Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS)

B ộ GIÁO DỰC ĐÀO TẠO B ộ Y TÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • • • • TRẦN CAO Sơ N ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ACID BÉO OMEGA 3,' OMEGA VÀ OMEGA TRONG ĐẬU TƯƠNG • • VÀ CÁC SẢN PHẩ M TỪ ĐẬU TƯƠNG BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ KHÍ KHố I PHổ (GC/MS) LUẬN VĂN THẠC s ĩ DƯỢC HỌC • • • • CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 607315 Người hướng dẫn khoa học: PGS Phạm Gia Huệ TS Lê Thị Hồng Hảo TRƯỜNG HÀ NỘI - 2010 ĐK DƯỢC HẢ NỘI N g a y thang S oD K C B : }_L ■ nS.v 20 ĩ: LỜI CẢM ƠN Trước Hên, tỏi xin bờv tó lòng biết ơn sáu sắc tới: PGS Phạm Gia Huệ TS Lê Thị Hồng Hảo Những người thầv ìuỏn quan tâm, giúp đỡ , hướng dan tơi suốt q trình thực hồn thành đê tài Xin chân thành cảm Ơ77 ban lãnh đạo đông nghiệp Viện Kiêm nghiệm an tồn vệ sinh thực phám Oc gia, người hêt lòng tạo điêu kiện thuận lợi trực tiếp giúp đỡ tói q trình thực đê tài Xin chân thành cảm 077 thây, cỏ Bộ mơn Hóa Phân tích trường Đại học Dược Hà N ội hướtìíỊ dan giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Xin chán thành càm ơìi Ban giám hiệu nhà trưỏnig, cam ơn tlĩầv cỏ, cán phòng quân lý sau đại học ph ò n ẹ ban khác cùa tntờng Đại học Dược Hà Nội giúp đờ tỏi suốt trình học tập tnrờng Ci cùmị xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, nẹười hết lòng ủng hộ, độn %viên, giúp đỡ tạo điểu kiện cho tỏi hoàn thành tot để tài Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2010 Dược s ĩ Trán Cao Sơn Học viên cao học khóa 13, Chuyên ngành Kiêm nghiệm Thuôc Độc chát MỤC LỤC LỜI CẢM Ơ N i MỤC L Ụ C ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢ N G vii DANH MỤC CÁC HÌNH V Ẽ .viii DANH MỤC CÁC HÌNH V Ẽ .viii ĐẶT VẤN Đ Ề CHƯƠNG : TỒNG Q U A N 1.1 Tổng quan lipid acid béo 1.1.1 Vài nét lipid 1.1.2 Các loại acid béo 1.1.3 Acid béo om ega .4 1.1.3.1 Acid béo omega-3 (acid béo n -3 ) 1.1.3.2 Acid béo omeea-6 (n-6) 1.1.3.3 Acid béo omega-9 (n-9) 1.2 Đậu tương sản phẩm từ đậu tương 1.2.1 Giới thiệu chung đậu tương 1.2.2 Các sản phẩm từ đậu tương 10 1.3 Các phương pháp xác định acid béo 11 1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu cao (H PLC) 11 1.3.2 Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) 12 1.3.3 Sắc ký khí (G C ) 12 1.4 Giới thiệu sắc ký khí khối p h ổ 14 1.4.1 Sắc ký khí 14 1.4.1.1 Khí mang 15 1.4.1.2 Buồng tiêm m ẫu 15 1.4.1.3 Cột tách lò 16 1.4.2 Detector khối phổ sắc ký khí .17 1.4.2.1 Khái niệm 17 1.4.2.2 Nguyên tắc hoạt động .18 1.4.2.3 Cấu tạ o 18 1.4.2.4 Một số kỹ thuật MS : 20 1.4.3 ứ n g dụng sắc ký khí khối p h ổ 21 1.4.3.1 Phân tích định tính : 21 1.4.3.2 Phân tích định lượng : 21 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 23 2.1 Đối tượng nghiên c ứ u .23 2.2 Hóa chất, thiết b ị .24 2.2.1 Thiết b ị 24 2.2.2 Dụng cụ 24 2.2.3 Hóa chất 24 2.2.4 Chất chuẩn 25 2.2.4.1 Chuẩn g ố c 25 2.2.4.2 Nội chuẩn 27 2.2.4.3 Pha dung dịch chuẩn 27 2.3 Phương pháp nghiên c ứ u 28 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu xử lý mẫu sơ 28 2.3.1.1 Mẫu đậu tương 28 2.3.1.2 Mẫu dầu đậu nành .28 2.3.1.3 Mẫu nước đậu n n h 28 2.3.1.4 Mẫu đậu p h ụ 28 2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng acid béo .28 2.3.2.1 Chiết chất béo khỏi mẫu .29 2.3.2.2 Dần xuất hóa tạo FA M E 29 2.3.2.3 Phân tích GC-MS 29 2.3.3 Thẩm định phương pháp 30 2.3.3.1 Tính phù họp hệ thống sắc k ý 30 2.3.3.2 Tính chọn lọc, đặc hiệu 30 2.3.3.3 Khoảng tuyến tính 30 2.3.3.4 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) .30 2.3.3.5 Độ lặp lại 31 2.3.3.6 Độ 31 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu : 32 CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 33 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích acid b éo 33 3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích acid béo 33 3.1.1.1 Nghiên cứu điều kiện chiết m ẫu 33 3.1.1.2 Khảo sát điều kiện chạy máy GC-M S 35 3.1.2 Thẩm định phương pháp 42 3.1.2.1 Tính phù họp hệ thống 42 3.1.2.2 Tính đặc hiệu, chọn lọc 43 3.1.2.3 Khoảng tuyến tính .43 3.1.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 46 3.1.2.5 Độ lặp lại 47 3.1.2.6 Độ 50 3.2 ứng dụng phương pháp để phân tích so acid béo omeea 3, 6, đậu tương sản phẩm từ đậu tương 52 3.2.1 Xác thành phần số acid béo omega 3, 6, đậu tương sản phẩm từ đậu tương 52 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian bảo quản đến thành phần acid béo đậu tương .54 CHƯƠNG 4: BÀN L U Ậ N 56 4.1 Quy trình chiết chất béo dan xuất acid béo 56 4.2 Chất nội chuẩn 58 4.3 Phân tích acid béo omega GC-MS .58 4.4 Kết thẩm định phương pháp 59 4.5 Hàm lượng acid béo omega đậu tương sản phẩm từ đậu tương 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN N G H Ị 61 KẾT LUẬN .61 KIẾN NG HỊ 61 TÀI LIỆU THAM K H Ả O 63 PHỤ LỤC 68 CT Chương trình HCBVTV Hóa chat bảo vệ thực vật AOAC Assosiation of Official Analytical Chemists (Hiệp hội nhà hóa phân tích thức) CI Chemical Ionization (lon hóa hóa học) DAD Diode Array Detector (Detector mảng diod) EI Electron Impact (Va đập điện tử) ELSD Evaporative light scattering detector (Detector tán xạ bay hơi) ES External Standard (Chat neoại chuẩn) FAME Fatty acid methyl ester (ester methylic acid béo) FID Flame Ionization Detector (Detector Ion hóa lửa) FLD Fluorescence Detector (Detector Huỳnh quana) FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy (Quang phổ hong neoại biến đổi Fourier) GC Gas chromatography (Sắc ký khí) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sac ký lỏng hiệu cao) IS Internal Standard (Chất nội chuân) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) MS Mass spectrometry (Khối phổ) RID Refractive Index Detector (Detector sổ khúc xạ) S/N Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu nhiễu) SIM Select Ion Monitoring (Chọn lọc ion) ƯV-VIS Ultraviolet - Visible (Tử nsoại khả kiến) DANH MỤC CÁC BẢNG • Bảng 1.1: Một số loại acid béo omega-3thường gặp Bảng 1.2: Một số loại acid béo omega-6thường gặp Bảng 1.3: Một số loại acid béo omega-9thường gặp Bảng 1.4: Đặc điểm hai loại cột sắc ký khí - lỏng 16 Bảng 1.5: Các loại pha tĩnh dùng sắc ký kh í 17 Bảng 2.1: Các acid béo omega 3, 6, mà đề tài nghiên cứu 23 Bảng 2.2: Thành phần dung dịch chuẩn 37 acid b é o .25 Bảng 2.3: Cách pha dung dịch chuẩn FAME làm v iệc 27 Bảng 3.1 : So sánh kết số phương pháp 35 Bảng 3.2: Kết khảo sát chương trình nhiệt độ c ộ t .37 Bảng 3.3: Xác định tính phù họp hệ thống 42 Bảng 3.4: Kết khảo sát khoảng tuyến tính acid oleic (C18:ln9) .44 Bảng 3.5: Kết khảo sát khoảng tuyến tính acid linoleic (C18:2n6) 44 Bảng 3.6: Ket khảo sát tuyến tính acid y-linolenic (C18:3n6) 44 Bảng 3.7: Kết khảo sát tuyến tính acid a-linolenic (C18:3n3) 45 Bảng 3.8: Kết khảo sát tuyến tính acid arachidonic (C20:4n6) 45 Bảne 3.9: Kết khảo sát khoảng tuyến tính EPA (C20:5n3) 45 Bảng 3.10: Kết khảo sát khoản? tuyến tính DHA (C22:6n3) r, 46 Bảng 3.11: Kết xác định độ lặp lại mẫu đậu tương 48 Bảng 3.12: Ket xác định độ lặp lại mẫu dầu đậu nành 48 Bảng 3.13: Kết xác định độ lặp lại mẫu nước đậu nành đậu phụ 49 Bảng 3.14: Ket khảo sát độ phương p háp 50 Bảng 3.15: Kết xác định độ thu hồi phương pháp 51 Bảng 3.16: Thành phần acid béo đậu tương sản phẩm đậu tương 52 Bảng 3.17: Khảo sát ảnh hưởng thời gian bảo quản đến hàm lượng acid béo omega 3, đậu tương 54 Hình 1.1: Cây đậu tương hạt đậu tương Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký khí 14 Hình 1.3 : Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ 18 Hình 3.1 Sơ đồ trình chiết chất béo 33 Hình 3.2: sắc đồ hỗn hợp FAME, cột DB5 (60m X 0,25mm X 0,25 Hình 3.3: sắc đồ hỗn hợp FAME, cột SP 2380 (30m X 0,25mm X | j x n ) 36 0,2 ịim) 36 Hình 3.4: Phổ khối điển hình acid béo omega 3, omega 6, omega 39 Hình 3.5: sắc đồ hồn hợp chuẩn FAME lp p m 40 Hình 3.6: sắc đồ chuẩn DHA |ig/ml (tR 20,22) nội chuẩn(tR 9,50) 41 Hình 3.7: sắc đồ chuẩn EPA 5|ig/ml (tR 17.66) nội chuẩn (tR 9,52) 41 Hình 3.8: sắc đồ chuẩn ALA (tR 11,65) nội chuẩn (tR 9,49) 41 Hình 3.9: Mầu trắng (A) mẫu thêm chuẩn (gồm chất C18:3n6, C18:3n3, C20:5n3 C22:6n3) nồng độ 0,25 |ig/ml (B) 43 Hình 3.10: sắc ký đồ xác định LOQ acid béo C18:ln9, C18:2n6, C18:3n6 C18:3n3 46 Hình 3.11: sắc ký đồ xác định LOQ C20:4n6, C20:5n3 C22:6n3 47 Hình 3.12: sắc đồ xác định độ lặp lại mẫu đậu phụ 49 Hình 3.13: sắc đồ mẫu xác định độ thu hồi 52 Hình 3.14: Hàm lượng acid béo thời eian bảo quản khác 55 ĐẶT VẤN ĐÈ Ngày nay, với phát triển kinh tế mức sổng ngày tăng, người phải đối mặt với nguy số bệnh đến từ phát triển Tỷ lệ mắc bệnh tim mạch, vấn đề xã hội đại, ngày gia tăng Bên cạnh việc tìm phương pháp thuốc để chữa trị nhữns bệnh này, chế độ dinh dường đóng vai trò quan trọng nhăm phòng ngừa chí có thê loại trừ phần tác động bệnh Các loại acid béo omega 3, omega omega sử dụng với tỷ lệ hợp lý acid béo có nhiều lợi ích đổi với sức khỏe người, đặc biệt cho hệ tim mạch Ngồi ra, vai trò chúng tạo thành cấu trúc não trẻ sơ sinh nhiều nghiên cứu chứng minh Hiện thị trường có nhiều sản phẩm thực phẩm chức dầu cá có chứa nhiều acid béo nói đặc biệt omega Các loại thực phẩm chức loại có nhiều tác dụng hệ tim mạch cần thiết phụ nữ có thai cho bú Tuy nhiên, giá loại dầu cá thường cao trình chiết xuất từ cá biển tốn kém, sản phẩm có nguồn gốc từ cá thường có sổ nguy ô nhiễm chất độc sử dụng nhiều ô nhiễm thủy ngân chất polyclorbiphenyl Nhiều công trình nghiên cứu sản xuất chế pham omega nhờ công nehệ vi sinh m ans lại kết khả quan Bên cạnh acid béo có nguồn 2ốc từ động vật, nguồn lớn khác chat omega có trone số lồi thực vật, nhiều hạt loài họ đậu đặc biệt đậu tương Thành phần acid béo omega 3, omega omega hạt đậu tương thường động vật, đậu loại dễ trồng đặc biệt điều kiện thời tiết nhiệt đới, dễ dàng thu hàm lượng lớn acid béo omega với chi phí thấp Hiện sản phẩm từ đậu tương sử dụng phổ biến sống hàng ngày bao gồm dầu đậu nành, đậu phụ, nước đậu nành Xác định hàm lượne acid béo đậu tương sản phẩm từ đậu tương góp phần quan trọng trons việc nghiên cứu chế độ dinh dưỡng nhằm cung H ình 3.14: H àm lượng acid béo thời gian bảo quản khác Nhận xét: Hàm lượng loại acid béo C18:2n6 C18:3n3 trong,đậu tượng có thay đổi theo thời gian bảo quản, với xu hướng giảm dần theo thời gian Vì điều kiện thời gian không cho phép nghiên cứu giới hạn việc thay đổi hàm lượng, chưa nghiên cứu đến ảnh hưởng điều kiện bảo quản khác CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Q uy trình chiết chất béo dẫn xuất acid béo Đe định lượng thành phần acid béo sản phẩm thực phẩm nói chung đậu tươns, sản phẩm đậu tương nói riêng bước phải chiết tồn chất béo Trong thực phẩm, chất béo tồn nhiều dạne, dạng tự dạns liên kết với hợp chất khác acid amin, phân tử protein, phân tử popysaccarid, gốc phosphat , muốn chiết hồn tồn chất béo mà không bị ảnh hưởng thành phần khác cần thiết phải trải qua bước thủy phân để cat lipid khỏi mẫu Có nhiêu phương pháp để thủy phân phương pháp đánh giá cao có hiệu tốt mà đề tài áp dụng phương pháp Weiball - Stoldt Phương pháp thực thủy phân với dung dịch HC1 10-20% mơi trường có ethanol Sau thủy phân, chất béo tự dễ dàng hòa tan dung môi không phân cực Trong nghiên cứu sử dụng hỗn hợp dung môi ether ethylic ether dầu hỏa Sự phối trộn loại ether có nhiều tác dụng, ether dầu hỏa có tác dụns làm aiảm linh động bay ether ethylic, tỷ lệ 1:1 tác dụng chiết tối đa chất béo giúp cho phân lớp dễ dàne sau chiết Trong số trường hợp, đổi với sản phẩm có hàm lượng nước cao (như nước đậu nành), bổ sung ethanol cần thiết cho trình phân lớp mà khơng ảnh hưởng đến kết phân tích Giai đoạn quan trọng định đến kết phân tích acid béo q trình dẫn xuất acid béo để tạo thành dạng ester methylic Trong nghiên cứu này, tiến hành nghiên cứu với phương pháp dẫn xuất khác phương pháp dẫn xuất với dung dịch BF3 methanol dung dịch NaOH methanol cho hiệu suất dẫn xuất cao (bảng 3.1) Đầu tiên, trình dẫn xuất với natri methylat cho hiệu suất tương đối tốt trình thực nhanh (3-5 phút) Tuy nhiên, natri methylat tác nhân dẫn xuất môi trường kiềm, cho phản ứng với acid béo tồn dạng ester (chỉ có phản ứns chuyển dạng ester, transesterification) Trong tự nhiên tồn acid béo tự do, lượng acid béo tự nhiều hay có khác eiữa loại thực phấm Đối với số sản phẩm định, loại thực phẩm chế biến sẵn dùng cho trẻ em, loại viên nang dầu cá dạng acid béo tự thườna chiếm tỷ trọng nhỏ so với dạng liên kết với glycerol, cholesterol hay alcol khác thực phản ứng với natri methylat Tuy vậy, để ứng dụng để phân tích thực phẩm nói chung đậu tươne nói riêng dẫn xuất với natri methylat cho kết với sai số âm So với natri methylat, tác nhân BF3 giúp dẫn xuất hai loại acid béo, acid béo dạng ester (thành phần chủ yếu) acid béo tự do: Phản ứng với BF3 xảy điều kiện nhiệt độ cao, cần đun hồi lưu nhằm tiết kiệm thời gian Một sổ nghiên cứu với BF3 thực dẫn xuất nhiệt độ 50°c cần để qua đêm, thực 100°c cần để tổi thiểu 45 phút Trong hai thí nghiệm, chúns tơi sử dụng dung dịch natri hydroxyd để xà phòng hòa chất béo trước cho phản ứng dẫn xuất với BF3 cho hiệu suất cao hẳn khơng có bước xà phòng hóa Phản ứng acid béo với methanol điều kiện nhiệt độ xúc tác BF3 bị ảnh hưởng bới nước Các khảo sát mẫu khơng loại nước hồn tồn natri sulfat khan trước dẫn xuất thường cho hiệu suất phản ứng thấp (50-60%) Do trước thực phản ứng tạo dẫn xuất, việc loại nước phải thực triệt để, như’các thành phần dung môi, thuốc thử phải tuyệt đối tinh khiết Ngoài ra, sổ tác giả khác sử dụng tác nhân methyl hóa khác dung dịch acid sulfuric methanol, dung dịch acid hydrochloric methanol hay diazomethan Trong so này, diazomethan cho phản ứng tương đổi nhẹ nhàng nhiên chất có độ ổn định khơng cao khó kiếm Khi sử dụng tác nhân acid đế dẫn xuất hiệu suất dẫn xuất thường khơng cao bị ảnh hưởng nước tạo thành trình dẫn xuất 4.2 C hất nội chuẩn Đe định lượne xác hàm lượng acid béo loại ảnh hưởna mẫu cần phải sử dụne thêm chất nội chuẩn chất chuẩn acid béo phân tích Chất nội chuẩn (IS) có vai trò quan trọng để đảm bảo độ ổn định kết phân tích, đặc biệt kỹ thuật có liên quan đến khối phổ LC-MS GC-MS Sở dĩ detector MS thường có độ ổn định loại detector khác Chất nội chuẩn tốt phải có tính chất hóa học tương tự chất phân tích khơng làm ảnh hưởng đến chất phân tích Trong thực tế phân tích, chất nội chuẩn tốt chất đồng vị (ví dụ c, 2H ), chất thuộc nhóm cấu trúc Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng methyl nonadecanoat (C 19:0) làm chất nội chuẩn đáp ứng yêu cầu nêu Trước hết, c 19:0 có chất ester methylic acid nonadecanoic, thuộc nhóm acid béo no với tính chất hóa học gần tương tự với acid béo khác Hơn nữa, gặp acid béo có sổ c lẻ (như 11C, 13C, ) tự nhiên khơng ảnh hưởng đến nồng độ acid béo Một sổ nghiên cứu tác giả khác sử dụng nội chuan C 11:0 C15:0 cho kết gần tương tự Tuy nhiên, không sử dụng C l 1:0 C15:0 nghiên cứu thành phần hỗn hợp chuẩn có sẵn C11:0 C15:0 Việc sử dụng nội chuẩn đồng vị nghiên cứu không thật cần thiết chất nội chuẩn đồng vị thường có giá cao kết khơng có khác biệt so với nội chuẩn sử dụng 'sổ c lẻ 4.3 Phân tích acid béo om ega G C-M S Hiện có nhiều phương pháp phân tích acid béo cho kết tốt, GC-MS lựa chọn hàng đầu Phân tích acid béo omega 3, 6, sắc ký khí khối phổ sử dụng cột SP2380 (30m X 0,25mm X 0,20|im ) cho kết tốt với khả tách đa số acid béo tính chọn lọc cao Hiện giới, nhiều nghiên cứu sử dụng loại cột loại cột có chất tương đương để phân tích acid béo Với điều kiện sắc ký xây dựng, acid béo omega, hoàn toàn có thê phân tích acid béo khác acid béo no, acid béo trans Trong điều kiện khối phổ, việc sử dụng nguồn EI phù hợp, phân tích khối loại bẫy ion cho độ nhạy tốt chế độ Fullscan Trong trường hợp sử dụne phân tích khối loại tứ cực, phân tích acid béo chế độ SIM Do đó, phòng thí nghiệm khác có trang bị thiết bị sắc ký khí khối phổ hồn tốn áp dụng phương pháp để phân tích acid béo đối tượna khác Hiện nay, sổ phương pháp sử dụng detector ion hóa lửa (FID) để phát định lượne acid béo Ngoài hạn chế khả khẳng định acid béo độ nhạy không bang MS, FID có ưu điểm rẻ tiền có khoảng động học lớn Phươns pháp chúng tơi nghiên cứu đưa sang áp dụng với thiết bị GC-FID để phân tích acid béo thành thường quy 4.4 K ết thẩm định phương pháp Sau lựa chọn điều kiện xử lý mẫu chạy máy, thẩm định phương pháp (hay xác định hiệu lực phương pháp - method validation) yêu cầu cần phải thực Phương pháp thẩm định nội phòng thí nghiệm cho kết tốt với thơng sổ tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, siới hạn phát 0,03ng/ml, giới hạn định lượng 0,l|!g/ml, khoảng tuyến tính từ 0,1 jng/ml đến 10ịig/ml, độ lặp lại tốt với RSD% từ 2,26 đến 5,32% độ thu hồi cao (trên 80%) Ngoài ra, việc ứng dụng phương pháp để phân tích mẫu liên phòng thí nghiệm cho kết đạt tiêu chuẩn so với phòng thí nghiệm quốc tể thông số quan trọng để đánh giá hiệu lực phươns; pháp ; Tuy nhiên, để phương pháp áp dụng rộng rãi thông số quan trọng cần thực xác định độ tái lập phương pháp Do điều kiện thời eian hạn chế, nghiên cứu chúng tơi dừng lại thẩm định hệ thống thiết bị phòng phân tích 4.5 H àm Iưọng acid béo om ega đậu tương sản phẩm từ đậu tương Những kết nghiên cứu hàm lượne acid béo omega trona đậu tương sản phẩm từ đậu tương góp phần cung cấp thơng tin hàm lượng acid béo đậu tương sản phẩm chúng Với kết nghiên cứu eiốne đậu tương Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam khẳne định trone đậu tương có thành phần hàm lượng acid béo omega 3, 6, chiếm tỷ lệ lớn Trung bình thành phần chất béo 2Ĩống đậu tưo'ng dao động khoảng 18-20%, hàm lượng acid béo omega (chủ yểu C18:3n3) chiếm khoảna 2%, hàm lượng acid béo omega (chủ yếu C18:2n6) chiếm khoảng 30% hàm lượng acid béo omega (chủ yểu C18:ln9) chiếm từ 30-50% tổng chất béo Nhữne sổ liệu cho thấy đậu tương, naồi thành phần protein q thành phần chất béo yếu tố có đóng £Ĩp lớn tạo nên hiệu dinh dưỡng cao lồi thực vật Các số liệu phân tích đối tượng khác sản phẩm chế biến từ đậu tương cho kết dao động tùy thuộc thành phần chất béo sản phẩm Với loại dầu thực vật, sản phẩm có 100% nguyên liệu dầu đậu nành cho hàm lượng acid béo omega cao hẳn sản phẩm có phối trộn loại dầu khác sản phẩm dầu thực vật khác Ở đây, quan tâm đến thành phần acid béo omega omega khơng phải acid béo omega khơng có vai trò quan trọng mà dễ dàng bổ sung acid béo omega từ thực phẩm Theo kết nghiên cứu sơ thay đổi hàm lượng acid béo omeea omega đậu tương cho thấy thời gian bảo quản có ảnh hưởne đến hàm lượng acid béo omega omega Theo số nghiên cứu tác giả khác, cho thấy có biến đối chất đa nối đôi chất có đơi Trong thể người, cune cấp đủ acid béo omega va omega 6, chất lại bị chuyển hóa thành acid béo omega Ket cho thấy, để thu hược hiệu tốt nhất, đậu tương sau thu hoạch cần sử dụng thời gian bảo quản ảnh hưởng khơng tốt đến chất lượng đậu tương KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ K ÉT LU Ậ N Qua thời gian nghiên cứu thực nghiệm, thu kết phù hợp với mục tiêu đề ra: Đã xây dựng thành công phương pháp định lượng đồng thời so acid béo đậu tương sản phẩm từ đậu tương kỹ thuật sắc ký khí khối phổ GC-MS, bao gồm: - Đã khảo sát xây dựng quy trình chiết chất béo dẫn xuất hóa so acid béo omega 3, 6, đậu tươne số sản phẩm từ đậu tương cho thấy phương pháp dẫn xuất với bor triflorid methanol có phổi hợp duns dịch natri hydroxid methanol cho hiệu suất tốt - Đã khảo sát điều kiện cột phân tích chương trình nhiệt độ cột nhằm tách ester methylic acid béo omega 3, 6, đồng thời lựa chọn điều kiện khối phổ để phát định lượng acid béo nói - Đã thẩm định phương pháp phòng thí nghiệm Kết thẩm định cho thấy phương pháp xây dựng đảm bảo cho kết phân tích xác, đáng tin cậy, ứng dụng phương pháp để phân tích acid béo trone đậu tương sản phẩm đậu tương Đã ứne dụng phương pháp nói để xác định thành phần số acid béo omega 3, 6, đậu tương số sản phẩm đậu tương dầu đậu nành, nước đậu nành đậu phụ nghiên cứu sơ ảnh hưởng thời gian bảo quản đến hàm lượng so acid béo omesa 3, đậu tương K IÉN N G H Ị Đê đê tài hồn thiện, chúng tơi kiến nghị tiếp tục nghiên cứu thực số vấn đề sau: Thẩm định rộne rãi phương pháp số phòns thử nshiệm khác để đánh giá mức độ phù hợp nhằm đưa áp dụng phương pháp chuẩn để phân tích acid béo trone đậu tương, ngũ cốc nói chung Nghiên cứu định lượng thành phần acid béo khác trona đậu tương sản phẩm nói riêne sản phẩm thực phẩm, dược phẩm nói chung Ngồi acid omega nhữne acid béo có vai trò quan trọng acid béo khác, acid béo có hại acid béo trans cũne cần nghiên cứu định lượng Nghiên cứu định lượne thành phần acid béo số loại hạt có dầu khác lạc mè, vừns hạt cải Từ kết nghiên cứu định hướng phát triển nguồn neuyên liệu giàu acid béo omega cho ngành nghệ thực phẩm dược phẩm, góp phần bảo vệ tăng cường sức khỏe cho người sử dụng, hạn chế tỷ lệ mắc bệnh tim mạch vốn gia tăne TÀI LIỆU THAM KHẢO A T ài liệu tiếng V iệt Trần Tử An (Chủ biên) (2007), Hóa phân tích II, NXB Y học, tr.108,117,161-163 Đào Thanh Bình, Nguyễn Đức Toàn, Nguyễn Tuấn Anh, Trịnh Văn Lẩu (2007), “Định lượng đồng thời acid eicosapentaenoic acid docosahexaenoic số viên nang mềm omega-3 sắc ký khí'’, Kiêm nghiệm tìmơc, 5(16) Tr 14-18 Trần Văn Điền (2007), Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Từ Giấy, Hà Huy Khôi, Bùi Minh Đức (2000), Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam, Viện Dinh Dưỡng, Bộ Y tế Phạm Quốc Long, Đoàn Lan Hương, Matthaus B (2002), ‘“Thành phần lipid dầu hạt thực vật họ Sapindaceae Việt Nam”, Khoa học tự nhiên công nghệ, 18(4), tr 28-36 Phạm Thị Kim Trang, Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thanh Hải (1998), “Sử dụng sẳc ký khí mao quản để xác định thành phần axit béo dầu thực vật", Phân tích lý hóa sinh học, 3(2), tr 6-11 Trường Đại học Dược Hà Nội (2008), Hóa sinh học (Sách dùng đào tạo dược sĩ đại học), NXB Y học, tr.31-33 Bộ N ông nghiệp Phát triển N ông thôn (2005), 575 giống trồng nông nghiệp m ới, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Phạm Hùng Việt (2005), sắc kí khỉ - Cơ sở ỉí thuyết khả ứng dụng, NXB Đại học quốc gia Hà Nội 10 Nguyễn Tường Vy, Trần Tử An, Đặng Đức Khanh, Trịnh Văn Lẩu (2005), “Xác định acid béo dầu màng hạt gấc phương pháp sắc ký khí (GC/FID)”, Kiểm nghiệm thuốc, 3(9), tr 21-25 11 Nguyễn Tườne Vy Trần Tử An Đặng Đức Khanh, Trịnh Văn Lẩu (2007), “Xác định thành phần acid béo dầu 2ấc sắc ký khí khối phổ (GC/MS)’\ Dược học, 3, tr 28-30 B T ài liệu tiếng A nh 12.Ahmed A A Frederick R V Jacqueline s and Andrew G (2006), "Automated FTIR Analysis of Free Fatty Acids or Moisture in Edible Oils’" JALA, 11, pp 23-29 13 Allred A c Per K E (2006) "Quantitative determination of saturated and unsaturated fatty acids in edible oils by infrared spectroscopy and chemometrics" Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 82, 130 136 14.Audun F Eli A B Achim K., et al (2005), "Determination of C22:5 and C22:6 marine fatty acids in pork fat with Fourier transform mid-infrared spectroscopy", Meat Science, 69, pp 433-440 15 Bruno J., Nicholas L s., William D J (1982), "Determination of the fattyacid composition of soybean oil by high-pressure liquid chromatography”, Talanta, 29, pp 54-56 ló.Caygill C.P., Hill M.J (1995) "Fish, 77-3 fatty acids and human colorectal and breast cancer mortality" European Journal o f Cancer Prevention (4) pp.329-332 17 Chen s H., Chen K c , Lien H M (1999), “Determination of fatty acids in vegetable oil by reversed-phase liquid chromatography with fluorescence detection" Journal o f Chromatography A, 849, pp 357-369 18 Chen s H., Chuang Y J (2002), "Review: Analysis of fatty acids by column liquid chromatography", Analytica Chimica Acta, 465, pp 145-155 19 Frederic D Cristina c H (2007), “Fast analysis by gas-liquid chromatography Perspective on the resolution of complex fatty acid compositions", Journal o f Chromatography A, 1169, 175-178 20.Fredoen V., Jacqueline J.M s., Lia E.M L.„ Albert H G., Ronald J.A w , and Stephan K (2003), ‘‘Analysis of very long-chain fatty acids using electrospray ionization mass spectrometry”, Molecular Genetics and Metabolism, 79 (2003) pp 189-196 21.Hibbeln, J.R (2006) “Healthy intake of 0)3 and co6 fatty acid: estimations considering worldwide diversity”, American Journal o f ; Clinical Nutrition, 83 (6, supplement): 1483S-1493S 22.Jasminka G., Ana M„ Cédomila M (2002), “Gas chromatographic determination of fatty acids contained in different lipid classes after their separation by solid-phase extraction'’, Journal o f Chromatography A , 976, 47-54 23 Lands, w E.M (2005), "Dietary fat and health: the evidence and the politics of prevention: careful use of dietary fats can improve life and prevent disease", Annals o f the New York Academy o f Sciences, 1055, pp 179-192 24 Lima E.S., Abdalla D.s.p (2002), “High-performance liquid chromatography of fatty acids in biological sample”, Analytica Chimica Acta 465 (2Ọ02), pp 81-91 25 Ludwig Huber (2007), Validation and Qualification in Analytical Laboratories, Informa Healthcare, pp 144-211 26 Mehdi J H., Maryam V (2004), “Characterization and determination of fatty acids in fish oil using gas chromatography-mass spectrometry coupled with chemometric resolution techniques", Journal o f Chromatography A, 1024, pp 165-176 27 Moưis et al (1993) “ Does fish oil lower blood pressure? A meta-analysis of controlled trials”, Circulation, 88 (2) 523-533 28.Mototeru Yamane (2002), "‘Review: High-performance liquid chromatography-thermospray ionization-mass spectrometry of the oxidation products of polyunsaturated-fatty acids", Analytica Chimica Acta, 465, 227236 29 Nestle Laboratory Instructions (2005), “ General Direct determination o f fatty acids in infant form ulae” LI 00.512 30.0kuyama H., Ichikawa Y., Sun Y., Hamazaki T., Lands w E.M (2007), "co3 fatty acids effectively prevent coronary heart disease and other late-onset diseases: the excessive linoleic acid syndrome", World Review o f Nutritional Dietetics, 96: 83-103 31.Rosana c s s et al (2004), “Optimization of gas chromatographic-mass spectrometric analysis for fatty acids in hydrogenated castor oil obtained by catalytic transfer hydrogenation”, Analytica Chimica Acta, 505 (2004) 223226 32.Rosenfeld J M (2002), “Review: Application of analytical derivatizations to the quantitative and qualitative determination of fatty acids”, Analytica Chimica Acta, 465, 93-100 33 Sanchez-Avilaa N., Mata-Granados J.M., Ruiz-Jimeneza J., Luque de Castroa M.D (2009), “Fast, sensitive and highly discriminant sas chromatographymass spectrometry method for profiling analysis of fatty acids in serum”, Journal o f Chromatography A, CHROMA-350327 34 Schacky c (2003) "The role of omega-3 fatty acids in cardiovascular disease." Current Atherosclerosis Report, (2), 139-145 35 Seppẩnen-Laakso T., Laakso I., Hiltunen R (2002), “Review: Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition” Analytica Chimica Acta, 465, pp 39-62 36 Simopoulos, A p (2002), "The importance of the ratio of omega-6/omeea-3 essential fatty acids" Biomedicine & Pharmacotherapy, 56 (8), pp 365379 37 Stewart O.J., Raghavan G.S.V., Orsat V., Golden K.D (2003), “The effect of drying on unsaturated fatty acids and trypsin inhibitor activity in soybean”, Process Biochemistry 39, pp 483- 489 38 William H., George L (2010), Official method o f Analysis o f AOAC International, 18th Edition, revision 3, No 972.28, 969.33, 996.01, 996.06 39.Yong Q c , et al (2007), “Modulation of prostate cancer genetic risk by omega-3 and omega-6 fatty acids", The Journal o f Clinical Investigation, 117(7) pp 1866 40 Zachary D N., Jeffrey B B., Garry J H (1999), “Purification of fatty acid methyl esters by high-performance liquid chromatography" Journal o f Chromatography B, 732, pp 495-500 41.Zruno J., Nicholas L s., William D J (1982), “Determination of the fattyacid composition of soybean oil by high-pressure liquid chromatography”, Talanta, 29 pp 54 -56 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Quy định AO AC độ thu hồi độ lặp lại [25] Hàm lượng (% ) Tỷ lệ chất Đon vị Độ lặp lại Độ thu hôi RSD (% ) R% 100 100% 1,3 98-102 10 10'1 10% 2,8 98-102 lO'2 1% 2,7 97.-103 ì 0,1 10° 0,1% 3,7 95-105 0,01 10'4 100 ppm 5,3 90-107 0,001 10'5 10 ppm 7,3 80-110 0,0001 10'6 ppm 11 80-110 0,00001 10'7 100 ppb 15 80-110 0,000001 10’8 lOppb 21 60-115 0,0000001 10'9 ppb 30 40-120 ... Định lưọng số acid béo omega 3, omega omega đậu tương sản phẩm từ đậu tưong kỹ thuật sắc ký khí khối phổ (GC/M S)” với mục tiêu: Xây dựng phươna pháp định lượng so acid béo omega 3, omega omega... omega thường gặp đậu tương sản phẩm từ đậu tương kỹ thuật sắc ký khí khối phổ (GC/MS); ứ n g dụna phương pháp để nghiên cứu hàm lượng so acid béo omeea 3, 6, đậu tương sản phẩm từ đậu tương CHƯƠNG... béo omega nói riêng Các kỹ thuật hay sử dụng bao gồm sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), sắc ký khí (GC), quang phơ hồns ngoại (FTIR), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) sắc ký khí khối phổ (GCMS) 1.3.1 Sắc