Báo cáo Chất chống oxy hóa nguồn gốc tự nhiên

15 136 0
Báo cáo Chất chống oxy hóa nguồn gốc tự nhiên

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO BÁO CÁO HẾT MƠN CÁC CHẤT CHỐNG OXY HĨA NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƢỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR) TRÌ KIM NGỌC Chuyên ngành: Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền Mã số:60720406 Khóa 2016-2018 TP HCM, 05/2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO BÁO CÁO HẾT MƠN CÁC CHẤT CHỐNG OXY HĨA NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƢỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR) Chuyên ngành: Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền Mã số:60720406 Khóa 2016-2018 Thầy hƣớng dẫn: PGS.Ts Trần Hùng Học viên : Trì Kim Ngọc TP HCM, 05/2017 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU Phần 1: TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƢỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR) 1.1 Giới thiệu 1.2 Mô tả phương pháp 1.2.1 Nguyên tắc 1.2.2 Cơ chế 1.2.3 Thiết bị, dụng cụ 1.2.4 Chuẩn bị mẫu 1.2.5 Cài đặt máy đo phổ 1.2.6 Đo giá trị g 1.3 Ưu điểm 1.4 Nhược điểm cách khắc phục Phần 2: ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƢỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR) TRONG PHÂN TÍCH DƢỢC LIỆU 2.1 Xác định hoạt tính chống oxy hoá quang phổ cộng hưởng spin electron 2.1.1 Giới thiệu 2.1.2 Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu 2.2.3 Kết 2.2 Xác định hoạt động thu dọn gốc tự chất chống oxy hóa từ dịch chiết hạt nho Quang phổ cộng hưởng điện tử Spin với hệ H2O2 / NaOH / DMSO 2.2.1 Giới thiệu 2.2.2 Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu 2.2.3 Quy trình thí nghiệm 10 2.2.4 Kết 11 2.3 Quang phổ cộng hưởng điện tử nghiên cứu hoạt động thu dọn gốc tự anthocyanin pyranoanthocyanin có rượu vang 12 2.3.1 Giới thiệu 12 2.3.2 Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu 12 2.3.3 Kết 13 MỞ ĐẦU Trong lĩnh vực sức khỏe nay, nói đến nhiều tác hại chất oxy hoá, phản ứng oxy hoá nhấn mạnh cần thiết sử dụng chất chống oxy hố để bảo vệ, trì sức khỏe Nhiều hoạt chất chứng minh có tác dụng chống oxy hóa tốt phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa khác Hoạt tính chống oxy hóa thường đo trực tiếp mà thông qua tác động chất chống oxy hóa q trình oxy hóa Các phương pháp đánh giá thường đa dạng, dựa chất ban đầu, chất oxy hóa, chất trung gian hay sản phẩm cuối [2] Bên cạnh phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa cổ điển, sử dụng phổ biến như:  Phương pháp peroxy hóa lipid – định lượng malonyl dialdehyd (MDA)  Phương pháp ức chế tạo thành gốc cation ABTS·+ (2,2'-azinobis-(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)  Thử nghiệm dập tắt gốc tự DPPH_ 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl  Thử nghiệm đánh giá khả khử ion sắt III (Ferric reducing antioxidant power_FRAP) Ngày phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa đại, ứng ụng máy móc, kỹ thuật cao đưa vào sử dụng Trong phạm vi báo cáo hết mơn “Các chất chống oxy hóa nguồn gốc tự nhiên”, trình bày “Thử hoạt tính chống oxy hóa phương pháp phân tích phổ cộng hưởng spin điện tử (ESR)” Bài báo cáo góp phần giới thiệu phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa mới, đại làm giảm thời gian đo, tăng độ nhạy, cải thiện độ phân giải…[5] Phần 1: TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƢỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR) 1.1 Giới thiệu Ngày nay, phổ ESR số phương pháp quan trọng để điều tra cấu trúc động lực hợp chất thuận từ (paramagnetic) Phương pháp nhạy đặt hiệu sử dụng nhiều lĩnh vực: hóa học, vật lý, sinh học, khống vật học [5] Mặc dù phương pháp xung giới thiệu quang phổ ESR khoảng thời gian với phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR phương pháp phổ nghiên cứu khoảng 30 năm trở lại Tuy nhiên, tình hình thay đổi vài năm qua Hiện quang phổ ESR lĩnh vực nghiên cứu lên phát triển nhanh chóng [5] Hiện xây dựng phổ kế ESR sử dụng thành phần chủ yếu mua thị trường Hiện khơng có phương pháp ESR mà bao gồm phương pháp xung khác nhau, kỹ thuật có tầm quan trọng đặc biệt [5] 1.2 Mô tả phƣơng pháp 1.2.1 Nguyên tắc Phổ cộng hưởng spin điện_Electron spin Resonance (ESR), gọi cộng hưởng điện tử thuận từ_ Electron paramagnetic Resonance (EPR), dựa hấp thụ xạ điện từ phạm vi vi sóng, kết chuyển tiếp mức lượng tạo từ trường electron không ghép đôi, gốc tự hữu cơ, ion tự do, trung tâm thiếu điện tử, ion kim loại thuận từ nhiều nguyên tử pha khí chứa electron khơng ghép đơi [4] 1.2.2 Cơ chế Phương pháp đo phổ ESR phát tâm thuận từ (ví dụ gốc_ radical) Các tâm thuận từ tác động chiếu xạ ảnh hưởng có mặt số hợp chất hợp khác Từ trường mạnh tạo chênh lệch mức lượng spin điện tử m = +1/2 m = -1/2 dẫn tới hấp thụ cộng hưởng chùm vi sóng sử dụng phổ kế Phổ ESR thông thường biểu thị theo vi phân bậc độ hấp thụ tương ứng với từ trường áp dụng định [1] Giá trị từ trường tần số vi sóng phụ thuộc vào việc bố trí thực nghiệm (kích thước mẫu giá chứa mẫu), tỷ lệ chúng (giá trị g) đặc tính bên tâm thuận từ tọa độ vị trí chúng [1] 1.2.3 Thiết bị, dụng cụ [1] Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 1.2.3.1 Phổ kế ESR X-Band có bán sẵn, gồm có: nam châm, cầu vi sóng, bảng điều khiển với kiểm sốt từ trường kênh tín hiệu, hốc hình trụ hình chữ nhật 1.2.3.2 Thiết bị đo giá trị G, gồm có: máy đếm tần số, đầu đo từ trường (máy đo cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)) thiết bị có lắp đo giá trị g 1.2.3.3 Các ống ESR, có đường kính khoảng 4,0 mm (ví dụ; ống thạch anh Suprasil) 1.2.3.4 Cân, xác đến mg (tùy chọn) 1.2.3.5 Tủ sấy chân khơng phòng thử nghiệm máy làm đông khô 1.2.4 Chuẩn bị mẫu Mẫu đông khô: Nếu mẫu khơng đủ khơ gây khó khăn chỉnh hốc máy đo phổ Trong trường hợp tốt nên giảm lượng mẫu sấy khô mẫu Mẫu nên sấy làm khô tủ sấy chân không 40 oC áp suất giảm dần máy làm đông khô [1] Mẫu pha lỗng dung mơi EtOH nhiệt độ phòng, đo cốc thạch anh [3] 1.2.5 Cài đặt máy đo phổ Sử dụng số thời gian tốc độ quét thích hợp tín hiệu ESR cho chiều rộng pic khoảng 0,2 mT đến 0,4 mT [1] 1.2.6 Đo giá trị g Việc đo giá trị g tín hiệu ESR hữu ích nhằm để mô tả rõ phổ ESR đặc biệt giúp cho việc nhận dạng mẫu chiếu xạ Giá trị g tín hiệu, gsignal tính cơng thức: g signal  71,448.VESR B Trong đó: VESR tần số vi sóng, đo gigahertz (GHz); B mật độ dòng từ (chế độ cài đặt từ trường cho máy đo phổ), đo militesla (mT) (10Gauss=10G=1 mT) Việc tính tốn giá trị g phổ ESR để xác định vị trí từ trường tâm phổ ESR để đo tần số v (ví dụ máy đếm tần số) từ trường B (ví dụ gaussmeter) điểm 1.3 Ƣu điểm Đây kỹ thuật phân tích phát cụ thể gốc tự hình thành tự oxy hóa q trình liên quan [2] 1.4 Nhƣợc điểm cách khắc phục Mặc dù chất nhạy cảm với gốc tự ổn định di-tert-butyl, nitroxid; ESR không đủ nhạy để phát gốc tự có thời gian tồn ngắn ngủi liên quan đến tự oxy hóa (từ 10-9 giây cho gốc hydroxyl đến vài giây gốc peroxyl thoáng qua với nồng độ 10-8 M) Nhiều kỹ thuật sử dụng để khắc phục vấn đề này, bao gồm phóng xạ xung, hệ thống dòng chảy liên tục bẫy spin Trong số bẫy spin sử dụng rộng rãi [2] Bẫy spin liên quan đến việc bổ sung vào mẫu hợp chất phản ứng với gốc tự để hình thành gốc tự gốc tồn lâu phát mà khơng gặp khó khăn ESR Bẫy spin thường hợp chất nitroso nitrones thường sử dụng hệ thống sinh học bao gồm tert-nitrosobutan (tNB), α-phenyl-tert-butylitrit (PBN), 5,5-dimetylpyrrolin-N-oxit (DMPO), tert-butylnitrosobenzen (BNB), α-(4-pyridyl-1-oxit) -N-tert-butylititron (4-POBN) 3,5-dibromo-4-nitrosobenzenesulfonic acid (DBNBS) [2] Phần 2: ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƢỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR) TRONG PHÂN TÍCH DƢỢC LIỆU 2.1 Xác định hoạt tính chống oxy hố quang phổ cộng hƣởng spin electron 2.1.1 Giới thiệu [7] Các gốc tự tạo trình thiết yếu sống, hô hấp, quang hợp phản ứng enzym Việc ổn định gốc tự trình liên tuc thể sống Tuy nhiên, chế bảo vệ tế bào bị gián đoạn, gốc tự tăng mức stress oxy hóa xảy Do hệ thống chống oxy hóa nội bào bổ sung lượng chất chống oxy hóa chế độ ăn uống Phụ gia thực phẩm chống oxy hóa tổng hợp butylat hydroxytoluen (BHT) butylated hydroxyanisol (BHA) sử dụng rộng rãi việc phòng ngừa thực phẩm bị oxy hóa kéo dài thời hạn sử dụng Gần người ta tìm thấy trái rau có khả chống oxy hóa hợp chất polyphenolic chẳng hạn flavonoid carotenoid Mặc dù lợi ích chúng, số chất chống oxy hoá tổng hợp BHT gây ung thư Các nhà sản xuất mong muốn sử dụng lựa chọn thay từ tự nhiên Do vitamin C, vitamin E, acid citric, β-caroten, chất chiết xuất thảo mộc sử dụng Tuy nhiên, tác dụng phụ nhiều chất chống oxy hóa tự nhiên hiệu chống oxy hóa tương đối chưa biết đầy đủ Hoạt động gốc tự xác định chắn thực nghiệm với phương pháp cộng hưởng spin electron (ESR) Việc đánh giá chất dinh dưỡng liên quan đến hoạt động chống oxy hố giúp biết chế độ ăn có vai trò điều chỉnh hạn chế bệnh lý liên quan tới stress oxy hóa Quang phổ ESR kỹ thuật phân tích có khả bẫy nghiên cứu gốc tự Mục tiêu nghiên cứu sử dụng quang phổ ESR để cung cấp dấu hiệu bán định lượng hoạt tính chống oxy hóa năm hợp chất chống oxy hóa biết đến 2.1.2 Nguyên liệu, phƣơng pháp nghiên cứu [7] Một hệ thống mơ hình phát triển OH· dược giải phóng từ phản ứng Fenton q trình oxy hóa Chất chống oxy hóa catechin, acid caffeic, 6,7-dihydroxy-4-methylcoumarin, o-coumarin scopoletin nồng độ dải 0-4.8 mM trộn lẫn với bẫy spin N-tertbutyl-a-phenylnitrone (PBN) Chúng hoạt động tác nhân thu nhặt OH· cạnh tranh với PBN sau: Fe2+ + H2O2  Fe3+ + OH- + OH· PBN + OH·  PBN-OH + H2O Chất chống oxy hóa + OH·  Chất chống oxy hóa-OH + H2O Khi chất chống oxy hóa cạnh tranh thành cơng vớii bẫy spin OH·, cường độ tín hiệu ESR giảm số lượng Trong thí nghiệm này, cường độ tín hiệu ESR phản ứng cạnh tranh đo với mẫu MnO / CaO làm chất chuẩn nội Dùng phương pháp lặp lại để đo spin tương đối hiệu tương đối chất chống oxy hóa xác định bẫy spin Chuẩn bị: Các hợp chất hòa tan dimethyl sulphoxid (DMSO) Các hỗn hợp sử dụng cho quang phổ ESR chất chống oxy hoá điều chế sau: 0.5 ml PBN (Dung tích 50 mM) trộn với 0,2 ml FeSO4 (1 mM) Pha dải nồng độ 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 1.0 ml dung dịch chống oxy hóa 10 mM với DMSO Thêm 0.5 ml H2O2 (100%) lắc 10 giây Sau ủ 40 °C 30 phút bồn nước Các phản ứng dừng lại cách đặt mẫu nước đá Sau 50 µl dung dịch đưa vào ống kính mỏng (đường kính 1mm) ghi lại phổ ESR quang phổ kế Bruker ER200D-SRC điều kiện sau: Tần số vi sóng: 9,78 GHz; Điện vi sóng: 13dB; biên độ giảm dần 0.5 G tần số 100kHz; Từ trường thu được: 1,25x105; độ rộng từ trường: 50G; thời gian quét: 100 giây với thời gian số 100 ms nhiệt độ phòng 2.2.3 Kết [7] Chiều cao tín hiệu cường độ (trong trường hợp khơng có chất chống oxy hóa) xem 100% cường độ tín hiệu phần trăm tính tốn giảm tới 80% so với chiều cao cường độ tín hiệu ESR tối đa với năm chất chống oxy hóa nồng độ 4.8 mM Khả bảo vệ tương đối chống lại OH· thể việc giảm tỷ lệ phần trăm chiều cao cường độ tín hiệu ESR năm hợp chất thử nghiệm nồng độ mol (4.8 mM) thể bảng Bảng Ảnh hưởng chất chống oxy hóa lên độ cao cường độ tín hiệu ESR Chất chống oxy hóa (4.8mM) Phần trăm kiểm sốt tín hiệu ESR Axit Caffeic O-coumarin 13 6,7-Dihydroxy-4-metylcoumarin 18 Catechin 19 Scopoletin 112 So sánh khả bảo vệ chúng cho thấy thứ tự hiệu lực là: axit caffeic> O-coumarin> 6,7-dihydroxy-4-methylcummarin>Catechin> scopoletin Ngoài ra, quan sát thấy số phân tử nồng độ thấp (dưới 3,6mM) có scopoletin cho cường độ tín hiệu ESR cao cường độ tín hiệu mức kiểm sốt Điều có nguồn bổ sung gốc tự OH· Những OH· bổ sung bắt nguồn từ phản ứng scopoletin với ion Fe2+ Kết luận ESR kỹ thuật phân tích hữu ích để bán định lượng hoạt động chống oxy hóa cho đa dạng hợp chất, cung cấp thông tin liên quan đến hoạt động chống oxy hóa 2.2 Xác định hoạt động thu dọn gốc tự chất chống oxy hóa từ dịch chiết hạt nho Quang phổ cộng hƣởng điện tử Spin với hệ H2O2 / NaOH / DMSO 2.2.1 Giới thiệu [8] Trong năm gần đây, người ta cho phản ứng oxy hóa đóng vai trò quan trọng nhiều bệnh ung thư, xơ cứng động mạch, loét dày, bệnh khác Để ngăn ngừa bệnh này, chất chống oxy hố nhóm polyphenol trà rượu vang đỏ đề cập nhiều Đặc biệt, polyphenol từ rượu vang đỏ làm giảm nguy bệnh tim mạch xơ cứng động mạch nghiên cứu dịch tễ học Renaud De Lorgeril năm 1992 Dịch chiết ethanol từ hạt nho giàu hợp chất nhóm polyphenol (proanthocyanidin) Các hiệu ứng thu hẹp gốc tự hình thành trong hệ H2O2 / NaOH / DMSO chiết xuất hạt nho kiểm tra phương pháp cộng hưởng điện tử bẫy spin (ESR) so sánh với chất chống oxy hoá tự nhiên khác như: acid ascorbic, dl-α tocopherol, β-caroten 2.2.2 Nguyên liệu, phƣơng pháp nghiên cứu [8] Hóa chất DMPO thu từ Công ty LABOTEC (Tokyo, Nhật Bản) Chất đối chiếu mua từ Aldrich Chemical Co (Milwaukee, WI) Các hóa chất khác mua từ Wako Pure Chemicals Ltd (Osaka, Nhật Bản) Chuẩn bị dịch chiết hạt Nho Nho (Vitis vinifera) lấy từ Kikkoman Corp (Tokyo) Dịch chiết chiết xuất từ hạt Nho dung dịch etanol 20% Phân tích hàm lƣợng thành phần dịch chiết hạt Nho Thành phần % Proanthocyanidin 38.7 Flavanol đơn 2.40 Độ ẩm (bằng phương pháp Karl Fischer) 2.10 Protein thơ (tổng N × 6.25) 3.70 Chất béo (phương pháp chiết Soxhlet) Chất xơ Tro 5.00 Glucose 7.79 Fructose 8.85 Đường khác 2.66 Acid hữu 11.60 Acid khác 5.05 Những thành phần khác có hạt Nho 11.99 Chuẩn bị Oligomer procyanidin tổng hợp Các oligomer procyanidin tổng hợp bao gồm: dimer, trimer, tetramer, pentamer (+) – catechin (+) - taxifolin kết tủa với diện NaBH4 ethanol Các chất phản ứng tách cách sử dụng cột sắc ký Sephadex LH-20 Dụng cụ đo phổ Phổ ESR ghi quang phổ JEOL JESRE1X sử dụng cốc đo phẳng thạch anh thiết kế cho dạng dung dịch Điều kiện ESR Các điều kiện quang phổ ESR sau: Từ trường: 336,3 ± mT; công suất: 8,0 mW; tần số điều chế: 100 kHz; biên độ điều chế: 0,063 mT; số lần quét: 500; thời gian quét phút; thời gian liên tục: 0,03 s 2.2.3 Quy trình thí nghiệm [8] 50 μL dimethyl sulfoxide (DMSO), NaOH 25 mM dung dịch mẫu (dung dịch nước) trộn đồng lượng ống nhựa dùng lần, bổ sung μL DMPO 50 μL hydrogen peroxide 30% Trong trường hợp chất chống oxy hố tan dầu mẫu hòa tan 50 μl DMSO, nước tinh khiết NaOH 25 mM pha đồng lượng, bổ sung μL DMPO 50 μL Hydrogen peroxide 30% Hỗn hợp sau phản ứng hút vào cốc đo thạch anh đặt máy ESR Quá trình quét bắt đầu sau bổ sung hydrogen peroxide 10 phút Chiều cao tín hiệu tính cách sử dụng chương trình phân tích gốc gắn liền với cơng cụ Tính tốn thực cho chiều cao tín hiệu dương Methyl-DMPO gốc hydroxylDMPO cho chiều cao tín hiệu âm superoxide-DMPO Phổ ESR điển hình hệ thống H2O2/NaOH/DMSO 10 Khả thu dọn gốc tự acid ascorbic, dl-α tocopherol, β-caroten dịch chiết hạt nho ba nồng độ 2.2.4 Kết [8] Chiết xuất hạt nho làm giảm đáng kể cường độ tín hiệu ESR gốc tự superoxide5,5-dimetyl-1-pyrrolin-N-oxit (DMPO) Chiết xuất hạt nho có hoạt động thu dọn yếu gốc tự hydroxyl hoạt động nhỏ gốc methyl Axit ascorbic biểu hoạt động dọn superoxide hydroxyl mạnh mẽ làm tăng lượng gốc methyl nồng độ cao dl-α tocopherol làm giảm lượng anion superoxide, đặc biệt lượng gốc methyl Tuy nhiên, làm giảm nhẹ lượng gốc hydroxyl Caroten làm giảm lượng gốc hydroxyl methyl triệt để, làm giảm nhẹ anion superoxid Trong trường hợp kết hợp sử dụng β-caroten dl-α tocopherol, tất loại gốc tự thu dọn cách triệt để Sự kết hợp Chiết xuất hạt nho dl-α tocopherol làm giảm tất loại cách triệt để Carotene dl-α tocopherol làm giảm gốc methyl hình thành axit ascorbic 11 2.3 Quang phổ cộng hƣởng điện tử đƣợc nghiên cứu hoạt động thu dọn gốc tự anthocyanin pyranoanthocyanin có rƣợu vang 2.3.1 Giới thiệu [6] Anthocyanin nhóm sắc tố tự nhiên chịu trách nhiệm màu sắc xanh đỏ nhiều loại trái rau cải Chúng glycosid anthocyanidin bao gồm chất polyhydroxy polymethoxy khác muối 2-phenylbenzopyrylium flavilium Nhiều trái cây, ngũ cốc rau cải màu đỏ, rượu vang, nguồn anthocyanin chế độ ăn uống người Lượng anthocyanins người ước tính 180-215 mg / ngày Hoa Kỳ, cao nhiều so với flavonoid khác (23 mg / ngày) bao gồm quercetin, kaempferol, myricetin, apigenin, luteolin] Anthocyanin hấp thụ nhanh chóng với tỷ lệ thấp (

Ngày đăng: 25/07/2019, 11:27

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan