Khảo sát lên men, thu nhận, tinh chế và dung hợp Granulocyte Colony Stimulati factor (GCSF) tái tổ hợp từ E. coli với Polyethylenglycol (PEG)

Trong đó, G-CSF tái tổ hợp đươc biểu hiện trong hệ thống vi khuẩn Escherichia coli E.coli được sử dụng rộng rãi do có ưu điểm nuôi cấy đơn giản, chi phí sản xuất thấp, và năng suất cao,

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN QUANG HUY

KHẢO SÁT LÊN MEN, THU NHẬN, TINH CHẾ

VÀ DUNG HỢP GRANULOCYTE COLONY STIMULATI

FACTOR (G-CSF) TÁI TỔ HỢP TỪ E COLI VỚI

POLYETHYLENGLYCOL (PEG)

Chuyên ngành: VI SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2012

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến GS.TS Trần Linh Thước, người thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em học tập và hoàn thành luận văn này.

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS Đặng Thị Phương Thảo, người cô đã trực tiếp hướng dẫn khoa học, dạy bảo, giúp đỡ, quan tâm và động viên tinh thần những lúc em gặp khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu.

Em xin chân thành cảm ơn GS Kaeko Kamei, Viện công nghệ Kyoto, Nhật Bản,

đã luôn tạo mọi điều kiện để em có thể nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận văn Thạc sĩ một cách tốt nhất.

Em xin chân thành cảm ơn chị Tú Anh, đã luôn nhiệt tình giúp đỡ em những lúc

em gặp khó khăn trong công việc cũng như trong cuộc sống trong suốt thời gian

em học tập ở Nhật.

Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn và các em phòng thí nghiệm CNSH Phân tử và Môi trường, phòng thí nghiệm Lên Men đã gợi mở và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm việc và nghiên cứu.

Với lòng kính trọng và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo đã dạy

dỗ và truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học Đại học và sau Đại học.

Và trên hết, con xin cảm ơn bố mẹ đã nuôi con khôn lớn, cho con nghị lực để vượt qua khó khăn Cảm ơn các anh chị luôn yêu thương giúp đỡ em Gia đình luôn là điểm tựa vững chắc cho con.

TP Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng 09 năm 2012

Nguyễn Quang Huy

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH iii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 NHÂN TỐ KÍCH THÍCH DÕNG BẠCH CẦU HẠT – GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR (G-CSF) 3

1.1 Giới thiệu chung 3

1.2 Cấu trúc và hình thái 3

1.3 Nguồn gốc và cơ chế hoạt động 5

1.3.1 Nguồn gốc 5

1.3.2 Cơ chế hoạt động 6

1.3.2.1 Sự tương tác của G-CSF với thụ thể 6

1.3.2.2 Con đường tín hiệu có liên quan 8

1.4 Hoạt tính sinh học 9

2 PHƯƠNG PHÁP CHỮA BỆNH NEUTROPENIA BẰNG G-CSF 11

2.1 Bệnh Neutropenia 11

2.2 Chữa bệnh Neutropenia bằng G-CSF 12

2.3 Một số sản phẩm G-CSF thương mại 14

3 SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN G-CSF Ở ESCHERICHIA.COLI 16

3.1 G-CSF dạng thể vùi điển hình 16

3.2 G-CSF dạng thể vùi non-classical (thể vùi không điển hình) 18

4 SẢN XUẤT THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH 22

4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành thể vùi không điển hình G-CSF 22

4.2 Đánh giá thể vùi không điển hình 24

4.2.1 Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) 24

4.2.2 Đánh giá khả năng hòa tan trong dung môi gây biến tính nhẹ 25

4.2.3 Xác định đặc tính của thể vùi bằng kính hiển vi điện tử 25

4.2.4 Xác định xứ thay đổi thể tích thể vùi trong các điều kiện pH 26

5 DUNG HỢP VÀ TINH CHẾ PROTEIN G-CSF 27

5.1 Dung hợp protein 27

5.2 Tinh chế protein 31

5.2.1 Sắc ký trao đổi ion 31

5.2.2 Sắc ký lọc gel 34

5.2.3 Đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế 35

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 1 VẬT LIỆU 36

1.1 Thiết bị - dụng cụ 36

1.2 Hóa chất 37

1.2.1 Hóa chất dùng cho nuôi cấy vi sinh 37

1.2.2 Hóa chất dùng để phá tế bào 37

1.2.3 Hóa chất dùng cho điện di SDS-PAGE 38

1.2.4 Hóa chất dùng trong điện di NATIVE-PAGE 39

1.2.5 Hóa chất nhuộm bạc 39

1.2.6 Hóa chất lai Western 39

1.2.7 Hóa chất dùng cho định lượng protein bằng phương pháp Bradford 40

1.2.8 Hóa chất tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion 40

1.2.9 Hóa chất thử nghiệm hoạt tính G-CSF 40

1.2.10.Hóa chất dùng trong sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC)

40 1.2.11.Hóa chất dùng trong dung hợp protein 40

1.2.12.Hóa chất dùng trong phân tích phổ khối (mass spectrometry) 41

1.3 Môi trường 41

1.4 Nguyên vật liệu 42

1.4.1 Chủng vi sinh vật 42

2.3.1 Khảo sát thời gian phản ứng

59

1.4.2 Dòng tế bào M-NFS60 43

1.4.3 Các thang phân tử lượng dùng trong điện di và chuyển màng 43

1.4.4 Các kháng thể sử dụng cho phương pháp lai Western 43

1.4.5 Cột tinh chế 44

2 PHƯƠNG PHÁP 44

2.1 Cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình và khảo sát khả năng thu nhận hG-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình 44

2.1.1 Các bước chuẩn bị 44

2.1.2 Lên men cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình và không điển hình 46

2.1.3 Các phương pháp phân tích thể vùi thu được sau quá trình lên men 46

2.1.3.1 Phương pháp phá tế bào thu nhận thể vùi điển hình và không điển hình 48

2.1.3.2 Phương pháp hòa tan thể vùi 48

2.1.3.3 Kiểm tra khả năng biểu hiện hG-CSF bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE 49

2.1.3.4 Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford 51

2.1.3.5 Xác nhận cấu hình tự nhiên của hG-CSF bằng kỹ thuật điện di NATIVE-PAGE và sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) 52

2.1.3.6 Đánh giá hoạt tính sinh học của hG-CSF bằng phương pháp thử hoạt tính trên tế bào invitro 55

2.1.3.7 Đánh giá hiệu quả lên men thu nhận hG-CSF 57

2.2 Khảo sát khả năng hòa tan thể vùi không điển hình bằng N-lauroylsarcosine, Tween20 và DMSO 57

2.2.1 Đánh giá mức độ biểu hiện G-CSF bằng phần mềm Quantity One 58

2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dung hợp G-CSF với chất cao phân tử Polyethyleneglycol (PEG) được xúc tác bởi transglutaminase (TGase) 58

3.3 Khảo sát nhiệt độ phản ứng dung hợp

81

2.3.2 Khảo sát dung dịch đệm và nồng độ TGase trong phản ứng dung hợp PEG vào G-CSF 59

2.3.3 Khảo sát nhiệt độ phản ứng dung hợp 59

2.4 Tinh sạch protein sau dung hợp bằng sắc ký trao đổi anion và sắc ký lọc gel 61

2.5 Xác định trọng lượng phân tử của protein dung hợp bằng MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization-Time Of Flight) 64

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 1 CẢM ỨNG BIỂU HIỆN hG-CSF DẠNG THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THU NHẬN hG-CSF CÓ HOẠT TÍNH TỪ THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH 66

1.1 Phân tích sự biểu hiện G-CSF dạng thể vùi không điển hình bằng SDS-PAGE và lai Western 66

1.2 Thu nhận G-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình 67

1.2.1 Hòa tan thể vùi trong N-lauroylsarcosine 67

1.2.2 Phân tích cấu hình tự nhiên của G-CSF thu nhận được bằng NATIVE- PAGE và RP-HPLC 69

1.2.3 Đánh giá hoạt tính sinh học 72

2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HÕA TAN THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH BẰNG N-LAUROYLSARCOSINE, TWEEN20 VÀ DMSO 73

2.1 Khảo sát khả năng hòa tan 73

2.2 Khảo sát nồng độ dung dịch hòa tan Tween20 76

2.3 Khảo sát tỉ lệ hòa tan của Tween20 đối với thể vùi không điển hình 76

3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH DUNG HỢP PROTEIN G-CSF VỚI PEG ĐƯỢC XÖC TÁC BỞI TGase 78

3.1 Khảo sát thời gian phản ứng dung hợp 78

3.2 Khảo dung dịch đệm và nồng độ TGase trong phản ứng dung hợp PEG vào G-CSF 79

4 TINH SẠCH PROTEIN SAU QUÁ TRÌNH DUNG HỢP BẰNG SẮC KÝ

TRAO ĐỔI ANION VÀ SẮC LÝ LỌC GEL 82

4.1 Sắc ký trao đổi anion 83

4.2 Sắc ký lọc gel 84

5 XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA PROTEIN SAU DUNG HỢP BẰNG MALDI-TOF 86

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 1 KẾT LUẬN 89

2 ĐỀ NGHỊ 90

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 91

TÀI LIỆU THAM KHẢO 92

PHỤ LỤC 96

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANC Asolube neutrophil count

ATCC American Type Culture Collection

CRH Cytokine receptor homologous

CSF Colony stimulating factor

DNA Deoxyribose nucleic acid

EDTA Ethylene Diamine TetraAcetic acid

FDA Food And Drug Administration

G-CSF Granulocyte colony stimulating factor

G-CSFR Thụ thể của protein hG-CSF (hG-CSF receptor)

G-MCSF Granulocyte macrophage colony stimulating factor

ncIBs non-classical Inclusion Bodies

PBST Phosphate Buffered Saline Tween

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh ưu nhược điểm của mỗi phương pháp sản xuất protein ở E.coli 16

Bảng 1.2 So sánh ưu điểm và nhược điểm giữa việc sản xuất protein tái tổ hợp ở dạng thể vùi điển hình và thể vùi không điển hình 21

Bảng 2.1 Môi trường lên men chủng E coli BL21(DE3)/pET-G-CSF (TV) 42

Bảng 2.2 Thí nghiệm đo Bradford với dung dịch chuẩn Albumin 51

Bảng 2.3 Chương trình chạy RP-HPLC phân tích mẫu hG-CSF

55 Bảng 3.1 So sánh kết quả hòa tan giữa thể vùi không điển hình và điển hình 68

Bảng 3.2 Hoạt tính của protein trong dịch hòa tan thể vùi điển hình và không điển hình 77

Bảng 3.3 Hiệu suất tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion và lọc gel 85

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc gen g-csf, mRNA và protein G-CSF 4

Hình 1.2 Cấu trúc mô hình bó xoắn 4 chuỗi của G-CSF 5

Hình 1.3 Sự điều hòa sản xuất G-CSF

6 Hình 1.4 Cấu trúc thụ thể G-CSF 7

Hình 1.5 Cấu trúc phức hợp tương tác giữa G-CSF và G-CSFR 8

Hình 1.6 Con đường tín hiệu trong tế bào khi G-CSF gắn với G-CSFR 9

Hình 1.7 Sự hoạt động và biệt hóa tế bào máu do G-CSF và các cytokine khác 11

Hình 1.8 Một số sản phẩm hG-CSF thương mại 14

Hình 1.9 Mô hình hấp dẫn giải thích sự hình thành của thể vùi 18

Hình 1.10 Các công đoạn chính của quá trình thu nhận G-CSF từ thể vùi điển hình và không điển hình sau quá trình sản xuất ở E coli 20

Hình 1.11 Phổ hồng ngoại (IR) ở các vùng Amit I và Amit II của G-CSF ở dạng

dung dịch, dạng tủa và dạng thể vùi 24

Hình 1.12 Ảnh cắt dọc của tế bào E coli dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt 26

Hình 1.13 Thể vùi không điển hình của G-CSF dưới kính hiển vi điện tử quét 26

Hình 1.14 Sự giảm thể tích cặn thể vùi khi thay đổi pH môi trường từ 7 xuống 4 27

Hình 1.15 Quá trình dung hợp PEG với phân tử G-CSF tại đầu N-terminal 29

Hình 1.16 Quá trình dung hợp PEG với phân tử G-CSF tại nhóm acyl thuộc Glutamine tại vị trí 133 trên phân tử GCSF 31

Hình 1.17 Nguyên tắc sắc kí trao đổi anion 33

Hình 1.18 Nguyên tắc sắc kí trao đổi cation 33

Hình 1.19 Nguyên tắc sắc kí lọc gel 34

Hình 2.1 Các vị trí lắp đặt thiết bị trên bình lên men 45

Hình 2.2 Hệ thống thiết bị lên men 46

Hình 2.3 Sơ đồ các bước đánh giá khả năng thu nhận G-CSF từ hai dạng thể vùi điển hình và không điển hình 47

Hình 2.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE 50

Hình 2.5 Phản ứng cho màu Coomassie 51

Hình 2.6 Đồ thị miêu tả đường chuẩn Bradford 52

Hình 2.7 Sơ đồ đánh giá lượng G-CSF qua các bước xử lý sau lên men 57

Hình 3.1 Xác nhận sự biểu hiện protein G-CSF ở dạng thể vùi không điển hình bằng điện di SDS PAGE và lai Western 66

Hình 3.2 Khả năng hòa tan của protein nằm trong thể vùi điển hình và thể vùi không điển hình 68

Hình 3.3 So sánh khả năng hòa tan giữa thể vùi điển hình và không điển hình 69

Hình 3.4 So sánh cấu hình tự nhiên của G-CSF so với mẫu neupogen chuẩn bằng điện di NATIVE PAGE 70

Hình 3.5 Kiểm tra cấu hình tự nhiên của protein nằm trong dịch hòa tan bằng RP- HPLC 71

Hình 3.6 Lượng G-CSF có hoạt tính trong dịch hòa tan từ thể vùi điển hình và thể

vùi không điển hình 72

Hình 3.7A Định tính khả năng hòa tan thể vùi không điển hình bằng

N-lauroylsarcosine, DMSO và Tween20 74

Hình 3.7B Lượng G-CSF trên 1g thể vùi không điển hình 75 Hình 3.8 Lượng G-CSF hòa tan được tính trên 10mg thể vùi không điển hình với tỉ

lệ hòa tan 1g thể vùi : 40ml dung dịch hòa tan 76

Hình 3.9 Đồ thị biểu thị lượng G-CSF sau hòa tan tính trên 10mg thể vùi không

điển hình với các tỉ lệ hòa tan khác nhau 77

Hình 3.10 Kết quả dung hợp G-CSF với PEG5kDa ở các khoảng thời gian khác

Hình 3.14 Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế bằng phương pháp sắc

ký lọc gel 85

Hình 3.15 Kết quả phân tích phổ khối sản phẩm sau dung hợp bằng MALDI-TOF 87

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

1

LỜI MỞ ĐẦU

Ung thư là căn bệnh có nguy cơ toàn cầu vì mức độ lan rộng cũng như tỉ lệgia tăng số người mắc bệnh ngày càng cao Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) sốngười tử vong vì ung thư vào năm 2008 là 7,6 triệu, chiếm 13% trong tổng số ca tửvong Ở Việt Nam, ung thư là một vấn đề được toàn xã hội quan tâm vì mức độ giatăng nhanh chóng cũng như nhiều hạn chế trong điều trị

Với chức năng kích thích sự biệt hóa, tăng sinh, trưởng thành và chức năngcủa các tế bào bạch cầu trung tính trong vùng máu ngoại vi chống lại sự nhiễmkhuẩn và các rủi ro khác khi điều trị ung thư, G-CSF đã được quan tâm sản xuấttrong nhiều hệ thống biểu hiện khác nhau như vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật

Trong đó, G-CSF tái tổ hợp đươc biểu hiện trong hệ thống vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) được sử dụng rộng rãi do có ưu điểm nuôi cấy đơn giản, chi phí sản xuất

thấp, và năng suất cao, tuy nhiên, protein thu nhận được thường ở dạng thể vùi, vàkhông có hoạt tính sinh học

Gần đây, Spela Petenel và cộng sự đã khám phá ra một dạng mới của thể vùi

khi biểu hiện vượt mức trong tế bào E.coli, bên trong lớp thể vùi có cấu trúc gấp

cuộn sai là các tiền chất gấp cuộn đúng, dễ dàng hoà tan trong dung dịch chất biếntính nhẹ, và đặc biệt là có hoạt tính sinh học sau khi hoà tan, được nhóm tác giả nàygọi là thể vùi không điển hình (non classical inclusion body)

Năm 1991, sản phẩm G-CSF tái tổ hợp đầu tiên được thương mại hóa có tênNeupogen, do công ty Amgen - Hoa Kỳ sản xuất, với giá thành một lọ tiêm

300µg/ml khoảng 1,7 triệu đồng Do mức độ đào thải Neupogen ra khỏi cơ thể bởicác protease cũng như là khả năng gây đáp ứng miễn dịch trong tế bào khá cao, nênngười bệnh cần phải được tiêm nhắc mỗi ngày trong suốt quá trình điều trị ung thư.Một lần nữa công ty Amgen đã đi đầu trong nghiên cứu khắc phục nhược điểm củaNeupogen bằng cách tiến hành dung hợp G-CSF với chất cao phân tửPolyethylenglycol (PEG) và đã dung hợp thành công G-CSF với NH2-PEG20kDa

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2

tại vị trí đầu N của protein, Năm 2002, cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩmHoa kỳ đã phê duyệt và đồng ý cho sản phẩm dung hợp này, có tên thương mại làNeulasta, được sử dụng thay thế cho các protein G-CSF tái tổ hợp đơn thuần, giúpcho quá trình điều trị ung thư dễ dàng và chi phí cũng thấp hơn

Việc nhập khẩu các sản phẩm G-CSF cũng như PEG-G-CSF từ nước ngoài đểđiều trị cho các bệnh nhân đã làm cho chi phí điều trị tăng lên khá cao và không phùhợp với phổ rộng người bệnh nước ta Do đó, việc nghiên cứu các qui trình côngnghệ để sản xuất protein G-CSF tái tổ hợp dung hợp với chất cao phân tử PEG nhằmđáp ứng nhu cầu trong nước, giúp giảm chi phí điều trị, phù hợp với thu nhập của đại

bộ phận bệnh nhân nước ta là một yêu cầu cấp thiết

Với mục tiêu như trên, chúng tôi thực hiện đề tài thạc sỹ: “Khảo sát lên men,

thua nhận, tinh chế và dung hợp Grannlocyte colony stimulati factor (G-CSF) tái

tổ hợp từ E coli với Polyethylenglycol (PEG)” với các nội dung chính như sau:

– Cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình

– Khảo sát khả năng thu nhận hG-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình– Khảo sát khả năng hoà tan thể vùi không điển hình bằng N-lauroylsarcosine, Tween20 và DMSO

– Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dung hợp hG-CSF với chất cao phân tử Polyethyleneglycol (PEG) bằng enzyme transglutaminase (TGase)– Tinh sạch protein sau quá trình dung hợp

– Phân tích trọng lượng phân tử của protein dung hợp sau tinh chế bằng

phương pháp phổ khối (mass spectrometry)

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 NHÂN TỐ KÍCH THÍCH DÕNG BẠCH CẦU HẠT – GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR (G-CSF)

1.1 Giới thiệu chung

G-CSF là một loại cytokine có bản chất là glycoprotein, đóng vai trò kíchthích sự tăng sinh, biệt hóa và quy định chức năng của những tế bào tiền thân củabạch cầu trung tính (neutrophil) hay chính sự trưởng thành của bạch cầu trung tính[30]

G-CSF chuột lần đầu tiên được nhận diện và tinh chế tại Úc vào năm 1983.Đến năm 1986, G-CSF người chính thức được tạo dòng phân tử bởi Nigata và cộng

sự, họ sử dụng mẫu dò oligonucleotide để thu nhận cDNA mong muốn bằng laiSouthern Blot [9] Từ đó mở ra một thời kì sản xuất G-CSF tái tổ hợp số lượng lớntrên vi sinh thông qua kĩ thuật tái tổ hợp DNA

1.2 Cấu trúc và hình thái

Gen g-csf mã hóa cho G-CSF ở người nằm trên nhiễm sắc thể số 17, tại vị trí

q11-12, dài khoảng 2.5Kb, có 5 exon và 4 intron Trong đó, vùng 300bp ở đầu 5’ của

sự phiên mã đóng vai trò kiểm soát sự biểu hiện gen g-csf Ngoài ra, với sự hiện diện

của đoạn trình tự giàu AU trong vùng 3’ không mã hóa lại là vị trí cốt yếu làm mất

ổn định mRNA g-csf và ảnh hưởng đến mức độ phiên mã và hậu phiên mã mRNA của g-csf (Hình 1.1) [9]

Gen g-csf mã hoá cho hai mRNA khác nhau, tùy thuộc vị trí cắt bỏ intron thứ

hai trong quá trình splicing mRNA Hai mRNA này mã hoá cho hai protein tiền CSF (preG-CSF) chứa 204 và 207 axít amin Sau khi được dịch mã, preG-CSF đượcvận chuyển qua mạng lưới nội chất nhám để được tiết ra khỏi tế bào Trong quá trìnhnày, đầu N chứa trình tự tín hiệu tiết 30 axít amin bị cắt bỏ để tạo nên hai phân tử G-CSF có hoạt tính chứa 174 và 177 axít amin Trong đó, dạng hoạt động gồm

G-174 axít amin có hoạt tính cao và được sử dụng nhiều làm protein dược phẩm [30]

Hình 1.1 Cấu trúc gen g-csf, mRNA và protein G-CSF

Cấu trúc G-CSF người (hG-CSF) được xác định qua phân tích cấu trúc tinhthể tia X và phổ hạt nhân [9] hG-CSF trưởng thành bao gồm 174 axít amin và trọnglượng phân tử khoảng 18,7kDa Phân tử hG-CSF được O-glycosyl hóa ở threonine

vị trí thứ 133, đặc điểm này giúp phân tử hG-CSF tránh được sự kết tụ protein vàgiúp làm tăng tính bền đối với nhiệt độ và pH Phân tử hG-CSF tái tổ hợp được sản

xuất ở E coli mặc dù không có nhóm O-glycosyl hóa nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính,

do nhóm này không ảnh hưởng đến tương tác của hG-CSF với thụ thể Trong phân

tử có năm cystein, bốn cystein tạo thành hai cầu nối disulfide là Cys36-Cys42 vàCys64-Cys74, nhờ hai cầu nối này hG-CSF mới có hoạt tính Cys thứ 17 còn lại ởdạng tự do, có nhiều nghiên cứu cho thấy nó có liên quan đến sự kết tụ của proteinhG-CSF Thêm vào đó, hai đoạn aa ngắn từ vị trí axít amin 44-47 (310) và 48-53 (α)

giúp duy trì sự ổn định cấu trúc G-CSF trong không gian (Hình 1.2) [16]

Hình 1.2 Cấu trúc mô hình bó xoắn 4 chuỗi của G-CSF

1.3 Nguồn gốc và cơ chế hoạt động

1.3.1 Nguồn gốc

G-CSF cũng như các loại nhân tố tăng trưởng (HGF) khác, được sản xuất ởnhiều loại tế bào và mô khác nhau G-CSF được sản sinh từ các nguyên bào sợi, các

đại thực bào và những tế bào nội mô (Hình 1.3) qua trung gian là các cytokine

(interleukine-1, interleukine-6 và nhân tố hoại tử khối u α (TNFα)) bằng con đườngtín hiệu thông tin thứ hai (second-messenger)

Sau khi được tạo ra, G-CSF lập tức làm nhiệm vụ biệt hóa giúp cho sự trưởngthành của bạch cầu trung tính từ những tế bào gốc tủy xương đồng thời kích thíchđưa chúng vào hệ máu ngoại vi để thực hiện chức năng sinh học [5]

Hình 1.3 Sự điều hòa sản xuất G-CSF

1.3.2 Cơ chế hoạt động

Trong tế bào, để thực hiện chức năng của mình, bất cứ loại cytokine nào hoạtđộng cũng cần phải có thụ thể G-CSF cũng không ngoại lệ, chúng tương tác thụ thểcủa mình để hoạt hóa con đường tín hiệu trong tế bào tiền thân của bạch cầu trungtính [21]

1.3.2.1 Sự tương tác của G-CSF với thụ thể

Thụ thể của G-CSF (G-CSF receptor hay G-CSFR) (Hình 1.4) hiện diện trên

những tế bào tiền thân trong tủy xương và được kích thích bởi G-CSF G-CSFR gồm

3 vùng có chức năng khác nhau: vùng ngoài tế bào để tương tác với G-CSF;

vùng xuyên màng giúp định vị G-CSFR trên màng và vùng nằm trong tế bào chất có nhiệm vụ hoạt hóa con đường tín hiệu [12].

Hình 1.4 Cấu trúc thụ thể G-CSF

G-CSF trước tiên tương tác với CRH (cytokine receptor homologousmodule), đây là dạng cấu trúc tương đồng thụ thể cytokine CRH được gắn với mộtdomain globuline miễn dịch (Ig) và 3 phân tử fibronectin loại III (FNIII) CRHtương tác với domain Ig của G-CSFR và với G-CSF ở vị trí II Tương tác thông quacác axít amin E (axít glutamic), R (Arginine) ở đầu N (BN) và đầu C (BC) Sự gắnkết này thúc đẩy sự thay đổi thành phần trong phức hợp G-CSF và G-CSFR, chophép tương tác giữa domain Ig của thụ thể với G-CSF thông qua vị trí III Kết quảG-CSFR bị dimer hóa và hình thành phức hợp cấu trúc homodimer 2:2 (2G-CSF –

2G-CSFR) (Hình 1.5)

Hình 1.5 Cấu trúc phức hợp tương tác giữa G-CSF và G-CSFR

Ngoài ra, sự gắn kết của G-CSF với domain Ig trong một thụ thể “khảm”(chimeric receptor), gp130 (GR-Ig), rất cần thiết cho sự thay đổi hình dạng của G-CSF khi có và không gắn với G-CSFR Sau khi được hoạt hóa, thông qua cácdomain 1,2,3 (Box 1,2,3) gắn tyrosine (Y) và các họ protein trong tế bào, chuỗi tínhiệu sẽ hình thành và khởi đầu cho tín hiệu tăng sinh, biệt hóa, sống sót [12]

1.3.2.2 Con đường tín hiệu có liên quan

Sau khi G-CSF tương tác với G-CSFR, ngay lập tức làm thay đổi hình dạngG-CSFR và giúp cho hai phân tử Jak2 của G-CSFR gắn kết với nhau Lúc này, họprotein Jak tyrosine kinase (Jak1, Jak2, Tyk ) cùng với một loạt tyrosine trong G-CSFR ở domain 1 và 2 (Box 1,2) sẽ được phosphoryl hóa Ngoài ra, các STAT1,STAT3, STAT5 gắn trên các tyrosine đó cũng lần lượt bị dimer hóa Trong đó, STAT

3 là nhân tố quan trọng nhất, STAT3 được gắn với tyrosine Y704 và Y744, làm

nhiệm vụ truyền tín hiệu vào trong nhân để kích thích biệt hóa tế bào (Hình 1.6)

[7]

Tuy nhiên yếu tố quan trọng nhất đóng vai trò “chìa khóa” trong chuỗi tínhiệu là SOCS và Ship SOCS gắn trực tiếp với G-CSFR và phosphoryl hóa Y729.Ngược lại, Ship không gắn với G-CSFR nhưng tác động thông qua Shc, Shcphosphoryl hóa Y764 và hoạt hóa protein Ras MAPK hình thành tín hiệu hoạt hóatăng sinh

Ngoài ra, những thành viên của họ Src kinase (Lyn và Hck) cũng được kíchhoạt sau khi được phosphoryl hóa Sau đó, Lyn có thể sẽ truyền tín hiệu hoạt hóatrực tiếp Ras-MAPK hay gián tiếp thông qua P13 kinase P13 kinase theo đó kíchthích Akt truyền tín hiệu vào nhân kích thích sự sống sót thông qua ức chếapoptosis.

Hình 1.6 Con đường tín hiệu trong tế bào khi G-CSF gắn với G-CSFR

Con đường tín hiệu trong tế bào kích thích bởi G-CSF là một quá trình đượcđiều hòa kiểm soát một cách chặt chẽ Chính sự chặt chẽ, liên hoàn này là yếu tố cốtlõi mà tế bào bạch cầu trung tính có thể trưởng thành, tồn tại ổn định cũng như thựchiện chính xác vai trò sinh lý quan trọng

1.4 Hoạt tính sinh học

G-CSF không chỉ là nhân tố điều hòa, kích thích tăng sinh, biệt hóa, tồn tạicủa dòng tế bào bạch cầu trung tính mà còn là nhân tố ổn định và duy trì khả năngmiễn dịch của cơ thể chủ [4] G-CSF ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng của bạchcầu trung tính trưởng thành qua con đường gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể(ADCC), thúc đẩy tiết axít arachidonic từ bạch cầu trung tính Ngoài ra, G-CSF còn

có khả năng gắn các peptide hướng hóa FMLP (N-formyl-methionel-leucyl-phenyl

alanine) với bạch cầu trung tính giúp quá trình thực bào qua trung gian kháng thể vàđiều hòa hoạt động của hệ thống bổ thể thông qua thụ thể C3b [26] [27]

Ở một số bệnh nhân thiếu hụt G-CSF, sau khi sử dụng G-CSF khoảng 4-7ngày, số lượng của những tế bào sơ khai (myeloid, erythriod, megakaryocytic )trong máu gia tăng rõ rệt Những nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra khả năng huyđộng tế bào gốc trong máu của những bệnh nhân vừa trải qua cấy ghép tế bào gốctạo máu dị sinh của G-CSF [14]

G-CSF cùng với những nhân tố tăng trưởng khác như M-CSF CSF), EPO (erythropoietin) hay IL (interleukine) là những mắt xích quan trọnggiúp cho tế bào máu được biệt hóa, tăng sinh từ tế bào gốc đa năng ở tủy xương

(macrophage-(Hình 1.7) [12] Khi không có G-CSF hay với sự hiện diện rất nhỏ do một số nguyên

nhân nào đó như hóa trị ung thư cơ thể sẽ bị thiếu hụt một số lượng lớn những tếbào bạch cầu trung tính trưởng thành Điều này lại ảnh hưởng trực tiếp lên sự cânbằng của hệ thống miễn dịch và kéo theo một loạt những hậu quả nghiêm trọng Tìnhtrạng này có tên là neutropenia (bệnh giảm bạch cầu)

Hình 1.7 Sự hoạt động và biệt hóa tế bào máu

do G-CSF và các cytokine khác

2 PHƯƠNG PHÁP CHỮA BỆNH NEUTROPENIA BẰNG G-CSF

2.1 Bệnh Neutropenia

Neutropenia là bệnh rối loạn khả năng tạo tế bào máu của cơ thể, đặc biệt là

sự giảm bất thường số lượng bạch cầu hạt trung tính trong máu (<1500 tế bào/mm3).Bạch cầu hạt trung tính chiếm hơn 70% tế bào bạch cầu trong máu và giữ vai tròchủ yếu trong các cơ chế phòng vệ chống lại sự xâm nhiễm Bạch cầu hạt trung tính

sẽ di chuyển đến các vị trí bị nhiễm và tiêu hóa, phân hủy các vi sinh vật Vì vậy, khi

số lượng bạch cầu hạt trung tính giảm xuống dưới mức cần thiết ở máu ngoại vi sẽdẫn đến neutropenia làm tăng nguy cơ nhiễm khuẩn và có thể gây tử vong

Người bị neutropenia có những triệu chứng nặng nhẹ khác nhau tùy theomức độ Những triệu chứng thường gặp như viêm amidan, đau họng, loét miệng hay

áp xe da Ngoài ra, nếu nhiệt độ cơ thể trên 38,50C/101,30F dễ gây ra những ảnhhưởng không tốt khác có liên quan [37]

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2007) trên thế giới có 7,9 triệu người chết

vì ung thư, chiếm 13% tổng số các ca tử vong Và dự đoán đến năm 2030 số người

tử vong vì ung thư tăng lên 11,5 triệu ca Do vậy, việc áp dụng các biện pháp điều trịung thư hiện nay là rất phổ biến và cấp thiết Tuy nhiên khi áp dụng hóa trị liệu và xạtrị ung thư người bệnh sẽ rất dễ rơi vào tình trạng giảm bạch cầu trung tính hay còngọi là neutropenia Ngoài những biến chứng thông thường của bệnh, neutropenia còngây những tác hại to lớn cả về sức khỏe lẫn chi phí điều trị Trước tiên neutropenia

sẽ làm gián đoạn phác đồ trị liệu ung thư, kéo dài thời gian bệnh Sau đó, sẽ làm tăngchi phí chữa trị, nhất là chi phí nằm viện Chính vì vậy, thông qua tác động làm giảmbạch cầu trung tính, neutropenia gây suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể Do đó,những bệnh nhân neutropenia dễ dàng mắc các bệnh cơ hội do nhiễm khuẩn hay vi-rút Để điều trị bệnh neutropenia, G-CSF tái tổ hợp hiện nay vẫn là nhân tố điều trịhiệu quả nhất [40]

2.2 Chữa bệnh Neutropenia bằng G-CSF

Việc sử dụng G-CSF làm giảm 50% nguy cơ nhiễm khuẩn và các rủi ro kháckhi sử dụng kết hợp sau hóa trị ung thư Cụ thể là, ở một số bệnh nhân ung thư, saukhi tiêm G-CSF lượng bạch cầu trung tính gia tăng rõ rệt trong máu ngoại vi trongvòng 24 giờ, kèm theo làm tăng nhẹ bạch cầu đơn nhân [7] Từ những thí nghiệmtrên lâm sàng, G-CSF cho thấy khả năng thúc đẩy mạnh mẽ sự gia tăng số lượngbạch cầu trung tính tùy theo liều lượng sử dụng Những nghiên cứu của Crawford vàcộng sự năm 1991 trên những bệnh nhân ung thư phổi cho thấy rằng thời gian bịneutropenia từ 6 ngày xuống 3 ngày với liều lượng sử dụng G-CSF là khoảng

5µg/kg/ngày bắt đầu từ ngày kết thúc hóa trị Tuy nhiên, một điều cần lưu ý là: liều lượng sử dụng hằng ngày của G-CSF nên được tiếp tục cho đến khi qua được giai

đoạn bạch cầu trung tính thấp nhất và sau khi số bạch cầu trung tính đạt được mứcbình thường.

Thêm vào đó, việc điều trị bằng G-CSF làm giảm đáng kể tần suất, mức độnặng và thời gian của giảm bạch cầu và giảm bạch cầu có sốt, thường thấy ở nhữngbệnh nhân sau hóa trị gây độc tế bào Thời gian cần thiết cho điều trị có thể lên đến

14 ngày tùy theo loại, liều lượng và phác đồ hóa trị gây độc tế bào được dùng Saukhi ngưng điều trị với G-CSF, lượng bạch cầu đa nhân trung tính trong máu giảm đi50% trong vòng 1-2 ngày và trở về mức bình thường trong vòng 1-7 ngày [15].Bệnh nhân điều trị kết hợp bằng G-CSF và hóa trị gây độc tế bào có thời gian nằmviện ít hơn và ít sử dụng kháng sinh hơn so với những bệnh nhân chỉ sử dụng đơnthuần riêng lẻ từng loại [8]

G-CSF cũng có hiệu quả đối với việc điều trị trên những bệnh nhân bị

neutropenia mãn tính, neutropenia chu kỳ hay tự phát Sự sản xuất bạch cầu trungtính có thể được thúc đẩy gia tăng bằng cách tiêm G-CSF với liều lượng khoảng1-10µg/kg/ngày Những nghiên cứu khác cũng chứng tỏ, G-CSF giúp gia tăng vàhuy động những tế bào sơ khai trong máu ngoại vi, tái sản sinh bạch cầu trung tính

và làm giảm lượng tế bào hồng cầu và tiểu cầu thông qua truyền máu [8]

Sử dụng lặp lại hG-CSF trong nhiều ngày hay nhiều tuần dẫn đến sự mở rộngquá trình hình thành bạch cầu hạt và trạng thái ổn định số lượng bạch cầu hạt trungtính Đáp ứng này có thể được ứng dụng cho các bệnh nhân sản xuất bạch cầu hạttrung tính không hiệu quả do mắc phải neutropenia cấp tính kinh niên hG-CSF cũnglàm giảm sự apoptosis của bạch cầu hạt trung tính, kéo dài sự sống của tế bào, tácdụng này có thể được ứng dụng điều trị cho các bệnh nhân mắc neutropenia donhiễm HIV

Do có khả năng kích thích dòng bạch cầu hạt tăng sinh, chống lại khả năngnhiễm khuẩn nên hG-CSF cũng được ứng dụng trong điều trị nhiễm khuẩn

Trong một số trường hợp điều trị neutropenia bẩm sinh nặng, khoảng 5-10%bệnh nhân xuất hiện hội chứng loạn sản sinh tủy, bệnh bạch cầu tủy cấp Tính an

toàn cũng như hiệu quả của G-CSF ở những bệnh nhân neutropenia bị chứng loạnsản sinh tủy, bệnh bạch cầu tủy cấp hoặc bệnh bạch cầu mãn tính dòng tủy chưađược xác định Do đó, cẩn thận trong khi dùng G-CSF trên bất kỳ bệnh lý ác tínhnào có liên quan đến tế bào dòng tủy [19]

Tóm lại, G-CSF là tác nhân hiệu quả hàng đầu ở những bệnh nhân có liênquan đến neutropenia Do nhu cầu sử dụng G-CSF là rất lớn, vì vậy hiện nay hầu hếtcác sản phẩm G-CSF thương mại đều được sản xuất thông qua kỹ thuật DNA tái tổhợp

2.3 Một số sản phẩm hG-CSF thương mại

Có 3 loại sản phẩm hG-CSF phổ biến trên thị trường (Hình 1.8)

 Filgrastim với tên thương mại Neupogen®

 Lenograstim: Granocyte®

 Pegfilgrastim: Neulasta®

Hình 1.8 Một số sản phẩm hG-CSF thương mại

Filgrastim là sản phẩm hG-CSF gồm 175 axít amin, trọng lượng phân tử là

18,8kDa được sản xuất từ vi khuẩn E coli So với hG-CSF tự nhiên, phân tử protein

này có thêm một axít amin methionine ở đầu N và không được O-glycosyl hóa Tuynhiên, filgrastim vẫn giữ được hoạt tính sinh học [32]

Lenograstim là hG-CSF tái tổ hợp được O-glycosyl hoá sản xuất từ tế bàobuồng trứng chuột đồng được sử dụng trong điều trị sau hoá trị liệu cũng như ghéptuỷ, đặc biệt có hoạt tính tốt trong quá trình kích thích huy động các tế bào CD34+.[32]

Pegfilgrastim chính là filgrastim dung hợp với polyethylenglycol (PEG), làmột polymer trơ, tan trong nước Filgrastim có thời gian tồn tại ngắn chỉ khoảng 3-5giờ nhưng Pegfilgrastim (Neulasta) lại tồn tại lâu hơn, do đó làm giảm khả năng bịthải loại trong quá trình lọc ở thận, giúp tăng thời gian hoạt động Khi bạch cầu hạttrung tính ở mức thấp thì sự thải loại pegfilgrastim cũng thấp và sẽ tăng ngay khibạch cầu hạt trung tính phục hồi Thường sau 24h hóa trị liệu thì sẽ tiêm dưới damột lượng 6mg [36]

Trên thực tế, những ứng dụng của G-CSF có phạm vi rất lớn Từ những bệnhnhân ung thư, đến các bệnh nhân bị bệnh tự miễn, thiếu hụt miễn dịch, thần kinh,AIDS hay các chứng bệnh nảy sinh do nhiễm khuẩn, dinh dưỡng không điều độ Nắm bắt nhu cầu đó, sản xuất dược phẩm có nguồn gốc từ G-CSF không nhữngmang lại một lợi nhuận khổng lồ mà còn mang lại nhiều hy vọng cho người bệnh.[36]

Tại "Hội nghị quốc tế về ứng dụng y học hạt nhân trong ung thư, tim mạch vàcác bệnh khác", diễn ra vào ngày 7-8/05/2009, các chuyên gia cho biết, ước tính đếnnăm 2010, mỗi năm nước ta có thêm khoảng 200.000 người mắc bệnh ung thư vàkhoảng 100.000 người sẽ tử vong Do vậy, số bệnh nhân ung thư phải áp dụng xạ trịhay hóa trị cũng như nhu cầu sử dụng G-CSF là rất lớn Các chế phẩm G-CSFthương mại chỉ được sử dụng hạn chế ở một số bệnh viện lớn Trung bình, một liềuneupogen 0.5ml (300mcg/ống) có giá khoảng 1,7 triệu đồng Vì vậy, khi áp dụngđiều trị neutropenia trong thời gian dài thì chi phí rất cao và không phù hợp với thực

tế ở Việt Nam

Nếu G-CSF được sản xuất với một lượng lớn, giá thành rẻ thì đây sẽ là mộttác nhân liệu pháp khắc phục nhiều trường hợp bệnh nhân bị bệnh liên quan đếnneutropenia do hóa trị ung thư Hiện nay, hầu hết G-CSF thương mại được sản xuất

theo mô hình DNA tái tổ hợp trong E coli, nấm men, CHO…

3 SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN G-CSF Ở ESCHERICHIA COLI

Có nhiều hệ thống tế bào dùng sản xuất protein tái tổ hợp khác nhau đã đượcnghiên cứu và phát triển như hệ thống biểu hiện protein trong tế bào vi khuẩn, tế bàothực vật, động vật…Việc lựa chọn hệ thống biểu hiện tùy thuộc vào đặc điểm và tínhchất của protein mục tiêu, cơ chế và mức độ biểu hiện, các biến đổi sau dịch mã, hệthống thiết bị nghiên cứu, chi phí sản xuất…Trên quy mô sản xuất công nghiệp, nhất

là trong công nghiệp dược phẩm, Escherichia coli hiện là tế bào chủ được sử dụng

phổ biến nhất do có nhiều ưu điểm nổi bật so với những hệ thống khác, đó là tốc độtăng trưởng nhanh chóng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, các đặc tính ditruyền đều đã được nghiên cứu rõ ràng, khả năng sản xuất protein với năng suấtcao…Các sản phẩm G-CSF thương mại hiện nay cũng được sản xuất chủ yếu ở tế

bào E coli Protein hG-CSF được sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, ký hiệu

rhG-CSF, để đơn giản chúng tôi gọi bằng tên chung G-CSF

Protein tái tổ hợp được sản xuất ở E coli có thể thực hiện theo ba hướng: sản

xuất nội bào, tiết trong chu chất, và sản xuất ngoại bào Mỗi chiến lược sản xuất đều

có những ưu nhược điểm riêng (theo bảng so sánh) Tuy nhiên, công nghệ sản xuấtprotein trên quy mô công nghiệp hiện nay, đặc biệt là protein G-CSF, phần lớn dựatrên chiến lược sản xuất nội bào vì khả năng sản xuất với năng suất cao hơn

Bảng 1.1 So sánh ưu nhược điểm của mỗi phương pháp sản xuất

protein ở E coli [17] [20] [25]

Chiến lược

Một vài sản phẩm đã được sản xuất

- Thể vùi có độ tinh khiết

- Protein ở dạngthể vùi không có hoạt tính

- Đòi hỏi quá trìnhdownstream phức

- Insullin

- G-CSF

- IGF-2 (insulin- like growth factor-2)

cao, thu nhận đơn giản bằngcách ly tâm

- Tránh được sự phân hủy củaprotease

tạp và tốn kém đểthu được protein

có hoạt tính

- Khó tạo cầu nốidisulfide có cấu hình đúng

- Lượng biểu hiệnthấp

- Protein dễ bị protease nội bào phân hủy

- Khả năng protein bị phânhủy bởi protease thấp

- Cần gắn trình tựtín hiệu tiết vàoprotein

- Lượng protein tiết bị giới hạn bởi thể tích vùng chu chất

- Insulin

Sản xuất

ngoại bào

- Thu nhận protein dễ dàng từmôi trường nuôi cấy

- Protein được tiết ra ngoài môi trường nên không cần tới bước phá tế bào

- Lượng protein tạo ra không

bị giới hạn và protein có hoạttính

- Lượng proteintiết ra ngoại bào thấp

- Interferon

- Xylanase

Sự hình thành thể vùi trong E coli có thể được giải thích giống như mô hình

hấp dẫn (Attractor model) của Kopito khi ông giải thích về sự hình thành thể vùi ởcác tế bào động vật (năm 2000), theo đó, thể vùi được hình thành từ quá trình kết tụcủa các “khối kết tụ đơn” Suốt quá trình biểu hiện vượt mức protein tái tổ hợp, đaphần protein có cấu hình gấp cuộn sai Sau khi tạo thành, các dạng gấp cuộn sai nàyphân tán nhanh chóng trong môi trường tế bào, chúng kết tụ lại với nhau tạo thànhnhiều “khối kết tụ đơn” Những khối kết tụ đơn này tiếp tục gắn kết nhau tạo thànhthể vùi bên trong tế bào Do được hình thành từ rất nhiều các khối kết tụ đơn nên thểvùi tạo ra được gọi là “thể vùi hấp dẫn” [22]

Do cơ chế biểu hiện vượt mức với sản lượng cao nên hầu hết protein mụctiêu được biểu hiện sau quá trình lên men đều nằm ở dạng thể vùi không có hoạttính, vì vậy đòi hỏi bước tái gấp cuộn (refolding) sau quá trình biểu hiện nhằm tạodạng protein có hoạt tính

các trạng thái gấp

Thể vùi hấp dẫn

Mô hình hấp dẫn

tổng hợp protein ở nhiều vị trí

nhiều khối kết tụ đơn liên tục hình thành

một cụm thể vùi tạo thành (theo sự hấp dẫn)

Thể vùi hoàn chỉnh

Hình 1.9 Mô hình hấp dẫn giải thích sự hình thành của thể vùi [22]

3.2 G-CSF dạng thể vùi không điển hình (non-classical inclusion body)

Protein mục tiêu nằm trong thể vùi điển hình thường có dạng gấp cuộn sai vàđòi hỏi nhiều bước biến tính/hồi tính mới thu nhận được dạng có hoạt tính sinh học

Do tính chất riêng của mỗi protein khác nhau nên các công đoạn của quá trình tinhchế cũng phải được tối ưu riêng cho mỗi protein Quá trình xử lý này có nhược điểmlớn là chi phí cao, tốn thời gian, và không thân thiện với môi trường Nhiều phươngpháp khác đã được nghiên cứu nhằm thu được protein mục tiêu ở trạng thái gấp cuộn

đúng bên trong tế bào chất ở E coli đã được thực hiện, nhưng tất cả đều chưa mang

lại hiệu quả cao

Một tiến trình khác được Simona Jevsevar và cộng sự thực hiện và công bố

vào năm 2005 cho thấy khi sản xuất G-CSF trong tế bào E coli ở nhiệt độ thấp

(khoảng 250C) thì thể vùi tạo thành chứa một lượng lớn các tiền chất protein gấpcuộn đúng Những thể vùi này có những đặc tính khác biệt đáng chú ý so với thể vùiđiển hình, do đó chúng được gọi với thuật ngữ là “thể vùi không điển hình” (non-classical inclusion bodies - ncIBs) [18]

Tính chất đặc biệt của thể vùi không điển hình là khả năng hòa tan cao hơncủa nó so với dạng thể vùi điển hình Một lượng lớn các protein hoặc các tiền chấtgấp cuộn đúng của nó được bao bọc bên ngoài bởi một lượng nhỏ protein gấp cuộnsai, do đó có thể dễ dàng thu nhận bằng cách hòa tan thể vùi thu được trong các dungdịch biến tính nhẹ Do đặc điểm cấu trúc như vậy, thể vùi không điển hình cũng ổnđịnh trong tế bào, protein mục tiêu được giữ tránh khỏi sự phân cắt của các proteasenội bào, và thể vùi này cũng có thể thu nhận dễ dàng theo cách thu nhận

Tinh chế Tinh chế

Hình 1.10 Các công đoạn chính của quá trình thu nhận G-CSF sau quá trình sản

xuất ở Escherichia coli từ: (a): thể vùi điển hình, (b): thể vùi không điển hình

Những nghiên cứu tiếp theo của Spela Peternel và cộng sự công bố vào năm 2008cũng cho thấy sự hình thành thể vùi không điển hình ở những protein khác nhưTNF-α (nhân tố hoại tử khối u), GFP (protein phát huỳnh quang xanh)…Như vậy, sựhình thành thể vùi không điển hình là một hiện tượng phổ biến, chứ không phải làmột trường hợp cá biệt Qua đó, các tác giả đã khẳng định chắc chắn cơ sở khoa họccho việc sản xuất protein tái tổ hợp theo một chiến lược hoàn toàn mới, không chỉriêng ở protein G-CSF mà còn có thể mở rộng ra những protein khác tương tự.

[24]

Bảng 1.2 So sánh ưu điểm và nhược điểm giữa việc sản xuất protein tái tổ

hợp ở dạng thể vùi điển hình và thể vùi không điển hình [18] [24]

- Dễ dàng thu nhận từ tế bào

- Cần công đoạn tái gấpcuộn phức tạp và tốn kémnhằm thu được dạng protein

- Chứa một lượng lớn protein mục tiêu hoặc tiền chất của nó với cấu hình gấp cuộn đúng nên không cần công đoạn tái gấp cuộn phức tạp và tốn kém

- Thân thiện với môi trường do

ít sử dụng các hóa chất độc hại

Do những ưu điểm nổi bật nêu trên, thể vùi không điển hình mở ra một tiềmnăng ứng dụng mới và rất ưu việt trong việc sản xuất protein tái tổ hợp Theo đó,quá trình sản xuất sẽ tránh gặp các vấn đề khó khăn của công đoạn biến tính/hồi tínhprotein, và dạng protein có hoạt tính sinh học có thể được thu nhận lượng lớn ngaykhi hòa tan từ thể vùi Hơn nữa, công nghệ này còn ít gây ảnh hưởng đến môi trường

do không sử dụng các hóa chất độc hại trong quá trình xử lý thể vùi điển hình

4 SẢN XUẤT THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH G-CSF

4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành thể vùi không điển hình G-CSF [18]

Từ những ưu điểm nổi bật của dạng thể vùi không điển hình như trên, việcứng dụng nó vào trong quá trình sản xuất các protein tái tổ hợp, mà điển hình ở đây

là protein G-CSF đang là một hướng sản xuất mới hứa hẹn nhiều triển vọng Tiếntrình sản xuất G-CSF có hoạt tính sinh học bao gồm việc điều chỉnh cách thức tiếnhành quá trình sinh tổng hợp protein bằng cách kiểm soát một hoặc vài thông số vàđiều kiện nuôi cấy sau đây để có thể thu được thể vùi không điển hình:

- Nhiệt độ nuôi cấy: một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tính chất của thểvùi Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi giảm nhiệt độ nuôi cấy, lượng protein gấp cuộn

đúng và có hoạt tính sinh học nằm bên trong thể vùi được sản xuất ở E coli gia tăng

đáng kể

- Phương thức cảm ứng: Tỉ lệ các tiền chất gấp cuộn đúng trong thể vùi khôngđiển hình cũng phụ thuộc vào phương thức cảm ứng bao gồm loại chất cảm ứng,nồng độ và thời gian cảm ứng Các chất cảm ứng thường được sử dụng trong quátrình này là IPTG, lactose và NaCl.

- Phương pháp lên men: Thực hiện lên men trong nồi lên men theo phươngpháp lên men mẻ hoặc theo phương pháp lên men mẻ có bổ sung (fed-batch) Theonghiên cứu của Viktor Menart và cộng sự (năm 2005) cho thấy rằng phương pháplên men dạng mẻ trong nồi lên men thu được lượng thể vùi có khả năng hòa tan caohơn

- Môi trường nuôi cấy thích hợp không chỉ ảnh hưởng đến khả năng tăngtrưởng và phát triển của chủng vi sinh vật mà còn ảnh hưởng đến lượng tiền chất G-CSF gấp cuộn đúng hình thành trong thể vùi không điển hình Việc bổ sung các chấtkhoáng vi lượng (FeSO4, CaCl2, CoCl2, ZnSO4, CuSO4…) và các vitamin cần thiếtcũng góp phần thúc đẩy khả năng tăng trưởng của vi khuẩn, cũng như gia tăng hiệuquả tạo trạng thái gấp cuộn đúng cho protein mục tiêu

- Bổ sung các tác nhân có khả năng gây stress tế bào: giúp gia tăng tỷ lệ tiềnchất gấp cuộn đúng Các tác nhân thường được sử dụng như ethanol và propanol vớinồng độ phù hợp

Các thông số nêu trên cần được điều chỉnh đơn lẻ hoặc có sự kết hợp vớinhau để gia tăng tỉ lệ các phân tử protein G-CSF gấp cuộn đúng và các tiền chất của

nó Mức biểu hiện cao của G-CSF trong tế bào E coli không đồng nghĩa với việc thuđược một lượng lớn các tiền chất gấp cuộn đúng của G-CSF Do đó, cần phải nghiêncứu tỉ lệ giữa sự kích thích biểu hiện G-CSF và phần trăm tiền chất gấp cuộn đúngnằm trong thể vùi để có thể thu được protein G-CSF có hoạt tính sinh học với sảnlượng cao nhất Protein có cấu hình đúng trong thể vùi không điển hình chỉ cần tácđộng bằng chất tẩy nhẹ như N-lauroyl sarcosine 0,2% Do đó, hướng sản xuấtprotein mục tiêu ở dạng thể vùi không điển hình (trong đó protein có hoạt tính đượcthu nhận trực tiếp không cần trải qua bước tái gấp cuộn phức tạp sử dụng nhiều hoá

chất độc hại) thể hiện ưu điểm về kinh tế, thân thiện với môi trường, an toàn với người sản xuất và tiêu dùng.

4.2 Đánh giá thể vùi không điển hình

4.2.1 Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR)

Phân tích quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier Intrared) là phương pháp đánh giá dạng thể vùi không điển hình thông qua việc xác định cấu trúc tự nhiên của protein nằm trong thể vùi

Transform-Đơn vị

tùy ý

Bước sóng (cm -1 )

Hình 1.11 Phổ hồng ngoại (IR) ở các vùng Amit I và Amit II của G-CSF ở dạng

dung dịch, dạng tủa và dạng thể vùi: (a) dung dịch protein (5 mg/mL), (b) protein được tủa bằng ammoni sulfate, (c, d, e) thể vùi thu được từ E coli nuôi cấy ở các

nhiệt độ lần lượt là 25 o C, 37 o C và 42 o C.[9]

Trong phương pháp này, phổ hồng ngoại của thể vùi được so sánh với phổcủa dung dịch protein có hoạt tính sinh học với độ tinh khiết cao và phổ của protein

tinh khiết tủa bằng ammoni sulfate (Hình 1.11) Chất kết tủa ammoni sulfate đại diện

cho trạng thái rắn gấp cuộn đúng của G-CSF (được chứng minh bằng cách đo hoạttính sinh học sau khi hòa tan chất tủa) Sau khi phân tích phổ của protein thu được từthể vùi và so sánh với phổ của protein hG-CSF chuẩn có hoạt tính sinh học,

có thể kết luận về sự giống và khác nhau về cấu trúc protein nằm trong thể vùi vàprotein chuẩn có hoạt tính hay không [23]

4.2.2 Đánh giá khả năng hòa tan trong dung môi gây biến tính nhẹ

Khả năng hòa tan của dạng thể vùi không điển hình trong dung môi khônggây biến tính cũng là cơ sở để đánh giá, phân biệt thể vùi không điển hình và thể vùiđiển hình Khác với dạng thể vùi điển hình, thường khó tan và đòi hỏi các dung môigây biến tính mạnh mới hòa tan được, nghiên cứu của Spela Petenel và cộng sự chothấy thể vùi không điển hình có thể dễ dàng hòa tan trong các dung môi không biếntính hoặc biến tính rất nhẹ như Na-deoxycholate 1%, urea 2M, Triton-X100 1%, n-propanol 5%, hoặc N-lauroyl-sarcosine 0,2%… [18] [23] Kết quả hòa tan đượcđánh giá bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, sắc ký lỏng cao áp đảo pha và điện

di NATIVE PAGE

4.2.3 Xác định đặc tính của thể vùi bằng kính hiển vi điện tử

Kính hiển vi điện tử là một công cụ thích hợp đã được chọn để mô tả hình ảnhcủa thể vùi Dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt (transmission electron

microscope – TEM), người ta quan sát được thể vùi G-CSF nằm trong tế bào E coli

ở dạng một hoặc hai khối co cụm dày đặc (Hình 1.12) Dùng kính hiển vi điện tử

quét (scanning electron microscope – SEM) người ta còn có thể đo được kích thước

của từng thể vùi qua hình ảnh chụp được của nó (Hình 1.13).

Do thể vùi không điển hình chứa một lượng protein gấp cuộn đúng bên trongnên nó có khả năng hòa tan nhanh trong dung môi có chứa chất biến tính nhẹ N-lauroylsarcosine 0,2% Dựa vào đặc điểm này, các nhà khoa học đã mô tả mộtphương pháp có thể phân biệt thể vùi không điển hình so với thể vùi điển hình bằngcách quan sát ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử quét Thể vùi bình thường khó hòatan trong dung dịch có N-lauroylsarcosine 0,2% nên kích thước của nó không thayđổi Còn khi rửa thể vùi không điển hình nhanh trong dung dịch có bổ sung N-lauroylsarcosine 0,2% thì kích thước của nó giảm đi rõ rệt so với trước khi rửa

(Hình 1.13) Qua đó xác nhận một lần nữa khả năng hòa tan của thể vùi không điển

hình

Hình 1.12 Ảnh cắt dọc của tế bào E coli

dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt [18]

(a) (b)

Hình 1.13 Thể vùi không điển hình của G-CSF dưới kính hiển vi điện tử quét:

(a): thể vùi chỉ được rửa bằng nước cất, (b): thể vùi rửa bằng nước cất và rửa nhanh (vài phút) với N-lauroylsarcosine 0,2% cho thấy kích thước nhỏ hơn [24]

4.2.4 Xác định sự thay đổi thể tích thể vùi trong các điều kiện pH

Ngoài ra, dựa theo đặc tính co lại trong môi trường pH thấp, người ta có thểxác định thể vùi không điển hình khá chính xác bằng cách quan sát bằng mắtthường Khi hòa tan trong dung dịch đệm natri phosphate 0,1M - pH 7.0 rồi chuyểnsang dung dịch đệm natri acetate 0,1M - pH 4.0 thì cả thể vùi điển hình lẫn thể vùi

không điển hình đều có sự giảm đi về thể tích tổng sau khi ly tâm (Hình 1.14) Điều

này được lý giải là do trong môi trường pH thấp, nồng độ proton cao có thể cảm ứngmột thay đổi ở các protein không được gấp cuộn, dẫn tới sự co lại của chúng và do

đó làm thể vùi kết đặc lại Tuy nhiên, trong khi thể tích tổng của thể vùi điển hình ở

pH 4.0 giảm đi khoảng một nửa so với thể tích ở pH 7.0 thì thể tích tổng của thể vùikhông điển hình chỉ giảm đi khoảng một phần ba [24]

Hình 1.14 Sự giảm thể tích cặn thể vùi khi thay đổi pH môi trường từ 7 xuống 4:

(a): Thể vùi không điển hình, (b): Thể vùi điển hình [24]

5 DUNG HỢP VÀ TINH CHẾ PROTEIN G-CSF

5.1 Dung hợp protein [6] [10] [11] [13] [34]

Năm 1991, cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa kỳ đã phê duyệtNeupogen, sản xuất bởi công ty Amgen – Mỹ, được sử dụng hỗ trợ những ngườibệnh nhân bị giảm bạch cầu trung tính trong hoặc sau khi hóa trị liệu Điều trị ungthư kết hợp với sử dụng G-CSF có thể cho phép cường độ chiếu xạ cao hơn, dẫn đếntác dụng chống ung thư tốt hơn Tuy nhiên, Neupogen chỉ tồn tại một thời gian ngắntrong cơ thể (khoảng 3-5 giờ) do hai yếu tố: nhanh chóng bị đào thải bởi quá trìnhlọc thận và quá trình tự điều hòa nồng độ G-CSF của cơ thể

Để khắc phục những hạn chế này, một số phương pháp đã được đề xuất,trong đó có dung hợp phân tử G-CSF với chất cao phân tử Polyethylenglycol (PEG)