng vào năm 2015, và khoảng 8.650 tử vong do bệnh này [25] Hútthuốc lá, uống rượu bia là những yếu tố nguy cơ chính cho HNSCC và ướctính chiếm phần nguyên nhân gây bệnh tật trên toàn thế giới [26] Tuy nhiên,một tỷ lệ nhỏ 15-20% trường hợp HNSCC xảy ra ở những người không uốngrượu, không hút thuốc, điều này cho thấy còn có sự hiện diện của các yếu tốnguy hiểm khác Những dữ liệu về dịch tễ học và sinh học phân tử gần đây đãkhẳng định rằng HPV lây nhiễm qua đường hô hấp trên có thể thúc đẩy cácloại ung thư vùng đầu cổ [23, 27]

Trong vòng 15 năm qua, virus gây u nhú ở người (HPV), nguyên nhânchính gây ung thư cổ tử cung [28, 29], cũng là nguyên nhân dẫn đến ung thư

tế bào vảy vùng đầu – cổ HNSCC [23, 30-33] Trong số các nghiên cứu vềHNSCC, tỷ lệ hiện nhiễm DNA HPV vẫn còn chưa rõ ràng, tuy nhiên một sốnghiên cứu đã ước tính có đến 60% số bệnh nhân HNSCC dương tính vớiHPV [30-33] Phát hiện DNA HPV trong các mô sinh khối u không phải làbằng chứng đầy đủ về nguyên nhân ung thư, tuy nhiên các nghiên cứu về sinhhọc phân tử đã giúp xác định một tập hợp các loại ung thư này có thể là hậuquả của nhiễm HPV [30, 33-37] Các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằngphơi nhiễm với HPV làm tăng nguy cơ HNSCC và HPV có thể tương tác với

sự phơi nhiễm rượu và thuốc lá trong việc thúc đẩy khối u Các nghiên cứuphân tử chỉ ra rằng virus có hoạt tính phiên mã là hạn chế trong các tế bào

khối u Vai trò của HPV trong sự phát triển của HNSCC đã được xác định, bởi

vì vắc xin điều trị dựa trên HPV đang được phát triển cho ung thư cổ tử cungcũng có thể có ích đối với HNSCC [27]

Một số loại genotype HPV nhóm “nguy cơ cao” đã được tìm thấy trongkhoang miệng và túi họng của những người lớn không có ung thư [38] vàtrong các mẫu sinh thiết ung thư từ bệnh nhân HNSCC [30-33] HPV16, loạiHPV phổ biến nhất trong ung thư cổ tử cung SCC [13], cũng là loại phổ biếnnhất hiện diện trong các HNSCC của bệnh nhân dương tính HPV [30-33].HPV16 và HPV18 chiếm hầu hết tất cả các loại HPV gây ung thư phát hiệntrong sinh thiết HNSCC

Những virus HPV nhóm “nguy cơ cao” này là một nguyên nhân cầnthiết nhưng không đủ để gây ung thư biểu mô tế bào vảy cổ tử cung và liênquan đến sự phát triển các ung thư tế bào vảy khác HPV có thể gây ung thưbằng một số cơ chế [39]: E6 và E7 gây ung thư protein, sự phá vỡ các gen ứcchế khối u, sự khuếch đại DNA ở cấp độ cao, ví dụ, oncogenes, tạo sản phẩmphiên mã thay thế không hoạt động, sự sắp xếp lại các interchromosomal,khác biệt hóa Mô hình methyl hóa và các mô hình biểu hiện gen được tạo rangay cả khi virus không được tích hợp vào bộ gen của vật chủ

Sự cảm ứng ung thư có thể liên quan tới biểu hiện của các oncoproteinvirus, quan trọng nhất là E6 và E7, hoặc nhiều cơ chế vận hành khác bởi việchòa nhập ví dụ như huy động hệ thống phiên mã thay thế, ngừng hoạt độngcủa các yếu tố ức chế khối u, sự khuếch đại DNA ở mức độ cao, sự sắp xếp lạicác interchromosomial, hay thay đổi trong mô hình methyl hóa DNA, những

sự thay đổi này có thể xuất hiện ngay cả khi virus ở trong biểu mô [40, 41].E6 cô lập p53 để thúc đẩy sự phân hủy của p53 trong khi pRb ức chế E7 P53ngăn cản sự phát triển của tế bào khi DNA bị hư hỏng bằng việc kích hoạt quátrình apotosis và p21, một kinase khóa sự hình thành của phức hợp cyclin D /Cdk4 tránh để pRb thực hiện quá trình Phosphorin hóa và bởi vậy ngăn cản sự