Báo cáo các phương pháp phổ ứng dụng trong nghiên cứu Dược liệu

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƢỢC BÁO CÁO MÔN PHƢƠNG PHÁP PHỔ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DƢỢC LIỆU Lớp cao học khóa 2016 - 2018 ỨNG DỤNG PHỔ KHỐI TRONG PHÂN TÍCH CÁC CHẤT TRONG HỖN HỢP, CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ TRÌ KIM NGỌC Chuyên ngành: Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền Mã số:60720406 Khóa 2016-2018 TP HCM, 05/2018 ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƢỢC BÁO CÁO MÔN PHƢƠNG PHÁP PHỔ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DƢỢC LIỆU Lớp cao học khóa 2016 - 2018 ỨNG DỤNG PHỔ KHỐI TRONG PHÂN TÍCH CÁC CHẤT TRONG HỖN HỢP, CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ Chuyên ngành: Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền Mã số:60720406 Khóa 2016-2018 Thầy hƣớng dẫn: PGS.Ts Trần Hùng Học viên : Trì Kim Ngọc TP HCM, 05/2018 MỤC LỤC MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ II GIỚI THIỆU PHỔ KHỐI 2.1 Giới thiệu 2.2 Nguyên tắc 2.3 Sự cải tiến phổ khối III CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ 3.1 Khái niệm chất cao phân tử 3.2 Các hợp chất cao phân tử điển hình 3.2.1 Axid amin 3.2.2 Carbohydrat 3.2.3 Lipid 3.2.4 Nucleotid IV ỨNG DỤNG PHỔ KHỐI TRONG PHÂN TÍCH CÁC CHẤT TRONG HỖN HỢP, CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ 4.1 Protein Peptid 4.1.1 Phân tích protein peptid phương pháp ion hóa ESI MALDI 10 4.1.2 Cấu trúc xác định chuỗi thông qua phân mảnh 12 4.1.3 Ứng dụng 15 4.2 Oligonucleotid 17 4.2.1 Khối phổ Oligonucleotid 17 4.2.2 Sự phân mảnh Oligonucleotid 18 4.2.3 Đặc trưng biến đổi Oligonucleotid 20 4.2.4 Các ứng dụng phổ khối Oligonucleotid 21 4.3 Oligosaccharid 21 4.3.1 Khối phổ Oligosaccharid 22 4.3.2 Phân mảnh Oligosaccharid 22 4.4 Lipid 23 4.4.1 Acid béo 24 4.4.2 Acylglycerol 26 4.4.3 Axid mật 27 4.5 Metabolomic 28 4.5.1 Phổ khối Metabolomic 28 4.5.2 Ứng dụng 28 III KẾT LUẬN 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 I ĐẶT VẤN ĐỀ Phương pháp phổ khối hay phổ khối lượng viết tắt MS (Mass Spectrometry), một phương pháp phân tích cơng cụ quan trọng để phân tích thành phần cấu trúc hợp chất vô hữu Phổ khối ngày khác biệt nhiều so với phương pháp phân tích cổ điển so với năm mươi năm trước lần sử dụng cơng cụ phân tích chung Ngun tắc khơng thay đổi thiết bị hỗ trợ liên tục cải tiến Từ ứng dụng phổ khối sinh học mở rộng với tốc độ phi thường cải tiến để giải thích thơng tin phổ khối phát triển để giải câu hỏi [5] Đại phân tử sinh học phân tử hữu phức tạp Những phân tử hình thànhthành phần cấu trúc tế bào sống Các hợp chất hữu nnhư axit amin, nucleotid monosaccharid đóng vai trò khối xây dựng phân tử sinh học phức tạp Các phân tử sinh học quan trọng protein, carbohydrat chất béo, enzym, vitamin, kích thích tố axit nucleic.Hầu hết phân tử sinh học lớn phức tạp Phản ứng chúng liên quan đến chế phức tạp [1] Ngày nay, khối phổ trở thành kỹ thuật phân tích sử dụng rộng rãi khoa học đời sống Do phạn vi báo cáo trình bày ứng dụng phổ khối phân tích đại phân tử sinh học như: peptide, protein, axit nucleic, oligosaccharides chất béo II GIỚI THIỆU PHỔ KHỐI 2.1 Giới thiệu Trong phổ khối, người ta tạo ion từ mẫu để phân tích Những ion sau tách biệt phát để định lượng Việc tách ion thực sở khác quỹ đạo chuyển động ion với tỷ lệ (m/z) khác điện và/hoặc từ trường Khối phổ phát triển từ thí nghiệm nghiên cứu vào đầu kỷ 20 giải thích trạng thái hạt tích điện trường lực từ trường tĩnh điện Những tên tiếng từ ngày đầu J J Thompson điều tra htrạng thái ion điện trường từ trường (1912), A J Dempster hướng tập trung (1918) F W Aston tập trung lượng (1919) Các ứng dụng phân tích sau tiếp tục phổ khối thương mại đáng tin cậy sản xuất Chủ yếu cho định lượng xác định số thành phần hỗn hợp phức tạp dầu thô Vào đầu năm sáu mươi, bắt đầu việc áp dụng phổ khối để xác định làm sáng tỏ cấu trúc hợp chất hữu phức tạp hơn, bao gồm polyme biomolecul Kể từ đó, kỹ thuật phát triển thành công cụ mạnh mẽ linh hoạt cho mục đích này, cung cấp thơng tin phần bổ sung kết hợp với kỹ thuật khác, chẳng hạn NMR Điều đáng ngạc nhiên kỹ thuật mà từ nhìn dường không cung cấp thêm thông tin ngồi trọng lượng hạt nhân Nhưng kiểm soát phân mảnh ion phân tử ban đầu mang lại thơng tin thú vị đóng góp cho việc xác định cấu trúc [6] 2.2 Nguyên tắc - Một lượng nhỏ hợp chất, thường micromol làm bốc Hơi đưa vào buồng ion hóa nơi áp suất trì khoảng 10-7 mbar - Các phân tử bị ion hóa chùm electron tạo cathod nóng, dây tóc Bằng cách làm electron hóa trị, tạo ion dương - Các ion dương ép khỏi buồng ion hóa điện tích dương nhỏ (vài Volts Sau ion rời khỏi buồng ion hóa, chúng gia tốc trường tĩnh điện (A> B) vài trăm đến hàng ngàn volts trước vào máy phân tích - Việc tách ion diễn máy phân tích đặt từ trường, áp suất khoảng 10-8 mbar Từ trường mạnh áp dụng vng góc với hướng chuyển động ion Các ion chuyển động nhanh sau theo quỹ đạo hình tròn, với gia tốc Lorentz, bán kính xác định tỷ số khối lượng/điện tích ion sức mạnh từ trường Các ion với tỷ lệ khối lượng/điện tích khác bị buộc thơng qua lối thoát-khe biến thể điện áp tăng tốc (A> B) cách thay đổi lực từ trường - Sau ion qua khe thoát, chúng va chạm vào điện cực thu Các kết khuếch đại ghi nhận hàm lực từ trường điện áp tăng tốc [6] Hình 2.1 Các phận thiết yếu máy đo phổ khối phân tích [6] Hình 2.2 Sơ đồ buồng ion hóa[6] 2.3 Sự cải tiến phổ khối Tiến sỹ Guido Verbeck, Phó Giáo sư hóa học Đại học Bắc Texas kiêm Giám đốc Phòng thí nghiệm Ghi ảnh Khối phổ, thiết kế thiết bị quang học ion nhằm thu nhỏ, chuẩn bị phân tích khối phổ Ơng phát triển khối phổ kế bẫy ion thu nhỏ Phòng thí nghiệm Quốc gia Oak Ridge, ba khối phổ chuẩn bị mẫu để lọc vật liệu chất xúc tác số ứng dụng phân tích tế bào đơn phân tích pháp y Tiến sỹ Verbeck nhận Tiến sỹ nghiên cứu sinh hóa học Proctor & Gamble trường Đại học Texas A&M.Ông nhận định, Sự thay đổi lớn lĩnh vực phổ khối thay hầu hết chuyên gia MS đến từ nhóm hóa hữu trước đây, MS xuất lĩnh vực có nhiều chuyên gia MS lĩnh vực Về mặt thiết bị, thay đổi lớn độ nhạy Dường tuân theo Quy luật Moore (một thuật ngữ máy tính cho thấy sức mạnh xử lý máy tính hai năm tăng gấp đơi), độ nhạy đạt tới mức 10-12 1015 mol/l Sự tiến thật tuyệt vời, cho phép ghi hình làm việc với khối lượng mẫu thấp nhận liệu tốt Một thay đổi tiểu hình hóa giúp khối phổ kế dần nhỏ với độ nhạy cao [4] Về mặt kỹ thuật ghép nối, dịch chuyển ion cộng đồng chấp nhận kỹ thuật tách cho MS thông lượng cao (IMS-MS) Với kỹ thuật ghi phổ MRM (multiple reaction monitoring) dịch chuyển ion, nhận số lượng lớn liệu có cấu trúc nhanh chóng, khoảng thời gian mà trước thu thập quang phổ Với dịch chuyển ion nhận phân tách nhanh chóng, vài phần ngàn giây Trước có kỹ thuật tách trước điểm cuối khối phổ, có khoảng thời gian định để có tất thơng tin giải phân chất phân tích Bây giờ, với dịch chuyển ion MRM, nhận hàng gigabyte liệu từ cột giải phân 10 15 giây Bước tiến lớn khả thực phạm vi khối phổ lớn thông lượng cao với độ phân giải cao toàn phạm vi khối phổ Một bước đột phá khác nằm lĩnh vực tin học - nhận 12 gigabyte liệu hình ảnh xử lý xác Chỉ để thu thập 12 gigabyte liệu tuần để xử lý Những đổi sở liệu tin học giúp người sử dụng thuật toán để đánh giá liệu dựa họ tìm kiếm trở nên quan trọng [4] III CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ 3.1 Khái niệm chất cao phân tử Cơ thể sống phức tạp dạng sống đơn giản Tuy nhiên, từ góc độ hóa học, thành phần tế bào tách biệt thành đại phân tử (DNA, RNA, protein, …), tương đối đơn giản phân tử (amino acid, monosaccharid, lipid) tiền chất chúng: CO2, H2O NH3 Nói chung, đại phân tử có xu hướng polyme nhỏ, phân tử sinh học; nhiên, phân tử này, dù đơn giản hay phức tạp tham gia vào vô số phản ứng trao đổi chất phức tạp Một trường hợp điển hình đường monosaccharid tổng hợp từ H2O CO2 Nó cung cấp lượng cho tế bào Ngồi ra, glucose nguyên liệu xây dựng đại phân tử tinh bột cellulose [3] 3.2 Các hợp chất cao phân tử điển hình 3.2.1 Axid amin Axit amin phân tử sinh học nhỏ đa Chúng có vai trò quan trọng sinh học bao gồm: xây dựng khối protein polyme axit amin, tiền chất kích thích tố tiền chất phân tử có chức sinh lý đặc biệt, ví dụ chất dẫn truyền thần kinh dopamin hormon thyroxin dẫn xuất tyrosin axit amin Như tên gọi nó, axit amin chứa nhóm amino cacboxyl Có thể chia thành nhóm dựa tính axid hòa tan nước, phân loại theo độ hòa tan, ví dụ, ưa nước kỵ nước [3] 3.2.2 Carbohydrat Carbohydrat gọi đường sacarit, định nghĩa polyhydroxy aldehyd ceton và/hoặc dẫn xuất chúng Chúng nhóm phân tử tìm thấy nhiều tự nhiên tham gia vào vai trò vận động cấu trúc,ví dụ: chúng đầu mối chuyển hóa lượng trung gian cấu trúc thực vật trao đổi chất Chúng tồn tự nhiên carbohydrat, chúng liên kết hóa học với lipid protein Carbohydrat đơn giản gọi đường, carbohydrat phức tạp gọi glycoconjugat tức glycolipid glycoprotein [3] 3.2.3 Lipid Lipid gọi chất béo, phân tử sinh học hòa tan dung mơi hữu khơng hòa tan dung dịch nước Chúng đóng vai trò thiết yếu màng sinh học Tất bào quan từ ty thể đến hạt nhân bao quanh màng lipid Chúng đóng vai trò bật trao đổi lượng thành phần mô mỡ Cuối cùng, đóng vai trò kích thích tố, chúng cần thiết cho điều hòa sinh lý cho trao đổi chất tế bào Có nhiều hợp chất lipid Bao gồm các: axit béo, triacylglycerol, sphingolipid, phospholipid, glycolipid, lipoprotein, steroid sterol, prostaglandin [3] 3.2.4 Nucleotid Giống axit amin đơn vị xây dựng protein, nucleotid đơn vị xây dựng khối axid nucleic, RNA DNA Ngồi vai trò sinh học chính, nucleotid đóng vai trò quan trọng chuyển hóa lượng, coenzym, chuyển hóa trung gian Nucleotid bao gồm base nitơ, đường nhóm phosphoryl Loại bỏ nhóm phosphoryl hợp chất gọi nucleosid Có hai loại base tìm thấy nucleotid purin pyrimidin Đường D-ribose 2-deoxy-D-ribose [3] IV ỨNG DỤNG PHỔ KHỐI TRONG PHÂN TÍCH CÁC CHẤT TRONG HỖN HỢP, CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ 4.1 Protein Peptid Protein peptid polyme tuyến tính tạo thành từ kết hợp 20 loại axit amin phổ biến liên kết với liên kết peptit Hơn nữa, protein sản xuất ribosom trải qua sửa đổi cộng hóa trị, gọi sửa đổi sau phiên dịch, sau kết hợp axit amin Hơn 200 sửa đổi phát hiện, quan trọng glycosyl hóa, hình thành cầu disulfid, phosphoryl hóa, sulfat, hydroxyl hóa, carboxyl hóa axetyl hóa Phổ khối khơng cho phép xác định xác khối lượng phân tử peptid protein mà xác định trình tự chúng, sử dụng đồng thời với kỹ thuật khối lượng Thật vậy, phân mảnh peptid protein cho thông tin chuỗi sử dụng để nhận dạng protein, trình tự xác định chất hóa học sửa đổi sau phiên dịch thay đổi cộng hóa trị khác [2] 4.1.1 Phân tích protein peptid phương pháp ion hóa ESI MALDI Các phương pháp ion hóa sử dụng thường xuyên để nghiên cứu peptid protein thông qua khối phổ ESI MALDI Tất kỹ thuật đặc trưng hình thành ion ổn định (vì chúng có lượng thấp) vắng mặt mảnh vỡ ESI tạo ion tích điện, cho phép phát phân tử lớn với phổ khối thông thường tứ cực, bẫy ion dụng cụ từ tính Các dòng electron phun với kích thước nano phát triển quan trọng phương pháp ion hóa Với dòng bơm khoảng 20 m /phút − 1, tín hiệu lâu dài thu phút số lượng mẫu, cho phép thực nhiều thí nghiệm MS/MS làm sáng tỏ cấu trúc Độ nhạy ESI không phụ thuộc vào tốc độ nano lít phút MALDI nguồn xung, thích hợp để sử dụng với phổ khối lượng TOF, với quang phổ kế cho phép lưu trữ ion bẫy ion FTICR Thường xuyên sử dụng công cụ TOF Trong thập kỷ qua, MALDI-TOF quang phổ kế có tiến quan trọng việc giới thiệu việc khai thác ion Kết là, hiệu suất máy phân tích TOF, độ phân giải độ xác khối lượng, cải thiện nhiều Mặc dù đạt với máy phân tích FTICR orbitrap, độ phân giải đạt tới 20.000 FWHM với giao thức hiệu chuẩn khối lượng tốt, khối lượng xác thu Các cơng cụ FTICR phức tạp được sử dụng với thành công ngày tăng Các công cụ sử dụng tái thẩm định công cụ cải tiến khác Sự phức tạp chi phí cao cơng cụ có nghĩa chúng có sẵn hạn chế số phòng thí nghiệm Một cơng cụ phát triển khác kết hợp trình phân tích trình tự khác cơng cụ Q-TOF, LIT-ICR LITorbitrap, theo thứ tự để tăng hiệu suất tính linh hoạt cho phép nhiều thử nghiệm thực Giới hạn phát ESI MALDI phụ thuộc vào số yếu tố, chẳng hạn chất mẫu chuẩn bị độ tinh khiết nó, dụng cụ sử dụng kỹ người vận hành Đối với peptid protein, giới hạn phát thực femtomol picomol, giới hạn attomol báo cáo Bởi độ phân giải cần thiết để tách đỉnh khác cụm đồng vị peptid thấp độ phân giải hầu hết máy phân tích, khối lượng phân tử đo tương ứng với tính tốn cách sử dụng đồng vị chiếm ưu phân tử Vì khơng phải trường hợp protein Vì độ phân giải cần thiết để giải cụm đồng vị tăng theo khối lượng với điện tích ion mang độ phân giải máy phân tích bị giới hạn, đỉnh khác cụm đồng vị kết hợp tạo thành đỉnh đơn trải rộng nhiều khối lượng (15 Da 10 000 Da 45 Da 100 000 Da) [2] phản ứng pha dung dịch Tuy nhiên, khả khác này, MS / MS thường sử dụng Thật vậy, MSn cho phép kết dựa xác định khối lượng phân tử xác nhận xác định [2] Xác định Protein Về mặt cổ điển, việc xác định protein đòi hỏi xác định tồn phần chuỗi chúng phương pháp suy thoái Edman Trong số trường hợp cụ thể, việc xác định protein dựa cơng nhận chúng kháng thể đặc hiệu Kỹ thuật đòi hỏi thời gian phân tích dài lượng lớn mẫu Phương pháp dựa so sánh liệu thu từ phổ khối với liệu dự đốn cho tất protein có sở liệu cách nhanh chóng độ nhạy cao Hơn nữa, phân mảnh khí giai đoạn để giải trình tự MS/MS dễ dàng peptid so với protein thường cho độ bao phủ chuỗi tốt Tuy nhiên, kỹ thuật cải thiện, trình tự protein nguyên vẹn MS / MS ngày trở nên mạnh [2] Phát mô tả đột biến Khối phổ cho phép phát mô tả đột biến protein, cho dù chúng tự nhiên hay thu thông qua đột biến trực tiếp Cách tiếp cận thường bao gồm ba bước: xác định khối lượng phân tử protein nguyên vẹn để phát đột biến, PMF enzyme tiêu hóa để xác định đột biến peptid, cuối cùng, MS / MS để xác định xác nhận vị trí chất axit amin bị đột biến Một đột biến điểm protein dẫn đến biến đổi khối lượng phân tử protein Sự thay đổi với khác biệt khối lượng loại tự nhiên dư lượng đột biến Thật vậy, 18 số 20 dư lượng axit amin tự nhiên có khối lượng phân tử đặc biệt Ngoại lệ với Leu Ile, đồng phân Sự khác biệt hàng loạt số axit amin thay dao động từ 0,0364 Da cho Gln / Lys đến 129,0578 Da cho Gly / Trp Do đó, tất thay axit amin dẫn đến biến đổi khối lượng phân tử phát mặt lý thuyết phép đo khối phổ [2] Thẩm định cấu trúc độ tinh khiết peptid protein Khối phổ đóng vai trò quan trọng việc xác minh cấu trúc vàđộ tinh khiết peptide tổng hợp Sự phát triển tổng hợp tự động làm cho việc sản xuất peptid tổng hợp ngày dễ dàng Tuy nhiên số lượng lớn lỗi xảy sau trình tổng hợp phần lớn số phát phép đo khối phổ Phổ khối lượng song song cho phép xác nhận chất sửa đổi mà để xác định vị trí peptid Khối phổ đóng vai trò quan trọng tổng hợp hóa học đặc biệt cho phân tích cấu trúc thư viện peptid Các thư viện thường chứa số lượng lớn mẫu nhiều trường hợp phức tạp Thật vậy, thư viện peptid dựa tổng hợp pha rắn thường chứa hàng triệu hợp chất Kiểm sốt tổng hợp đòi hỏi kỹ thuật phân tích nhanh đáng tin cậy cung cấp thơng tin mẫu [2] Trình tự Peptid Ladder Khối phổ sử dụng để đọc toàn đoạn hoàn chỉnh thao tác đơn lẻ MALDI-TOF công cụ lựa chọn để xác định khối lượng phân tử peptid đơn giản quang phổ độ nhạy cao Phổ khối chứa ion tương ứng với loài polypeptid Sự khác biệt khối lượng đỉnh liên tiếp tương ứng với dư lượng axit amin thứ tự xuất chúng tập liệu xác định trình tự axit amin chuỗi peptid ban đầu Độ nhạy trình tự peptid bậc thang, tổng số picomol mẫu peptid, so sánh với phương pháp Edman có, với khả nhạy lớn nhiều [2] Thông tin cấu trúc phức hợp protein khơng cộng hóa trị Tridimensional Khối phổ đặc biệt ESI sử dụng cho việc nghiên cứu tương tác không cộng hóa trị protein Thật vậy, ESI phương pháp ion hóa thích hợp quan sát phức hợp khơng cộng hóa trị protein hình thành dung dịch chuyển pha khí [2] 4.2 Oligonucleotid Oligonucleotid đặt tên axit nucleic (DNA RNA), polyme tuyến tính nucleotid Các nucleotid bao gồm sở dị vòng, đường nhóm phosphat Có năm nhóm khác Cytosine (C), thymine (T) uracil (U) sở pyrimidin adenin (A) guanin sở purin Cả DNA RNA không khác với thành phần chúng (ACGT cho DNA ACGU cho RNA) mà chất phần đường (2’ -deoxy-D-ribose DNA D-ribose RNA) Các nucleosid deoxynucleosid hình thành cách gắn kết vị trí N-9 purin N-1 vị trí pyrimidin với C-1’ ribo deoxyribo tương ứng Khối phổ khối đóng vai trò quan trọng việc làm bật sửa đổi xác định cấu trúc vị trí chúng oligonucleotid Khối phổ khơng cho phép xác định xác trọng lượng phân tử oligonucleotid mà định trình tự chúng theo cách trực tiếp gián tiếp [2] 4.2.1 Khối phổ Oligonucleotid Trong nhiều năm, khối phổ có vai trò quan trọng phân tích axit nucleic Với đời FAB PD, oligonucleotid nhỏ bao gồm lên đến khoảng 10 đơn vị phân tích Bởi axit nucleic phức tạp chất sinh học, chúng hưởng lợi nhiều từ đời ESI MALDI phương pháp cho phép phân tích lượng oligonucleotid nhỏ, vài chục femtomol Tuy nhiên, oligonucleotid khơng dễ phân tích peptid protein Do hình thành liên kết mạnh nhóm phosphodiester gun tử kim loại kiềm, chủ yếu Na K, dẫn đến hình thành cấu trúc chứa nhiều nguyên tử Các oligonucleotid phát tốt chế độ ion âm, ion quan sát có cơng thức chung (M [n + m] H + mNa / K) n− Sự phân bố ion phân tử vài giá trị khối lượng dẫn đến giảm tỷ số tín hiệu nhiễu Việc tách ion riêng lẻ đòi hỏi độ phân giải cao Nói chung là, chúng khơng tách rời tạo đỉnh lớn Điều làm giảm độ xác khối lượng Hơn nữa, hỗn hợp chứa hợp chất có khác biệt khối lượng nhỏ khơng tách Khó khăn khắc phục cách thêm ion amoni cho mẫu Chúng thay ion kim loại kiềm cách liên kết với nhóm phosphodiester, giai đoạn khí amoniac giải phóng, để lại oligonucleotid tự Khó khăn thứ hai phân tích oligonucleotid phân mảnh dễ dàng chúng.Ccác oligonucleotid có xu hướng đơn vị nucleic chúng chế loại bỏ 1,2 Sự phân mảnh chuỗi hạt nhân 5’ 3’ xảy Vấn đề ổn định quan trọng MALDI phân tích ESI [2] Oligonucleotide phân tích hai chế độ ion dương âm Tuy nhiên, chế độ ion âm cho độ nhạy độ phân giải tốt hơn, đặc biệt ESI Phổ MALDI bị chi phối ion phân giải (M + H) + deprotonated (M - H) - loài phân tử Sự thành cơng phân tích oligonucleotid phụ thuộc nhiều vào lựa chọn ma trận chuẩn bị mẫu Một cải tiến lớn dẫn đến việc giới thiệu ma trận cụ thể cho oligonucleotid Một ví dụ 3-hydroxypicolinic axit Một số cách chuẩn bị mẫu áp dụng, với mục tiêu chủ yếu loại bỏ nhiễu từ ion kim loại kiềm phổ biến: kết hợp việc sử dụng cột trao đổi cation để thay ion kim loại kiềm amoni bổ sung số muối amoni vào mẫu Phản ứng nucleotid với MALDI phụ thuộc vào chất, kích thước thành phần tín hiệu mạnh so với tín hiệu sở khác Thymin khó tạo proton so với base khác Do đó, khó loại bỏ hơn, điều dẫn đến kết ổn định chuỗi polyme tốt RNA dễ phân tích DNA Điều xuất kết từ thực tế loại bỏ 1,2 sở xảy với deoxyribo; diện nhóm -hydroxyl RNA cản trở phản ứng loại bỏ.Khi kích thước nucleotid tăng, trở nên khó khăn để ion hóa phát Hơn nữa, hình thành adducts tăng lên phản ứng phân mảnh tăng lên Những kiện giải thích oligonucleotid lớn phát với tỷ số tín hiệu nhiễu thấp độ phân giải thấp hơn, tín hiệu bị triệt tiêu hoàn toàn Sai số khối lượng phân tử đo MALDI từ 0,01 đến 0,05% cho oligonucleotid nhỏ Sai số tăng lên 0,5% chí nhiều cho nucleotid lớn Thật vậy, khối lượng cao tín hiệu từ adducts kết từ mát đơn vị cao giải quyết, gây mở rộngđỉnh Sai số xác định trọng tâm tăng lên Người ta xem xét kích thước tối đa phân tích hợp lý MALDI khoảng 50 base cho DNA Đối với RNA 100 đơn vị phân tích thành cơng [2] 4.2.2 Sự phân mảnh Oligonucleotid Sự phân mảnh oligonucleotid pha khí vấn đề cần khắc phục để phân tích phân tử Tuy nhiên, phân mảnh sử dụng để xác định trình tự oligonucleotid Sự phân ly oligonucleotid xảy kết dư thừa lượng truyền cho phân tử q trình giải hấp/ion hóa Đây trường hợp phổ FAB oligonucleotid Phổ khối FAB chế độ âm oligonucleotid đặc trưng diện hai chuỗi ion đặc trưng chuỗi: chứa phosphat 5’ bên cạnh bên có chứa phosphat 3’ Thông thường cường độ 5’ lớn so với dòng 3’, hàng loạt ion khác khối lượng 18 Đà thấp (mất nước) 80 Da cao (bổ sung HPO3) có mặt Phổ điển hình oligonucleotid nhỏ với trình tự UGUU, đo chế độ FAB/MS, thể Hình 3.7 [2] Hình 3.7 Phổ FAB chế độ âm oligonucleotid với chuỗi UGUU [2] Sự phân mảnh nucleotid quan sát thấy phổ MALDI Trong nguyên tắc, mảnh vỡ cho phép suy luận trình tự Chỉ mảnh vỡ xảy nhanh giải hấp quan sát thấy khối phổ giá trị m/z bên phải chúng cơng cụ TOF tuyến tính Phân ly xảy sau quan sát khai thác từ nguồn bị trì hỗn sử dụng máy phân tích phản xạ Sự kết nối MALDI với máy phân tích bẫy, bẫy ion FTICR, cho phép tất mảnh vỡ phát Sự hình thành mảnh vỡ phụ thuộc vào ma trận, sức mạnh chùm tia laser trình tự oligonucleotid gửi tới phân tích [2] Sự ion hóa electrospray tạo ion ổn định loài phân tử, trừ điều kiện nguồn điều chỉnh để tạo phân ly va chạm vòi phun–khu vực skimmer.Sự phân ly nucleotid thu cách thêm lượng bên vào ion ổn định Kết hợp phân ly với MS/MS cho phép thu ion phân mảnh từ tiền thân chọn Điều cho phép phân tích oligonucleotid từ hỗn hợp ngăn chặn ion khối lượng thấp có nguồn gốc từ ma trận FAB MALDI sử dụng Với ESI, quang phổ đơn giản hóa có trạng thái chọn Số phân tích phổ khối sử dụng oligonucleotid ngày tăng MS/MS Kết thu cách ghép nối nguồn ESI MALDI với máy phân tích FTICR cách ghép nguồn ESI vào dụng cụ bốn cực [2] Hình 3.8 Các sản phẩm phân ly từ oligonucleotid [2] 4.2.3 Đặc trưng biến đổi Oligonucleotid Oligonucleotid trải qua thay đổi cộng hóa trị Đây tự nhiên tRNA rRNA chúng phản ứng với chất ngoại sinh dấu hiệu cho thấy suy giảm có tế bào Chúng sửa đổi hóa học để tạo loại thuốc Hầu tất sửa đổi kèm biến thể khối lượng, phổ khối lượng hữu ích để xác định chất chúng vị trí chuỗi Một sơ đồ phân mảnh chung vẽ dựa MS MS/MS nhiều nucleosid đo chế độ dương âm kỹ thuật ion hóa khác (EI, CI, FAB, ESI), Hình 3.9 [2] Hình 3.9 Dấu vết phân ly FAB / MS / MS N 6-isopentenyladenosin (25 ng) chứa hydrolyzat chƣa đƣợc lọc hóa E.coli tRNATyr [2] Kết phân mảnh phong phú từ phân cắt liên kết nucleobase đường Biết sơ đồ phân mảnh sử dụng MS/MS, phát xác định cấu trúc nucleosid biến đổi trực tiếp hỗn hợp nucleosid thu enzym tiêu hóa thủy phân, mà khơng có phân tách trước [2] 4.2.4 Các ứng dụng phổ khối Oligonucleotid Ứng dụng phổ khối đơn giản phổ biến xác định xác trọng lượng phân tử để xác minh có mặt oligonucleotid trình tự cho, dự đoán mong muốn Điều đặc biệt áp dụng cho tổng hợp oligonucleotid oligonucleotid sản xuất kỹ thuật sinh học phân tử, chẳng hạn phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Việc sử dụng oligonucleotid sản xuất với tổng hợp tự động trở nên nhiều thường xuyên Tuy nhiên, oligonucleotid tổng hợp bị lẫn tạp đáng kể hoặc, trình tự chúng khác với mong đợi phản ứng depurination, nhóm bảo vệ khơng bị loại bỏ,… tổng hợp tự động tăng cường đáng kể mức độ tự tin cho oligonucleotid tạo Thật vậy, xác định xác trọng lượng phân tử oligonucleotid sản xuất khơng cho phép xác nhận trình tự mong đợi mà, trường hợp khuyết tật, cho phép xác định sửa đổi xảy chất chất gây nhiễu Một lợi quan trọng phổ khối lượng so với kỹ thuật khác điện di sắc ký tốc độ cao Ví dụ, kết hợp MALDI/TOF với chuẩn bị tự động mẫu, với việc mua lại quang phổ tự động, cho phép phân tích 100 oligonucleotide 90 phút [2] Một ưu điểm quan trọng khác phổ khối khả xác định kết hợp nucleotid sửa đổi Hiển thị phổ khối oligonucleotid tổng hợp có khối lượng lý thuyết 5838 Da Ngoài nucleotid mong muốn, hợp chất khác có mặt Chênh lệch khối lượng đỉnh (111–151 Da) tương ứng với khối lượng bazơ nucleic Điều cho thấy phản ứng depurination có xảy q trình tổng hợp Xác định kích thước trọng lượng phân tử axit nucleic quan trọng phân tử sinh học Tầm quan trọng tăng lên nhờ đời PCR, cho phép tác nhân xác định (ví dụ: vi khuẩn gây bệnh) liên kết di truyền cá nhân cho phép dự đoán chẩn đoán bệnh [2] 4.3 Oligosaccharid Oligosaccharid phân tử hình thành kết hợp số monosaccharid liên kết với thông qua liên kết glycosid Việc xác định cấu trúc hồn chỉnh oligosaccharid khó khăn so với protein oligonucleotid u cầu xác định đặc tính bổ sung chất đồng phân monosaccharid khả tạo thành tuyến tính oligosaccharid phân nhánh Việc biết cấu trúc oligosaccharid không đòi hỏi xác định trình tự monosaccharid mơ hình phân nhánh nó, mà vị trí đồng phân cấu hình anomeric liên kết glycosidic Hơn nữa, monosaccharid dạng cyclic chúng có đồng phân pyran/furan Việc xác định tất thông tin cấu trúc thu phép đo phổ khối, đòi hỏi việc sử dụng kỹ thuật khác [2] 4.3.1 Khối phổ Oligosaccharid Việc sử dụng phổ khối để mô tả đặc tính oligosaccharid khơng phải Thật vậy, GC/MS sử dụng nhiều thập kỷ để xác định monosaccharid oligosaccharid Việc sử dụng GC/MS cần tạo dẫn xuất trước phân tử cách methyl hóa, acetyl hóa trimethylsilylation Ngày nay, GC/MS phương pháp lựa chọn để xác định thành phần monosaccharid oligosaccharid sử dụng rộng rãi Phân tích bắt đầu với thủy phân thẩm tách oligosaccharid thành monosaccharid, sau dẫn xuất (chủ yếu trimethylsilylation) phân tích GC/MS Monosaccharid nhận dạng dựa so sánh thời gian lưu giữ mẫu phân mảnh với tài liệu tham khảo GC/MS sử dụng chủ yếu phân tích methyl hóa, cho phép xác định vị trí liên kết glycosidic oligosaccharid Permethylation oligosaccharid thực trước thủy phân Sau đó, monosaccharid methyl hóa phần peracetyl hóa, tạo phần methyl hóa alditol acetates (PMAA) Phân tích phân tử GC/MS, sở giải thích đơn giản phân mảnh, vị trí glycosidic trước xác định Phân tích khối phổ oligosaccharid khơng thủy phân bắt đầu với kỹ thuật ion hóa FAB phát triển với ESI MALDI ESI không hiệu oligosaccharid tự nhiên MALDI Thật vậy, oligosaccharid tự nhiên khơng chứa nhóm có tính axit bản, khơng dễ bị ion hóa ESI Phản ứng cho oligosaccharid yếu so với peptid protein Tuy nhiên, oligosaccharid có chứa phosphoryl hóa, sulfated sialicacid ion hóa tốt ESI chế độ ion âm Nói chung, oligosaccharid phân tích ESI sau dẫn xuất, cách methyl hóa acetyl hóa Sự khử amin nhóm aldehyd ketone sử dụng Permethyl hóa ưu tiên cho dẫn xuất gia tăng khối lượng kết thấp oligosaccharid lớn phân tích Dẫn xuất khơng cải thiện tín hiệu mang lại nhiều thơng tin cấu trúc hơn, đặc biệt với MS/MS [2] 4.3.2 Phân mảnh Oligosaccharid Bởi phương pháp ion hóa sử dụng cho oligosaccharid tạo vài mảnh, phân ly va chạm gây (CID) phân rã sau nguồn (PSD) phải sử dụng cho xác định cấu trúc Hai kỹ thuật áp dụng cho ion phân tử bị hủy hoại, proton alkali hóa từ oligosaccharid có nguồn gốc dẫn xuất FAB, ESI MALDI Sự phân mảnh oligosaccharid bị ảnh hưởng mạnh số lượng lớn yếu tố, chẳng hạn phương pháp ion hóa, máy phân tích, chất đạo hàm, chất lồi phân tử, … Tuy nhiên, quan sát năm loại ion phân đoạn Như hiển thị phổ trình bày Hình 3.10 hai dãy ion đầu tiên, thường phong phú, đến từ phân cắt liên kết glycosidic [2] Hình 3.10 Dấu vết phân ly ESI/MS/MS thêm phụ gia natri maltoheptulose methyl hóa (m / z = 760,7) [2] Vì vậy, chúng chứa giảm khơng giảm kết thúc hai mảnh vỡ này, cách trải qua phân cắt liên kết glycosidic thứ hai, dẫn đến loạt ion thứ ba gọi mảnh bên Chúng không chứa hai termini ban đầu (phân cắt hai đầu) Hai dãy ion cuối cùng, thường hơn, phân cắt kép vòng glycosidic Các mảnh giữ lại điện tích phía khơng giảm gọi A, B C, mảnh giữ lại điện tích phía giảm gọi X, Y Z, tùy thuộc vào việc họ cắt vòng liên kết glycosidic Nói chung, MS/MS cho phép xác định trình tự mơ hình phân nhánh oligosaccharid Vị trí đồng phân liên kết glycosidic chúng xác định Mặt khác, cấu hình anomeric liên kết glycosidic phân biệt monosaccharid với diastereoisomeric xác địnhbằng kỹ thuật [2] 4.4 Lipid Lipid tạo thành từ nhiều lớp phân tử khác nhau, tất thể độ hòa tan tính chất dung mơi hữu Khối phổ khối đóng vai trò quan trọng q trình sinh hóa chất béo Thật vậy, phổ khối khơng cho phép phát xác định cấu trúc phân tử mà định lượng chúng Thực tế, axit béo, acylglycerol axit mật nêu đây, loại chất béo khác phospholipid, steroid, prostaglandin, ceramid, sphingolipid leukotrien phân tích thành cơng khối phổ Hơn nữa, phương pháp mô tả giới hạn phương pháp dựa phổ khối, phần lớn phương pháp thường ghép đôi trực tiếp gián tiếp với kỹ thuật tách GC HPLC [2] 4.4.1 Acid béo Axid béo nhóm phân tử tạo thành từ chuỗi hydrocarbon dài, độ dài thay đổi mức độ khơng bão hòa khác nhau, kết thúc nhóm cacboxylic Một số sinh vật vi khuẩn, bọt biển số loại thực vật sản xuất axid béo biến đổi: nhánh; có vòng cyclopropan, cyclopropen epoxy; hydroxyl hóa alkoxyl hóa; chí khơng bão hòa bất thường Phương pháp phân tích cổ điển bao gồm chiết xuất chất béo từ vật liệu sinh học sau mơ tả axid béo tinh khiết trước cách so sánh chúng với axid béo tham chiếu, phân tích cách sử dụng loạt phương pháp quang phổ Nhiều kỹ thuật sắc ký, bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), HPLC GC, sử dụng trình lọc Bởi axid béo có nguồn gốc từ nguồn tự nhiên có mặt hỗn hợp, phương pháp phân tích lý tưởng cho phân tử nên áp dụng cho hỗn hợp mà không yêu cầu tách dẫn xuất Khối phổ công cụ tuyệt vời để xác định cấu trúc axid béo có hỗn hợp Có thể xác định khơng trọng lượng phân tử thành phần nguyên tố mà chất vị trí nhánh nhóm khác chuỗi carbon hầu hết trường hợp Hơn nữa, phân tích đòi hỏi khối lượng thấp từ 10 pg đến 100 ng lipid, tùy thuộc vào mẫu phân tích, phương pháp ion hóa sử dụng Phương pháp phân tích chung cho axid béo dựa lượng quang phổ cao anion carboxylat Thật vậy, FAB, ion hóa hóa học giải hấp (DCI), ESI quang phổ hóa học áp suất khí (APCI) đo chế độ âm đặc trưng diện loại ion phân tử đồng vị chúng vắng mặt mảnh Đặc điểm sử dụng để tạo thuận lợi cho xác định khối lượng phân tử axid béo chúng có mặt phức hợp hỗn hợp, khơng cung cấp thơng tin liên quan đến cấu trúc Sự bất tiện khắc phục cách chuyển lượng dư thừa cần thiết để phân mảnh thành ion ổn định sản xuất q trình ion hóa cách sử dụng MS/MS Những mảnh vỡ tương ứng đến alkan: CH4, C2H6, , CnH2n + Chúng tạo chế loại trừ cụ thể 1,4 phân tử hydro,như Hình 3.11 [2] Hình 3.11 Cơ chế loại trừ 1,4 H2 xảy dọc theo chuỗi axid béo để số lƣợng mảnh tƣơng ứng với alken [2] Sự CnH2n + bắt đầu đầu cuối alkyl tiến triển dọc theo chuỗi hydrocacbon Trong trường hợp axit béo bão hòa, phong phú mảnh tạo phổ đặc trưng Hình 3.12 Hình 3.12 Dấu vết phân ly FAB/MS/MS axid octadecanoic thu đƣợc chế độ ion âm lƣợng cao [2] Sự diện phân nhánh chuỗi hydrocacbon biểu thị cạnh tranh phân mảnh điểm phân nhánh cách nhấn mạnh phân mảnh liên kết tiếp giáp với nhánh phía alkyl Vì vậy, phổ axid béo phân nhánh đặc trưng tín hiệu kép hai-metylen, tức hai đỉnh dãy phân cách Sự diện khơng bão hòa axid béo định vị trí thiết lập vắng mặt mảnh có nguồn gốc từ phân tách liên kết khơng bão hòa yếu tố liền kề Các biến đổi khác chuỗi hydrocarbon axit béo, chẳng hạn hydroxyl hóa có thêm vòng cyclopropan, cyclopropen epoxy, xác định định vị theo phương pháp MS / MS lượng cao áp dụng cho (M + Li) + (M - H + 2Li) + tương ứng với axit béo phân loại Li + (được ưu tiên kim loại kiềm khác chúng liên kết chặt chẽ với nhóm cacboxylic) cho kết so sánh với kết thu chế độ ion âm [2] 4.4.2 Acylglycerol Acylglycerol este axit béo glycerol Bởi –OH glycerol este hóa, phân tử chứa một, hai ba axid béo, gọi mono-, dior triacylglycerol, tương ứng Đặc tính phân tử acylglycerol khơng u cầu xác định axit béo thành phần mà vị trí chúng phân tử glycerol (đồng phân vị trí) Để xác định vị trí axid béo thành phần khác acylglycerol, không phương pháp đơn giản mà không sử dụng phổ khối, tiến phân tích acylglycerol vài năm qua sử dụng GC có độ phân giải cao HPLC pha đảo Phương pháp sử dụng thường xuyên bao gồm điều chế acylglycerol tinh khiết lipase đặc biệt tách liên kết ester vị trí trung tâm sau mơ tả đặc tính axid béo giải phóng Rõ ràng việc xác định acylglycerol hoàn toàn sử dụng phương pháp cổ điển tốn thới gian, khó khăn đòi hỏi số lượng mẫu lớn Hiện nay, phổ khối lượng cho phép phân tích acylglycerol cách xác định axid béo thành phần khác vị trí chúng glycerol mà không cần tách trước sắc ký Số lượng mẫu sử dụng phổ khối phân tích khoảng picomol Các kỹ thuật ion hóa khác nhau, chẳng hạn EI, CI, DCI, PD, FAB, APCI ESI, sử dụng thành cơng Nhìn chung, phổ acylglycerol thu chế độ dương tính chứa ion chiếm ưu thế, ngồi ion phân tử M + + EI ion phân tử (M + H) +, (M + Na) + (M + NH4) + trường hợp kỹ thuật ion hóa khác, ion phát từ mát acyloxy nhóm có mặt phân tử, có nhóm (M - RnCOO)+ acylium tương ứng ion, có nhãn (RnCO)+ Các ion gắn nhóm (M - RnCOO)+ gọi 'Các ion loại diglycerid' Trong chế độ âm, ion chiếm ưu phân tử ion loại (M - H)- ion tương ứng với axid béo có mặt, có nhóm (RnCOO)-, Hình 3.13 Tầm quan trọng tương đối ion khác phụ thuộc kỹ thuật ion hóa sử dụng Ví dụ, chế độ dương, cường độ ion phân tử yếu EI FAB mạnh CI DCI, có ion ESI [2] Hình 3.13 Sơ đồ phân mảnh chung acylglycerol [2] Các kết thu phổ ion CID/MS/MS triacylglycerol ion dương độc lập với loại tiền thân chọn chế độ ion hóa sử dụng để thu ion tiền thân [2] 4.4.3 Axid mật Axid mật nhóm phân tử có nguồn gốc từ cholesterol Chúng đặc trưng vòng steroid gồm bốn vòng mang chuỗi bên gắn vào C-17 nguyên tử cacbon kết thúc nhóm cacboxylic Chúng khác số lượng vị trí nhóm hydroxyl ceto Hơn nữa, axit mật tồn axit cacboxylic tự liên hợp amit nhóm cacboxylic với glycin (NH2CH2CO2H) taurin (NH2CH2CH2SO3H) Khối phổ trở thành phương pháp thiếu để phân tích axit mật sức mạnh để xác định cấu trúc định lượng axit mật tự liên hợp, tinh khiết hỗn hợp Nó hữu ích khơng để nghiên cứu trao đổi chất axid mật mà phát chẩn đốn bệnh chuyển hóa Sự xuất kỹ thuật ion hóa FAB, thermospray (TSP), APCI ESI, kết hợp với MS/MS, đơn giản hóa đáng kể phân tích Trên số lượng mẫu nhỏ hơn, axid mật phân tích mà khơng cần phân tách tạo dẫn xuất trước Nói chung, phổ ESI đơn giản phổ FAB TSP Phân tích axid mật tự liên hợp MS/MS lượng cao cho phép quan sát ion phân đoạn từ xa (CRF) vòng steroid mặt bên chuỗi Các đồng phân tạo phổ tương tự không phân biệt chúng hỗn hợp Nhưng CRF cung cấp thông tin chất vị trí chất thay vòng steroid Vị trí liên kết đơi suy diện mảnh cụ thể Sơ đồ phân mảnh chung suy luận từ phổ thể hình 3.14 [2] Hình 3.14 Sơ đồ phân mảnh tổng hợp taurine 4-cholenoic liên hợp [2] Biết sơ đồ phân mảnh axid mật, tức cấu trúc đoạn sản xuất, cho phép người ta xác định cấu trúc hồn chỉnh phân tử Ví dụ: khối lượng mảnh A B cho biết diện vắng mặt nhóm hydroxyl vị trí C-12 Tính hữu ích MS/MS lượng thấp thể chẩn đoán bệnh chuyển hóa cách phân tích axit mật liên hợp hay không, mẫu sinh học phức tạp nước tiểu huyết 4.5 Metabolomic Metabolomic khoa học trao đổi chất Thuật ngữ định nghĩa tương tự với genomic, transcriptomic proteomic Chất chuyển hóa định nghĩa hồn chỉnh phân tử nhỏ (hợp chất khơng phải polymer với trọng lượng phân tử thấp khoảng 1000 Da) có liên quan đến phản ứng trao đổi chất chung sinh tổng hợp tế bào, mô sinh vật Các hợp chất khối lượng cao thường polyme định danh có hệ thống chúng gọi theo loại hợp chất, chẳng hạn ‘glycome’ chẳng hạn Metabolomic nghiên cứu bao gồm việc xác định định lượng chất chuyển hóa tập hợp điều kiện định Nó nghiên cứu thay đổi động chất chuyển hóa [2] 4.5.1 Phổ khối Metabolomic Đối với proteome phổ khối có vai trò trung tâm giúp xác định trình tự protein nhanh chóng với số lượng mẫu thấp Nhưng kiến thức gen, transcriptome proteome không tiết lộ kiểu hình hệ thống sống, khó khơng thể thiết lập liên kết trực tiếp protein hoạt tính enzym nó, chất chuyển hóa sản xuất Hầu khơng có cách để dự đoán chất chất chuyển hóa enzym chưa biết có tổng số trình tự biết Việc làm sáng tỏ chất chuyển hóa đặc biệt khó khăn tính chất hóa học đa dạng phân tử nhỏ Phổ khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) kỹ thuật sử dụng rộng rãi cho phân tích chuyển hóa, kỹ thuật khác bao gồm phát mảng điện hóa sử dụng NMR đo đồng thời tất loại phân tử nhỏ từ chất chuyển hóa Hơn nữa, mẫu phục hồi để phân tích thêm Tuy nhiên, NMR có hạn chế đáng kể độ nhạy Do đó, áp dụng cho hợp chất có nồng độ cao khơng thể sử dụng để phân tích nhiều nồng độ thấp So với NMR, khối phổ nhạy sử dụng cho hợp chất có nồng độ thấp Mặc dù dễ dàng đo lường picomol hợp chất, giới hạn phát mức độ attomol đạt Khối phổ có khả xác định hợp chất thông qua việc làm sáng tỏ cấu trúc hóa học chúng MS/MS xác định khối lượng xác chúng Điều với cho hợp chất 500 Da, giới hạn khối phổ độ phân giải cao xác định rõ ràng thành phần nguyên tố [2] 4.5.2 Ứng dụng Metabolomic lên kỹ thuật hữu ích lĩnh vực đa dạng chẩn đốn lâm sàng, khám phá thuốc hóa sinh thực vật Trong làm sáng tỏ tất phân tử nhỏ tế bào, mô sinh vật mục tiêu quan trọng, 'các chất chuyển hóa vi phân' mang lại kết thú vị thơng qua so sánh chất chuyển hóa tham chiếu mẫu giống sau sửa đổi, loại thuốc, biến đổi di truyền, bệnh, căng thẳng Mặt khác, người ta biết chất chuyển hóa sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp dược phẩm, khác biệt metablome sinh vật ảnh hưởng loại thuốc lợi ích tối thượng Điều cung cấp thông tin không chất chuyển hóa thuốc, mà chủ yếu tác động thuốc đường sinh học Metabolomics quan trọng giai đoạn trình phát triển thuốc Bằng cách đo xác chất chuyển hóa thay đổi bệnh nhân khỏe mạnh bệnh nhân, hợp chất sinh học bệnh khác xác định trở thành chẩn đốn cho bệnh Bằng cách ánh xạ thay đổi cho đường trao đổi chất biết, enzymechịu trách nhiệm cho thay đổi suy luận đó, enzym có vai trò quan trọng bệnh xác định Sau chiết xuất hoàn toàn từ mơ này, hỗn hợp lần phân tích HPLC/ESI/MS chế độ ion dương âm Xác định mô tả hợp chất chưa biết đo khối lượng xác MS/MS [2] III KẾT LUẬN Việc xác định trọng lượng phân tử phép đo sử dụng để mơ tả đặc tính chất cao phân tử sinh học Tính đến cuối năm 1970, kỹ thuật cung cấp thông tin phương pháp điện di, sắc ký siêu ly tâm Kết thường khơng xác (sai số trung bình 10-100% ) chúng phụ thuộc vào đặc điểm khác với trọng lượng phân tử, chẳng hạn cấu tạo, bán kính Stokes tính kỵ nước Do đó, cách biết trọng lượng phân tử xác đại phân tử tính tốn dựa cấu trúc hóa học Vào thời điểm đó, kỹ thuật ion hóa phổ khối bắn phá electron (EI) ion hóa hóa học (CI) yêu cầu phân tử phân tích có mặt pha khí thích hợp cho hợp chất dễ bay Hơn nữa, phương pháp ion hóa trường hấp phụ (FD) cho phép ion hóa phân tử khơng bay với khối lượng lên đến 5000 Da, kỹ thuật phức tạp yêu cầu người sử dụng phải có kinh nghiệm Điều hạn chế đáng kể lĩnh vực ứng dụng phổ khối phân tử sinh học khơng bay khích thước lớn [2] Sự phát triển phương pháp ion hóa giải hấp dựa phát xạ ion từ trước từ chất lỏng bề mặt rắn, chẳng hạn giải hấp plasma (PD), bắn phá nguyên tử nhanh (FAB) giải hấp laser (LD), cho phép bước đột phá cho phổ khối lĩnh vực phân tích sinh học phân tử Vào đầu năm 1990, hai phương pháp ion hóa mới, ion hóa phun điện (ESI) hấp phụ / ion hóa laser hỗ trợ ma trận (MALDI) kết hợp với phận phân tích khối thời gian bay (TOF) phát triển tiếp tục cách mạng hóa vai trò khối phổ nghiên cứu sinh học Những phương pháp cho phép phân tích phân tử sinh học có trọng lượng phân tử cao với độ xác cao [2] TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ashvin B Padhiyar (2010), Introduction: Important Biomolecules, Sardar Patel University, p [2] Edmond de Hoffmann and Vincent Stroobant (2007), Mass Spectrometry: Principles and Applications, Third Edition, John Wiley & Sons Ltd, pp 305-391 [3] H.J Fromm and M.S Hargrove (2012), Essentials of Biochemistry, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp 5-33 [4] Hội phòng thử nghiệm Việt Nam-Vinalab, Sự đổi phương pháp khối phổ (MS), http://www.vinalab.org.vn/news/1108_3314/su-doi-moi-trong-phuong-phap-khoipho-ms.html (15/05/2015) [5] Kenneth L Busch (2003), Mass Spectrometry, Kennesaw State University, pp 145-146 [6] Peter M van Galen and Martin C Feiters (2016), Mass Spectrometry part of the Instrumental Analysis in (Bio)Molecular Chemistry, Institute for Molecules and Materials ... vai trò quan trọng chuyển hóa lượng, coenzym, chuyển hóa trung gian Nucleotid bao gồm base nitơ, đường nhóm phosphoryl Loại bỏ nhóm phosphoryl hợp chất gọi nucleosid Có hai loại base tìm thấy nucleotid... chất béo, phân tử sinh học hòa tan dung mơi hữu khơng hòa tan dung dịch nước Chúng đóng vai trò thiết yếu màng sinh học Tất bào quan từ ty thể đến hạt nhân bao quanh màng lipid Chúng đóng vai... hình thành dung dịch chuyển pha khí [2] 4.2 Oligonucleotid Oligonucleotid đặt tên axit nucleic (DNA RNA), polyme tuyến tính nucleotid Các nucleotid bao gồm sở dị vòng, đường nhóm phosphat Có