Khảo sát ảnh hưởng của đường và amino acid lên sự sinh tổng hợp glucosinolate của rễ bất định cây bông cải xanh (brassica oleracea l var italica)

ðẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA HUỲNH THỊ KIM KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ðƯỜNG VÀ AMINO ACID LÊN SỰ SINH TỔNG HỢP GLUCOSINOLATE CỦA RỄ BẤT ðỊNH CÂY BÔNG CẢI XANH (Brassica oleracea L var italica) CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ NGÀNH : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12 NĂM 2013 Cơng trình hồn thành tại: Trường ðại học Bách Khoa- ðHQG-TP.HCM Cán hướng dẫn khoa học : (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ ñược bảo vệ Trường ðại Học Bách Khoa, ðHQG Tp.HCM ngày tháng năm Thành phần Hội ñồng ñánh giá Luận văn thạc sĩ gồm: (ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội ñồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) Xác nhận Chủ tịch Hội ñồng ñánh giá LV Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ðỒNG TRƯỞNG KHOA CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ðẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA ðộc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: HUỲNH THỊ KIM MSHV: 11310611 Ngày, tháng, năm sinh: 18 – 03 – 1986 Nơi sinh: Phú Yên Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60.42.80 I TÊN ðỀ TÀI: Khảo sát ảnh hưởng ñường amino acid lên sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất ñịnh cải xanh (Brassica oleracea L var italica) II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nâng cao hàm lượng glucosinolate rễ bất định bơng cải xanh (Brassica oleracea L var italica) cách khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon, tiền chất hữu cơ, tác nhân cảm ứng III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19 – 08 – 2013 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 22 – 11 – 2013 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS LÊ THỊ THỦY TIÊN TP HCM, ngày CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) tháng năm 20 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ðÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA (Họ tên chữ ký) LỜI CÁM ƠN Trong trình học tập trường ðại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh hồn thành luận văn thạc sĩ, tơi nhận nhiều động viên, giúp đỡ chân thành Lời tơi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc ñến PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên, tận tình hướng dẫn, định hướng, sửa chữa, góp ý động viên tinh thần để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành gửi lời cám ơn đến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương, tận tình giảng dạy cho tơi suốt thời gian học cao học, giúp ñỡ tạo ñiều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Cám ơn quản lí phịng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi để tơi sử dụng sở vật chất, máy móc thiết bị phịng thí nghiệm môn Cám ơn chị Nga, chị Thủy, anh Bình, anh Nhựt giúp đỡ tơi động viên tinh thần để tơi vượt qua khó khăn Cám ơn bạn Dân, Phúc, em Duy, Trung, Văn, Vân, Thiện, Nhã giúp đỡ tơi đồng hành tơi suốt q trình làm luận văn Cám ơn ba mẹ anh chị ln bên cạnh tơi, ủng hộ động viên tinh thần giúp tơi vượt qua khó khăn Gia đình ln chỗ dựa động lực tơi phấn ñấu trưởng thành Cuối xin chân thành cám ơn gửi lời chúc sức khỏe, thành công hạnh phúc ñến tất người TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013 Huỳnh Thị Kim TĨM TẮT LUẬN VĂN Tử diệp, trụ hạ diệp cuống tử diệp mầm cải xanh in vitro ngày tuổi ñược sử dụng làm nguyên liệu tạo rễ bất định mơi trường MS bổ sung saccharose 30 g/l, agar g/l IBA nồng ñộ thay ñổi 1,4; 1,6; 1,8 2,0 mg/l Kết cho thấy mơi trường có IBA 1,6 mg/l rễ bất ñịnh hình thành tăng sinh tốt từ mẫu cấy tử diệp với tỉ lệ phát sinh rễ cao (98,40%) khơng có hình thành mơ sẹo Rễ bất định từ tử diệp chuyển sang ni cấy môi trường lỏng với thành phần tương tự môi trường tạo rễ Trong môi trường lỏng, rễ bất ñịnh tăng sinh tốt với trọng lượng rễ khởi đầu 1,2 g/30 ml mơi trường ni cấy, số tăng trưởng rễ hàm lượng glucosinolate cao tuần thứ 3,998 0,617 µmol/g Sự kết hợp saccharose với glucose, saccharose với fructose mơi trường ni cấy thúc đẩy tăng sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất ñịnh (tổ hợp đường có hiệu cao saccharose 30 g/l kết hợp glucose 10 g/l) Trong số amino acid (cystein, phenylalanin, methionin, tyrosin tryptophan) ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm làm tăng sinh tổng hợp glucosinolate, có phenylalanin nồng độ 40 mg/l có hiệu tốt mục đích Sự cảm ứng sorbitol thiếu hụt nước dinh dưỡng ñều làm tăng sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất ñịnh cao gần lần so với ñối chứng SUMMARY Cotyledons, hypocotyls and petioles of days in vitro broccoli seedling were used as explant for to obtain adventitious rooting on MS medium supplement with sucrose 30 g/l, g/l agar and concentration IBA of different (1.4; 1.6; 1.8 and 2.0 mg/l) Results indicating that on medium with IBA 1.6 mg/l adventitious roots from cotyledons initiated and proliferated the best with the highest ratio (98.40%) and without callus initiation Adventitious roots from cotyledons were moved in the liquid medium with the same components as rooting medium The highest proliferation of adventitious roots were found in liquid medium containing 1.2 g roots in fresh weight in 30 ml MS medium, growth and glucosinolate concentration of roots was highest at the third week respectively 3.998 and 0.617 µmol/g The combination sucrose with glucose, sucrose with fructose in medium promoted proliferation and glucosinolates synthesis of adventitious roots (the combinations was sucrose 30 g/l and glucose 10 g/l) The amino acids (cysteine, phenylalanine, methionine, tyrosine and tryptophane) were supplemented in medium to increased glucosinolate biosynthesis Phenylalanine 40 mg/l was the best factor for this purpose Induction by sorbitol and shortages of water and nutrients were increased glucosinolates biosythesis was times higher than controls LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Người viết Huỳnh Thị Kim MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC ẢNH iv CHƯƠNG MỞ ðẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây cải xanh 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Nguồn gốc phân bố 2.1.3 ðặc điểm hình thái 2.1.4 Thành phần hóa học 2.1.5 Công dụng cải xanh 2.1.6 Các nghiên cứu nước 2.2 Giới thiệu glucosinolate 2.2.1 Sự phân bố glucosinolate thực vật 2.2.2 Glucosinolate cấu trúc hóa học 11 2.2.3 Phân loại glucosinolate 12 2.2.4 Sinh tổng hợp glucosinolate 14 2.2.5 Thủy phân glucosinolate 16 2.2.6 Vai trò glucosinolate thông qua isothiocyanate 16 2.2.6.1 Ngăn chặn ung thư 16 2.2.6.2 Bảo tồn chu trình tế bào 17 2.2.6.3 Kháng viêm 17 2.2.6.4 Kháng Helicobacter pylori 18 2.3 Ứng dụng 18 2.4 Nuôi cấy rễ bất ñịnh thu nhận hợp chất thứ cấp (HCTC) 20 2.4.1 Rễ bất ñịnh 20 2.4.2 Sự tạo rễ bất ñịnh in vitro 20 2.4.3 Ni cấy rễ bất định thu nhận HCTC 20 2.4.4 Phương pháp làm tăng sản lượng HCTC nuôi cấy rễ bất ñịnh 23 CHƯƠNG VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu 25 3.2 Phương pháp nghiên cứu 26 3.2.1 Tạo mầm in vitro 27 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng ñộ IBA nguồn gốc mẫu cấy lên tạo rễ bất ñịnh 28 3.2.3 lỏng Khảo sát tăng sinh tổng hợp GLS rễ bất ñịnh môi trường 29 3.2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng trọng lượng rễ ban ñầu ñến tăng sinh rễ bất ñịnh 29 3.2.3.2 Khảo sát tăng sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất ñịnh theo thời gian 30 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon amino acid lên tăng sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất ñịnh 30 3.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng ñộ saccharose glucose lên tích lũy glucosinolate rễ bất ñịnh 30 3.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng ñộ saccharose fructose lên tích lũy glucosinolate rễ bất ñịnh 31 3.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng amino acid lên sinh tổng hợp glucosinolate 32 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng sorbitol ñến khả sinh tổng hợp glucosinolate 32 3.2.6 Ảnh hưởng ñiều kiện thiếu nước dinh dưỡng lên sinh tổng hợp glucosinolate 32 3.2.7 Trích ly định lượng glucosinolate 33 3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 4.1 Kết 37 4.1.1 Sự tạo mầm in vitro 37 4.1.2 Sự tạo rễ bất ñịnh 38 4.1.2.1 Ảnh hưởng nồng ñộ IBA nguồn gốc mẫu cấy lên tạo rễ bất ñịnh 38 4.1.3 Sự nuôi cấy rễ bất định mơi trường lỏng 40 4.1.3.1 Ảnh hưởng trọng lượng rễ khởi ñầu ñến tăng sinh rễ bất ñịnh 41 4.1.3.2 Sự tăng sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất ñịnh theo thời gian42 4.1.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên sinh tổng hợp glucosinolate 43 4.1.4.1 Ảnh hưởng nồng ñộ saccharose glucose lên tích lũy glucosinolate rễ bất ñịnh 43 4.1.4.2 Ảnh hưởng nồng ñộ saccharose fructose lên tích lũy glucosinolate rễ bất ñịnh 44 4.1.4.3 Ảnh hưởng cystein lên sinh tổng hợp glucosinolate 45 4.1.4.4 Ảnh hưởng phenylalanin lên sinh tổng hợp glucosinolate 45 4.1.4.5 Ảnh hưởng methionin lên trình sinh tổng hợp GLS 46 4.1.4.6 Ảnh hưởng tyrosin lên trình sinh tổng hợp glucosinolate 47 4.1.4.7 Ảnh hưởng tryptophan lên trình sinh tổng hợp GLS 48 4.1.5 Khảo sát ảnh hưởng sorbitol lên sinh tổng hợp glucosinolate 49 4.1.5.1 Ảnh hưởng hạn chế nước dinh dưỡng lên tăng sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất ñịnh 50 4.2 Thảo luận 51 4.2.1 Ảnh hưởng auxin lên tạo rễ bất ñịnh 51 4.2.2 Về tăng sinh rễ môi trường lỏng 52 4.2.3 Ảnh hưởng trọng lượng rễ khởi ñầu ñến tăng sinh rễ 52 4.2.4 Vai trị đường tăng sinh tổng hợp GLS rễ bất ñịnh53 4.2.5 Ảnh hưởng amino acid 54 4.2.6 Ảnh hưởng ñiều kiện thiếu nước dinh dưỡng lên sinh tổng hợp glucosinolate 56 ... carbon l? ?n sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất định • Khảo sát ảnh hưởng amino acid l? ?n khả tổng hợp glucosinolate rễ bất định • Khảo sát ảnh hưởng sorbitol ñiều kiện thiếu nước dinh dưỡng l? ?n khả tổng. .. sát ảnh hưởng ñường amino acid l? ?n sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất định bơng cải xanh (Brassica oleracea L var italica) II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nâng cao hàm l? ?ợng glucosinolate rễ bất định. .. 4.7 Ảnh hưởng cystein l? ?n tăng sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất ñịnh cải xanh 45 Hình 4.8 Ảnh hưởng phenylalanin l? ?n tăng sinh tổng hợp glucosinolate rễ bất định bơng cải xanh