Báo cáo Chất chống oxy hóa nguồn gốc tự nhiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO BÁO CÁO HẾT MÔN CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO BÁO CÁO HẾT MÔN CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA

NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƯỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR)

TRÌ KIM NGỌC

Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền

Mã số:60720406 Khóa 2016-2018

TP HCM, 05/2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO BÁO CÁO HẾT MÔN CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA

NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN

THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG

HƯỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR)

Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền

Mã số:60720406 Khóa 2016-2018

Thầy hướng dẫn: PGS.Ts Trần Hùng Học viên : Trì Kim Ngọc

TP HCM, 05/2017

MỤC LỤC

MỤC LỤC 2

MỞ ĐẦU 3

Phần 1: TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƯỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR) 4

1.1 Giới thiệu 4

1.2 Mô tả phương pháp 4

1.2.1 Nguyên tắc 4

1.2.2 Cơ chế 4

1.2.3 Thiết bị, dụng cụ 4

1.2.4 Chuẩn bị mẫu 5

1.2.5 Cài đặt máy đo phổ 5

1.2.6 Đo giá trị g 5

1.3 Ưu điểm 5

1.4 Nhược điểm và cách khắc phục 5

Phần 2: ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƯỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR) TRONG PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU 7

2.1 Xác định hoạt tính chống oxy hoá bằng quang phổ cộng hưởng spin electron 7

2.1.1 Giới thiệu 7

2.1.2 Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu 7

2.2.3 Kết quả 8

2.2 Xác định hoạt động thu dọn gốc tự do của các chất chống oxy hóa từ dịch chiết hạt nho bằng Quang phổ cộng hưởng điện tử Spin với hệ H2O2 / NaOH / DMSO 9

2.2.1 Giới thiệu 9

2.2.2 Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu 9

2.2.3 Quy trình thí nghiệm 10

2.2.4 Kết quả 11

2.3 Quang phổ cộng hưởng điện tử được nghiên cứu hoạt động thu dọn gốc tự do của anthocyanin và pyranoanthocyanin có trong rượu vang 12

2.3.1 Giới thiệu 12

2.3.2 Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu 12

2.3.3 Kết quả 13

MỞ ĐẦU

Trong lĩnh vực sức khỏe hiện nay, nói đến nhiều tác hại của chất oxy hoá, phản ứng oxy hoá

và nhấn mạnh sự cần thiết sử dụng chất chống oxy hoá để bảo vệ, duy trì sức khỏe Nhiều hoạt chất đã được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa tốt bởi các phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa khác nhau Hoạt tính chống oxy hóa thường không thể đo trực tiếp

mà thông qua tác động của chất chống oxy hóa trên quá trình oxy hóa Các phương pháp đánh giá thường rất đa dạng, có thể dựa trên chất ban đầu, chất oxy hóa, các chất

trung gian hay sản phẩm cuối cùng [2] Bên cạnh những phương pháp thử hoạt tính

chống oxy hóa cổ điển, được sử dụng rất phổ biến như:

 Phương pháp peroxy hóa lipid – định lượng malonyl dialdehyd (MDA)

 Phương pháp ức chế tạo thành gốc cation ABTS·+ (2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)

 Thử nghiệm dập tắt gốc tự do DPPH_ 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

 Thử nghiệm đánh giá khả năng khử ion sắt III (Ferric reducing antioxidant power_FRAP)

Ngày nay các phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa hiện đại, ứng ụng máy móc,

kỹ thuật cao cũng được đưa vào sử dụng Trong phạm vi bài báo cáo hết môn “Các

chất chống oxy hóa nguồn gốc tự nhiên”, trình bày về “Thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp phân tích phổ cộng hưởng spin điện tử (ESR)”

Bài báo cáo góp phần giới thiệu một phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa mới, hiện đại có thể làm giảm thời gian đo, tăng độ nhạy, cải thiện độ phân giải…[5]

Phần 1: TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ

CỘNG HƯỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR)

1.1 Giới thiệu

Ngày nay, phổ ESR là một trong số các phương pháp quan trọng nhất để điều tra cấu trúc và động lực của các hợp chất thuận từ (paramagnetic) Phương pháp này rất nhạy và đặt hiệu do

đó được sử dụng trong nhiều lĩnh vực: hóa học, vật lý, sinh học, và khoáng vật học [5]

Mặc dù các phương pháp xung được giới thiệu trong quang phổ ESR cùng khoảng thời gian với phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR nhưng phương pháp phổ này chỉ mới được nghiên cứu trong khoảng 30 năm trở lại đây Tuy nhiên, tình hình đã thay đổi trong vài năm qua Hiện nay quang phổ ESR là một lĩnh vực nghiên cứu nổi lên và đang phát triển nhanh chóng [5] Hiện nay có thể xây dựng một phổ kế ESR sử dụng các thành phần chủ yếu có thể mua trên thị trường Hiện nay không chỉ có một phương pháp ESR mà bao gồm các phương pháp xung khác nhau, các kỹ thuật có tầm quan trọng đặc biệt [5]

1.2 Mô tả phương pháp

1.2.1 Nguyên tắc

Phổ cộng hưởng spin điện_Electron spin Resonance (ESR), còn gọi là cộng hưởng điện tử thuận từ_ Electron paramagnetic Resonance (EPR), dựa trên sự hấp thụ của bức xạ điện từ trong phạm vi vi sóng, là kết quả của sự chuyển tiếp giữa các mức năng lượng được tạo ra bởi một từ trường trên các electron không ghép đôi, các gốc tự do hữu cơ, các ion tự do, các trung tâm thiếu điện tử, các ion kim loại thuận từ và nhiều nguyên tử trong pha khí chứa các electron không ghép đôi [4]

1.2.2 Cơ chế

Phương pháp đo phổ ESR phát hiện được các tâm thuận từ (ví dụ như các gốc_ radical) Các tâm thuận từ này là do tác động của chiếu xạ hoặc do ảnh hưởng bởi sự có mặt của một số hợp chất hợp khác Từ trường ngoài mạnh sẽ tạo ra sự chênh lệch giữa các mức năng lượng của các spin điện tử m = +1/2 và m = -1/2 dẫn tới sự hấp thụ cộng hưởng của một chùm vi sóng đã sử dụng trong phổ kế Phổ ESR thông thường được biểu thị theo vi phân bậc nhất của

độ hấp thụ tương ứng với một từ trường đã áp dụng nhất định [1]

Giá trị từ trường và tần số vi sóng phụ thuộc vào việc bố trí thực nghiệm (kích thước mẫu và giá chứa mẫu), trong khi đó tỷ lệ giữa chúng (giá trị g) là đặc tính bên trong của tâm thuận từ

và tọa độ vị trí của chúng [1]

1.2.3 Thiết bị, dụng cụ [1]

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

1.2.3.1 Phổ kế ESR X-Band có bán sẵn, gồm có: nam châm, cầu vi sóng, bảng điều khiển

với bộ kiểm soát từ trường và kênh tín hiệu, các hốc hình trụ hoặc hình chữ nhật

1.2.3.2 Thiết bị đo giá trị G, gồm có: máy đếm tần số, đầu đo từ trường (máy đo cộng

hưởng từ hạt nhân (NMR)) hoặc bất kỳ thiết bị nào có lắp bộ đo giá trị g

1.2.3.3 Các ống ESR, có đường kính trong khoảng 4,0 mm (ví dụ; như ống thạch anh

Suprasil)

1.2.3.4 Cân, chính xác đến 1 mg (tùy chọn)

1.2.3.5 Tủ sấy chân không phòng thử nghiệm hoặc máy làm đông khô

1.2.4 Chuẩn bị mẫu

Mẫu đông khô: Nếu mẫu không đủ khô sẽ gây ra khó khăn khi chỉnh các hốc của máy đo phổ Trong trường hợp này tốt nhất nên giảm lượng mẫu hoặc sấy khô mẫu hơn Mẫu nên được sấy hoặc làm khô trong tủ sấy chân không ở 40 oC dưới áp suất giảm dần hoặc trong máy làm đông khô [1]

Mẫu pha loãng trong dung môi EtOH ở nhiệt độ phòng, đo trong cốc thạch anh [3]

1.2.5 Cài đặt máy đo phổ

Sử dụng hằng số thời gian và tốc độ quét thích hợp đối với các tín hiệu ESR cho chiều rộng giữa 2 pic khoảng 0,2 mT đến 0,4 mT [1]

1.2.6 Đo giá trị g

Việc đo giá trị g của tín hiệu ESR là rất hữu ích nhằm để mô tả rõ hơn phổ ESR và đặc biệt giúp cho việc nhận dạng mẫu chiếu xạ

Giá trị g của một tín hiệu, gsignal được tính bằng công thức:

B

V

signal

448

,

71

Trong đó:

V ESR là tần số vi sóng, đo bằng gigahertz (GHz);

B là mật độ dòng từ (chế độ cài đặt từ trường cho máy đo phổ), đo bằng militesla (mT) (10Gauss=10G=1 mT)

Việc tính toán giá trị g của phổ ESR là để xác định vị trí từ trường ở tâm phổ ESR để đo tần

số v (ví dụ máy đếm tần số) và từ trường B (ví dụ gaussmeter) tại điểm đó

1.3 Ƣu điểm

Đây là kỹ thuật phân tích duy nhất có thể phát hiện cụ thể các gốc tự do hình thành do

sự tự oxy hóa và các quá trình liên quan [2]

1.4 Nhƣợc điểm và cách khắc phục

Mặc dù bản chất nhạy cảm với các gốc tự do ổn định như di-tert-butyl, nitroxid; ESR không đủ nhạy để phát hiện các gốc tự do có thời gian tồn tại ngắn ngủi liên quan đến

tự oxy hóa (từ 10-9 giây cho gốc hydroxyl đến một vài giây đối với các gốc peroxyl thoáng qua với nồng độ dưới 10-8 M) Nhiều kỹ thuật đã được sử dụng để khắc phục vấn

đề này, bao gồm sự phóng xạ xung, hệ thống dòng chảy liên tục và bẫy spin Trong số đó bẫy spin đã được sử dụng rộng rãi nhất [2]

Bẫy spin liên quan đến việc bổ sung vào các mẫu một hợp chất phản ứng với các gốc

tự do để hình thành các gốc tự do gốc tồn tại lâu hơn và có thể được phát hiện mà không gặp khó khăn bởi ESR Bẫy spin thường là hợp chất nitroso hoặc nitrones và thường được sử dụng trong các hệ thống sinh học bao gồm tert-nitrosobutan (tNB), α-phenyl-tert-butylitrit (PBN), 5,5-dimetylpyrrolin-N-oxit (DMPO), tert-butylnitrosobenzen (BNB), α-(4-pyridyl-1-oxit) -N-tert-butylititron (4-POBN) và 3,5-dibromo-4-nitrosobenzenesulfonic acid (DBNBS) [2]

Phần 2: ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỔ CỘNG HƯỞNG SPIN ĐIỆN TỬ (ESR) TRONG PHÂN TÍCH

DƯỢC LIỆU

2.1 Xác định hoạt tính chống oxy hoá bằng quang phổ cộng hưởng spin electron

2.1.1 Giới thiệu [7]

Các gốc tự do được tạo ra trong các quá trình thiết yếu của sự sống, như hô hấp, quang hợp và các phản ứng enzym Việc ổn định các gốc tự do là quá trình liên tuc của cơ thể sống Tuy nhiên, nếu các cơ chế bảo vệ trong tế bào bị gián đoạn, các gốc tự do tăng quá mức thì stress oxy hóa có thể xảy ra

Do đó hệ thống chống oxy hóa nội bào được bổ sung bởi lượng chất chống oxy hóa trong chế

độ ăn uống Phụ gia thực phẩm chống oxy hóa tổng hợp như butylat hydroxytoluen (BHT) và butylated hydroxyanisol (BHA) được sử dụng rộng rãi trong việc phòng ngừa thực phẩm bị oxy hóa và kéo dài thời hạn sử dụng Gần đây người ta tìm thấy trái cây và rau có khả năng chống oxy hóa là do các hợp chất polyphenolic chẳng hạn như flavonoid và carotenoid

Mặc dù lợi ích của chúng, một số chất chống oxy hoá tổng hợp như BHT có thể gây ung thư Các nhà sản xuất đang mong muốn sử dụng các lựa chọn thay thế từ tự nhiên Do đó vitamin

C, vitamin E, acid citric, β-caroten, chất chiết xuất thảo mộc được sử dụng Tuy nhiên, tác dụng phụ của nhiều chất chống oxy hóa tự nhiên và hiệu quả chống oxy hóa tương đối chưa được biết đầy đủ

Hoạt động gốc tự do có thể được xác định chắc chắn bằng thực nghiệm với phương pháp cộng hưởng spin electron (ESR) Việc đánh giá các chất dinh dưỡng liên quan đến hoạt động chống oxy hoá có thể giúp biết được chế độ ăn có vai trò điều chỉnh và hạn chế các bệnh lý liên quan tới stress oxy hóa

Quang phổ ESR là một kỹ thuật phân tích có khả năng bẫy và nghiên cứu các gốc tự do Mục tiêu của nghiên cứu này là được sử dụng quang phổ ESR để cung cấp dấu hiệu bán định lượng hoạt tính chống oxy hóa của năm hợp chất chống oxy hóa được biết đến

2.1.2 Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu [7]

Một hệ thống mô hình được phát triển trong đó OH· dược giải phóng từ phản ứng Fenton trong quá trình oxy hóa Chất chống oxy hóa catechin, acid caffeic, 6,7-dihydroxy-4-methylcoumarin, o-coumarin và scopoletin ở nồng độ trong dải 0-4.8 mM được trộn lẫn với bẫy spin N-tertbutyl-a-phenylnitrone (PBN) Chúng hoạt động như tác nhân thu nhặt OH· cạnh tranh với PBN như sau:

Fe2+ + H2O2  Fe3+

+ OH- + OH·

PBN + OH·  PBN-OH + H2O

Chất chống oxy hóa + OH·  Chất chống oxy hóa-OH + H2O

Khi chất chống oxy hóa cạnh tranh thành công vớii bẫy spin trên OH·, cường độ tín hiệu ESR

sẽ giảm số lượng Trong thí nghiệm này, cường độ tín hiệu ESR của phản ứng cạnh tranh được đo với một mẫu MnO / CaO làm chất chuẩn nội

Dùng phương pháp lặp lại để đo spin tương đối như vậy hiệu quả tương đối của các chất chống oxy hóa có thể được xác định đối với bẫy spin

Chuẩn bị:

Các hợp chất được hòa tan trong dimethyl sulphoxid (DMSO) Các hỗn hợp được sử dụng cho quang phổ ESR của các chất chống oxy hoá được điều chế như sau: 0.5 ml PBN (Dung tích 50 mM) được trộn với 0,2 ml FeSO4 (1 mM) Pha một dải nồng độ 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 và 1.0 ml dung dịch chống oxy hóa 10 mM với DMSO Thêm 0.5 ml H2O2 (100%) và lắc đều trong 10 giây Sau đó ủ ở 40 °C trong 30 phút trong bồn nước Các phản ứng được dừng lại bằng cách đặt các mẫu trên nước đá Sau đó 50 µl dung dịch được đưa vào ống kính mỏng (đường kính trong 1mm) và ghi lại các phổ ESR trên quang phổ kế Bruker ER200D-SRC điều kiện như sau:

Tần số vi sóng: 9,78 GHz; Điện vi sóng: 13dB; biên độ giảm dần 0.5 G ở tần số 100kHz; Từ trường thu được: 1,25x105

; độ rộng từ trường: 50G; thời gian quét: 100 giây với thời gian hằng số 100 ms ở nhiệt độ phòng

2.2.3 Kết quả [7]

Chiều cao tín hiệu cường độ (trong trường hợp không có chất chống oxy hóa) được xem như 100% và cường độ tín hiệu phần trăm được tính toán giảm tới 80% so với chiều cao cường độ tín hiệu ESR là tối đa với năm chất chống oxy hóa ở nồng độ 4.8 mM Khả năng bảo vệ tương đối chống lại OH· thể hiện bằng việc giảm tỷ lệ phần trăm chiều cao cường độ tín hiệu ESR

của năm hợp chất thử nghiệm ở cùng nồng độ mol (4.8 mM) thể hiện trong bảng 1

Bảng 1 Ảnh hưởng của chất chống oxy hóa lên độ cao cường độ tín hiệu ESR

So sánh khả năng bảo vệ của chúng cho thấy thứ tự của hiệu lực là:

axit caffeic> O-coumarin> 6,7-dihydroxy-4-methylcummarin>Catechin> scopoletin

Ngoài ra, cũng quan sát thấy trong số các phân tử ở nồng độ thấp (dưới 3,6mM) có scopoletin cho cường độ tín hiệu ESR cao hơn cường độ tín hiệu hơn mức kiểm soát Điều này chỉ ra rằng có một nguồn bổ sung của gốc tự do OH· Những OH· bổ sung này bắt nguồn từ phản ứng của scopoletin với ion Fe2+

Kết luận

ESR là một kỹ thuật phân tích hữu ích để bán định lượng hoạt động chống oxy hóa cho đa dạng các hợp chất, cũng như cung cấp thông tin liên quan đến hoạt động chống oxy hóa

2.2 Xác định hoạt động thu dọn gốc tự do của các chất chống oxy hóa từ dịch chiết hạt nho bằng Quang phổ cộng hưởng điện tử Spin với hệ H 2 O 2 / NaOH / DMSO

2.2.1 Giới thiệu [8]

Trong những năm gần đây, người ta cho rằng phản ứng oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong nhiều căn bệnh như ung thư, xơ cứng động mạch, loét dạ dày, và các bệnh khác Để ngăn ngừa những bệnh này, các chất chống oxy hoá nhóm polyphenol trong trà và rượu vang

đỏ đã được đề cập rất nhiều Đặc biệt, các polyphenol từ rượu vang đỏ làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch và xơ cứng động mạch trong các nghiên cứu dịch tễ học của Renaud và De Lorgeril năm 1992

Dịch chiết ethanol từ hạt nho giàu các hợp chất nhóm polyphenol (proanthocyanidin) Các hiệu ứng thu hẹp gốc tự do hình thành trong trong hệ H2O2 / NaOH / DMSO của chiết xuất hạt nho đã được kiểm tra bằng phương pháp cộng hưởng điện tử bẫy spin (ESR) và so sánh với các chất chống oxy hoá tự nhiên khác như: acid ascorbic, dl-α tocopherol, và β-caroten

2.2.2 Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu [8]

Hóa chất

DMPO thu được từ Công ty LABOTEC (Tokyo, Nhật Bản) Chất đối chiếu mua từ Aldrich

Chemical Co (Milwaukee, WI) Các hóa chất khác mua từ Wako Pure Chemicals Ltd (Osaka, Nhật Bản)

Chuẩn bị dịch chiết hạt Nho

Nho (Vitis vinifera) được lấy từ Kikkoman Corp (Tokyo) Dịch chiết được chiết xuất từ hạt

Nho bằng dung dịch etanol 20%

Phân tích hàm lượng các thành phần trong dịch chiết hạt Nho

Độ ẩm (bằng phương pháp Karl Fischer) 2.10

Chất béo (phương pháp chiết Soxhlet) 0