NGHIÊN cứu một số đặc điểm tế bào máu và tủy XƯƠNG ở BỆNH NHI lơ xê MI cấp DÒNG LYMPHO b TRƯỚC và SAU điều TRỊ tấn CÔNG tại BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG

BC Bạch cầuCALLA Common acute lymphoblastic leukemia antigen Kháng nguyên phổ biến lơxêmi cấp thể lympho CD Cluster of diferentiation Cụm biệt hóa Cig Cytoplasmic Immunoglobuline Globuli

Hoàn thành luận văn này, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Bangiám hiệu, Phòng đào tạo sau Đại học, Bộ môn Huyết học – Truyền máuTrường Đại học Y Hà Nội, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã tạođiều kiện và giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Trần Thị Hồng Hà, người đã trực tiếphướng dẫn, đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và động viên em, tạo không khí chia

sẻ, làm nguồn động lực cho em trong suốt quá trình nghiên cứu Cô đã dạy emkhông chỉ kiến thức chuyên môn mà còn cả đạo đức nghề nghiệp, nhiệt huyếtnghiên cứu và phương pháp luận khoa học

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trungương đã cho em cơ hội được tham gia và hoàn thành khóa học với những điềukiện tốt nhất Xin gửi lwoif cảm ơn tới Phòng Kế hoạch tổng hợp Bệnh việnNhi Trung ương đã tạo điều kiện cho em trong quá trình thu thập số liệu

Em xin gửi lời cảm ơn tập thể cán bộ nhân viên Khoa Huyết học, KhoaUng bướu, Bệnh viện Nhi Trung ương, nơi em thực hiện đề tài đã tận tìnhgiúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu

Xin gửi lời cảm ơn tới tập thể anh chị em Khoa Khám bệnh, KhoaTruyền máu bệnh viện Nhi Trung ương nơi em đã và đang công tác đã chia sẻcông việc trong suốt thời gian 2 năm học, tạo điều kiện cho em hoàn thànhkhóa học

Sau cùng em xin dành lời cảm ơn thân thương cho những người thântrong gia đình mình, bạn bè thân thiết, đã động viên và là chỗ dựa vững chắccho em nỗ lực, phấn đấu trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 16 tháng 10 năm 2017

Em là Phạm Thị Thu, học viên cao học khóa 24, chuyên ngành Huyết học– Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân em trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa Tiến sĩ Trần Thị Hồng Hà

2 Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công

bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này

Hà Nội, ngày 16 tháng 10 năm 2017

Phạm Thị Thu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Những nét cơ bản về quá trình tạo máu và điều hòa tạo máu 3

1.1.1 Vi môi trường tạo máu 3

1.1.2 Vị trí tạo máu 4

1.1.3 Tế bào nguồn tạo máu 4

1.1.4 Điều hòa tạo máu 5

1.2 Dòng lympho, quá trình biệt hóa và chức năng: 7

1.2.1 Lympho B 7

1.2.2 Lympho T 8

1.2.3 Tế bào NK và tế bào K 9

1.3 Sinh bệnh học của bệnh LXM cấp thể lympho 9

1.3.1 LXM cấp dòng tế bào pre-B 10

1.3.2 LXM cấp dòng lympho tế bào B trưởng thành: 11

1.3.3 LXM cấp dòng lympho tế bào T 11

1.4 Các phương pháp chẩn đoán và phân loại bệnh LXM cấp dòng lympho ở trẻ em 11

1.4.1 Dựa vào hình thái tế bào và hóa học tế bào theo FAB 12

1.4.2 Dựa vào kiểu hình miễn dịch 13

1.4.3 Phân loại dựa vào di truyền tế bào và di truyền phân tử: 15

1.4.4 Một số trường hợp đặc biệt của LXM cấp dòng lympho: có một số thể bệnh ít gặp hơn nhưng cũng rất cần lưu ý để không bỏ qua: 17

1.4.5 Phân loại bệnh theo mức nguy cơ: 17

1.5 Điều trị LXM cấp dòng lympho ở trẻ em 17

1.5.1 Hóa trị liệu 18

1.6 Các dấu ấn miễn dịch tế bào trong quá trình sinh sản và biệt hóa tế bào máu Xác định bệnh tồn lưu tối thiểu bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy 19

1.6.1 Các dấu ấn miễn dịch tế bào 19

1.6.2 Xác định bệnh tồn lưu tối thiểu bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy 21

1.7 Điểm qua tình hình nghiên cứu bệnh LXM cấp dòng lympho ở trẻ em trên thế giới và ở Việt Nam 26

1.7.1 Trên thế giới 26

1.7.2 Tại Việt Nam 26

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3 Kỹ thuật sử dụng và phương pháp đánh giá 30

2.3.1 Kỹ thuật sử dụng 30

2.3.2 Phương pháp đánh giá 32

2.3.3 Tiêu chuẩn đánh giá và nguyên tắc phân tích MRD 34

2.4 Xử lý số liệu 36

2.5 Mô tả kết quả 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 37

3.1.1 Phân bố độ tuổi 37

3.1.2 Phân bố theo giới 37

3.1.3 Phân loại thể bệnh trong nhóm nghiên cứu 38

3.2 Một số đặc điểm tế bào máu và tủy xương trước và sau điều trị 38

3.2.1 Đặc điểm tế bào máu ngoại vi trước và sau điều trị 39

3.2.2 Đặc điểm tế bào tủy xương trước và sau điều trị 41

flow cytometry 50

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 56

4.1 Một số đặc điểm dịch tễ nhóm bệnh nhân nghiên cứu 56

4.1.1 Đặc điểm về tuổi 56

4.1.2 Đặc điểm về giới 56

4.1.3 Đặc điểm xếp loại thể bệnh trong nhóm nghiên cứu 57

4.2 Một số đặc điểm tế bào máu và tủy xương trước và sau điều trị tấn công. 57 4.2.1 Một số đặc điểm tế bào máu ngoại vi trước và sau điều trị 57

4.2.2 Một số đặc điểm tế bào tủy xương trước và sau điều trị 59

4.3 Một số đặc điểm miễn dịch tế bào trong nhóm nghiên cứu trước và sau điều trị 60

4.3.1 Đặc điểm miễn dịch tế bào của nhóm nghiên cứu khi chẩn đoán, 60

4.3.2 Đặc điểm một số dấu ấn miễn dịch tế bào sau giai đoạn điều trị tấn công 63 4.3.3 Đánh giá bệnh tồn lưu tối thiểu sau khi kết thúc giai đoạn điều trị tấn công bằng hóa trị liệu 65

KẾT LUẬN 67

KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

BC Bạch cầu

CALLA Common acute lymphoblastic leukemia antigen

(Kháng nguyên phổ biến lơxêmi cấp thể lympho)

CD Cluster of diferentiation (Cụm biệt hóa)

Cig Cytoplasmic Immunoglobuline

(Globulin miễn dịch nguyên sinh chất)

DAMDTB Dấu ấn miễn dịch tế bào

FAB French- American- British

( Phân loại bệnh theo tiêu chuẩn Pháp-Mỹ-Anh)

Ig Immunoglobulin (Globulin miễn dịch)

MPO Myeloperoxydase (Men peroxydase bạch cầu)

MIC Morphology- Immunology- Cytogenetic

( Hình thái tế bào- Miễn dịch- Di truyền tế bào)

PAS Periodic acid- Schiff

PCR Polymerase chain reaction

Sig Surface Immunoglobulin (Globulin miễn dịch bề mặt)

TdT Terminal deoxynucleotidyl tranferase

PerCP-Cy5.5 Peridin chlorophyll protein 5.5 ( PerCP- Cy5.5)PE-Cy7 Phycoerythrin-cyanine 7

WHO World Health Organization

Bảng 1.2 Các kỹ thuật đánh giá MRD 22

Bảng 2.1 Phân loại mức độ tồn lưu tối thiểu của bệnh theo MDTB 35

Bảng 3.1 Đặc điểm chung một số chỉ số máu và tủy xương trước và sau điều trị 38

Bảng 3.2 Số lượng bạch cầu, bạch cầu hạt trung tính máu ngoại vi trước và sau điều trị 39

Bảng 3.3 Lượng Hb trước và sau điều trị 40

Bảng 3.4 Số lượng tiểu cầu trước và sau điều trị 40

Bảng 3.5 Phần trăm tế bào ác tính máu ngoại vi khi chẩn đoán 41

Bảng 3.6 Số lượng tế bào tủy xương trước và sau điều trị 41

Bảng 3.7 Dòng hạt tủy xương trước và sau điều trị 42

Bảng 3.8 Tỷ lệ tế bào ác tính tủy xương khi chẩn đoán 42

Bảng 3.9 Tỷ lệ tế bào ác tính máu ngoại vi và tủy xương khi chẩn đoán 43

Bảng 3.10 Số lượng bạch cầu theo nhóm tuổi 44

Bảng 3.11 Đặc điểm biểu hiện một số dấu ấn non ở bệnh nhi LXM cấp dòng lymphoB 45

Bảng 3.12 Đặc điểm biểu hiện một số dấu ấn đặc trưng dòng lympho B ở nhóm nghiên cứu 45

Bảng 3.13 Biểu hiện dấu ấn CD19 trước và sau điều trị 46

Bảng 3.14 Biểu hiện dấu ấn CD10 trước và sau điều trị 46

Bảng 3.15 Biểu hiện dấu ấn CD20 trước và sau điều trị 47

Bảng 3.16 Biểu hiện dấu ấn CD34 trước và sau điều trị 47

Bảng 3.17 Biểu hiện dấu ấn CD45 trước và sau điều trị 48

Bảng 3.18 Biểu hiện dấu ấn CD38 trước và sau điều trị 48

Bảng 3.19 Biểu hiện dấu ấn CD123 trước và sau điều trị 49

Bảng 3.22 Kết quả MRD trên flow cytometry 51Bảng 3.23 Lui bệnh hoàn toàn về mặt hình thái học và chỉ số MRD sau điều trị 51Bảng 3.24 Đánh giá mức độ nguy cơ trước điều trị và theo MRD sau điều trị 52Bảng 3.25 Số lượng BC máu ngoại vi và 3 nhóm nguy cơ theo MRD 52Bảng 3.26 Số lượng ác tính trong tủy và mức độ nguy cơ theo chỉ số MRD

53Bảng 3.27 Biểu hiện Dấu ấn CD34 trong các nhóm nguy cơ theo chỉ số MRD 54Bảng 3.28 Biểu hiện dấu ấn CD10 trong các nhóm nguy cơ theo chỉ số MRD 55

Biểu đồ 3.1 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm độ tuổi mắc bệnh 37Biểu đồ 3.2 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm giới tính mắc bệnh 37Biểu đồ 3.3 Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho B 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Phân loại tế bào lympho bằng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với

kháng nguyên biệt hóa 20

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơxêmi (LXM) là bệnh máu ác tính hay gặp nhất trong số những bệnh áctính ở trẻ em, bao gồm LXM dòng tủy và LXM dòng lympho Trong đó LXMcấp dòng lympho (ALL) chiếm khoảng 25% của tất cả các chẩn đoán ung thư

ở trẻ < 15 tuổi Tỷ lệ ALL trên toàn thế giới là 1/25.000 trẻ em mỗi năm, trong

đó có 3.000 trẻ em mắc bệnh mỗi năm tại Hoa kỳ [1] Ở Pháp, tỷ lệ mắc mới1,5/100.000 dân/ năm, 1000 trường hợp mắc mới về ALL mỗi năm LXM cấpdòng lympho chiếm 80% các trường hợp Lơxêmi cấp ở trẻ em và 20% cáctrường hợp Lơxêmi cấp ở người lớn[2], với 2 đỉnh tần số: ở trẻ em 2-10 tuổi( 75% các trường hợp được chẩn đoán trước 6 tuổi) và người trưởng thành từ

> 50 tuổi.[2] Tại Việt Nam theo tác giả Đỗ Trung Phấn và Trần Thị MinhHương (2002) đã nghiên cứu tình hình bệnh máu tại viện Huyết học – Truyềnmáu Trung ương Bệnh viện Bạch Mai, thấy LXM cấp gặp với tỷ lệ cao nhất( 38,5%) trong số các bệnh máu gặp tại Bênh viện Bạch Mai [3]

LXM cấp dòng lympho là một bệnh ác tính do sự tăng sinh clone và sự

ứ trệ của các tế bào đầu dòng, mà ở các tế bào đó có thể hiện các marker tếbào liên quan đến giai đoạn sớm nhất của sự trưởng thành dòng lympho Tạithời điểm chẩn đoán, các tế bào LXM, hay còn gọi là lymphoblast, sẽ hầu nhưthay thế hoàn toàn các tế bào bình thường ở tủy xương, rồi theo đường máucác tế bào LXM đã được gieo rắc đến các cơ quan khác ngoài tủy như gan,lách, hạch Sự sinh máu bị ảnh hưởng nghiêm trọng, lý do không chỉ do tế bàogốc sinh máu vạn năng bị ảnh hưởng mà chủ yếu do một tác động thứ phátcủa sự ứ trệ quá nhiều các lymphoblast tại tủy xương [4] Điều này sẽ dẫn đếnnhững thay đổi phức tạp các thông số cận lâm sàng và biểu hiện các triệuchứng lâm sàng Đây là bệnh có tính không đồng nhất Bởi vậy, chúng ta cầntìm hiểu sâu sắc về bệnh, để có thể phân loại bệnh một cách chính xác nhất, từ

đó có phác đồ điều trị một cách hiệu quả nhất

Trên thế giới ở những nước phát triển từ 20 năm trở lại đây, điều trịLXM cấp dòng lympho ở trẻ em đã đạt được những thành công đáng kể nhờvào những tiến bộ trong phân loại bệnh, hóa trị liệu, điều trị hỗ trợ, tỷ lệ bệnhnhân lui bệnh hoàn toàn sau giai đoạn điều trị tấn công đạt trên 90%, tỷ lệsống không bệnh 5 năm đạt khoảng 80% [5] Ở Việt Nam với sự hội nhậpquốc tế về y học, sự phát triển như vũ bão của công nghệ sinh học, y họcnhững hiểu biết về căn bệnh LXM cấp ở trẻ em đã có nhiều cải thiện, LXMcấp dòng lympho không còn là căn bệnh vô phương cứu chữa, đặc biệt làLXM cấp dòng lympho B – thể bệnh hay gặp nhất ở trẻ em Tuy nhiên, bệnhnhân LXM cấp có khoảng 1012 tế bào BC ác tính lúc chẩn đoán, thì vào giaiđoạn lui bệnh theo tiêu chuẩn hình thái học vẫn còn 109 tế bào BC ác tínhkhông phát hiện được và là tiềm năng gây tái phát bệnh [6] Xét nghiệm đánhgiá bệnh tồn lưu tối thiểu (MRD) là một cách tốt nhất để đánh giá hiệu quảđiều trị, giúp xác định bệnh nhân có thực sự đạt lui bệnh hoàn toàn haykhông, dự báo kết quả điều trị và tái phát sớm để từ đó có thể điều chỉnh phác

đồ một cách chính xác nhất đối với từng bệnh nhân

Vì vậy, đề tài này thực hiện nhằm hai mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu một số đặc điểm tế bào máu và tủy xương ở bệnh nhi LXM cấp dòng lympho B trước và sau điều trị tấn công.

2 Phân tích sự thay đổi dấu ấn miễn dịch và đánh giá bệnh tồn lưu tối thiểu trên bệnh nhi LXM cấp dòng lympho B trước và sau điều trị tấn công tại Bệnh viện Nhi trung ương.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Những nét cơ bản về quá trình tạo máu và điều hòa tạo máu

LXM cấp dòng lympho là một bệnh ác tính do sự tăng sinh các tế bàolymphoblast và sự ứ trệ ở tủy xương và sự sinh máu bình thường bị tổn hạinghiêm trọng, gây nên những rối loạn về sinh máu Để hiểu rõ hơn về nhữngrối loạn đó chúng ta cần nắm được cơ chế sinh máu bình thường của cơ thể

1.1.1 Vi môi trường tạo máu

Tổ chức đệm (vi môi trường tạo máu) là nơi có những điều kiện thíchhợp để quá trình tạo máu diễn ra một cách thuận lợi nhất Ở tổ chức này có sựtương tác giữa tế bào - dịch thể và tương tác tế bào - tế bào để điều hòa tạomáu theo cơ chế cận tiết Hai thành phần cấu tạo nên hệ đệm là tế bào đệm vàchất đệm gian bào

 Tế bào đệm: Tất cả các tế bào của hệ thống liên kết có mặt ở tủy

xương để hỗ trợ cho việc sinh máu Lớp tế bào vỏ khoang tạo thành bởi liênkết lỏng lẻo của các tế bào nội mô mạch máu và các tế bào liên võng ngoạimạc Cấu trúc này tạo thành hàng rào ngăn cách tương đối giữa tế bào sinhmáu và tuần hoàn tủy xương, giúp kiểm soát sự xâm nhập của tế bào lạ từmáu vào tủy xương, đồng thời điều hòa việc phóng thích tế bào trưởng thành

từ tủy xương ra máu Tế bào liên võng ngoại mạc tỏa các tua bào tương vàokhoang tạo máu làm thành khung đỡ cho các tế bào máu cư trú Ngoài ra, cácđại thực bào, tế bào lympho, tạo cốt bào, hủy cốt bào, tế bào xơ, góp phần tạo

vi môi trường sinh máu do sản xuất ra các hormon tham gia điều hòa quátrình sinh máu và các protein của tổ chức đệm [7] Tế bào mỡ giúp ổn địnhkhông gian sinh máu, cung cấp năng lượng và các lipid cấu trúc màng cho tếbào tạo máu, có khả năng chuyển biến thành các tế bào sinh máu hoặc các tế

bào khác của hệ đệm khi cần thiết và đặc biệt có chức năng chế tiết một sốyếu tố tăng trưởng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh máu Đại thựcbào, tế bào lympho cũng tham gia vi môi trường tạo máu, kiểm soát tạo máutại chỗ qua việc tiết các yếu tố kích thích tế bào gốc (interleukin 1, IL-1), yếu

tố ức chế tế bào gốc (macrophage inhibitor for progenitor – MIP), protein gâyviêm 1a và yếu tố hoại tử khối u (tumor necrosis factor – TNF) [8],[9]

 Chất đệm gian bào: Gồm toàn bộ các protein ngoại bào của mô liên

kết như: fibronectin, collagen, osteonectin và nhiều protein khác tạo hệ đệmgian bào, là môi trường cần thiết cho hoạt động tạo máu Các protein nàycũng đóng vai trò trong tương tác giữa các tế bào gốc và tế bào đệm, truyềndẫn thông tin điều hòa tạo máu [2]

1.1.3 Tế bào nguồn tạo máu

Tế bào nguồn sinh máu là những tế bào có khả năng sinh sản và biệt hóa

thành các tế bào máu trưởng thành có chức năng riêng biệt [13].

Tế bào nguồn sinh máu vạn năng (pluripotential stem cells): là tế

bào gốc non nhất, phát triển sớm nhất, là tế bào đầu dòng của tất cả các dòng

tế bào máu, có khả năng sống dài ngày và tái sinh sản tốt Chúng có hình thái

giống tế bào lympho nhưng không tạo hoa hồng với hồng cầu cừu và cũngkhông có khả năng đáp ứng miễn dịch khi bị kích thích bằng kháng nguyên.Bằng kỹ thuật xác định dấu ấn màng, người ta thấy tế bào nguồn sinh máu vạnnăng có nhóm quyết định kháng nguyên CD 34+ Tế bào gốc vạn năng chủ yếutrong tủy xương nhưng cũng có một tỷ lệ nhỏ ở lách và ở máu ngoại vi

Tế bào nguồn sinh máu đa năng (multipotential stem cells): phát

triển từ tế bào nguồn sinh máu vạn năng Chúng có khả năng tạo tế bào gốccho từng nhóm tế bào, còn gọi là tế bào gốc tạo máu định hướng như nhómđịnh hướng dòng tủy (myeloid) CFU-GEMM, nhóm định hướng dònglympho (CFU-L)

 Tế bào nguồn có khả năng sinh hai dòng tế bào (bipotential stem cells): tế bào này chỉ sinh được hai dòng tế bào như CFU-EM (Erythroid/

Megakaryocyte) chỉ sinh ra hồng cầu và tiểu cầu, hoặc CFU-GM(Granulocyte/ Macrophage) chỉ sinh ra bạch cầu hạt và bạch cầu mono/ đạithực bào

 Tế bào nguồn chỉ có khả năng sinh ra một dòng tế bào và biệt hóa thành tế bào chín ( unipotential stem cells): đó là các tế bào mẹ của dòng

hồng cầu (BFU-E, CFU-E), dòng bạch cầu hạt (CFU-G), bạch cầu ưa acid(CFU-Eo), bạch cầu ưa base (CFU-Ba) và mẫu tiểu cầu (CFU-Meg)

1.1.4 Điều hòa tạo máu

Điều hòa tạo máu ở mức tế bào gốc chủ yếu do cơ chế autocrin (tự tiết)

và cơ chế paracrin (cận tiết) chi phối Thông tin điều hòa tạo máu xuất phát từtiếp xúc tế bào – tế bào, từ các cytokin tạo máu và từ chất đệm gian bào do tếbào liên kết trong vi môi trường tạo máu tiết ra Tác dụng của cytokin có thểmang tính chất cộng hưởng hoặc đối kháng, nhưng kết quả cuối cùng là điềuhòa tạo máu có hiệu quả để đáp ứng nhu cầu của cơ thể [7], [9],[14]

 Các yếu tố kích thích tạo máu: Khi cơ thể thiếu oxy, nhiễm trùng,

hoặc do các tác nhân gây giảm một hoặc nhiều thành phần tế bào máu ngoại

vi, thông qua các yếu tố phát triển sẽ kích thích tủy xương tăng tạo máu Cácyếu tố phát triển bao gồm toàn bộ các protein hormon kích thích phát triển tếbào máu, chúng được sản xuất từ lymphocyte, monocyte, đại thực bào, tế bàonội mạc và nguyên bào xơ, chúng có mặt trong vi môi trường tạo máu của tủyxương Các chất kích thích phát triển kiểm soát quá trình sinh sản và biệt hóa

tế bào gốc thành tế bào chín, ảnh hưởng đến chức năng của tế bào chín (ví dụ:chức năng bạch cầu trong nhiễm trùng); cần thiết cho sự phát triển của tế bàogốc tạo máu, tế bào đa năng thuộc nhóm myeloid, lymphoid và tế bào trưởngthành [15] Ngoài ra còn có IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, FGF, PDGF,…cũng có tác dụng kích thích phát triển lympho B, hồng cầu, tế bào NK [7], [9][13]

 Các yếu tố ức chế tạo máu [16] [18]:

Yếu tố phát triển chuyển dạng β1, β2, β3 tác dụng tương tác trên thụthể serine threonin kinase, ức chế BFU-E và CFU-S

H subunit ferritin: ức chế BFU-E, CFU-GEMM và CFU-GM Chấtnày ức chế CFU-GM bằng cách làm giảm tế bào đi vào chu kỳ phân bào,giảm số lượng tế bào ở tủy xương và lách, giảm bạch cầu hạt trung tính ở máungoại vi

Interferon α, β, γ và TNF α, β làm giảm nhiều loại cytokin, ức chế

IL-4, CFU-GM và CFU-G

Prostaglandin E1, E2 (PGE) ức chế trực tiếp CFU-M, CFU-GM,CFU-G nhưng không ức chế CFU-E

Lactofferin là một protein gắn sắt, ức chế giải phóng CSF và IL-1

Các chemokine (như Macrophage inflammatory protein 1α-MIP-1 α,MIP-2α) ức chế CFU-S, CFU-GEMM, BFU-E và CFU-GM

Quá trình sinh máu của cơ thể là một quá trình cực kỳ tinh vi và phứctạp, chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố bên trong cũng như bên ngoài cơ thể.Nếu mất sự cân bằng giữa yếu tố kích thích và ức chế sẽ gây ra rối loạn sinhmáu LXM cấp dòng lympho là một trong những bệnh lý gây nên sự mất cânbàng nghiêm trọng ấy Có nhiều phương pháp để đánh giá tình trạng bìnhthường cũng như bệnh lý của cơ quan tạo máu như: thăm dò hình thái, nghiêncứu thụ thể, kỹ thuật di truyền, nuôi cấy tế bào, sinh học phân tử Trong đóthăm dò hình thái là xét nghiệm đầu tay rất đơn giản nhưng cũng rất quantrọng, để từ đó có thể định hướng cho các xét nghiệm tiếp theo [10], [16],[17], [18], [19].

1.2 Dòng lympho, quá trình biệt hóa và chức năng:

Bắt nguồn từ tế bào gốc sinh máu vạn năng, tế bào mẹ của dòng lympho

sẽ phân chia tiếp thành 3 nhóm chính: lympho T, lympho B và NK Về bảnchất, quá trình biệt hóa của dòng lympho liên quan đến sự thêm vào, bớt racủa hàng loạt các kháng nguyên bề mặt gọi là cụm biệt hóa (CD) được xácđịnh bởi các kháng thể đơn dòng

1.2.1 Lympho B

Đây là các tế bào có chức năng chính là sinh kháng thể, quá trình biệt hóacủa lympho B xảy ra ở tủy xương, quá trình biệt hóa có thể tóm tắt như sau:

Sắp xếp lại các gen chuỗi nặng Ig ở giai đoạn tiền B sớm

Xuất hiện các IgM đơn dòng trong nguyên sinh chất ở giai đoạn tiền B

Lympho B trưởng thành có các IgM và cả IgD đơn dòng trên bề mặtnhưng không có trong nguyên sinh chất

Lympho B chín biệt hóa thành tương bào Trong giai đoạn này cần có

sự kích thích của kháng nguyên và sự hợp tác của tế bào lympho T hỗ trợ Khikháng nguyên vào cơ thể sẽ chọn lọc gắn với SIg của lympho B hình thànhphức hợp “KN – SIg” Phức hợp này chuyển vào trong tế bào chịu một quá

trình biến đổi để biệt hóa lympho B thành tương bào có khả năng tiết Ig Tùygiai đoạn của quá trình đáp ứng miễn dịch và tính chất của kháng nguyên mà

sẽ có các tương bào sản xuất và tiết ra IgM hoặc IgG, IgA, IgD hay IgE, thamgia vào quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể Quá trình biệt hóa này diễn rađồng thời với việc bộc lộ liên tục các kháng nguyên bề mặt cũng như các thụthể đối với bổ thể và Fc của chuỗi Ig [8], [20], [21] Dấu ấn tiền lympho Bsớm nhất được tìm thấy là cCD22, CD19, CD10 Sự khác biệt và trưởngthành hơn của tế bào tiền B trong tủy xương được đặc trưng bởi sự giảm dầnCD10 cùng với sự tăng dần CD20 Sự xuất hiện các dấu ấn miễn dịch nàycùng với sự biến mất của các dấu ấn non (TdT, CD34) biểu hiện tế bào Btrưởng thành Trong đó, các CD hiện diện sớm nhất và ổn định trong tất cảcác giai đoạn biệt hóa là cyCD79a, cyCD22, smCD22, CD19, HLA-DR Cácdấu ấn trưởng thành hơn là CD20, cyIgM, sIgM, Igµ hoặc Igλ

1.2.2 Lympho T

Bắt nguồn từ tế bào gốc định hướng dòng lympho Đây là nhóm tế bàophụ thuộc tuyến ức vì chúng được biệt hóa tại tuyến ức, giai đoạn trưởng thànhtrong tuyến ức là một sự thay đổi cơ bản về mặt chức năng của lympho T, xuấthiện các dấu ấn khác nhau Trong thời gian ở tuyến ức chúng được huấn luyệnmiễn dịch bao gồm có khả năng nhận biết kháng nguyên cũng như phân biệtkháng nguyên của mình với kháng nguyên lạ [8].Quá trình biệt hóa và trưởngthành trải qua nhiều giai đoạn với sự hình thành và biến mất của các CD đặctrưng, với sự hỗ trợ của các tế bào biểu mô, tế bào đuôi gai và các đại thực bàotuyến ức [22] Có 3 giai đoạn phát triển chính [23]

Giai đoạn T sớm: xảy ra ở tủy xương, tế bào được gọi là tế bào tiền T(Pro - T), xuất hiện chủ yếu cyCD3, CD7

Giai đoạn T trung gian: xảy ra ở vỏ tuyến ức, tế bào T được gọi là tếbào tuyến ức (T - thymocyte) Đặc trưng là sự xuất hiện CD1a+, các CD kháclần lượt xuất hiện là: CD3yếu, CD4+, CD8+, CD2+, CD5+.

Giai đoạn T chín: xảy ra ở tuyens ức, tế bào xuất hiện tương đối đủcác CD của dòng lympho T, trong đó CD3+ là biểu hiện đặc trưng

1.2.3 Tế bào NK (Natural killer) và tế bào K (Killer):

Tế bào NK: là những tế bào lympho to có hạt chứa peforin vàgranzyn, chiếm khoảng 4-10% tổng số lympho lưu hành trong máu Tế bào

NK chỉ hoạt động khi nhận ra sự vắng mặt hay thay đổi của phân tử MHC lớp

I trên bề mặt các tế bào khác Thụ thể của NK với MHC gọi là KIR (Killercell inhibitor receptor) khi tiếp xúc với MHC thì ức chế tín hiệu hoạt hóachương trình dung giải tế bào nghĩa là chỉ hoạt động đối với những tế bào íthay không có MHC lớp I như những tế bào ưng thư hoặc nhiễm virus [8],[24], [25]

Tế bào K: các tế bào này có một thụ thể ái tính yếu với IgG (CD16) liênkết với các phân tử hoạt hóa sớm enzym protein tyrosin kinase (PTK) Chúng làthành phần tế bào của hiện tượng độc tế bào phụ thuộc kháng thể [8]

1.3 Sinh bệnh học của bệnh LXM cấp thể lympho: [26] [27][4]

Bình thường các lympho cũng giống như các tế bào khác trong cơ thể,được sinh ra, biệt hóa đầy đủ để có thể thực hiện chức năng của chúng, rồi sau

đó chúng già và chết, quá trình này được chi phối bởi hệ thống gen điều khiển

“chết theo chương trình”, nó giúp cho các tế bào không bị tồn đọng một cáchquá mức Quá trình này được điều hòa bởi 2 hệ thống gen (hệ thống tiền gen gâyung thư và hệ thống gen chống ung thư) Khi một trong hai hệ thống gen này bịđột biến vì một lý do nào đó sẽ gây ra bệnh lý, trong đó có bệnh ưng thư

Cơ chế sinh bệnh học của LXM cấp dòng lympho gắn liền với các tổnthương nhiễm sắc thể và gen Các tổn thương vật chất di truyền được tìm thấy

trên 80% bệnh nhân LXM cấp dòng lympho Các đột biến này có vai trò trongviệc tạo ra clone tế bào ác tính, có ưu thế về sinh sản và không có khả năngbiệt hóa trưởng thành

1.3.1 LXM cấp dòng tế bào pre-B

 Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể: NST Philadelphia (NST Ph1) là

tổn thương thường gặp trong LXM cấp dòng pre-B ( gặp trong 20% trườnghợp) Đột biến này thể hiện bởi chuyển đoạn t (9;22) (q34;q11) Trong LXMcấp dòng lympho, đứt gãy xảy ra giữa exon 1 và 2 của vùng m-BCR (genBCR) và exon 1 và 2 của gen ABL Đột biến này tạo ra sản phẩm proteinp190 với hoạt tính tyrosin kynase cao NST Ph1 thường đi kèm với tiên lượngxấu đối với bệnh nhân LXM cấp dòng lympho Chuyển đoạn t (1;19)(q23;p13) dẫn đến tạo ra gen tổ hợp E2A/PBX1 Chuyển đoạn t(17;19)(q21;p13), gặp trong LXM cấp dòng lympho tế bào B dẫn tới sự tổ hợp genE2A và HLF trên NST số 17,chuyển đoạn này thường đi kèm với tiên lượngxấu Chuyển đoạn t (4;11)(q21;q23) trong LXM cấp dòng lympho B dẫn tới

sự tổ hợp gen MLL và AF4 Chuyển đoạn này thường đi kèm với nhóm bệnhnhân có số lượng BC cao, tiên lượng xấu Chuyển đoạn t (12;21)(p13;q22)gặp trên 25% bệnh nhân LXM cấp dòng lympho tế bào B trẻ em và khoảng3% bệnh nhân người lớn Ở mức độ phân tử, gen ETV6 trên NST số 12 tổhợp với gen AML1 trên NST số 21, chuyển đoạn này đi kèm với tiên lượngxấu

 Đột biến về số lượng NST: đột biến thêm NST trong LXM cấp

dòng lympho tế bào B cũng thường gặp và thường đi kèm với tiên lượng tốt.Các bệnh nhân đột biến tăng bội (51-65 NST trong karyotype) thường có tiênlượng tốt nhất so với các đột biến số lượng NST khác trong LXM cấp dònglympho Thêm NST số 4, 6, 10, 14, 17, 18, 21 và X cũng thường gặp, trong

đó các đột biến NST số 4, 10, 17, và 18 đi kèm với tiên lượng tốt hơn Ngược

lại, các đột biến gây giảm bội (23-29 hoặc 39-39 NST trong karyotype) cótiên lượng rất xấu

1.3.2 LXM cấp dòng lympho tế bào B trưởng thành:

Trên 80% của LXM cấp dòng lympho tế bào B trưởng thành có ít nhất 1trong 3 chuyển đoạn: t(8;22) (q24;q32), t(2;8)(p12;q24), hoặc t (8;22)(q24;q11) Ở mức độ phân tử, NST số 14, 2 hoặc 22 mã hóa cho các genimmunoglobulin chuỗi nặng, kappa chuỗi nhẹ và lambda Oncogene c-MYCnằm trên NST số 8 Khi xảy ra các chuyển đoạn, gen c-MYC chuyển tới cácgen Ig nêu trên Hậu quả là hoạt động của gen c-MYC tăng mạnh, dẫn tớihình thành dòng tế bào B ác tính

1.3.3 LXM cấp dòng lympho tế bào T

Trong LXM cấp dòng lympho tế bào T có thể gặp nhiều tổn thương ditruyền khá đa dạng Một số tổn thương liên qua đến gen T-cell receptor(TCR), (TCR α/δ), (TCR β) và (TCR γ) tại các vị trí tương ứng là 14q11,7q32 và 7p15 Tổn thương gen tại vị trí 9p21-p22 gặp trong khoảng 80%trường hợp LXM cấp dòng lympho tế bào T ở trẻ em Các đột biến này liênquan tới các gen ức chế khối u là MTS1 và MTS2 Các gen này mã hóa chocác protein có chức năng ức chế cyclin D-dependent serin – threonin kinase,cần thiết để tế bào tạo máu chuyển từ pha G1 sang S Chuyển đoạn t(5;14)(q35;q32), liên quan đến sự hoạt hóa gen HOX11L2, ngoài ra còn có tổnthương nhánh dài NST số 6 (6p) cũng gặp trên khoảng 12% bệnh nhân

1.4 Các phương pháp chẩn đoán và phân loại bệnh LXM cấp dòng lympho ở trẻ em

LXM cấp dòng lympho là một nhóm bệnh không đồng nhất, biểu hiện làcác tế bào blast ở các bệnh nhân rất khác nhau về mặt hình thái và miễn dịch.Việc phân loại là hết sức cần thiết và từ đó có thể đưa ra những phác đồ điềutrị có hiệu quả Năm 1976 nhóm hợp tác nghiên cứu Anh – Pháp – Mỹ (FAB)

đã đưa ra bảng phân loại LXM cấp về mặt hình thái học khá hoàn chỉnh Tiêuchuẩn phân loại dựa vào việc đánh giá các tế bào ác tính ở máu ngoại vi vàtủy xương qua nhuộm Romanowsky và nhuộm hóa học tế bào Phân loại này

đã nhanh chóng được chấp nhận rộng rãi Sau đó nó đã được hoàn chỉnh và bổsung về mặt miễn dịch, di truyền, sinh học phân tử vào những năm 1982,

1985, 1991 [28] Hiện nay việc phân loại LXM cấp dựa vào hình thái tế bào

và hóa học tế bào theo FAB, kiểu hình miễn dịch (Immunophenotye), ditruyền tế bào (Cytogenetic), gọi tắt là MIC [29]

1.4.1 Dựa vào hình thái tế bào và hóa học tế bào theo FAB

 Hình thái tế bào dựa vào các tiêu chuẩn như: kích thước tế bào, tỷ

lệ nhân/ nguyên sinh chất, hình dáng nhân, số lượng và sự có mặt của hạtnhân, tính chất của nguyên sinh chất, sự có mặt của hốc ở nguyên sinhchất, tính chất của sợi nhiễm sắc thể ở nhân, nhóm FAB đã phân loại LXMcấp dòng lympho làm 3 loại: L1, L2 và L3 [33][56] Phân loại của FAB gầnđây đã được bổ xung, thay đổi này giới thiệu một hệ thống điểm theo 4 đặctính tế bào:

Tỷ lệ nhân/ nguyên sinh chất

Sự có mặt và số lượng hạt nhân

Sự đều đặn của màng nhân

Kích thước của tế bào

Các tiêu chuẩn này được tính theo phần trăm để cho điểm (+) hoặc (-),rồi tính tổng điểm để chia ra L1 hoặc L2 [30] [31]

 Hóa học tế bào: Phương pháp hóa học tế bào được sử dụng từ năm

1830 với nhiều mục đích khác nhau, trong phân loại LXM cấp cũng là mộtứng dụng Cùng với hình thái học tế bào, hóa học tế bào cho tới nay vẫn lànền tảng để chẩn đoán và phân loại bệnh LXM cấp Trong LXM cấp dònglympho, lymphoblast âm tính với MPO và chloroacetate esterase [32] Đối

với nhuộm PAS, nhiều lymphoblast dương tính dưới dạng những hạt màu đỏtím, thể L3 ít dương tính hơn Tuy nhiên không phải nhuộm PAS âm tính màkhông phải là LXM cấp dòng lympho

Mặc dù hình thái học tế bào và hóa học tế bào là những tiêu chuẩn đầutiên cần thiết để phân loại bệnh nhưng vẫn chưa đủ Trên thực tế, nếu chỉ dựavào hai tiêu chuẩn trên thì không đủ để phân loại hoặc gặp nhiều khó khăn vớimột số trường hợp LXM cấp tế bào chưa biệt hóa hoặc thể L2, hoặc khó đánhgiá về tiên lượng bệnh Ngày nay, việc phân loại đã được hoàn thiện hơn dựavào miễn dịch học và di truyền học

1.4.2 Dựa vào kiểu hình miễn dịch

Từ đầu những năm 1970, một số nhà nghiên cứu đã áp dụng phươngpháp MDH trong xếp loại LXM cấp, từ đó đến nay đã có rất nhiều tiến bộ, từviệc xếp loại trên kính hiển vi huỳnh quang, đến nay đã xếp loại miễn dịchbằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometry - FC) một cáchthường xuyên hơn ở các trung tâm xét nghiệm trên thế giới [33]

Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, gián tiếp: Dựa vào

nguyên lý phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể để phát hiện cáckháng nguyên của dòng tế bào khi chúng kết hợp đặc hiệu với kháng thể đơndòng có gắn huỳnh quang và phát quang khi đọc kết quả trên kính hiển vihuỳnh quang, mức độ dương tính của phản ứng sẽ tương ứng với mức độ pháthuỳnh quang Kỹ thuật này đã mang lại giá trị bổ sung cho phương pháp hìnhthái học, tuy nhiên nó còn nhiều hạn chế: kết quả phụ thuộc vào người làm,người đọc, chưa tách biệt được tuyệt đối quần thể tế bào non ác tính cầnnghiên cứu, chỉ phân tích được từng dấu ấn riêng biệt, do vậy độ chính xácchưa cao [34]

Phương pháp hóa mô miễn dịch: phương pháp này cũng được áp

dụng khá lâu trong chẩn đoán, xếp loại LXM cấp cũng như các bệnh lý ác

tính cơ quan tạo máu Phương pháp này dựa trên cơ sở các kháng thể đơndòng gắn chất nhuộm liên kết đặc hiệu với kháng nguyên bề mặt tế bào, đểxác định nguồn gốc tế bào trên kính hiển vi quang học Phương pháp này cókhả năng đánh giá được đặc điểm về hình thái, cấu trúc của bệnh phẩm [35]

 Phương pháp đếm tế bào dòng chảy: Đếm tế bào dòng chảy là

phương pháp đo và phân tích đồng thời nhiều thông số, phân tử (tế bào) cầnnghiên cứu bao gồm: kích thước, tính chất hạt trong nguyên sinh chất, độphức tạp của bào tương, nhân, mức độ gắn huỳnh quang của phức hợp khángnguyên – kháng thể cần nghiên cứu Phương pháp phân tích định lượng tế bàobắt đầu từ những năm 1930, trong các công trình nghiên cứu về acid nucleiccủa tế bào của Capersson và Schultz Coons và Kaplan đã có một đột phá, đó

là gắn huỳnh quang vào các kháng thể, mở ra một cơ hội phát hiện khángnguyên trên bề mặt tế bào tương ứng đặc hiệu với kháng thể đó Phát hiện ratính dẫn điện thấp của tế bào với dung dịch nước muối sinh lý, tính kháng trởđược dùng để đo lường kích thước tế bào khi chúng đi qua một khe hẹp [20].Phân loại miễn dịch đối với LXM cấp dựa trên một nguyên tắc căn bản,

đó là dựa trên những hiểu biết về các dấu ấn đặc hiệu với từng dòng tế bàobình thường, xuất hiện trong những giai đoạn biệt hóa khác nhau của chúng

để nhận định nguồn gốc của quần thể tế bào cần phân tích

LXM cấp dòng lympho theo nguồn gốc tế bào và giai đoạn biệt hóa có 3dưới nhóm về miễn dịch đã được đưa ra Sử dụng các thụ thể với hồng cầucừu cho thấy khoảng 20% bệnh nhân là T lymphoblast Các phức hợp thụ thể

và các globulin miễn dịch đã xác định B lymphoblast từ 1-2% Hầu hết cácbệnh nhân (khoảng 80%) không tìm thấy các dấu ấn trên bề mặt tế bào đượccoi là không - T, không - B, hay còn gọi Null-cell Sau này với sự phát triểncủa kháng thể đơn dòng, cho thấy khoảng 80% những trường hợp không - T,không - B nói trên có kháng nguyên LXM cấp thể lympho phổ biến (CALLA)

trên bề mặt tế bào Dưới nhóm này coi là LXM cấp thể lympho phổ biến đểphân biệt với nhóm CALLA âm tính không -T, không -B (Null-cell thực sự).Hầu hết các trường hợp không -T, không -B trước kia được xác đinh thuộcdòng B lympho Với các kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho thấy 80 – 85% trẻ

bị LXM cấp thể lympho đều thuộc dòng B lympho [36] Sự có mặt của CIg làmột dấu ấn để xác định mức độ biệt hóa của tế bào lymphoblast dòng B.Những tế bào sản xuất CIg được gọi là tiền B (pre-B) Chúng biệt hóa hơnnhững tế bào tiền B sớm chưa tổng hợp CIg, nhưng chưa biệt hóa như những

tế bào có dấu ấn SIg Đa số các trường hợp T lympho biểu hiện protein màngvới dấu ấn của giai đoạn tiền thymocyte hoặc thymocyte như CD2, CD5,CD7 CD3 thường không biểu hiện trên màng tế bào mà thường thấy ởnguyên sinh chất, trừ giai đoạn cuối của quá trình biệt hóa Khoảng 1/3 trườnghợp T lympho ở giai đoạn biệt hóa cuối có biểu hiện rõ kháng nguyên bề mặtCD4, CD8 Một số tế bào T lympho có thể cũng có dấu ấn CD10 và HLA –

DR Trong những trường hợp có biểu hiện pha trộn kháng nguyên bề mặt, khó

có thể đánh giá nếu chỉ dựa vào các kháng thể đơn dòng thông thường mà còncần đến nghiên truyền và sự phát triển của kỹ thuật nhuộm băng NST Các bấtthường NST trong LXM cấp dòng lympho được chia thành 4 nhóm lớn căn cứvào hình ảnh di truyền của tế bào blast [4].cứu về sự sắp xếp lại gen thụ thể tếbào T và karyotup

1.4.3 Phân loại dựa vào di truyền tế bào và di truyền phân tử:

Được ứng dụng từ những năm cuối của thập kỷ 70 của thế kỷ trước, dotiến bộ của phương pháp nghiên cứu tế bào di

 Các karyotyp bình thường: nghĩa là trong các tế bào blast, chưatìm thấy các bất thường ở trên cả 46 NST

 Lưỡng bội giả: ở 46 NST có những bất thường cấu trúc kiểuchuyển đoạn

 Lưỡng bội dư nhóm I: là những trường hợp có 47 đến 50 NST.

 Lưỡng bội dư nhóm II: là những trường hợp có trên 50 NST

Ở trẻ em thường gặp lưỡng bội dư Có một số rối loạn tế bào di truyềncần lưu ý: Chuyển đoạn đặc hiệu t(8;14), là một dấu hiệu cố định trong LXMcấp dòng lympho thể L3 có immunoglobulin bề mặt Chuyển đoạn t(9;22)hoặc NST Philadelphia, t(4;11), t(1;19) có liên quan với LXM cấp dònglympho tế bào tiền B Chuyển đoạn t(4;11) thường phát hiện thấy trong các tếbào blast có kháng nguyên hỗn hợp dòng myelo và lympho Người ta cònthấy có lẽ có sự tái tổ hợp phân tử trên NST 11q23 ở LXM cấp dòng lympho

ở trẻ em

Ngày nay người ta sử dụng khá rộng rãi kỹ thuật phản ứng khuếch đạichuỗi polymerase (PCR), đây là một kỹ thuật tốt hơn trong việc phát hiện cácchuyển đoạn đặc hiệu Kiểu gen lệch bội lẻ còn có thể được phát hiện bằng kỹthuật đếm tế bào dòng chảy Đây là kỹ thuật cho phép xác định được chỉ sốDNA, là tỷ lệ của lượng DNA của tế bào LXM so sánh với các tế bào bìnhthường không phân chia Lưỡng bội thừa sẽ được xác định khi chỉ số DNAtrên 1,15

Bảng 1.1 Các bất thường về tế bào di truyền trong LXM cấp dòng lympho

1.4.4 Một số trường hợp đặc biệt của LXM cấp dòng lympho: có một số thể

bệnh ít gặp hơn nhưng cũng rất cần lưu ý để không bỏ qua:

 Dạng suy tủy hoặc giảm sản tủy

 Dạng hạt

 Dạng có tế bào gương cầm tay

 Dạng xâm lấn tế bào NK

 LXM cấp thể nhiều dòng

 LXM thể không phân loại được

1.4.5 Phân loại bệnh theo mức nguy cơ:

 LXM cấp dòng lympho B có nguy cơ trung bình:

 Dựa vào tuổi khi được chẩn đoán: 1- 9 tuổi

 Dựa vào số lượng BC khi chẩn đoán: SLBC < 50 G/l

 LXM cấp dòng lympho B có nguy cơ cao:

 Tuổi khi được chẩn đoán: < 1 tuổi và ≥ 10 tuổi

 SLBC khi chẩn đoán : ≥ 50 G/l

1.5 Điều trị LXM cấp dòng lympho ở trẻ em: [26][38]

LXM cấp là sự tăng sinh không kiểm soát được của tế bào non ác tínhtrong tủy xương Trong quần thể tế bào ung thư, chỉ một tỷ lệ nhỏ tế bào đivào chu trình phân bào, phần lớn còn lại sẽ ở giai đoạn Go Một phần khác bịchết do tính không ổn định về di truyền của tế bào ác tính, do thiếu cung cấpmáu dẫn đến hoại tử Do bản chất của ung thư là tiến triển, tỷ lệ tế bào chết sẽnhỏ hơn tế bào sinh ra do tổ chức ung thư đã phá vỡ cơ chế kiểm soát sự hằngđịnh nội môi Sự phối hợp các loại thuốc với các cơ chế tác dụng khác nhautheo những chu kỳ thích hợp đã có khả năng loại trừ đến 99% khối tế bào áctính và tạo lui bệnh hoàn toàn trong 70 – 95% với LXM cấp dòng lympho

Liệu trình chỉ định và thực hiện điều trị bao gồm các bước sau:

 Đánh giá mức độ nguy cơ

 Lựa chọn phác đồ điều trị

 Thực hiện liệu trình điều trị bao gồm: điều trị cảm ứng (tấn công),điều trị củng cố, điều trị dự phòng xâm lấn hệ thần kinh trungương và điều trị duy trì

1.5.1 Hóa trị liệu

Sử dụng phác đồ CCG 1991 với bệnh nhi có nguy cơ trung bình, phác đồCCG 1961 với bệnh nhi có nguy cao [28]

 Điều trị cảm ứng: Thời gian điều trị tấn công 28 ngày

 Phác đồ CCG 1991: Vincristin 1,5mg/m2/tuần 1 lần, Prednisolon40mg/m2/ngày, E.coli Asparaginase 6.000 UI/m2/lần tiêm bắp 9 lần,Methotrexate( <1 tuổi: 6mg, 1-<2 tuổi: 8mg, 2-<3 tuổi: 10mg, >3tuổi: 12mg) 3 lần ( ngày 0, ngày 7 hoặc 14, ngày 28)

 Phác đồ CCG 1961: Vincristin 1,5mg/m2/tuần 1 lần, Prednisolon40mg/m2/ngày, E.coli Asparaginase 6.000 UI/m2/lần tiêm bắp 9 lần,Daunorubicine 25mg/m2/tuần 1 lần, Methotrexate( <1 tuổi: 6mg,1-<2 tuổi: 8mg, 2-<3 tuổi: 10mg, >3 tuổi: 12mg) 3 lần ( ngày 0,ngày 7 hoặc 14, ngày 28)

 Điều trị duy trì: 2-3 năm, tránh tái phát bệnh

Methotrexate tiêm tủy sống: 2-3 tháng/lần

Dexamerhason uống 5 ngày đầu/ tháng, Vincristine 4 tuần/ lần,6MP uống hàng ngày, Methotrexate uống hàng tuần Chỉnh liều6MP, Methotrexate để duy trì BC hạt từ 1.000-2.000/mm3

1.5.2 Điều trị hỗ trợ: Ngoài điều trị bằng thuốc chống ung thư, còn có những

điều trị hỗ trợ bởi các yếu tố tăng trưởng, các kháng sinh, truyền chế phẩm

máu khi cần thiết

1.5.3 Ghép tế bào gốc tạo máu (tủy xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn): [38]

 Chỉ định cho nhóm bệnh nhân có tiên lượng xấu ngay khi đượcchẩn đoán hoặc sau khi tái phát Bệnh nhân phải đạt được lui bệnhhoàn toàn sau khi điều trị bằng hóa trị liệu liều cao toàn thân

 Người cho tế bào gốc đòi hỏi phù hợp HLA mức độ cao

1.6 Các dấu ấn miễn dịch tế bào trong quá trình sinh sản và biệt hóa tế bào máu Xác định bệnh tồn lưu tối thiểu bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy.

1.6.1 Các dấu ấn miễn dịch tế bào.

Trong quá trình phát triển, tế bào máu sẽ lần lượt trải qua các thay đổi vềcấu trúc nhân, nguyên sinh chất và đặc biệt là sự xuất hiện và mất đi của các dấu

ấn biệt hóa màng tế bào Mỗi loại tế bào có những dấu ấn mang tính đặc trưngcho từng dòng, thậm chí từng loại tế bào và tương ứng với từng giai đoạn biệthóa của chúng Việc xác định được các dấu ấn màng, bào tương tế bào đã chophép nhận dạng chính xác các tế bào máu Dấu ấn màng đầu tiên đặc trưng cho

tế bào gốc tạo máu là CD34 Sau đó, cùng với quá trình sinh sản và biệt hóa của

tế bào gốc thành các tế bào gốc định hướng dòng tủy hay định hướng dònglympho, mật độ các dấu ấn CD34 trên màng tế bào gốc giảm và dần dần xuấthiện thêm các dấu ấn khác nhằm khẳng định quá trình biệt hóa Sự xuất hiện cácdấu ấn không phải theo quy luật “tất cả hoặc không” mà chỉ biểu hiện mức độbiệt hóa hay ức chế của các gen chi phối việc tổng hợp ra các dấu ấn Hiện nay,người ta đã phát hiện được khoảng 350 CD

Cũng giống như các dòng tế bào máu khác, dòng tế bào lympho B cũngtrải qua các giai đoạn sinh sản và biệt hóa, ở mỗi giai đoạn nó cũng có nhữngdấu ấn màng, bào tương đặc trưng Dấu ấn tiền lympho B sớm nhất được tìmthấy là cyCD22, CD19, CD10 Cùng với sự biệt hóa tế bào, mức độ biểu hiệndấu ấn CD10 giảm dần, mất dần biểu hiện của các dấu ấn non (TdT, CD34) vàdấu ấn CD20 tăng dần biểu hiện của tế bào lympho B trưởng thành Một số dấu

ấn hiện diện sớm và ổn định trong tất cả các giai đoạn biệt hóa là cyCD79a,cyCD22, CD19, HLA- DR Các dấu ấn của lympho B trưởng thành là: CD20,cyIgM, sIgM, Igμ hoặc Igλ

Đối với dòng lympho T, quá trình phát triển và biệt hóa cũng trải quanhiều giai đoạn với sự hình thành và mất đi của các dấu ấn miễn dịch đặc trưng.Dòng lympho T có 3 giai đoạn phát triển chính: (1) giai đoạn T sớm với sự xuấthiện của dấu ấn cyCD3, CD7 (2) giai đoạn T trung gian dấu ấn đặc trưng là:CD1a, CD4, CD8, Cd2, CD5, và sự giảm dần của cyCD3 (3) giai đoạn T trưởngthành xuất hiện tương đối đầy đủ các CD của dòng lympho T, trong đó đặc trưng

là dấu ấn CD3

Hình 1.1 Phân loại tế bào lympho bằng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với

kháng nguyên biệt hóa [43].

Dựa vào các dấu ấn biệt hóa đặc hiệu của từng giai đoạn phát triển, người ta

có thể xác định được chính xác dòng tế bào và các giai đoạn biệt hóa của các tếbào máu Việc xác định này mang lại những ứng dụng vô cùng to lớn trong việctìm hiểu về bệnh lý của các dòng tế bào máu Dựa vào sự xuất hiện của các dấu

ấn tế bào và mức độ biểu hiện của nó cho phép phân loại chính xác được thểbệnh và các dưới nhóm LXM cấp Ngoài ra nó còn được ứng dụng trong việcxác định bệnh tồn dư tối thiểu trong và sau quá trình điều trị bệnh Hiện nay dấu

ấn biệt hóa tế bào thường được xác định bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy (FlowCytometry – FC) với việc sử dụng kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang

1.6.2 Xác định bệnh tồn lưu tối thiểu bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy.

Bệnh LXM cấp thường được đánh giá lui bệnh khi quần thể tế bào blastdưới 5% tế bào bạch cầu trong tủy xương theo hình thái học Tuy nhiên, bệnhnhân LXM cấp có khoảng 1012 tế bào BC ác tính lúc chẩn đoán, thì vào giaiđoạn lui bệnh theo tiêu chuẩn hình thái học vẫn còn hơn 1010 tế bào BC áctính không phát hiện được nếu chỉ dựa vào hình thái học, là tiềm năng gây táiphát bệnh, nên còn được gọi là bệnh tồn lưu tối thiểu (MRD)[6]

Xác định bệnh tồn lưu tối thiểu (MRD) đã trở thành một thực hành lâmsàng trong điều trị LXM cấp dòng lympho ở trẻ em và người lớn Xác địnhMRD đã được chứng minh là xét nghiệm theo dõi tốt nhất, cho phép phânnhóm nguy cơ và từ đó các bác sĩ lâm sàng có thể ra quyết định rút ngắn hoặckéo dài thời gian điều trị cho phù hợp [44]

Hiện nay, có rất nhiều kỹ thuật được áp dụng để phát hiện bệnh tồn lưutối thiểu và mỗi kỹ thuật có những ưu nhược điểm khác nhau Tuy nhiên cầnthiết được đặt ra đối với xét nghiệm xác định bệnh tồn lưu tối thiểu trong

LXM cấp là: xét nghiệm phải có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian cho kếtquả sớm và giá thành phù hợp.

Có thể dương tínhgiả, đắt tiền

0,001% (104-105)

Đếm TB dòng

chảy

Có thể áp dụngcho phần lớnbệnh nhân, kếtquả có tính địnhlượng, nhanh, đặc

hiệu

Không đặc hiệubằng PCR, có thểthay đổi miễndịch khi tái phát

0,01% (104)

Kỹ thuật FC cũng có nhiều ưu điểm như kỹ thuật phân tích PCR-địnhlượng về độ nhạy, độ đặc hiệu và đặc biệt là kỹ thuật FC được ứng dụng trongphân tích MRD đối với LXM cấp dòng lympho B hết sức tối ưu bởi nhữngđiểm sau: (1) Phân tích kết quả nhanh (3000- 200.000 events/giây) (2) Phântích kết quả một cách độc lập (3) Phân tích nhiều tham số (4) Kết quả mangtính định lượng do đó độ tin cậy cao (5) Kết quả đưa ra được tổng hợp từnhiều tham số thu thập (6) đặc biệt là trong LXM cấp dòng lympho B các tếbào ác tính thường đồng nhất về nhân và nguyên sinh chất, và dựa vào biểuhiện dấu ấn màng trong quá trình biệt hóa tế bào dòng lympho B thì sẽ có

“khoảng trống” rõ ràng trên dot plot, đây là điều thuận lợi để áp dụng kỹ thuật

FC trong việc xác định MRD dòng lympho B Kỹ thuật FC trong việc pháthiện MRD ở những bệnh nhân LXM cấp nhờ vào việc xác định những kiểudấu ấn bất thường được gọi là những kiểu hình miễn dịch liên quan đến bạchcầu cấp, gọi tắt là LAIP (leukemia associated immunophenotypes), chỉ hiệndiện trên tế bào BC ác tính và không hiện diện hoặc hiện diện không ổn địnhtrên tế bào tạo máu bình thường Kỹ thuật FC cho phép phát hiện 1 tế bào BC

ác tính/ 10.000 tế bào tủy xương bình thường Mục tiêu của những nghiên cứuMRD là cải thiện khả năng đánh giá số lượng tế bào BC ác tính, là chỉ điểmcho sự tiến triển và đánh giá độ nhạy của thuốc đối với bệnh nhân, giúp chọnlựa chiến lược điều trị thích hợp [6], [45]

 Phương pháp luận trong việc phát hiện MRD bằng kỹ thuật miễn dịch học.

Hiện tại trên thế giới chiến lược miễn dịch học đánh giá MRD bằngcách phát hiện những kiểu hình miễn dịch liên quan bạch cầu cấp (LAIP)khác nhau sử dụng rất nhiều loại kháng thể gắn từ 4-15 màu huỳnh quangkhác nhau cho thấy luôn có sự hằng định DAMDTB bất thường giữa lúc chẩnđoán và lúc tái phát Cho đến những năm cuối thế kỷ XX, các chuyên giahàng đầu tại các trung tâm nghiên cứu về ung thư máu tại Mỹ và Châu Âu đãtập trung đánh giá MRD căn cứ vào việc xác định những kiểu hình LAIP khác

nhau giữa tế bào BC ác tính và tế bào progenitor bình thường

Dựa vào các phương pháp luận khác nhau, dấu ấn miễn dịch được coi làkiểu hình miễn dịch liên quan bạch cầu cấp khi chúng có những đặc điểm sau[45],[6]:

 Có “khoảng trống” (Empty space): là vùng dot plot của tế bào áctính nằm ngoài vùng những tế bào bình thường

 Biểu hiện không đồng bộ (Asynchronous Antigen Expression)giữa các dấu ấn non và trưởng thành: là sự xuất hiện đồng thời các

DAMDTB non và trưởng thành hơn trên cùng một tế bào mà trong

sơ đồ phát triển bình thường chúng không bao giờ hiện diện cùnglúc (ví dụ: CD10/CD20; CD34/CD45)

 Sự biểu hiện quá mức hoặc dưới mức so với tế bào bình thường(Over/ underexpression): là sự xuất hiện của một dấu ấn nào đóvới nồng độ cao hơn, hoặc thấp hơn bình thường

 Biểu hiện dị dòng: là những kháng nguyên điển hình của dòng tủyxuất hiện trên tế bào lympho, và ngược lại; hoặc kháng nguyênđiển hình của tế bào B hiện diện trên tế bào T, và ngược lại (ví dụLXM cấp dòng Lympho B nhưng bạch cầu non có dấu ấn dòng tủy(CD13 và/CD33)

 Không có biểu hiện: ví dụ như sự vắng mặt CD19, CD22 trên bạchcầu ác tính dòng lympho B, vắng mặt CD13, CD33 trên bạch cầu

Chiến lược đánh giá MRD được đánh giá cao nhất vì có khả năng lặp lạigiống nhau ở mọi phòng xét nghiệm là việc dựa vào sự biểu hiện khángnguyên khác dòng Đó là trên tế bào non dòng lympho B (CD19+ hoặcCD22+) có sự biểu hiện của các kháng nguyên dòng tủy (như CD13, CD33,

CD15, CD16, CD14, CD64, CD36, CD117…), hoặc các kháng nguyên dònglympho T (như CD3,CD4, CD2, CD7,CD8…)

Dựa vào sơ đồ phát triển bình thường của các tế bào dòng lympho B,Borowitz và cộng sự đã đưa ra khái niệm sự xuất hiện không đồng bộ giữacác kháng nguyên trong cùng dòng là một đặc điểm bất thường của các tế bàoblast dòng B Các kiểu LAIP không đồng bộ là trên các tế bào CD19+/CD10+(và/hoặc CD22+) có sự đồng biểu hiện của CD34+/CD20+, TdT+/CD20+,CD34+ hoặc TdT với các immunoglobulin bề mặt như Igμ, Igκ, Igλ

Flow cytometry có thể phát hiện 1 tế bào ác tính trong 10.000 tế bào tủybình thường, nhưng không phải trường hợp nào có MRD cũng bị tái phát.Những năm gần đây các nhà nghiên cứu đã thống nhất ngưỡng MRD liênquan đến nguy cơ tái phát cao là > 1% tế bào có LAIP, và là mốc các bác sĩđiều trị cần lưu ý đến quyết định có bổ sung thêm hóa chất nhằm tiêu diệt đểdiệt triệt để những tế bào blast còn sót lại Mức MRD có nguy cơ cao có thể

có dao động từ 0,1-1%, mức MRD có nguy cơ thấp có thể là ≤0.1% theoElaina Coustan – Smith, nhưng cũng có thể là < 0.05% theo Vidriales và cộng

sự Và mức MRD được xem là âm tính là < 0,03% hoặc < 0,01% tùy thuộcvào phác đồ điều trị

Miễn dịch tế bào vẫn được các nhà nghiên cứu khai thác, áp dụng tốt hơnnữa trong công cuộc nghiên cứu điều trị các bệnh lý ung thư nói chung vàbệnh LXM cấp nói riêng Ở Việt Nam, năm 2012, Nguyễn Phương Liên,Nguyễn Tấn Bỉnh đã có nghiên cứu “Đánh giá tồn lưu tế bào ác tính sau hóatrị liệu bệnh bạch cầu cấp bằng dấu ấn miễn dịch” Nghiên cứu này đã chochúng ta hiểu rõ hơn về những kiểu hình miễn dịch tế bào liên quan đến bệnhbạch cầu Một nghiên cứu sát thực hơn trong việc ứng dụng các dấu ấn miễndịch tế bào đế đánh giá kết quả điều trị LXM cấp là: “Xác định tồn dư bệnhtối thiểu bằng Flow cytometry cho trẻ bị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho B”

của nhóm nghiên cứu Trần Thị Hồng Hà và cộng sự năm 2014 Đây là mộtnghiên cứu rất có ý nghĩa để ta có thể tìm hiểu sâu hơn nữa về LXM cấp dònglympho, cũng như theo dõi đáp ứng bệnh đối với phác đồ điều trị chuyên sâuhơn nữa, để từ đó có thể điều trị liều lượng thuốc điều trị hợp lý và mang lại

hy vọng chữa khỏi hoàn toàn bệnh

1.7 Điểm qua tình hình nghiên cứu bệnh LXM cấp dòng lympho ở trẻ

em trên thế giới và ở Việt Nam

1.7.1 Trên thế giới

Ngày nay, việc phân loại bệnh đều dựa vào tiêu chuẩn FAB- Kiểu hìnhmiễn dịch- Di truyền tế bào, di truyền phân tử Trên cơ sở phân loại như vậycùng với việc phân tích các yếu tố tiên lượng, bệnh nhi đã được xếp nhómnguy cơ bệnh Mỗi nhóm nguy cơ có phác đồ điều trị thích hợp Bệnh LXMcấp dòng lympho ở trẻ em đã được coi là một bệnh có thể chữa khỏi [46],[47], [48]

Nghiên cứu bệnh tồn lưu tối thiểu trong và sau điều trị vẫn luôn được cácnhà khoa học trên thế giới nghiên cứu, nhằm đưa ra những bằng chứng chínhxác nhất để khẳng định bệnh đã được khỏi hoàn toàn hay chưa hay khả năngtái phát chính xác là thế nào Năm 1992, van Dongen JJ, và cộng sự đã cónghiên cứu xác định bệnh tồn lưu tối thiểu dựa vào phân tích các dấu ấn miễndịch và PCR [49] Năm 1999, Lúcio P, Parreira A, van den Beemd MW, vàcộng sự đã có nghiên cứu ứng dụng của máy đếm tế bào dòng chảy để phântích tế bào lympho B bình thường, từ đó xác định MRD trong LXM cấp thểtiền –B [49] Ý nghĩa của MRD trong tiên lượng bệnh LXM cấp qua theo dõidấu ấn miễn dịch tế bào bằng hệ thống Flow cytometry đã đượcWeng XQ, Shen Y, Sheng Y và cộng sự nghiên cứu và công bố năm 2013[49]

1.7.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, cũng có nhiều nghiên cứu về LXM Năm 1981 NguyễnCông Khanh đẫ áp dụng tiêu chuẩn phân loại theo FAB đối với LXM cấp ởtrẻ em, và cho thấy LXM cấp dòng lympho chiếm 75,7% [50] Sau đó, các tácgiả khác như Nguyễn Thị Quỳnh Nga [35], Bạch Thị Minh Hằng [51], cũng

có ngững nghiên cứu đi sâu vào nhuộm hóa học tế bào

Năm 1995, Nguyễn Công Khanh và Trần Thị Hồng Hà, Phan Thị PhiPhi, đã bước đầu phân loại LXM cấp dòng lympho ở trẻ em theo miễn dịch Với những kháng thể đơn dòng tối thiểu cho dòng lympho, các tác giả thấy tỷ

lệ tế bào thể null chiếm 80,6%, tương đương với tỷ lệ này trên thế giới vàonhững năm 1970 Một nghiên cứu nữa khá sâu sắc về miễn dịch tế bào trênbệnh nhân LXM cấp là nghiên cứu của Nguyễn Triệu Vân năm 2008

Năm 1985, Phạm Quang Vinh phân tích NST tủy xương của bệnh nhânLXM thấy ở LXM cấp dòng lympho thường gặp bất thường trên lưỡng bội[52] Năm 1997, Trần Thị Hồng Hà, Nguyễn Công Khanh, thấy rằng trên trẻ

em bị LXM cấp dòng lympho gặp khá nhiều những rối loạn NST khác nhauvào thời điểm chẩn đoán bệnh

Năm 2004, Trần Thị Hồng Hà đã có một nghiên cứu sâu về đặc điểm vàgiá trị tiên lượng của một số yếu tố sinh học và lâm sàng ở bệnh nhi LXM cấpdòng lympho Trong nghiên cứu này, tác giả đã chỉ ra những ưu việt củaphương pháp xác định dấu ấn miễn dịch và những bất thường về di truyền tếbào trong việc phân loại thể bệnh, từ đó giúp ích rất nhiều trong lựa chon phác

đồ điều trị phù hợp và tiên lượng bệnh [53] Năm 2008, Nguyễn Triệu Vâncũng có một nghiên cứu về một số dấu ấn biệt hóa tế bào máu trong chẩnđoán phân loại LXM, tác giả đã đi sâu nghiên cứu về dấu ấn tế bào miễn dịchtrong bệnh lý LXM ở người lớn và những giá trị của nó trong phân loại vàtiên lượng bệnh [15]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tổng số 55 bệnh nhi cho mục tiêu 1; 48 bệnh nhi cho mục tiêu 2 Các

bệnh nhi được chẩn đoán và theo dõi điều trị LXM cấp dòng lympho B tạikhoa ung bướu Bệnh viện Nhi trung ương từ năm 2016 đến năm 2017

Các bệnh nhi được chẩn đoán dựa vào những tiêu chuẩn sau:

 Lâm sàng: Bệnh nhân có đầy đủ hoặc có một số triệu chứngtrong 2 nhóm triệu chứng sau:

 Những triệu chứng do suy giảm tế bào máu trưởng thành: thiếumáu, sốt nhiễm khuẩn, xuất huyết

 Những triệu chứng do tăng sinh và thâm nhiễm tế bào LXM như:hạch to, lách to, gan to, đau xương khớp, u xương, thâm nhiễmda…

Huyết học:

 Máu ngoại vi: có lymphoblast hoặc không

 Tủy xương: có >20% tế bào có nhân trong tủy là lymphoblast, cóhiện tượng lấn át các dòng tủy bình thường

2.1.2 Các bệnh nhi được nghiên cứu về hình thái tế bào, hóa học tế bào, xác

định tồn dư bệnh tối thiểu bằng Flow cytometry, gồm những bệnh nhi theođuổi điều trị, được điều trị hóa trị liệu