Báo cáo-SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ Khoa Dược SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (Hight-performance Liquid Chromatography- HPLC) DH17DUO01 – Nhóm Phạm Thị Huỳnh Hoa Lê Quan Hải Cao Thị Mỹ Duyên Nguyễn Phước Duy Lương Gia Hân Phạm Phong Quang Lê Kim Ngân Nguyễn Thanh Nhẫn NỘI DUNG 1 Nguyên tắc phân loại Cấu tạo máy HPLC Các đại lượng đặc trưng HPLC Kĩ thuật tách HPLC Tối ưu hóa q trình sắc ký Ứng dụng ĐẠI CƯƠNG Từ viết tắt HPLC, đưa Giáo sư Csaba Horváth cho báo Pittcon năm 1970, ban đầu áp suất cao sử dụng để tạo dịng chảy qua cột sắc ký Hình 1: Cột HPLC  Là công cụ mạnh mẽ hóa học phân tích  Có khả tách, định danh định lượng hợp chất có mặt mẫu hịa tan chất lỏng  Áp dụng cho mẫu nào, chẳng hạn dược phẩm, thực phẩm, chế phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm, mơi trường, pháp y hóa chất công nghiệp Là kĩ thuật tách chất phân tích đồng thời chất hỗn hợp mẫu từ đa lượng đến vi lượng mà sắc ký cổ điển không đáp ứng Cơ sở sắc ký lỏng hiệu cao dựa tương tác thành phần chất phân tích, pha tĩnh pha động KHÁI NIỆM NGUYÊN TẮC VÀ PHÂN LOẠI 1.1 NGUYÊN TẮC Là kĩ thuật tách chất dựa tổ hợp nhiều trình vừa có tính chất hóa học + lý học Là cân động xảy cột sắc ký pha tĩnh pha động Là vận chuyển phân bố lại liên tục chất tan (hỗ hợp mẫu phân tích) theo lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách Trong q trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu cột, có chất tan bị lưu giữ  có q trình tách chất xảy cột sắc ký Hình 2: Các chất tách với thời gian lưu tương ứng Hình 3: Hỗn hợp mẫu cần phân tích đưa vào máy HPLC Hình 4: Các chất tách khỏi chúng di chuyển theo pha động qua cột chứa cột pha tĩnh Sắc ký đại diện cho thấy phân tích 45 axit amin sử dụng thuốc thử aTRAQ phân tích LC/MS/MS Tổng thời gian chạy 18 phút * Loại hợp chất không bền nhiệt gồm:  Dược phẩm: aspirin, ibuprofen, acetaminophen (Tylenol)…  Muối: sodium chloride, potassium phosphate…  Proteins: Lòng trắng trứng, protein, enzym…  Hợp chất hữu cơ: polymers (e.g polystyrene, polyethylene)  Hydrocarbon nặng: Dầu mỏ  Sản phẩm tự nhiên: Sâm, thuốc chiết xuất từ cỏ…  Ngồi cịn xác định với hợp chất bền nhiệt, nhiên dùng GC thích hợp 75 6.1 Phạm vi ứng dụng • nd 76 Vì HPLC lựa chọn phân tích dược liệu? o HPLC có nhiều ứng dụng nghiên cứu hợp o o o o chất tự nhiên nới chung nghiên cứu dược liệu nói riêng Ưu điểm lớn phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, khả phân tích rộng GC Có thể dùng HPLC để phân tích chất từ chất phân cực -> khơng phân cực, từ chất bay -> chất không bay hơi, từ chất trung tính -> chất điện ly Tính linh hoạt HPLC cao phương pháp khác nhờ chế tách, pha tĩnh pha động đa dạng, phong phú Với hiệu tách cao, khả phân tích rộng vậy, HPLC lựa chọn ưu tiên phân tích hay điều chế chất Dược động học  Thiết bị HPLC HPLC/MS công cụ hỗ trợ lớn cho nghiên cứu thực nghiệm (trên động vật: chuột, thỏ) mặt đánh giá số thông số dược động học  LC-MS ứng dụng nhiều nghiên cứu dược phẩm Những nghiên cứu HPLC cung cấp cách nhanh chóng thơng tin lưu lượng, chu kỳ phân huỷ loại thuốc máu, gan hay phận thể  Xác định sản phẩm chuyển hoá trung gian, biến tính dược phẩm thể: sàng lọc thuốc, kiểm tra ổn định, nhận dạng chất chuyển hoá, xác định tạp chất, định lượng kiểm soát chất lượng Dược phẩm  Định lượng riêng lẻ chất hỗn hợp phức tạp dịch chiết dược liệu  Có thể dễ dàng phân tích chất hỗn hợp mức ppm tới ppb, chí ppt  Phân tích điểm chi xác định nguồn gốc xuất xứ dược liệu, xác định nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu, xác định sản phẩm nhái, giả mạo,…  Xác định phân tích tính chất loại thuốc sản xuất hợp chất hoá học hay thiên nhiên Kiểm tra chất lượng hợp chất thuốc suốt trình sản xuất  Nhiều nhà nghiên cứu sử dụng thiết bị ghép nối LC-MS-NMR để phân tích thành phần dịch chiết xác định cấu trúc chất hỗn hợp mà khơng cần tách riêng  Phân tích đa lượng vitamin, kháng sinh, kháng khuẩn, chất bảo quản phụ gia thực phẩm, loại đường,… thực phẩm, dược liệu, hố chất, phân bón, thức ăn gia súc,  Phân tích vi lượng vitamin trái cây, sữa, bánh kẹo,…  Đặc biệt, hệ thống HPLC với đầu dị huỳnh quang có độ nhạy tính chọn lọc cao phân tích độc tố Mycotoxin thực phẩm, nguyên liệu chế biến thức ăn, gia súc Aflatoxin, Orchatoxin, Zearalenone,… VD: Xác định đồng thời hàm lượng paracetamol caffein số dược phẩm phương pháp HPLC - Chọn điều kiện phù hợp để tách xác định đồng thời hàm lượng chất hệ thống sắc kí HPLC sử dụng detector UV-VIS + Cột tách: RP-18,5 µm, 220x4,6 mm + Pha động: 100% CH3OH + Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút +Detector UV-VIS:  = 270 nm + Nhiệt độ cột: 25 độ C + Thể tích vịng mẫu: 20µl - Xác định khoảng tiến tính cho chất trên: Kết quả: - Phân tích hàm lượng paracetamol caffein mẫu dược phẩm Panadol Extra thu hệ số thu hồi paracetamol 0,85 ± 0,125 cafein 0,908 ± và0,135 -> Dựa kết thu được, ta nhận thấy phương pháp xác định đồng thời paracetamol caffein hệ thống HPLC tương đối tốt, xác sử dụng để xác định hàm lượng dược phẩm Nguồn: GVHD Th.s Nguyễn Ngọc Hưng, SVTH Nguyễn Thị Ngọc Trinh Khóa luận tốt nghiệp: Phân tích đồng thời paracetamol caffein dược phẩm pp HPLC Trường Đại Học Sư Phạm TP.HCM, Khoa Hóa Học Sự phát triển từ HPLC lên UPLC Máy sắc ký lỏng đại (UPLC) có cấu hình hồn thiện Các bước tiến hành phân tích 89 89 ... 1-20 3.4 HIỆU NĂNG (Số đĩa lý thuyết)   Số   đĩa lý thuyết đo sắc ký đồ N = 5.54*()2 hay N = 16*()2 Với W1/2 chiều rộng pic sắc ký vị trí ½ chiều cao pic (phút) W chiều rộng pic sắc ký vị trí... chất phân tích đồng thời chất hỗn hợp mẫu từ đa lượng đến vi lượng mà sắc ký cổ điển không đáp ứng Cơ sở sắc ký lỏng hiệu cao dựa tương tác thành phần chất phân tích, pha tĩnh pha động KHÁI NIỆM... tĩnh Sắc ký đại diện cho thấy phân tích 45 axit amin sử dụng thuốc thử aTRAQ phân tích LC/MS/MS Tổng thời gian chạy 18 phút 1.2 PHÂN LOẠI Sắc ký phân bố Sắc ký loại trừ Dựa vào kỹ thuậtSắc ký hấp