Khảo sát sự ảnh hưởng của tia UV và tia xạ gamma co60 đến sự sinh tổng hợp astaxanthin của chủng nấm men đột biến rhodosporidium toruloides BE1 và b18

Hướng nghiên cứu gây đột biến cũng như tối ưu hóa môi trường để thu nhận tốiđa hàm lượng astaxanthin từ loài nấm men đỏ Rhodosporidium toruloides đang tia xạ gamma Co60 trên chủng nấm me

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI: Khảo sát sự ảnh hưởng của tia UV và tia xạ gamma Co60

đến sự sinh tổng hợp astaxanthin của chủng nấm men đột biến

Rhodosporidium toruloides BE1 và B18

Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp astaxanthin của hai chủng

Rhodosporidium toruloides BE1 và B18 bằng tác nhân tia UV và tia xạ gamma

Co60, chọn lọc được 4 chủng đột biến sinh tổng hợp astaxanthin cao vượt trội là

chủng BEU108 tích lỹ astaxanthin 935,471 ± 0,061 (μg/g sinh khối khô), đạt 2826,67±1,15 (μg/L môi trường); cao gấp 1,05 lần so với chủng ban đầu BE1; đặc biệt cao gấp 6 lần so với chủng hoang dại ban đầu, chủng BU102 tích lỹ

astaxanthin 1065,39±5,39 (μg/g sinh khối khô), đạt 2150,10±1,52 (μg/L môi

trường); cao gấp 3 lần so với chủng B18 ban đầu và 4,7 lần so với chủng WT, chủng BEG4.21 tích lỹ astaxanthin 1123,50 ± 20,8 (μg/g sinh khối khô), đạt

3072,6 ± 46 (μg/L môi trường); cao gấp 1,2 lần so với chủng ban đầu BE1, đặc biệt cao gấp 6,7 lần so với chủng hoang dại ban đầu, chủng BG1.21 tích lỹ

astaxanthin 1133,66 ± 0,01 (μg/g sinh khối khô), đạt 2924,85 ± 0,07 ( μg/L môi

trường); cao gấp 3 lần so với chủng B18, gấp 6,4 lần chủng WT ban đầu

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp astaxanthin của 4 chủng đột biến khi nuôi cấytrên môi trường YM, YPD và Hansen.Trong đó, môi trường YPD thích hợp cho

việc nuôi cấy hai chủng BEG4.21 và chủng BEU108, hàm lượng astaxanthin mà

2 chủng tích lũy lần lượt là 4570,4 ± 27,7 (µg/L dịch nuôi cấy) cao gấp 2 lần so

với BE1 và gấp 10 lần chủng WT ,4337,13 ± 0,56 (µg astaxanthin/L dịch nuôi cấy) cao gấp 1,8 lần BE1 và gấp 9,5 lần WT Đối với chủng BU102 sinh tổng hợp

astaxanthin cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường YM, đạt 3974,4 ± 36,2 (µg

astaxanthin/L dịch nuôi cấy); cao gấp 4,3 lần chủng B18 và gấp 8,7 lần chủng hoang dại Môi trường Hansen thích hợp khi nuôi cấy chủng BG1.21 đạt 2931,1

± 45,1(µg/L dịch nuôi cấy); cao gấp 3 lần chủng B18 và 6,4 lần so với WT.

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của 4 chủng đột biến chọn lọc thu nhận đượckết quả hoạt tính kháng oxy hóa so với chất chuẩn vit E được sắp xếp theo thứ tự

tăng dần: B18 < BU102 < BE1,BG1.21 < BEG4.21 < BEU108 Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa so với chất chuẩn vit C được sắp xếp theo thứ tự tăng dần: B18 <

BU102 < BE1,BG1.21 < WT <BEG4.21 < BEU108.

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Carotenoids là các hợp chất tự nhiên được tìm thấy trong tất cả các giới sinh vậtsống Các hợp chất này rất dễ nhận biết nhờ vào màu sắc tươi sáng của chúngnhư vàng, cam, đỏ và tím Đến năm 1987, hơn 600 loại carotenoids tự nhiên đãđược phát hiện và phần lớn các cấu trúc hóa học của chúng đều đã được xácđịnh Carotenoids là loại terpenoids được sinh tổng hợp chủ yếu trong cơ thể visinh vật, tảo, nấm và thực vật [1]

Trong đó, astaxanthin là hợp chất màu đỏ cam, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh

và là hợp chất đầy tiềm năng được ứng dụng rộng rãi trong dinh dưỡng, mỹphẩm, thực phẩm và ngành công nghiệp chăn nuôi Astaxanthin là sắc tốcarotenoid chính được tìm thấy trong thủy sản như cá hồi, rong biển đỏ, tôm;trong các loài chim như chim hồng, chim cút; trong các loài tảo và một số loàinấm men đỏ [2]

Nhóm nấm men như nấm men đỏ Rhodosporidium toruloides, tảo lục

Haematococcus pluvialis và một số vi khuẩn gram âm đều có khả năng sinh tổng

hợp astaxanthin [3]

Do mang lại nhiều lợi ích nên việc thương mại hóa astaxanthin đang là vấn đềđược quan tâm hàng đầu Trong đó, các nguồn cung cấp astaxanthin chính hiện

nay là từ loài vi tảo Haematococcus pluvialis với hàm lượng astaxanthin mà vi

tảo tích lũy là 0,3 g astaxanthin / 21kg sinh khối khô [2] và từ các loài nấm men

đỏ với hàm lượng astaxanthin cao hơn 5 - 50 lần so với các loài giáp xác [4] Vớikhả năng sinh tổng hợp astaxanthin cao nhưng việc nuôi trồng vi tảo để thu nhậnastaxanthin còn rất nhiều khó khăn như điều kiện nuôi trồng phức tạp, thời giannuôi cấy lâu, công đoạn thu nhận hợp chất mất nhiều công sức Do đó hướngnghiên cứu về việc thu nhận astaxanthin từ loài nấm men đỏ đang rất được quantâm vì một số đặc điểm như sinh sản nhanh, tăng trưởng trong thời gian ngắn và

có khả năng sử dụng đa dạng các nguồn cơ chất với chi phí thấp để tạo mộtlượng sinh khối lớn

Hướng nghiên cứu gây đột biến cũng như tối ưu hóa môi trường để thu nhận tối

đa hàm lượng astaxanthin từ loài nấm men đỏ Rhodosporidium toruloides đang

tia xạ gamma Co60 trên chủng nấm men đỏ Rhodosporidium toruloides cho kết

quả ban đầu khả quan về việc sinh tổng hợp astaxanthin cao gấp 2,2-3,9 [41] lần

so với chủng ban đầu Hai chủng nấm men đã qua đột biến kép bằng tác nhân

hóa học BE1 và B18 cho kết quả cao về việc sinh tổng hợp astaxanthin so với

chủng nấm men hoang dại ban đầu [42], nhưng theo một số nghiên cứu cácchủng nếu được tiếp tục gây đột biến bằng tác nhân vật lý sẽ cho kết quả sinhtổng hợp cao vượt trội hơn Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Khảosát sự ảnh hưởng của tia UV và tia xạ gamma Co60 đến sự sinh tổng hợp

astaxanthin của chủng nấm men đột biến Rhodosporidium toruloides BE1 và

B18” nhằm mục đích chọn lọc và thu nhận các giống đột biến mới cho khả năng

sinh tổng hợp astaxanthin cao được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát sự ảnh hưởng của tia UV đến khả năng sinh tổng hợp astaxanthin của

chủng nấm men đột biến Rhodosporidium toruloides BE1 và B18.

Khảo sát sự ảnh hưởng của tia xạ gamma Co60 đến khả năng sinh tổng hợp

astaxanthin của chủng nấm men đột biến Rhodosporidium toruloides BE1 và

B18.

Tách chiết astaxanthin từ các chủng nấm men đột biến

Xác định đường cong tăng trưởng và thời điểm tích lũy astaxanthin cao nhất củacác chủng nấm men đột biến

Khảo sát môi trường tối ưu để nuôi cấy các chủng nấm men đột biến nhằm thunhận hàm lượng astaxanthin cao nhất.

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin được tách chiết từ các chủngđột biến

1.3 Ý nghĩa đề tài

Ý nghĩa khoa học: thu nhận các chủng nấm men đột biến mới cho khả năng sinhtổng hợp astaxanthin cao vượt trội so với chủng ban đầu, mở rộng hướng nghiên

cứu trên nấm men nói chung và chủng Rhodosporidium toruloides nói riêng.

Ý nghĩa thực tiễn: góp phần cho sự phát triển trong ngành công nghiệp sản xuấtastaxanthin thương mại tại các nước có khí hậu nhiệt đới, đa dạng hóa các nguồnthu nhận hợp chất astaxanthin – một hợp chất đa chức năng và đầy triển vọng

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một số đặc điểm về astaxanthin

Astaxanthin là một sắc tố thuộc về nhóm của xanthophylls, dẫn xuất oxy hóa củacarotenoid được tổng hợp trong thực vật và có nguồn gốc từ lycopene [13] Giống như các sắc tố tự nhiên khác, astaxanthin thu hút rất nhiều sự chú ý củacác nhà khoa học ở thế kỷ 19 [10] Chất màu astaxanthin được phân bố rộng rãitrong tự nhiên, nơi chúng đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các tếbào và sinh vật chống lại sự oxy hóa Chúng là tác nhân chống lại tác động củaánh sáng, oxy phân tử và các tác nhân có thể gây ra tổn thương oxy hóa cho tếbào vào mô [11]

Theo như nghiên cứu, thị trường astaxanthin trong 2019/2020 được ước tính sẽđạt 1,5 – 1,8 tỷ đô la với tỷ lệ tăng trưởng hàng năm của hợp chất là 3,9%, hợpchất này sẽ được thương mại hóa và công nghiệp hóa rộng rãi do nhu cầu tiêudùng ngày càng cao trong thực phẩm, mỹ phẩm, các ngành công nghiệp hóa chất

và dược phẩm [12]

Dù có rất nhiều nguồn thu nhận và nhiều phương pháp để sản xuất astaxanthinnhưng nguồn thu nhận từ vi sinh vật là vấn đề nổi bật và đầy tiềm năng đangđược các nhà khoa học quan tâm Một số lợi ích khi thu nhận astaxanthin từphương pháp nuôi cấy vi sinh vật như chi phí thấp, năng suất thu hoạch cao vàđặc biệt là không gây ô nhiễm môi trường Các nhà khoa học đã công bố một số

loài vi khuẩn, tảo và nấm men như Rhodotorula, Phodosporidium,Sporolomyces

và Rhaffia có khả năng sinh tổng hợp hợp chất này

2.1.1 Công thức cấu tạo

Astaxanthin ( 3,3 dihydroxy beta carotente 4,4 dione ) là một keto carotenoid, công thức phân tử là C40H52O4 Astaxanthin được cấu tạo từ năm tiềnchất carbon, isopentenyl diphosphate và dimethylallyl diphosphate Nó là mộtchất chuyển hóa của zeaxanthin (hydroxyl (- OH)) và cathaxanthin(ketone (C =O)), do đó astaxanthin có chức năng của cả hai nhóm này [14]

-Hình 2.1 Công thức cấu tạo của astaxanthin

Tùy thuộc vào nguồn gốc, astaxanthin có thể ở dạng kết hợp với một số chấtkhác Đôi khi astaxanthin được đồng trùng hợp một hay cả hai nhóm hydroxylvới các loại acid béo như palmitic, oleic, estearic hoặc linoleic, astaxanthin cũngtồn tại ở dạng tự do (các nhóm hydroxyl nguyên vẹn) và astaxanthin cũng có thểkết hợp với protein hình thành carotenoprotein hay kết hợp với lipid hình thànhcarotenolipoprotein.[1]

Hình 2.2 Công thức các dạng đồng phân của astaxanthin.

2.1.2 Đặc tính sinh hóa của astaxanthin

Astaxanthin là một sắc tố tự nhiên, là một diketo carotenoid, là một hợp chấtkhông phân cực nên có khả năng tan trong chất béo nhưng không tan trong nước

và lipophilic [3] Tinh thể astaxanthin ở dạng bột, màu tím đậm, có nhiệt độ nóngchảy khoảng 2240C Astaxanthin có thể hòa tan trong các dung môi hữu cơ nhưcarbon disulfide, aceton, benzen, chloroform và hòa tan ở nhiệt độ phòng trongdicloromethan,dimethylsulfoxide Chúng thường kém ổn định hơn so với các loàiisopyrenoids khác [3] Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc: astaxanthin hấp thụ rấtmạnh bức xạ trong vùng 470 - 510 nm nên tạo màu đỏ cam rất đẹp [38]

Bảng 2.1 Một số tính chất vật lý của astaxanthin [15]

Kết tinh ( trong ether dầu hỏa) Huỳnh kim màu đỏ

2.1.3 Chức năng sinh học của astaxanthin

Astaxanthin là một chất carotene đỏ tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa mạnh [18]

Hình 2.3 Chức năng sinh học của astaxanthin.

2.1.3.1 Astaxanthin được ứng dụng nhiều trong chăn nuôi và trong y học

Các yếu tố nội tại như di truyền, chuyển hóa tế bào, hormon, các quá trình traođổi chất và các quá trình ngoại sinh như tiếp xúc với ánh sáng, ô nhiễm, bức xạion hóa, hóa chất và độc tố đều gây ra lão hóa da [19]

Hình 2.4 Hình ảnh da lão hóa theo độ tuổi.

Astaxanthin được lựa chọn là tác nhân chống oxy hóa hiệu quả, nó có hoạt tínhcao hơn nhiều so với một số chất chống oxy hóa như carotenoid và vitamin E

Do tác dụng chống oxy hoá mạnh mà astaxanthin được sử dụng như tác nhânchống lão hóa [19]

2.1.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa lipid

Astaxanthin có thể tồn tại trong gan và ngoài tế bào, nó giúp chống những tác hạioxy hóa bởi các cơ chế khác nhau như kết hợp với oxy đơn phân tử, ngăn chặncác gốc tự do, bảo vệ cấu trúc màng tế bào, tăng cường chức năng của hệ thốngmiễn dịch và điều chỉnh biểu hiện gen Astaxanthin ức chế sự peroxid hóa lipidtrong các mẫu sinh học khác nhau [20]

2.1.3.3 Ngăn ngừa ung thư

Các chất oxy hóa được tạo ra trong sự trao đổi chất hiếu khí bình thường haytrong quá trình oxy hóa chất béo đều góp phần vào các bệnh lão hóa, ung thư và

xơ vữa động mạch thông qua quá trình oxy hóa DNA, protein và chất béo Cáchợp chất chống oxy hóa sẽ làm giảm đột biến và ung thư bằng cách ức chế tổnthương oxy hóa cho tế bào Theo nghiên cứu, astaxanthin cho thấy hoạt tínhchống ung thư đáng kể khi so sánh với các carotenoids khác như canthaxanthin

và β – carotene Astaxanthin cũng ức chế sự tăng trưởng của xơ hóa, vú , các tếbào ung thư tuyến tiền liệt và nguyên bào sợi phôi Astaxanthin ức chế sự chết tếbào, sự tăng sinh tế bào và các khối u vú ở chuột đực và chuột cái Ngoài ra,

virus Epstein - Barr và chất gây ung thư trong u nhú da chuột bị ức chế đáng kể

bởi điều trị astaxanthin [20]

2.1.3.4 Cải thiện chất lượng trứng gà và trong chăn nuôi thủy sản

Việc bổ sung astaxanthin vào thức ăn chăn nuôi gà sẽ làm tăng hàm lượng chấtdinh dưỡng cũng như màu sắc trong lòng đỏ trứng Theo như nghiên cứu củaAkiba và Dike, đã kiểm tra sự thay đổi của màu sắc lòng đỏ trứng gà khi bổ sungthêm astaxathin vào khẩu phần ăn của gà, kết quả cho rằng lòng đỏ trứng có màusậm hơn nhiều so với ở chế độ ăn bình thường [21]

Bên cạnh đó, astaxanthin là một trong những sắc tố chính trong các loài giáp xác,

cá hồi với vai trò là cung cấp sắc tố đỏ cam trong những sinh vật này [13]

2.1.3.5 Chất bảo vệ mắt và hệ thống thần kinh

Astaxanthin là chất chống oxy hóa có hiệu quả có thể đi qua màng não (Tso vàLam,1996), lợi ích của astaxanthin đối với sức khỏe của mắt và hệ thống thầnkinh rất được hứa hẹn

Nghiên cứu hiệu quả chống oxy hoá ở mắt chuột cho thấy rằng astaxanthin có thểcải thiện các retinal bị tổn hại và astaxanthin cũng có hiệu quả tốt trong việc bảo

vệ tế bào nhận kích thích ánh sáng khỏi bị thoái hóa [38]

2.1.4 Sản phẩm astaxanthin

Hình 2.5 Một số sản phẩm astaxanthin thương mại.

2.2 Con đường chuyển hóa thành hợp chất astaxanthin

Hình 2.6 Con đường chuyển hóa thành hợp chất astaxanthin [17]

Astaxanthin được hình thành qua con đường mevalonate, khi acetyl-CoA thôngqua con đường mevalonate để hình thành isopentenylpyrophosphate (IPP) là tiềnchất chung của tất cả isoprenoid Sau đó, 8 phân tử IPP ngưng tụ tạo thànhphytoene không màu Phytoene sau khi qua 4 phản ứng khử hydro và 2 chu trìnhphytoene được chuyển đổi thành L-carotene Cuối cùng là quá trình oxy hóa L-carotene để tạo ra astaxanthin.

2.3 Một số loài động vật, thực vật và vi sinh vật sinh tổng hợp astaxanthin

Nguồn thu nhận astaxanthin rất đa dạng như từ thủy hải sản, tảo và vi sinh vật Hiện nay, người ta sản xuất các dạng astaxanthin thương mại chủ yếu từ các

nguồn như nấm men Phaffia, vi tảo Haematococcuspluvialis và phương pháp

Haematococcus pluvialis là một loài vi tảo lục, nước ngọt, đơn bào, sinh sản vô

tính bằng cách nhân đôi và có khả năng di chuyển

Hình 2.7 Vi tảo Haematococcus pluvialis.

Hình thái tế bào của Haematococcus pluvialis có sự biến đổi khác nhau trong chu

trình sống của chúng Tế bào có hai dạng gồm tế bào sinh dưỡng và nang bào tử

Tế bào sinh dưỡng: màu xanh, dạng cầu hoặc elip Trong điều kiện thuận lợi,phần lớn các tế bào sinh dưỡng tổng hợp chlorophyll a, chlorophyll b và tiềncarotenoid trong điều kiện quang tự dưỡng khi có ánh sáng và quang dị dưỡngkhi trong bóng tối

Nang bào tử: khi gặp điều kiện bất lợi (cạn kiệt dinh dưỡng, nhiệt độ cao), nangbào tử hình thành và thay đổi thành dạng cyst Ngay thời điểm đó tốc độ sinhtrưởng của tế bào giảm và tế bào tích lũy một lượng lớn astaxanthin Ban đầu,astaxanthin tập trung hình thành quanh nhân và quá trình được tiếp tục khi toàn

bộ tế bào chuyển sang màu đỏ

Hình 2.8 Quá trình sinh tổng hợp astaxanthin.

Hình 2.9 Vòng đời của vi tảo Haematococcus pluvialis.

Ở Haematococcus pluvialis, astaxanthin được tổng hợp ở giai đoạn tạo bào nang,

là loại sắc tố đặc trưng và có giá trị kinh tế rất cao Hàm lượng astaxanthin mà vitảo tích lũy là 0,3 g astaxanthin / 21kg sinh khối khô [2]

Mặc dù hàm lượng astaxanthin từ tảo lục Haematococcus pluvialis cao nhưng

còn nhiều hạn chế khi áp dụng trong quy mô công nghiệp như phải chiếu sanglên tục và sục khí CO2 liên tục trong suốt quá trình nuôi cấy,canh tác tự dưỡngkéo dài trong ao nước ngọt, khi thu nhận astaxanthin phải phá vỡ tế bào của nó.[21]

Hình 2.2 Quy trình sản xuất astaxanthin thương mại từ vi tảo Haematococcus

pluvialis [12]

Trong số các loài vi sinh vật, vi khuẩn, nấm men, nấm và tảo đều là những loàitích lũy carotenoid – một loại sắc tố nội bào Trong số các loại nấm men, nấm

men đỏ Phaffia rhodozyma là loài sản xuất astaxanthin được ứng dụng trong nuôi

trồng thủy sản nhiều nhất, điển hình là làm gia tăng giá trị dinh dưỡng trong chấtlượng thịt của cá hồi [15]

Theo như nghiên cứu, nấm men đỏ Phaffia rhodozyma chứa hàm lượng

astaxanthin cao hơn 5 - 50 lần so với các loài giáp xác , chứa khoảng 30 - 800 g/

g astaxanthin tùy thuôc vào phương pháp nuôi cấy Do đó, chúng thường được

bổ sung vào khẩu phần ăn trong nuôi trồng thủy sản [4]

Hình 2.3 Một số nguồn sản sinh astaxanthin.

Đây là hướng nghiên cứu đầy tiềm năng nhằm đa dạng hóa các nguồn thu nhậnastaxanthin thương mại phục vụ cho các ngành công nghiệp, dược phẩm, mỹphẩm

2.3.2 Thu nhận astaxanthin từ vỏ các loài thủy sản

Phương pháp hóa học dùng để thu nhận hợp chất astaxanthin chủ yếu từ các loại

vỏ tôm, vỏ cua – phế liệu từ ngành công nghiệp thủy sản:

Hình 2.4 Vỏ tôm hùm.

Vỏ tôm , rửa sạch, sấy khô (45 - 500C, 120 - 150 phút) , nghiền , rây ,trích lybằng dầu thực vật (dầu đậu nành, dầu mè, dầu hạt cải), ly tâm (3000 rpm / phút) ,thu dịch nổi , pha loãng , đo phổ hấp thụ ở 487nm , xác định hàm lượngastaxanthin

Hiện nay, dạng astaxanthin được thu nhận bằng phương pháp hóa học thường bổsung vào thức ăn cho cá hồi như chất tạo màu nhằm làm tăng thành phần dinhdưỡng trong khẩu phần ăn của chúng (New York Times, 17/8/1987) [38]

2.4 Nấm men Rhodosporidium toruloides

2.4.1 Đặc điểm hình thái của chủng nấm men Rhodosporidium toruloides

Nấm men Rhodotorula toruloides còn được gọi là Rhodosporidium toruloides, là

loài có màu đỏ đặc trưng của hợp chất carotenoid Nấm men đỏ này là nguồn sảnxuất các hợp chất carotenoids (do bản thân nó chứa hợp chất này trong tế bào)hay tiền chất vitamin A và đồng thời cung cấp đặc tính chống oxy hóa [12] Tùyvào điều kiện nuôi cấy khác nhau mà chúng có các kiểu hình khác nhau như hìnhtrứng, hình cầu tròn và hình gậy Chúng là loài đơn bào với kích thước từ 2 – 5

µm chiều rộng ; 2,5 – 10 µm chiều dài và kích thước khuẩn lạc phụ thuộc vàomôi trường dinh dưỡng và nhiệt độ nuôi cấy [22]

Hình 2.5 Khuẩn lạc Rhodosporidium toruloides.

2.4.2 Một số loài nấm men Rhodosporidium sinh tổng hợp astaxanthin

Bảng 2.2 So sánh khả năng sinh tổng hợp carotenoid ở một số loài nấm men.

[12]

carotenoids ( mg/gsinh khối khô )

Tổng hàm lượngcarotenoids( mg/L)

2.5 Các phương pháp gây đột biến nấm men

Hướng nghiên cứu gây đột biến trên đối tượng vi sinh vật nhằm mục đích thunhận các hợp chất thương mại cao là hướng nghiên cứu đang được rất nhiều sựquan tâm của các nhà khoa học vì nó không đòi hỏi chi phí đầu tư cao – phù hợpvới điều kiện khoa học kỹ thuật tại Việt Nam Trong đó, việc nghiên cứu tạochủng nấm men đột biến cho hàm lượng astaxanthin cao là vấn đề đầy triểnvọng

Hiện nay, có nhiều phương pháp gây đột biến như là:

a) Đột biến bằng tác nhân hóa học: EMS (ethyl methanesulfonate), NTG (N

- Methyl - N′ - nitro - N - nitrosoguanidine), H2O2, β – ionone…

b) Đột biến bằng tác nhân vật lý: tia phóng xạ (tia X, tia gamma, .), tia tửngoại, sốc nhiệt…

c) Đột biến bằng tác nhân sinh học: virus, vi khuẩn…

Đột biến là những biến đổi trong cấu trúc của gen (cấp độ phân tử) hay biến đổinhiễm sắc thể (cấp độ tế bào) tại một điểm nào đó trên phân tử DNA và có liênquan đến sự thay đổi về số lượng, thành phần, trật tự các cặp nucleotide tronggen Người ta lựa chọn chủng đột biến dực trên kiểu hình khuẩn lạc, màu sắckhuẩn lạc qua kết quả đột biến ngẫu nhiên trên vi sinh vật – đây là phương phápđột biến đơn giản [24] [25] [26]

Trong các phương pháp gây đột biến, phương pháp sử dụng hóa chất cũng mang

lại nhiều kết quả tốt Theo An và cộng sự, chủng nấm men đột biến P.

Rhodozyma từ tác nhân hóa học NTG cho hàm lượng carotenoid 1200 ug /g (cao

gấp 3 - 4 lần so với chủng hoang dại) [27]

Bên cạnh đó, có rất nhiều công bố về việc sử dụng tác nhân vật lý gây đột biếnlên nấm men nhằm thu được hàm lượng astaxanthin cao từ chủng hoang dại hoặcchủng đã được gây đột biến Simpson và cộng sự (1964) phân lập được chủng

đột biến 62-506, dưới điều kiện nhiệt ổn định chủng sinh tổng hợp hàm lượng

gamma-carotene tăng 65% so với chủng ban đầu [52].L eland H Hartwell( 1967) đã tạo dòng đột biến bằng phương pháp sốc nhiệt, kết quả thu nhận đượcchủng đột biến sinh tổng hợp hàm lượng astaxanthin 48,08 mg/L , tăng 43%

chủng ban đầu Jef D Boeke và cộng sự ( 1984) đã phân lập được dòng đột biến

S pombe ura4-294 ( dưới tác dụng tia UV) tích lũy hàm lượng astaxanthin cao

gấp 2 lần so với chủng hoang dại ban đầu[50] Tương tự, Jang Houng Park vàcộng sự ( 2008) thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của chủng nấm men đột biến

ypt1-G80D, kết quả thu nhận được chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt cao

và khả năng sinh tổng hợp carotenoid cao, tăng 35% so với chủng bố mẹ[53]

Phương pháp gây đột biến bằng tác nhân vật lý lên các chủng nấm men đã quađột biến cũng cho các kết quả cao về khả năng sinh tổng hợp carotenoids cũng

nấm men P rhodozyma 2A2N (2A2N đã được đột biến với NTG) được chiếu xạ gamma liều thấp dưới 10kGy và thu được chủng đột biến 3A4 – 8 cho hàm lượng 3,3mg carotenoid /g sinh khối khô (cao hơn 50% lần so với chủng 2A2N trước

khi chiếu xạ) [31]

2.5.1 Cơ chế gây đột biến của tia UV [32]

Tia UV là sóng điện từ có bước sóng (100 - 400nm) ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy

và dài hơn tia X Tia UV bao gồm 3 loại dựa vào bước sóng:

a) Tia UVA có bước sóng dài từ 320 - 400nm có năng lượng thấp hơn vùng tiaUVB và UVC Tia UVA có lượng bức xạ cực tím nhiều nhất (chiếm tới 97%), do

đó chúng dễ dàng xuyên qua tầng ozone Tia UVA có thể xuyên qua giác mạc, đivào thủy tinh thể hay võng mạc ở bên trong mắt, khi tiếp xúc dưới bức xạ UVAquá lâu sẽ dẫn đến hiện tượng bị đục nhân mắt hay thoái hóa điểm vàng

b) Tia UVB có bước sóng trung bình từ 280 - 320nm và có năng lượng thấp hơnvùng tia UVC Tia UVB kích thích quá trình chuyển hóa Melanin (một loại sắc

tố da) làm cho da trở nên tối đi, tạo ra sự rám nắng Nếu với cường độ cao, tiaUVB sẽ gây nên hiện tượng cháy nắng, làm tăng các nguy cơ bị ung thư da TiaUVB cũng gây nên các hiện tượng bạc màu da, các nếp nhăn và các dấu hiệukhác sớm trước tuổi Hầu hết các bức xạ UVB chủ yếu gây nên các bệnh giácmạc như viêm giác mạc, hạt kết giác mạc

Hình 2.6 Ảnh hưởng của tia UVA, UVB lên cấu trúc da.

c) Tia UVC có bước sóng ngắn từ 100 - 280nm Đây là vùng tia UV có nănglượng cao nhất và có tính chất tiệt trùng Tia UV tác dụng lên nucleoprotein của

vi sinh vật, chủ yếu gây ra đột biến gene và đột biến nhiễm sắc thể ở vi sinh vật

Bảng 2.3 Phân loại tia tử ngoại theo ISO-21348 [32]

photon (eV) Ghi chú / Tênkhác

315nm-280nm 3,94-4,43eV Sóng trung ,bị lớp ozon

hấp thụ phầnlớn

280nm-100nm 4,43-12,4eV Sóng ngắn ,khử trùng , bị

lớp ozon vàkhí quyển hấpthụ hoàn toàn

2.5.2 Cơ chế gây đột biến của tia gamma

Tia gamma thường sinh ra bởi sự phân rã gamma từ đồng vị phóng xạ tự nhiênnguồn Coban60 (Co60) hoặc Cesium137 (137Cs) và bức xạ thứ cấp từ các tươngtác với các hạt trong tia vũ trụ Cũng có những nguồn gamma tự nhiên kháckhông có nguồn gốc hạt nhân, ví dụ như các tia sét [10]

Hình 2.7 Ảnh hưởng của tia gamma lên các phân tử nước.

2.6 Khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin

Một số nghiên cứu cho thấy carotenoids là một chất kháng oxy hóa có khả năngbất hoạt các gốc tự do và các oxy đơn phân tử Trong đó, astaxanthin là hợp chấtchính của carotenoids, là hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất trong

số các chất thuộc nhóm carotenoids Do astaxanthin trong phân tử chứa đồng thờichuỗi polyene, nhóm hydroxyl và nhóm keto trên mỗi vòng ionone, các nhómnày ức chế các gốc tự do bằng cách phản ứng với các gốc tự do để chấm dứtphản ứng và chuyển đổi chúng thành các sản phẩm khác [41] Theo như một sốbáo cáo, hoạt tính kháng oxy hóa của astaxanthin cao gấp 10 lần so với các hợp

chất khác thuộc nhóm carotenoids như zeaxanthin, lutein, canthaxanthin vàalpha- carotene

Astaxanthin ngày càng khẳng định vai trò kháng oxy hóa cao qua một số nghiêncứu như chúng được bổ sung vào chế độ ăn của chuột bị thiếu vitamin E giúptránh quá trình peroxid hóa chất béo, bảo vệ ty thể và hồng cầu ở chuột Ngoài

ra, astaxanthin cũng được bổ sung vào chế độ ăn của gà giúp tránh quá trình oxyhóa chất béo ở màng gan gà [42] Không chỉ ở động vật, astaxanthin có thể ngănngừa những tổn thương oxy hóa đến các tế bào cyst ở các loài vi tảo lục bằngcách tương tác với các phân tử oxy đơn phân được tạo ra bởi chính các loải vi tảonày [43]

Đối với người, khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin giúp ngăn ngừa và hạnchế lan truyền ung thư do astaxanthin bất hoạt các gốc tự do và các oxy đơn phân

tử trong cơ thể [44] Hơn thế nữa, astaxanthin có khả năng phân hủy các gốclipid và các chuỗi peroxid giúp bảo vệ các acid béo trong tế bào [45]

Không giống như beta-carotene, astaxanthin có thể dễ dàng vượt qua các hàngrào võng mạc giúp chống quá trình oxy hóa, bảo vệ các tế bào thần kinh củavõng mạc cũng như hệ thần kinh trug ương, tủy sống khi bị gây tổn thương bởicác gốc tự do [46] Trong nguyên bào sợi ở thận chuột, astaxanthin giúp chốnglại quá trình oxy hóa do tia cực tím UVA gây ra hiệu quả hơn nhiều so với lutein

và beta-carotene [47] Do đó, khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin mang lạinhững lợi ích đầy hứa hẹn

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ tháng 01/2018 - 01/2019

Địa điểm: Phòng thí nghiệm chuyên đề C123, C124, Khoa Khoa học ứng dụng,Đại học Tôn Đức Thắng

3.2 Giống nấm men từ họ hàng nấm men Rhodosporidium

Chủng nấm men Rhodosporidium toruloides đã qua đột biến bằng hóa chất, bao gồm 2 giống BE1 và B18, giống được lưu giữ ở tủ -80 tại phòng thí nghiệm C506

CNSH, Trường đại học Tôn Đức Thắng Tp.HCM

3.3 Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường Hansen, thành phần bao gồm

3.4 Hóa chất sử dụng

Bảng 3.1 Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu.

Hóa chất tách chiết

astaxanthin

Petroleum ether Xilong-Trung Quốc

3.6 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.6.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Rhodosporidium toruloides BE1 và B18

Tăng sinh

Chiếu tia UV Chiếu tia xạ

gamma Co60

Khuẩn lạc đột biến Tách chiết astaxanthin

Định lượng astaxanthin

Chọn chủng đột biến cho hàm lượng astaxanthin cao nhất

Khảo sát sự sinh tổng hợp astaxanthin

của các chủng đột biến khi nuôi cấy

trên môi trường khác nhau

Khảo sát đường cong tăng trưởng của chủng đột biến thu nhận được và thời điểm thu nhận astaxanthin thích hợp

Xác định khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin được tách chiết từ các chủng đột biến

3.6.2 Nội dung nghiên cứu

Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của tia UV đến khả năng sinh tổng hợp

astaxanthin chủng Rhodosporidium toruloides BE1 và B18

Mục đích: Chọn lọc và thu nhận các chủng nấm men đột biến cho hàm lượng

astaxanthin cao hơn nhiều lần so với chủng nấm men ban đầu nhờ vào hình dáng vàmàu sắc khuẩn lạc

- Tiến hành chiếu UV ở các đĩa petri chứa dịch tế bào nấm men đã pha loãng vớikhoảng thời gian 5s, 10s, 15s , 20s, 25s, 30s với khoảng cách chiếu từ đèn đến cácđĩa dịch tế bào là 20 cm và sử dụng tia UVC để tiến hành chiếu xạ

- Tiến hành cấy 1ml dịch sinh khối lên đĩa Hansen thạch (0,1 mL/ đĩa), ủ các đĩasau khi cấy ở trong tối , nhiệt độ phòng

- Sau 14 ngày, ghi nhận và chọn lọc những khuẩn lạc thay đổi về màu sắc ( màu đỏđậm hơn chủng ban đầu ), hoặc hình dáng ( khuẩn lạc bóng hơn chủng ban đầu) ,hoạt hóa các giống đột biến trong bình môi trường Hansen lỏng , cấy chuyền lên ốngthạch Hansen nghiêng, giữ giống ở 40C

Thí nghiệm 2 : Khảo sát sự ảnh hưởng của tia xạ gamma Co60 đến khả năng

sinh tổng hợp astaxanthin của chủng Rhodosporidium toruloides BE1 và B18

Mục đích: Chọn lọc và thu nhận các chủng nấm men đột biến cho hàm lượng

astaxanthin cao hơn nhiều lần so với chủng nấm men ban đầu nhờ vào hình dáng vàmàu sắc khuẩn lạc

Cách tiến hành

- Dịch nấm men Rhodosporidium toruloides sau khi hoạt hóa trong 100 mL môi

trường Hansen lỏng, trong 24 giờ

- Chuẩn bị eppendroff vô trùng, cho 0,5mL dịch sinh khối nấm men, pha loãng bằngnước cất vô trùng ở các độ pha loãng như không pha loãng 10-1 ,10-2 ,10-3 và 10-4 Cho hết 0,5 ml dịch tế bào nấm men ở các độ pha loãng vào eppendroff vô trùng

- Tiến hành chiếu xạ ở các eppendroff chứa dịch tế bào nấm men ở các độ pha loãngvới khoảng liều xạ 0 kGy, 1kGy , 2 kGy, 3 kGy, 3,5 kGy, 4 kGy, 4,5 kGy, 5 kGy,5,5 kGy, 6 kGy, 6,5 kGy và 7 kGy , mỗi khoảng liều xạ ứng với 1 lần chiếu lên0,5mL dịch sinh khối

- Tiến hành cấy 0,5ml dịch sinh khối lên 5 đĩa Hansen thạch (0,1 mL/ đĩa), ủ các đĩasau khi cấy ở trong tối, nhiệt độ phòng

- Sau 14 ngày, ghi nhận và chọn lọc những khuẩn lạc thay đổi về màu sắc (màu đỏđậm hơn chủng ban đầu ), hoặc hình dáng ( bóng hơn chủng ban đầu), hoạt hóa cácgiống đột biến trong bình môi trường Hansen lỏng , cấy chuyền lên ống thạchHansen nghiêng, giữ giống ở 40C

Thí nghiệm 3: Quy trình tách chiết, định tính và định lượng astaxanthin từ các chủng nấm men đột biến

Mục đích: Xác định các chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp hàm lượng

astaxanthin cao hơn nhiều so với chủng ban đầu

Cách tiến hành

Thu sinh khối, nghiền sinh khối của mẫu sau cân, cho 0,1g sinh khối + 1,5 mLDMSO , ủ trong tủ sấy ở 550C trong 30 phút , ly tâm 6000 vòng/phút trong 7 phút đểthu phần dịch chứa sắc tố, bổ sung 2,5 mL acetone vào phần cặn còn lại, vortexmẫu, ly tâm để thu dịch nổi chứa sắc tố , lặp lại phần bổ sung aceton khoảng 3 lần

để thu hết sắc tố trong mẫu, gom hết dịch chiết sắc tố vào phễu chiết , thêmPetroleum Ether (PE) (1V dịch chiết : 0,5 V PE) , lắc nhẹ để hòa tan sắc tố, thêm 10 mLnước cất, thêm 5 mL NaCl bão hòa để tiến hành rửa mẫu ( loại bỏ tạp chất trongmẫu ), thu dịch chiết sắc tố trong pha PE để tiến hành định lượng astaxanthin

Thí nghiệm 4: Xác định đường cong tăng trưởng của chủng nấm men đột biến cho hàm lượng astaxanthin cao nhất và xác định thời điểm thu nhận astaxanthin thích hợp nhất của các chủng đột biến

Mục đích: Xác định đường cong tăng trưởng của chủng nấm men đột biến được

chọn và tiến hành so sánh với các chủng nấm men ban đầu, đồng thời xác định đượcthời điểm sinh tổng hợp astaxanthin nhiều nhất của chủng đột biến tối ưu

Cách tiến hành

Dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD600nm và mật độ tế bào (logN/mL), dựng đường cong tăng trưởng của chủng đột biến trên môi trường Hansen

cơ bản ,tiến hành vẽ đường cong tăng trưởng theo thời gian ,xác định thời điểm thunhận astaxanthin.

Thí nghiệm 5 : Khảo sát sự sinh tổng hợp astaxanthin của các chủng đột biến khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau

Mục đích: Lựa chọn được môi trường nuôi cấy thích hợp thay thế môi trường

Hansen cơ bản nhằn thu nhận hàm lượng astaxanthin cao nhất từ chủng nấm men

Rhodosporidium toruloides đột biến được chọn.

Thành phần môi trường nuôi cấy

Môi trường YPD

Hoạt hóa dịch sinh khối nấm men trong môi trường Hansen lỏng , ở điều kiện nhiệt

độ phòng, lắc 200vòng/phút trong 24 giờ, cấy dịch sinh khối sang erlen chứa 100mL

môi trường YM và YPD và sang erlen chứa môi trường Hansen cơ bản ( môi trườngđối chứng ),ở điều kiện nhiệt độ phòng, lắc 200 vòng/phút trong 4 ngày, ly tâm6000v/phút để thu sinh khối , sấy đến trọng lượng không đổi ở 550C, nghiền mẫu vàtiến hành tách chiết astaxanthin, định lượng astaxanthin, so sánh kết quả thu được

với kết quả khi nuôi cấy nấm men Rhodosporidium toruloides trong môi trường

Hansen cơ bản

Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin được tách chiết từ các chủng đột biến bằng phương pháp xác định hoạt tính bắt gốc tự do ABTS

Mục đích: Xác định khả năng kháng oxy hóa của hợp chất astaxanthin từ các chủng

nấm men Rhodosporidium toruloides đột biến được chọn.

Pha dung dịch vitamin C 1000 µg/mL: cân 0,01 g vitamin C pha trong 10 mLDMSO

Pha dung dịch astaxanthin 1000 µg/mL: cân 0,01 g astaxanthin pha trong 10 mLDMSO

Dựng đồ thị hoạt tính ABTS theo nồng độ:

Lô eppendorf số 0 1 2 3 4 5

Lắc đều, hút 0,2 mL qua eppendorf mới

Thể tích mẫu thử đã pha loãng

Lắc đều và ủ 6 phút trong tối ở nhiệt độ phòng, sau đó đem đo độ hấp thu ở bước sóng

734 nm, mỗi lô thí nghiệm thực hiện lặp lại 3 lần

Tỷ lệ bắt gốc ABTS (%) = (A0 – Amẫu)*100/A0

Trong đó: A0 là độ hấp thu của dung môi và ABTS+: Amẫu là độ hấp thu của mẫu thử

và ABTS+

Cách tính IC 50 : Từ phương trình của đồ thị thể hiện sự tương quan giữa tỷ lệ bắt gốc

ABTS (%) và nồng độ chất khảo sát, ta tính ra được nồng độ mẫu tương ứng với tỷ

lệ bắt gốc ABTS là 50 %

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

4.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tia UV đến khả năng sinh tổng hợp

astaxanthin chủng Rhodosporidium toruloides BE1 và B18

Ta tiến hành chiếu tia UV lên dịch nấm men từ hai chủng Rhodosporidium

toruloides BE1 và B18 ở độ pha loãng 10-4 ở các khoảng thời gian 5s, 10s, 15s , 20s ,25s, 30s với khoảng cách cố định giữa đèn UV tới đĩa chứa dịch nấm men là

20cm.Theo như kết quả thu nhận được, cả hai chủng BE1 và B18 sau khi chiếu ở các

khoảng thời gian 5s, 10s, 15s, 20s, 25s, 30s đều cho các đĩa có tỷ lệ phần trăm sốngsót cao gần như nhau Do khoảng tiếp xúc giữa dịch nấm men và đèn UV tốt và khả

năng chống chịu cao của hai chủng BE1 và B18 nên ta thu nhận được các chủng

phát sinh đột biến thay đổi về kiểu hình và kiểu gen, đồng thời có khả năng sống sótcao vượt trội

a)5s b)10s c)15s d)20s e)25s f)30s

Theo hình 4.1 và hình 4.2 nhận thấy tỷ lệ sống sót của hai chủng BE1 và B18 sau khi chiếu tia UV cao gần như nhau Do chủng B18 đã qua lần đầu đột biến Benomyl và chủng BE1 đã qua lần đầu đột biến Benomyl-EMS nên hai chủng có

khả năng sinh tồn cao, kết quả thu nhận được các chủng đột biến từ hai chủng banđầu có khả năng sinh tồn cao vượt trội

Sau khi thu nhận, các chủng đột biến được mã hóa theo chủng ban đầu BE1 và

tương ứng với từng khoảng thời gian chiếu là

Bảng 4.1 Mã hóa giống đột biến theo chủng BE1.

Các chủng đột biến được mã hóa theo chủng ban đầu B18 và tương ứng với từng

khoảng thời gian chiếu là

Bảng 4.2 Mã hóa giống đột biến theo chủng B18.

Mã hóa

Khoảng thời gian

BU

88 chủng đột biến từ chủng ban đầu B18 Chủng hoang dại đạt hàm lượng sinh khối

0,25233 ± 0,0208 (g/L), 182,480 ± 0,058 (µg astaxanthin/g sinhkhốikhô) và 456,280

± 0,001 (µg astaxanthin /L môi trường).Với hàm lượng astaxanthin của chủng BE1

là 884,617 ± 0,021 (μg/g sinh khối khô), đạt 2397,89 ± 0,01 (μg/L môi trường) và

chủng B18 là 348,94 ± 0,001 (μg/g sinh khối khô), đạt 915,323 ± 0,015 (μg/L môi trường nuôi cấy), ta thu nhận được hai chủng tối ưu nhất là chủng BEU108 tích lỹ

astaxanthin 935,471 ± 0,061 (g/g sinh khối khô), đạt 2826,67±1,15 (μg/L môitrường) ; cao gấp 1,05 lần so với chủng ban đầu BE1; đặc biệt cao gấp 6 lần so với

chủng hoang dại ban đầu,chủng BU102 tích lỹ astaxanthin 1065,39±5,39 (μg/g sinh khối khô), đạt 2150,10±1,52 (μg/L môi trường); cao gấp 3 lần so với chủng B18 ban đầu và 4,7 lần so với chủng WT Do đó, hai chủng đột biến BEU108 và BU102 được

lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

Hình 4.3 Khuẩn lạc của chủng BEU108 và BU102.

Hình 4.4 Môi trường 96h nuôi cấy chủng BEU108 và chủng BE1

Hình 4.5 Môi trường 96h nuôi cấy chủng BU102 và chủng B18

Bên cạnh đó, ta cũng thu nhận được mốt số chủng đột biến cho hàm lượngastaxanthin cao vượt trội

Bảng 4.3 Hàm lượng astaxanthin của một số chủng đột biến từ chủng ban đầu BE1.

Mã hóa Hàm lượng sinh khối

khô(g/L)

Hàm lượngastaxanthin(µg/g sinhkhối khô)

Hàm lượngastaxanthin(µg/Lmôi trường )

BEU223 0,31433±0,01692b 982,505±0,178c 3575±263aBEU251 0,29483±0,00407b 972,128±0,111d 2904,36±6,35bBEU108 0,30333±0,001155b,c 935,471±0,061f 2826,67±1,15bBEU104 0,21767±0,00493e,f,g 598,148±0,001n 1268,75±0,58kBEU209 0,212333±0,00577f,g 727,356±0,049m 1542,40±0,58h,i,jBEU219 0,351100±0,000854a 594,939±0,519n 2085,48±0,56e,fBEU6 0,19667±0,00493f,g 1173,91±0,05a 2242,86±0,52d,eBEU7 0,20100±0,00854f,g 909,789±0,012g 1756,82±0,97gBEU117 0,243±0,0269d,e 747,675±0,056l 2049,88±1,16e,fBEU207 0,31347±0,00566b 823,499±0,056i 2557,07±0,001cBEU215 0,211167±0,00764f,g 785,605±1,157j 1650,61±0,57g,h,iBEU208 0,220833±0,00764e,f 770,629±0,576k 1708,44±0,05g,hBEU158 0,191667±0,001528g 1034,45±0,001b 1984,14±1,72fBEU107 0,159667±0,001528h 951,140±0,580e 1502,98±0,58i,jBEU203 0,259±0,00781d 581,18±6,43o 1444,64±3,09j,kBE1 0,287167±0,00208c 884,617±0,021h 2397,89±0,01c,d

Hàm lượngastaxanthin(µg/L môi

trường

BU104 0,29667±0,00577a 983,315±0,608c 2950,18±2,08a

BU 2 0,2517±0,001473c 597,747±1,162m 1492,64±1,05h

BU 51 0,220767±0,000404e,f 673,695±0,013l 1485,45±1,53h,i

WT 0,25133±0,001528c 182,513±0,001p 456,280±0,001n

WT: Chủng nấm men hoang dại.Giá trị trên cùng một cột mang ký tự (a,b,c,d…) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê( P<0,05).