CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

5.4 Ph-ơng pháp sắc ký lớp mỏng Ph-ơng pháp sắc ký lớp mỏng đ-ợc dùng để định tính, thử tinh khiết để bán định l-ợng định l-ợng hoạt chất thuốc Sắc ký lớp mỏng kỹ thuật tách chất đ-ợc tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh chấm hỗn hợp chất cần tách Pha tĩnh chất hấp phụ đ-ợc chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích, đ-ợc trải thành lớp mỏng đồng đ-ợc cố định phiến kính phiến kim loại Pha động hệ dung môi đơn đa thành phần đ-ợc trộn với theo tỷ lệ quy định chuyên luận Trong trình di chun qua líp hÊp phơ, c¸c cÊu tư hỗn hợp mẫu thử đ-ợc di chuyển lớp mỏng, theo h-ớng pha động, với tốc độ khác Kết thu đ-ợc sắc ký đồ lớp mỏng Cơ chế tách chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay phối hợp đồng thời nhiều chế tùy thuộc vào tính chất chất làm pha tĩnh dung môi làm pha động Đại l-ợng đặc tr-ng cho mức độ di chuyển chất phân tích hệ số di chuyển Rf đ-ợc tính tỷ lệ khoảng dịch chuyển chất thử khoảng dịch chuyển dung môi: Rf a b Trong đó: a khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử, tính cm b khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo đ-ờng vết, tính cm Rf: Chỉ có giá trị từ đến l Ngoài ra, sắc ký liên tục không xác định đ-ợc tuyến dung môi, vị trí vết chất thử sắc đồ xác định hệ số dịch chuyển t-ơng đối Rr Hệ số dịch chuyển t-ơng đối Rr đ-ợc xác định tỷ số khoảng cách dịch chuyển vết chất thử khoảng cách dịch chuyển vết chất chuẩn đối chiếu đ-ợc sắc ký điều kiện mỏng víi mÉu thư: Rr  a c Trong ®ã: a khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử, tính cm c khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết chất chuẩn, tính cm Giá trị Rr lớn hay nhỏ l Cách tiến hành Dụng cụ Bình triển khai, th-êng b»ng thủ tinh st cã kÝch th-íc phù hợp với phiến kính cần dùng có nắp đậy kín Đèn tử ngoại, phát xạ có b-ớc sóng ngắn 254 nm b-ớc sóng dài 365 nm Dơng ®Ĩ phun thc thư Tđ sấy điều nhiệt để hoạt hóa sấy mỏng sắc ký đồ, để sấy nóng số phản ứng phát Tủ hút độc Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ cho phép chấm nhanh nhiều lần dung dịch pha loãng chất cần phân tích Một máy ảnh tốt chụp l-u giữ sắc ký đồ ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30 - 50 cm Tủ lạnh để bảo quản thuốc thử dễ hỏng Micropipet nhiỊu cì tõ l, 2, 5, 10 ®Õn 20 l, ống mao quản dụng cụ thích hợp Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát quang thích hợp Tr-ờng hợp phòng thí nghiệm điều kiện trang bị loại mỏng tráng sẵn tự chuẩn bị lấy mỏng với dụng cụ sau đây: Các kính phẳng có kích th-ớc phù hợp đ-ợc xử lý tr-ớc hóa chất rửa n-ớc sấy khô Thiết bị trải chất hấp phụ lên kính thành lớp mỏng đồng đều, có chiều dày thích hợp Giá để xếp kính trải Chuẩn bị mỏng Sắp xếp mỏng chuẩn bị thiết bị: Các phiến kính phải đ-ợc lau chùi cẩn thận tẩy hoàn toàn chất béo cách ngâm dung dịch sulfocromic Sau đó, rửa d-ới tia n-ớc máy tráng n-ớc cất làm khô giá nhiệt độ th-ờng hay tủ sấy Đặt lên khung tr¶i phiÕn kÝnh 20 x 20 cm (hay phiÕn kính 10 x 20 cm) dày Điều chỉnh độ dày lớp hấp phụ thông số thiết bị trải Điều chế vữa chất hấp phụ: Chất hấp phụ đ-ợc chọn lọc cho phù hợp với yêu cầu phân tích nh-: Silicagel G, kieselguhr, cel1u1ose, nhôm oxyd, số silicagel G đ-ợc dùng th«ng dơng nhÊt Trén 25g silicagel G víi 50 ml n-ớc cất nhào cối lắc mạnh b×nh nãn cã dung tÝch 200 - 250 ml, nót kín, 30 - 45 giây Dịch treo tạo đ-ợc dạng lỏng đồng Rót vào thiết bị trải điều chỉnh độ dày cho mỏng khoảng 0,25 mm (nếu dẫn chuyên luận riêng) Sau rót dịch treo vào thiết bị trải, lật tay đòn 180o phía trái chờ dịch treo chảy bắt đầu trải Khi trải đến phiến cuối lật tay đòn phía phải để giữ cho dịch treo không chảy xuống Để ngụyên phiến kính chỗ khoảng 10 phút tới mặt hết bóng, để khô tự nhiên nhiệt độ phòng Hoạt hóa: Cho mỏng khô mặt vào tủ sấy sÊy ë l05 - l10oC 30 (nÕu kh«ng có dẫn chuyên luận riêng) Để nguội bảo quản bình hút ẩm Khi dùng, cần hoạt hóa lại cách sấy l05 - l100C l cạo bỏ dải chất hấp phụ dọc hai bên cạnh kính Chuẩn bị bình khai triển: Các bình khai triển th-ờng bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín, kích th-ớc thay đổi tùy theo yêu cầu mỏng sử dụng Bão hòa dung môi vào khí bình cách lót giấy lọc xung quanh thành bình, rót l-ợng vừa đủ dung môi vào bình, lắc để giấy lọc thấm dung môi L-ợng dung môi sư dơng cho sau thÊm ®Ịu giÊy läc lại lớp dày khoảng mm đến 10 mm đáy bình Đậy kín nắp bình để yên l nhiệt độ 20 - 25oC Muốn thu đ-ợc kết lặp lại, ta nên dùng dung môi thật tinh khiết, loại dùng cho sắc ký Những dung môi dễ bịến đổi hóa häc chØ nªn pha tr-íc dïng NÕu sư dơng hệ pha động phức tạp phải ý đến thành phần dễ bay làm thay đổi thành phần hệ pha động dẫn đến t-ợng không lặp lại trị số Rf Chấm chất phân tích lên mỏng: L-ợng chất hỗn hợp chất đ-a lên mỏng có ý nghĩa quan trọng hiệu tách sắc ký, đặc bịệt ảnh h-ởng lớn đến trị số Rf L-ợng chất lớn làm cho vết sắc ký lớn kéo dài, đó, vết chất có trị số Rf gần bị chồng lấp L-ợng chất nhỏ không phát đ-ợc độ nhạy thuốc thử không đủ (thông th-ờng độ nhạy thuốc thử 0,005 g) L-ợng mẫu thông th-ờng cần đ-a lên mỏng 0,l - 50 g dạng dung dịch dung môi thích hợp Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml tr-ờng hợp đ-a mẫu lên mỏng d-ới dạng điểm từ 0,l - 0,2 ml đ-a mẫu lên mỏng d-ới dạng vạch nh- tr-ờng hợp sắc ký điều chế Đối với dung dịch có nồng độ loãng làm giàu trực tiếp mỏng cách chấm nhiều lần vị trí sấy khô sau lần chấm Đ-ờng xuất phát phải cách mép d-ới mỏng l,5cm - cm cách bề mặt dung môi từ 0,8 - l cm Các vết chấm phải nhỏ, có đ-ờng kính - mm cách 15 mm Các vết bìa phải cách bờ bên mỏng cm để tránh hiệu ứng bờ Khi làm sắc ký lớp mỏng bán định l-ợng, độ xác kết phân tích phụ thuộc nhiều vào độ xác l-ợng chất thử đ-a lên mỏng, tức thể tích dung dịch chấm lên mỏng Do đó, với tr-ờng hợp phân tích bán định l-ợng phải dùng mao quản định mức xác Khi không cần định l-ợng dùng micropipet ống mảo quản th-ờng Triển khai sắc ký: Đặt mỏng vào bình triển khai Chú ý l-ợng dung môi dùng để vết chấm phải bề mặt lớp dung môi Đậy kín bình để triĨn khai ë nhiƯt ®é tõ 20 - 25o C tránh ánh mặt trời Khi dung môi triển khai mỏng đ-ợc đoạn theo quy định chuyên luận, lấy mỏng khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay dung môi đọng lại mỏng vết theo dẫn chuyên luận riêng Quan sát vết xuất hiện, tính giá trị Rf Rr tiến hành định tính, phát tạp chất định l-ợng nh- quy định chuyên luận riêng Chú ý: Khi phân tích sắc ký lớp mỏng phải chấm chất đối chiếu bên cạnh vết chất thử với l-ợng t-ơng tự nh- dự đoán có vết chất thử để so sánh kết màu sắc, kích th-ớc giá trị R f Rr điều kiện Hiệu mỏng đ-ợc kiểm tra nh- sau: ChÊm mét thĨ tÝch thÝch hỵp (10 l ) cho lớp mỏng thông th-ờng l đến l cho loại mỏng có kích th-ớc hạt mịn) dung dịch thử hiệu lớp mỏng gồm lục bromocresol, da cam methyl, đỏ methyl sudan G đỏ (thuốc thử) Tiến hành sắc ký với hệ dung môi methanol toluen ( 20 : 80) Kết sắc ký đồ phải có 04 vết tách rõ ràng có Rf nhsau: Lôc bromocresol : < 0,15; da cam methyl: 0,1 - 0,25, đỏ methyl: 0,35 - 0, 55 sudan G ®á: 0, 75 - 0, 98 5.8 CÁC KỸ THUẬT TÁCH SẮC KÝ Các kỹ thuật tách sắc ký phương pháp tách thành phần mẫu phân bố vào hai pha: pha tĩnh pha động Pha tĩnh chất rắn, chất lỏng giữ chất rắn hay gel Pha tĩnh nhồi vào cột, trải thành lớp, hay phân tán thành lớp phim v.v Pha động chất khí, chất lỏng hay chất lưu siêu tới hạn (còn gọi chất lỏng siêu tới hạn) Sự tách sắc ký dựa chế khác hấp phụ, phân bố khối lượng (hay phân chia), trao đổi ion, dựa khác tính chất lý hố phân tử kích thước, khối lượng, thể tích, v.v… Phụ lục đề cập tới định nghĩa phép tính thông số thông thường kỹ thuật sắc ký, yêu cầu thường áp dụng cho tính phù hợp hệ thống sắc ký Nguyên lý, thiết bị phương pháp tách trình bày phương pháp thử chung: - Phương pháp sắc ký giấy (Phụ lục 5.1) - Phương pháp sắc ký khí (Phụ lục 5.2) - Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) - Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) - Phương pháp sắc ký rây phân tử (Phụ lục 5.5) Định nghĩa: Các định nghĩa sau dùng chun luận để tính tốn thơng số Một số thiết bị có phần mềm nhà sản xuất dùng để tính tốn vài thơng số tỷ số tín hiệu nhiễu Trong trường hợp này, người sử dụng có trách nhiệm đảm bảo phương pháp dùng phần mềm phù hợp với yêu cầu dược điển này; không, phải điều chỉnh cho phù hợp Sắc đồ Sắc đồ đồ thị hay cách trình bày khác mơ tả thay đổi đáp ứng detector (hay nồng độ chất hay đại lượng khác dùng làm thước đo nồng độ chất) theo thời gian, thể tích hay khoảng cách Một sắc đồ lý tưởng có dạng chuỗi pic kiểu Gauss đường Các thông số lưu giữ Thời gian lưu thể tích lưu Trong sắc ký rửa giải, lưu giữ chất biết dạng thời gian lưu tR Thời gian lưu xác định trực tiếp sắc đồ vị trí đỉnh pic Từ thời gian lưu tính thể tích lưu VR dựa cơng thức: VR    t R Trong đó: t R (thời gian lưu) khoảng cách đường từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic chất ,  (tốc độ dòng) lưu lượng dòng pha động Hệ số phân bố khối lượng Hệ số phân bố Dm gọi thừa số dung lượng k’ hay thừa số lưu giữ k định nghĩa tính theo cơng thức sau: D m  k'  QS V  KC S QM VM Trong đó: QS QM lượng chất tan pha tĩnh pha động, VS VM thể tích pha tĩnh pha động, KC hệ số phân bố cân bằng, gọi số phân bố Hệ số phân bố khối lượng chất xác định từ sắc đồ theo công thức: Dm  k'  tR  tM tM Trong đó: tR (thời gian lưu hay thể tích lưu), khoảng cách đường từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic chất t M (thời gian chết hay thể tích rỗng), khoảng cách đường từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic chất không bị lưu giữ Hệ số phân bố Trong sắc ký gel, đặc tính rửa giải chất biểu thị dạng hệ số phân bố Ko tính theo công thức: Ko  tR  to tt  to đó: tR (thời gian lưu hay thể tích lưu), khoảng cách đường từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic chất t o (thời gian chết hay thể tích rỗng), khoảng cách đường từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic chất không bị lưu giữ t t (thời gian lưu hay thể tích lưu), khoảng cách đường từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic chất tiếp cận đầy đủ lỗ xốp pha tĩnh Thừa số chậm Thừa số chậm RF (còn gọi hệ số di chuyển Rf), dùng sắc ký mặt phẳng (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy) tỷ số khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tâm vết sắc ký khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tuyến dung môi RF  b a Trong đó: b quãng đường di chuyển chất tan, a quãng đường di chuyển tuyến dung môi Các thông số vế sắc ký Pic sắc ký Pic chất xác định diện tích pic (A), hay chiều cao pic (h), chiều rộng pic nửa chiều cao (wh) chiều cao pic (h) chiều rộng pic điểm uốn (wi) Với pic dạng Gauss (hình 5.8.1) ta có hệ thức: wh = 1,18 wi Hình 5.8.1 Hệ số đối xứng Hệ số đối xứng (As) (hay hệ số kéo đi) pic Hình 5.8.2 tính theo công thức: AS  w 0, 05 2d Trong đó: w 0,05 chiều rộng pic 1/20 chiều cao pic, d khoảng cách từ đường thẳng đứng qua đỉnh pic đến cạnh phía trước pic 1/20 chiều cao pic Khi As = 1,0 pic hồn tồn đối xứng (lý tưởng) Hình 5.8.2 Hiệu cột số đĩa lý thuyết biểu kiến Tuỳ theo kỹ thuật sử dụng, dựa liệu thu điều kiện đẳng nhiệt, đẳng dòng hay đẳng mật độ, hiệu cột (hay hiệu lực biểu kiến cột), biểu thị dạng số đĩa lý thuyết biểu kiến (N), tính theo cơng thức đây: t N  5,54 R  wh    đó: t R thời gian lưu hay thể tích lưu hay khoảng cách đường từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng góc kẻ qua đỉnh pic tương ứng với chất, w h chiều rộng pic nửa chiều cao pic tính theo đơn vị đo t R (thời gian, thể tích hay khoảng cách) Số đĩa lý thuyết biểu kiến thay đổi theo chất, theo cột theo thời gian lưu Các thông số tách sắc ký Độ phân giải Độ phân giải (RS) hai pic hai chất tính theo cơng thức: RS  1,18t R  t R1  w h1  w h Trong đó: t R1 t R thời gian lưu, hay khoảng cách đường từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng góc kẻ qua hai đỉnh pic tương ứng với hai chất cạnh nhau, w h1 w h chiều rộng hai pic nửa chiều cao pic tương ứng Độ phân giải lớn 1,5 hai pic tách đến đường Cơng thức cho không pic không tách đường Trong sắc ký mặt phẳng, thay cho thời gian lưu, người ta sử dụng quãng đường dịch chuyển độ phân giải tính theo cơng thức RS  1,18a R F  R F1  w h1  w h Trong đó: R F1 R F = thừa số chậm (hay hệ số lưu giữ) hai chất, w h1 w h = chiều rộng hai pic nửa chiều cao pic tương ứng a = quãng đường dịch chuyển dung môi Công thức áp dụng cho trường hợp sắc đồ vết sắc ký mặt phẳng quét chuyển sang dạng pic sắc ký Tỷ số đỉnh-hõm Tỷ số đỉnh-hõm (p/v) dùng thơng số tính phù hợp hệ thống phép thử tạp chất liên quan hai pic không tách đến đến đường (xem hình 5.8.3) p/v  Hp Hv đó: Hp = chiều cao đỉnh pic nhỏ so với đường ngoại suy Hv = chiều cao đáy hõm tách hai pic lớn nhỏ Hình 5.8.3 Độ lưu giữ tỷ đối Độ lưu giữ tỷ đối (r), gọi thừa số chọn lọc (α), ước lượng theo cơng thức sau: r t R2  t M t R1  t M Trong đó: tR2 thời gian lưu pic chất quan tâm tR1 thời gian lưu chất đối chiếu (thường pic chất cần thử) t M = thời gian chết (hay thể tích rỗng), khoảng cách đường từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic chất không bị lưu giữ Độ lưu giữ tỷ đối chưa hiệu (rG) tính theo cơng thức: rG  t R2 t R1 10 Trừ có hướng dẫn khác, trị giá độ lưu giữ tỷ đối cho chuyên luận độ lưu giữ tỷ đối chưa hiệu Trong sắc ký mặt phẳng, thừa số chậm (hệ số di chuyển) Rf2 Rf1 dùng thay cho thời gian lưu tR2 tR1 Độ chụm kết định lượng Tỷ số tín hiệu nhiễu Tỷ số tín hiệu nhiễu (S/N) ảnh hưởng đến độ chụm (precision) kết định lượng tính theo cơng thức: S/ N  2H h đó: H = chiều cao pic (Hình 5.8.4) ứng với chất khảo sát sắc đồ thu với dung dịch chất đối chiếu định, chiều cao đo từ đỉnh pic đến đường ngoại suy khoảng 20 lần chiều rộng pic nửa chiều cao pic, h = khoảng dao động nhiễu đường sắc đồ thu sau tiêm mẫu trắng, khoảng dao động xác định quãng đường 20 lần chiều rộng pic nửa chiều cao pic sắc đồ thu tiêm dung dịch chất đối chiếu định khoảng đường phân bố hai bên vị trí pic chất nghiên cứu Hình 5.8.4 11 Độ lặp lại Độ lặp lại đáp ứng biểu thị dạng độ lệch chuẩn tương đối % (RSD%) của dãy liên tiếp kết phép tiêm đo tính theo cơng thức:  y  y   100   i  RSD %   n 1 y Trong đó: yi giá trị cá thể dạng diện tích pic hay chiều cao pic hay tỷ số diện tích phương pháp chuẩn hố,  y trung bình giá trị cá thể, n số giá trị cá thể Với dãy lần tiêm dung dịch đối chiếu, cho giới hạn xác định, giá trị cực đại độ lệch chuẩn tương đối (RSDmax) tính theo cơng thức sau: RSD max  KB n t 90%,n 1 Trong đó: K số (0,349), tính từ biểu thức K  0,6 0,6 t 90%,n 1  2 RSD yêu cầu cho B = 1,0, sau lần tiêm B giới hạn xác định chuyên luận riêng trừ 100 phần trăm, n số dung dịch đối chiếu (3 ≤ n ≤ 6) t 90%,n 1 t bảng Student với mức xác suất 90 % (hai chiều) n-1 bậc tự Tính phù hợp hệ thống Các phép thử tính phù hợp hệ thống phần khơng thể thiếu phương pháp dùng để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu phù hợp Hiệu lực biểu kiến, tỷ số phân bố khối lượng, độ lưu giữ tỷ đối hệ số đối xứng thông số thường dùng để đánh giá hiệu cột Các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính sắc ký bao gồm thành phần pha động, sức ion, nhiệt độ pH biểu kiến pha động, lưu lượng, chiều dài cột, nhiệt độ áp suất, đặc tính pha tĩnh, mức biến đổi hoá học độ xốp (cỡ lỗ), cỡ hạt, kiểu hạt, diện tích bề mặt riêng, trường hợp pha đảo mức độ biến đổi 12 hoá học (được biểu diễn dạng mức độ khoá đầu (end-capping) hay tải lượng carbon, v.v ) Các phận cấu thành máy phải có khả đáp ứng yêu cầu độ chụm tiến hành phép thử hay định lượng Nếu khơng có dẫn khác chuyên luận hệ thống phải đạt yêu cầu sau đây: - Hệ số đối xứng pic phải khoảng 0,8 -1,5, trừ có dẫn khác chuyên luận Yêu cầu áp dụng rộng rãi cho phép thử định lượng chuyên luận - Độ lệch chuẩn tối đa phép cho lần tiêm lặp lại dung dịch đối chiếu không vượt trị giá cho bảng 5.8.1 Yêu cầu áp dụng cho phép định lượng không áp dụng cho phép thử tạp chất liên quan Giới hạn phát pic (ứng với tỷ số tín hiệu nhiễu 3) nhỏ giới hạn bỏ qua tạp chất liên quan Giới hạn định lượng pic (ứng với tỷ số tín hiệu nhiễu 10) nhỏ giới hạn bỏ qua tạp chất liên quan Bảng 5.8.1 Yêu cầu độ lặp lại Số lần tiêm Độ lệch chuẩn tối đa phép B (%) 2,0 0,41 0,59 0,73 0,85 2,5 0,52 0,74 0,92 1,06 3,0 0,63 0,89 1,10 1,27 Yêu cầu tính phù hợp hệ thống cho chun luận khơng có Dược điển Việt Nam: Trừ có dẫn riêng chuyên luận, độ lệch chuẩn tối đa phép cho lần tiêm lặp 2,0% Yêu cầu áp dụng cho phép định lượng Điều chỉnh điều kiện sắc ký Để thoả mãn tiêu chí yêu cầu tính phù hợp hệ thống, mà khơng làm thay đổi phương pháp, điều chỉnh thông số sắc ký phạm vi nêu bảng cho để tham khảo Các điều kiện sắc ký thẩm định trình xây dựng chuyên luận Các phép thử tính phù hợp hệ thống đưa vào để đảm bảo yêu cầu tách cho phép thử hay phép định lượng đạt chất lượng mong muốn Tuy nhiên, pha tĩnh mô tả cách chung chung, thị trường lại có nhiều loại pha tĩnh có đặc tính sắc ký khác nhau, nên cần điều chỉnh số điều kiện sắc ký để đạt yêu cầu 13 tính phù hợp hệ thống Đặc biệt phương pháp sắc ký pha đảo, việc thay đổi thông số sắc ký lúc cho kết tách thoả đáng Trong trường hợp này, phải thay cột khác loại, ví dụ cột silicagel gắn C18 khác mà cho kết mong muốn Với thơng số quan trọng, việc điều chỉnh xác định rõ ràng chuyên luận để đảm bảo tính phù hợp hệ thống Nên tránh điều chỉnh nhiều thứ lúc gây tác động tích luỹ hiệu hệ thống Sắc ký lớp mỏng sắc ký giấy Thành phần pha động: lượng thành phần dung mơi nhỏ điều chỉnh  30% nồng độ tương đối hay  % nồng độ tuyệt đối tuỳ theo lớn Ví dụ với dung môi thành phần nhỏ cỡ 10% pha động thay đổi 30% tương đối nghĩa nồng độ khoảng 713% thay đổi 2% nồng độ tuyệt đối nghĩa nồng độ khoảng 8-12%; khoảng theo nồng độ tương đối lớn hơn; thành phần dung mơi nhỏ 5% thay đổi 30% tương đối nghĩa khoảng 3,5-6,5% thay đổi 2% nồng độ tuyệt đối nghĩa khoảng 3-7%, trường hợp khoảng theo nồng độ tuyệt đối lớn Không thành phần dung môi thay đổi lớn 10% nồng độ tuyệt đối pH thành phần nước pha động: điều chỉnh thay đổi  0,2 đơn vị pH trừ có dẫn khác chuyên luận, hay thay đổi  đơn vị pH nghiên cứu chất trung tính Nồng độ muối thành phần đệm pha động: thay đổi  10% Thể tích mẫu chấm sắc ký điều chỉnh khoảng 10-20% thể tích quy định sử dụng mỏng cỡ hạt nhỏ (2-10 μm) Khoảng dịch chuyển tuyến dung môi không 50mm với mỏng hiệu cao khơng 30 mm Sắc ký lỏng Thành phần pha động lượng thành phần dung mơi nhỏ điều chỉnh  30% nồng độ tương đối hay  % nồng độ tuyệt đối tuỳ theo trị số lớn (Xem ví dụ trên) Khơng thành phần dung môi thay đổi lớn 10% nồng độ tuyệt đối Nồng độ muối thành phần đệm pha động: Được thay đổi  10% Bước sóng detector khơng điều chỉnh Pha tĩnh: Chiều dài cột:  70% Đường kính cột:  25% Cỡ hạt: Giảm tối đa 50% không phép tăng 14 Lưu lượng pha động:  50% Khi chuyên luận cho thời gian lưu pic chính, phải thay đổi lưu lượng dung mơi thay đổi đường kính cột Khơng giảm lưu lượng dung môi chuyên luận sử dụng số đĩa lý thuyết biểu kiến phần đánh giá chất lượng Nhiệt độ  10%, tối đa 60oC Thể tích tiêm giảm giới hạn phát độ lặp lại pic xác định thoả đáng Rửa giải gradient Cấu hình thiết bị dùng thay đổi đáng kể độ phân giải, thời gian lưu thời gian lưu tỷ đối nêu phương pháp Nếu điều xảy thể tích dung mơi cư trú (dwell volume) q lớn Thể tích dung mơi cư trú thể tích điểm hai dung mơi rửa giải gặp điểm đầu cột Sắc ký khí Pha tĩnh: Chiều dài cột:  70% Đường kính cột:  25% Cỡ hạt: giảm tối đa 50% không phép tăng Bề dày lớp phim: giảm 50% đến tăng 100% Lưu lượng pha động:  50% Nhiệt độ  10% Thể tích tiêm giảm giới hạn phát độ lặp lại pic xác định thoả đáng Định lượng Đáp ứng detector: Độ nhạy detector tín hiệu đầu đơn vị nồng độ hay đơn vị khối lượng pha động vào detector Hệ số đáp ứng tương đối detector, thường gọi hệ số đáp ứng, biểu thị độ nhạy detector chất chuẩn Hệ số hiệu chỉnh nghịch đảo hệ số đáp ứng Phương pháp chuẩn ngoại Nồng độ thành phần cần phân tích xác định cách so sánh (các) đáp ứng pic dung dịch thử với đáp ứng pic chất đối chiếu Phương pháp chuẩn nội Chất chuẩn nội phải chất tách khỏi chất khảo sát Thêm lượng chuẩn nội vào dung dịch thử dung dịch chất đối chiếu Chất chuẩn nội khơng có phản ứng với khảo sát, phải bền khơng chứa tạp có thời gian lưu tương tự thời gian lưu chất khảo sát Nồng độ chất khảo sát xác định dựa vào việc so sánh tỷ số diện tích pic (hay chiều cao pic) chất khảo sát chuẩn nội dung dịch thử với tỷ số 15 diện tích pic (hay chiều cao pic) chất khảo sát chuẩn nội dung dịch chất đối chiếu Quy trình chuẩn hố, gọi phương pháp chuẩn hoá Hàm lượng phần trăm hay nhiều thành phần chất thử tính cách xác định diện tích pic hay nhiều pic dạng % tổng diện tích tất pic trừ pic dung môi hay thuốc thử pic mức bỏ qua Quy trình hiệu chuẩn, gọi phương pháp đường chuẩn Xác định mối quan hệ tín hiệu đo hay đánh giá (y) lượng (nồng độ, khối lượng, vv.) chất (x) tính hàm hiệu chuẩn (phương trình đường chuẩn) Tính kết phân tích từ tín hiệu chất phân tích (được đo hay đánh giá) theo phương pháp hàm số ngược Trong chuyên luận thường cho phương pháp định lượng khác phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, quy trình chuẩn hố (phương pháp đường chuẩn) dùng quy trình chuẩn hố (phương pháp chuẩn hoá) Trong phép thử tạp chất liên quan, người ta dùng phương pháp chuẩn ngoại với dung dịch đối chiếu, dùng quy trình chuẩn hố Tuy hai phương pháp chuẩn ngoại chuẩn hố, phải pha lỗng dung dịch chất thử để so sánh hệ số đáp ứng tạp chất liên quan phải xấp xỉ đáp ứng thân chất phân tích (hệ số đáp ứng 0,8-1,2), khơng phải dùng hệ số hiệu chỉnh Khi chuyên luận có quy định phép thử tạp chất liên quan tổng tạp chất hay phải định lượng tạp chất điều quan trọng phải chọn ngưỡng thích hợp điều kiện thích hợp cho việc lấy tích phân diện tích pic Trong phép thử ngưỡng bỏ qua (nghĩa diện tích pic ngưỡng khơng tính đến) thường 0,05% Như thế, ngưỡng đặt cho hệ thống thu thập liệu phải nửa ngưỡng bỏ qua Việc lấy tích phân diện tích pic tạp khơng tách hồn tồn khỏi pic nên thực theo phương pháp ngoại suy từ hõm tới hõm (vạch tiếp tuyến) Các pic dung mơi hồ tan mẫu bỏ qua 16 ... methyl: 0,1 - 0,25, đỏ methyl: 0,35 - 0, 55 sudan G ®á: 0, 75 - 0, 98 5.8 CÁC KỸ THUẬT TÁCH SẮC KÝ Các kỹ thuật tách sắc ký phương pháp tách thành phần mẫu phân bố vào hai pha: pha tĩnh pha động... Phương pháp sắc ký khí (Phụ lục 5.2) - Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) - Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) - Phương pháp sắc ký rây phân tử (Phụ lục 5.5) Định nghĩa: Các định nghĩa... số thông thường kỹ thuật sắc ký, yêu cầu thường áp dụng cho tính phù hợp hệ thống sắc ký Nguyên lý, thiết bị phương pháp tách trình bày phương pháp thử chung: - Phương pháp sắc ký giấy (Phụ lục