Khảo sát các phương pháp lên men thu nhận l lysine bằng chế phẩm cố định corynebacterium glutamicum

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - NGÔ NAM LUÂN KHẢO SÁT CÁC PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN THU NHẬN L-LYSINE BẰNG CHẾ PHẨM CỐ ĐINH ̣ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ Hƣớng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THÚY HƢƠNG TP HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2012 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG – HCM Cán hƣớng dẫn khoa học: ……………………………………… (Ghi rõ ho ̣, tên, học hàm, học vị và chữ ký ) PGS.TS NGUYỄN THÚY HƢƠNG Cán chấm nhận xét 1: ……………………………………… (Ghi rõ ho ̣, tên, học hàm, học vị và chữ ký) ……………………………………… Cán chấm nhận xét 2: …………………………………… (Ghi rõ ho ̣, tên, học hàm, học vị và chữ ký ) ……………………………………… Luận văn Thạc sĩ đƣợc bảo vệ trƣờng Đa ̣i ho ̣c Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM, ngày 16 tháng 11 năm 2012 Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ ho ̣, tên, học hàm, học vị Hô ̣i đồ ng chấ m bảo vê ̣ luâ ̣n văn tha ̣c si )̃ ………………………………………………………… ………………………………………………………… ………………………………………………………… ………………………………………………………… ………………………………………………………… Xác nhận của Hô ̣i đồ ng đánh giá Luâ ̣n văn và Trƣởng Khoa quản lý chuyên ngành sau Luâ ̣n văn đã đƣơ ̣c sƣ̉a chƣ̃a (nế u có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – Hạnh phúc Tp HCM, ngày… tháng……năm 2012 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGÔ NAM LUÂN Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh : 06 – 09 – 1983 Nơi sinh: BR-VT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 09310576 1- TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát các phƣơng pháp lên men thu nhận L-lysine chế phẩm cố định Corynebacterium glutamicum 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Khảo sát giống vi sinh vật Cố định tế bào Corynebacterium glutamicum chất mang Alginate Lên men fed-batch liên tục với tế bào tự chế phẩm cố định 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Tháng 2/2011 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Tháng 8/2012 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỢ HƢỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN THÚY HƢƠNG Nợi dung và đề cƣơng Luận văn Thạc sĩ đƣợc Hội Đồng Chuyên ngành thông qua CB HƢỚNG DẪN CN BỘ MÔN KHOA QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Suố t thời gian làm luận văn tốt nghiệp , đã ho ̣c đƣơ ̣c rấ t nhiề u điề u bổ ić h tƣ̀ thầ y cô, bạn bè và môi trƣờng làm việc Chính những điều này giúp trƣởng thành nhiều Tôi muố n gƣ̉i lời cảm ơn chân thành nhấ t đế n tấ t cả mo ̣i ngƣời Đầu tiên , cho gƣ̉i lời cảm ơn sâu sắ c và chân thành nhấ t đế n cô – PGS.TS Nguyễn Thúy Hƣơng Cô không chỉ là ngƣời giúp đỡ và hƣớng dẫn tâ ̣n tình suố t quá trình thực đề tài, mà còn động viên, chia sẻ lúc gă ̣p nhƣ̃ng khó khăn cuộc sống Em cảm ơn cô rấ t nhiề u ! Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Trƣờng Đại học bách Khoa, Khoa Kỹ thuật hóa học và Bộ môn Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận văn này Xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức nhƣ kinh nghiệm để có đƣợc những kiến thức quý báu và hoàn thành tốt luận văn này Xin cảm ơn chị Nhƣ Ngọc đã giúp đỡ rấ t nhiề u lúc gặp khó khăn quá trình thực đề tài Cảm ơn các bạn học viên cao học, các bạn sinh viên đã cùng chia sẻ nhƣ̃ng niề m vui, nỗi buồ n và nhƣ̃ng kinh nghiê ̣m quý báu suố t thời gian làm viê ̣c chung với Cuố i cùng cho gƣ̉i lời tri ân đến Ba, Mẹ, nhƣ̃ng ngƣời đã chăm sóc và lo lắ ng cho tƣ̀ng ng ày Ba, Mẹ là chỗ dựa vững chắc cho suốt cuộc đời này TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát phƣơng pháp lên men để thu nhâ ̣n L -lysine bằ ng chế phẩ m cố đinh ̣ Corynebacterium glutamicum ” Đề tài thu đƣơ ̣c kế t quả sau: Điề u kiê ̣n tố i ƣu để cố đinh ̣ tế bào C glutamicum chấ t mang Alginate là : nồ ng đô ̣ Alginate 3%, CaCl2 2%, tỷ lệ giữa giống và Alginate là 1:4 (mâ ̣t đô ̣ giố ng là 1010 tế bào/ml) Hiê ̣u suấ t cố đinh ̣ đa ̣t 94,6% (mâ ̣t đô ̣ tế bào vi khuẩ n là 2,6.109 tế bào/g chế phẩ m ) Lên men fed -batch liên tu ̣c : tiế n hành bổ sung môi trƣờng lên men vào canh trƣờng nuôi cấ y sau 12 giờ lên men với tố c đô ̣ là 40ml/h Với tế bào tƣ̣ do: 10% giố ng (mâ ̣t đô ̣ giố ng 2.108 tế bào/ml), sản lƣợng Llysine đa ̣t đƣơ ̣c là 33,55 g/l Với chế phẩ m cố đinh ̣ : 3% chế phẩ m cố đinh ̣ (mâ ̣t đô ̣ tế bào vi khuẩ n là 2,6.109 tế bào/g chế phẩ m), sản lƣợng L-lysine đa ̣t đƣơ ̣c là 28,55 g/l Số lần tái sử dụng hạt chế phẩm cố định lên men fed giới ̣n khảo sát của đề tài là 28,08 g/l -batch liên tu ̣c lầ n, lƣơ ̣ng L-lysine trung bình đa ̣t đƣơ ̣c là ABSTRACT My thesis: “The survey of fermentation processes to uptake L-lysine by immobilized Corynebacterium glutamicum” The result is given as follows: The optimal conditions of immobilized C glutamicum in Alginate carrier are: Alginate concentration 3%, CaCl2 2%, the ratio between innoculum and Alginate is 1:4 (the cells density is 1010 CFU/ml) the immobilization efficiency is 94,6% (the cells density is 2,6.109 CFU/g) The continuous fed-batch fermentation: the media was added to culture media after 12 hours with fedding rate is 40ml/h With free cells: innoculum 10% (cultural quality 2.108 CFU/ml), the Llysine yield is 33,55 g/l With immobilized cells: 3% (w/v) immobilized cells (the cells density is 2,6.109 CFU/g), the L-lysine yield is 28,55 g/l The immobilized cells could reused about times in continuous fed-batch fermentation the average L-lysine yield is 28,08 g/l MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIÊU ̣ 1.1 VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM 1.1.1 Lịch sử phát triển phân loại .2 1.1.2 Đặc điểm vi khuẩn Coryebacterium glutamicum 1.1.3 Đặc điểm di truyền vi khuẩn Coryebacterium glutamicum .3 1.1.4 Sự chuyển hóa vật chất Coryebacterium glutamicum 1.2 AMINO ACID LYSINE 1.2.1 Giới thiệu 1.2.3 Sinh tổng hợp L-lysine .8 1.2.3.1 Cụm gen sinh tổng hợp L-lysine 1.2.3.2 Quá trình tổng hợp và điều hòa sinh amino acid lysine 1.2.4 1.3 Lên men thu nhận L-lysine 14 1.2.4.1 Ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng 14 1.2.4.2 Ảnh hƣởng một số điều kiện ngoại cảnh 17 1.2.4.3 Kỹ thuật lên men .19 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 22 1.3.1 Định nghĩa 22 1.3.2 Phƣơng pháp cố định tế bào vi sinh vật 22 1.3.3 Chất mang Alginate 24 1.3.3.1 Cấu tạo .24 1.3.3.2 Tính chất 24 1.3.3.3 1.4 Phƣơng pháp cố định tế bào chất mang Alginate 25 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 25 CHƢƠNG VẬT LIÊU ̣ VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, MÔI TRƢỜNG 29 2.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 30 2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 32 2.3.1 Kiểm tra giống 32 2.3.2 Cố định tế bào chất mang Alginate 33 2.3.3 Khảo sát tỷ lệ chế phẩm cố định trình lên men 34 2.3.4 Lên men fed-batch liên tục .34 2.4 2.3.4.1 Lên men batch 34 2.3.4.2 Lên men fed-batch liên tục với tế bào tƣ̣ 34 2.3.4.3 Lên men fed-batch liên tục với chế phẩ m cố đinh ̣ 36 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÍ NGHIỆM .36 2.4.1 Phƣơng pháp vi sinh 36 2.4.2 Phƣơng pháp hóa sinh 37 2.4.2.1 Phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử thuốc thử DNS 37 2.4.2.2 Phân tích định lƣợng sơ bộ amino acid dich lên men phƣơng pháp đo mật độ quang 39 2.4.2.3 Phân tích định tính amino acid dịch lên men phƣơng pháp sắc ký giấy 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIÊN ̣ LUẬN 3.1 GIỐNG VI SINH VẬT 41 3.1.1 Nguồn gốc vi sinh vật 41 3.1.2 Đặc điểm sinh học chủng C glutamicum VTCC B – 656 .41 3.1.3 Đƣờng cong sinh trƣởng chủng C glutamicum VTCC B – 656 .43 3.2 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT MANG ALGINATE .45 3.2.1 Khảo sát nồng độ Alginate ảnh hƣởng đến trình cố định 45 3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ CaCl2 đến khả tạo hạt 46 3.2.3 Khảo sát tỷ lệ [Giống : Alginate] ảnh hƣởng đến trình cố định 47 3.2.4 Khảo sát tỷ lệ chế phẩm cố định trình lên men 49 3.3 LÊN MEN FED-BATCH .49 3.3.1 Lên men batch 49 3.3.2 Lên men fed-batch với tế bào tƣ̣ 50 3.3.3 Lên men fed-batch với chế phẩ m cố đinh ̣ .53 3.3.3.1 Lên men fed-batch liên tục với chế phẩm cố định .53 3.3.3.2 Khảo sát khả tái sử dụng chế phẩm cố định .55 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần môi trƣờng 29 Bảng Đặc điểm sinh học chủng C glutamicum VTCC B – 656 41 Bảng Ảnh hƣởng nờng đợ Alginate đến q trình cố định tế bào .45 Bảng 3 Ảnh hƣởng nồng độ CaCl2 đến khả tạo hạt .46 Bảng Ảnh hƣởng tỷ lệ [Giống : Alginate] đến hiệu suất cố định 47 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bợ gen vi khuẩn Corynebacterium glutamicum .3 Hình Quy trình chuyển hóa chất C.glutamicum sinh amino acid Llysine Hình Cơng thức cấu tạo lysine Hình Cụm gen sinh tổng hợp lysine Hình Con đƣờng sinh tổng hợp L-lysine 10 Hình Sơ đồ các phƣơng pháp cố định tế bào vi sinh vật 22 Hình Sơ đồ nội dung thực đề tài .31 Hình 2 Hệ thống lên men fed-batch liên tục 35 Hình Phản ứng giữa đƣờng khử acid 3,5-dinitrosalicylic môi trƣờng kiềm 37 Hình Hình dạng tế bào C glutamicum VTCC B – 656 vật kính 100X 42 Hình Hình dạng màu sắc khuẩn lạc C glutamicum VTCC B – 656 .42 Hình 3 Hạt chế phẩm cố định C glutamicum .48 Trang 58 4.2 KIẾN NGHỊ Với những kết đề tài đạt đƣợc, kiến nghị một số hƣớng phát triển nghiên cứu nhƣ sau:  Khảo sát quá trình cố định tế bào C glutamicum nhiề u loa ̣i chấ t mang khác nhau, nhằ m tìm chấ t mang phù hơ ̣p cho quá trình lên men thu nhâ ̣n L lysine  Tiế p tu ̣c theo dõi khả tái sƣ̉ du ̣ng của ̣t chế phẩ m cố đinh ̣  Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men fed-batch và tiế n hành lên men fed -batch fermenter để làm sở cho sản xuấ t ở quy mơ cơng nghiê ̣p  Nghiên cứu hồn chỉnh quy trình lên men thu nhận L-lysine bao gờm: lên men, thu nhận tinh  Nghiên cứu đƣa L-lysine vào ƣ́ng dụng thực tiễn Trang 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Nguyễn Thùy Châu: Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh sản xuất chế phẩm acid amin nguồn enzyme từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp hải sản quy mô bán công nghiệp, Đề tài KHCN cấp nhà nước, Hà Nội, (2006): 154- 165 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi Sinh Vật, NXB Giáo Dục, (2000) Nguyễn Thúy Hƣơng và Trần Thị Minh Tâm, “Ứng dụng vi khuẩn Corynebacterium sp Cố định lên men thu nhận L-lysine”, Tạp chí khoa học cơng nghệ các trƣờng đại học kỹ thuật, số 70, trang 96 – 100 (2009) Nguyễn Duy Lâm Trần Thị Mai, Phát triển công nghệ sản xuất ứng dụng một số chế phẩm sinh học bảo quản chế biến kiểm tra chất lƣợng sản phẩm, Hội thảo ứng dụng phát triển công nghệ, Bộ khoa học công nghệ, (2008) Nguyễn Đức Lƣợng cs., Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hờ Chí Minh, (2006) Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng, Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học tập 1, Thí nghiệm Hóa sinh học, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hờ Chí Minh, (2003) Nguyễn Đức Lƣợng, Công nghệ vi sinh tập 2, Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hờ Chí Minh, (2006) Vũ Kim Thoa và cs., Phân lập tuyển chọn một số chủng Corynebacterium sp Có khả sản xuất L-lysine, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Hà Nợi (2003): 381- 383 Nguyễn Thị Thu Vân cs., Thí nghiệm phân tích định lượng, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, (2006) Trang 60 Tài liệu tham khảo tiếng nƣớc 10 Anastassiadis Savas, L-lysine Fermentation, Recent Patents on Biotechnology, (2007): 11- 24 11 Burkovski Andreas Kramer, Lysine excretion by Corynebacterium glutamicum, Eur.J.Biochem., 202 (1) (1991): 137- 143 12 Cheetham cs., Physical studies on cell immobilization using Calcium alginate gels, biotechnol Bioeng., 21 (12) (2004): 2155 – 2168 13 De Graaf Aa, Eggeling L., Sahm H, Metabolic engineering for L-lysine production by Corynebacterium glutamicum, adv Biochem Eng Biotechnol., 73 (2001): – 29 14 Dieter J Reinscheid, Bernhard J Eikmanns, and Hermann Sahm, Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for a feedback-resistant homoserine dehydrogenase, J Bacteriol., 173 (10)(1991): 3228 – 3230 15 Eggeling Lothar and Michael Bott Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, the United States of America, 2005 16 Eggeling Lothar Sahm Hermann, Review: The cell wall barrier of Corynebacterium glutamicum Amino acid efflux, Journal of Bioscience Bioengineering, 92 (3) (2001): 201- 213 17 Georgi T., Rittmann D., Wendisch VF., Lysine and glutamate production by Corynebacterium glutamicum on glucose, fructose and sucrose: roles of malic enzyme and fructose-1,6-biphosphate, Metab Eng., 7(4)(2005): 291 – 301 18 Gordon F Bickertaff, Immobilization of enzymes and cells, Humana Press Inc, New Jersey, (1997) 19 Gunji Y., Yasueda H., Enhancement of L-lysine production in methylotroph Methylophilus methylotrophus by introducing a mutant lysE exporter, J Biotechnol., (2006): 126- 132 20 Haleem Shah Abdul, Hameed Abdul, Ahmad Safia Majid Khan Gul, Optimization of culture conditions for L-lysine Fermentation by Corynebacterium glutamicum, Online Iournal of Biotechnology Sciences, (3) (2002): 151- 156 Trang 61 21 Hayashi M cs., A leuC mutation leading to increased L-lysine production and rel-independent globalepressing changes in Corynebacterium glutamicum, Appl Microbiol Biotechnol., 37 (2006): 566 – 571 22 Imaizumi A, Takikawa R, Koseki C, Usuda Y, Yasueda H, Kojima H, Matsui K, Sugimoto S, Improved production of L-lysine by disruption of stationary phase specific rmf gene in Escherichia coli, J Biotechnol., 117 (1) (2005) : 111 – 118 23 Kutzner H, Sonnen H, Thierbach G, Kautz S, Kalinowski J, Schneider J, Puhler A, Characterization of pGA1, a new plasmid from Corynebacterium glutamicum LP-6, J Bacteriol., 107 (1) (1991):69 – 74 24 Lee Ieongseok, Yup Lee Sang, Park Sunwon, Middelberg Anton P J., Control of fed- batch fermentations, Biotechnology Advances, 17 (1999): 29- 48 25 Lee KY, Survival of Bifidobacterium longum immobilized in calcium alginate beads in simulated gastric juices and bile salt solution, Appl Environ Microbiol., 66 (2000): 869 – 873 26 Minihane B J Brown D E., Fed –batch culture technology, Biotech Adv., (1986): 207- 218 27 Miroslav Patek cs., Leucin Synthesis in Corynebacterium glutamicum: Enzyme Activities Structure of leuA, and Effect of leuA Inactivation on lysine synthesis, Appl And Environ Microbiol., 60(1)(1994): 133 – 140 28 Ohnishi J, Hayashi M, Mitsuhashi S, Ikeda M, Efficient 40 degrees C fermentation of L-lysine by a new Corynebacterium glutamicum mutant developed by genome breeding, Appl Microbiol Biotechnol., 62 (1)(2003): 69 – 75 29 Pfefferle Walter, Mockel Bettina, Bathe Brigitte, Marx Achim Biotechnological manufacture of lysine , Adv Biochem Eng Biotechnol., 79 (2003): 60- 107 30 Sindelar G and Wendisch VF., Improving lysine production by Corynebacterium glutamicum through DNA microarray-based identification of novel target genes, Appl Microbiol Biotechnol., 76 (2007): 677 – 689 Trang 62 31 Stackebrandt E., Rainey FA Ward-Rainey NL., Proposal for a new hierarchal classification system, Actinobacteria classis nov, Int J Syst Bacteriol., 47 (1997): 479 - 491 32 Stanbury Peter F., Whitaker Allan, Hall Stephen J., Principles of Fermentation Technology, Butterworth Heinemanm Press, Great Britain, (2003) 33 Tada Kiyoshi, Kishimoto Michimasa, Omasa Takeshi, Katakura Yoshio Ken- Suga Ichi, L-lysine production by exponential feeding of L-threonine, Journal of Bioscience and Bioengineering, 90 (6) (2000): 669- 674 34 Tateno T., Fukuda H., Kondo A., Production lysine from starch by Corynebacterium glutamicum displaying alpha-amylase on its cell surface, Appl Microbiol Biotechnol., 74 (6)(2007): 1213 – 1220 Tài liệu từ internet 35 http://vi.wikipedia.org/wiki/Lysine, truy câ ̣p ngày 05/08/2012 PHỤ LỤC Trang PL PHỤ LỤC MỘT SỐ ĐƢỜNG CHUẨN DÙNG TRONG ĐỀ TÀI Phụ lục 1.1 Đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa OD sinh khối khô Tiến hành nuôi cấy Corynebacterium glutamicum mơi trƣờng nhân giống, lắc 200 vịng/ phút, pH = 7.0, nhiệt độ nuôi cấy 28oC, thu sinh khối sau 24 Ly tâm sinh khối 5000 vòng/phút 10 phút Sấy khô sinh khối đến khối lƣợng không đổi, cân trọng lƣợng sinh khối khơ Tiến hành pha lỗng sinh khối khơ, đo OD bƣớc sóng 660nm cho giá trị OD 660nm nhận đƣợc nằm giới hạn 0.005 đến 0.85 Xây dựng đƣờng chuẩn và xác định hàm số y = f (x), với y OD 660nm, x OD 660nm sinh khối khô (g/l) 1.0 y = 1.018x + 0.031 R² = 0.995 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Sinh khối khô (g/l) Đồ thị phụ lục 1.1 Đƣờng chuẩn sinh khối khô OD 660nm Phụ lục 1.2 Đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa OD và lƣợng đƣờng glucose Chuẩn bị dung dịch đƣờng có nờng đợ glucose lần lƣợt 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/ml Ứng với mỗi dung dịch, hút 3ml cho vào mỗi ống nghiệm Sau đó, cho vào mỗi ống 1ml DNS Dùng một miếng nilon bịt kín đầu ống Trang PL nghiệm, đặt vào nƣớc sôi phút Làm lạnh nhiệt độ phòng và đo đợ OD 540nm hấp thu OD bƣớc sóng 540 nm 1.6 y = 2.895x - 0.100 R² = 0.999 1.2 0.8 0.4 0.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Glucose (g/l) Đồ thị phụ lục 1.2 Đƣờng chuẩn glucose OD 540 nm Phụ lục 1.3 Đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa OD Lysine Ở chúng sử dụng phƣơng trình đƣờng chuẩn lysine đƣợc khảo sát sau (Trần Thị Tuyết Lan, 2010): y = 0.0096 x + 0.0019 Trong đó, y là giá trị OD 560 nm và x là lƣợng lysine dịch (g/l) Trang PL PHỤ LỤC pH, SINH KHỐI KHÔ, LƢỢNG ĐƢỜNG GLUCOSE, LƢỢNG LLYSINE BIẾN THIÊN THEO THỜI GIAN Tiến hành nuôi cấy Corynebacterium glutamicum môi trƣờng tối ƣu lên men theo mẻ, pH = 7.5, nuôi cấy nhiệt đợ phịng Sau khoảng thời gian xác định, lấy mẫu đem đo ba giá trị: pha loãng đo bƣớc sóng 660 nm, đo giá trị đƣờng glucose có dịch lên men bƣớc sóng 540 nm và đo lƣợng lysine có mơi trƣờng bƣớc sóng 560 nm Sinh khớ i khơ Glucose L-lysine (g/l) (g/l) (g/l) 7.5 0.50 99.83 0.00 7.42 4.09 96.03 0.00 12 7.13 8.84 89.46 0.11 24 6.49 13.26 76.68 1.36 30 6.35 16.38 72.19 2.20 36 6.17 18.48 64.94 3.45 48 5.97 19.86 59.93 5.11 54 6.02 19.66 52.85 5.64 60 5.79 19.51 46.46 6.68 72 5.63 19.54 42.40 7.20 78 5.59 19.45 40.16 6.57 Thời gian (giờ) pH Trang PL PHỤ LỤC KHẢO SÁT TỶ LỆ CHẾ PHẨM CỐ ĐỊNH TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN Tỷ lệ chế phẩm cố định L-lysine (g/l) 1% 2.1 2% 4.8 3% 10.2 4% 7.1 5% 5.5 PHỤ LỤC LÊN MEN FED-BATCH Phụ lục 4.1 Hàm lƣợng L -lysine theo thời gian lên men batch với tế bào tƣ̣ Thời gian (giờ) L-lysine (g/l) 0.00 0.00 12 0.11 24 4.49 30 7.20 36 10.01 48 13.86 54 17.51 60 20.64 72 22.61 78 21.89 Trang PL Phụ lục 4.2 Hàm lƣợng L -lysine theo thời gian thí nghiệm khảo sát thời điểm fed-batch 12h sau lên men tốc độ fed-batch liên tục 30, 40 50ml/h L-lysine (g/l)- L-lysine (g/l)- L-lysine (g/l)- 30ml/h 40ml/h 50ml/h 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 12 0.11 0.11 0.01 24 4.91 6.36 5.43 30 10.64 11.78 11.26 36 16.57 18.24 19.07 48 24.49 23.66 23.34 54 25.64 30.11 24.70 60 28.34 33.55 28.24 72 27.61 30.53 28.55 78 27.20 31.16 26.57 Thời gian (giờ) Trang PL Phụ lục 4.3 Hàm lƣợng L -lysine theo thời gian thí nghiệm khảo sát thời điểm fed-batch 24h sau lên men tốc độ fed-batch liên tục 30, 40 50ml/h L-lysine (g/l)- L-lysine (g/l)- L-lysine (g/l)- 30ml/h 40ml/h 50ml/h 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 12 0.22 0.11 0.11 24 4.49 5.64 4.49 30 9.49 9.91 11.26 36 17.20 16.57 18.76 48 23.14 20.22 24.59 54 25.53 26.68 26.57 60 27.51 29.49 30.64 72 28.03 31.16 30.53 78 26.99 29.59 27.93 Thời gian (giờ) Trang PL Phụ lục 4.4 Hàm lƣợng L-lysine theo thời gian thí nghiệm so sánh hiệu suất lên men giữa lên men với tế bào cố định lên men với tế bào tự do, thời điểm fedbatch 12h sau lên men tốc độ fed-batch liên tục 40 ml/h L-lysine (g/l)-fed-batch L-lysine (g/l)-fed-batch 40ml/h-tế bào tự 40ml/h-tế bào cố đinh ̣ 0.00 0.00 0.00 0.00 12 0.11 0.01 24 6.36 4.59 30 11.78 9.28 36 18.24 13.03 48 23.66 19.18 54 30.11 21.57 60 33.55 25.32 72 30.53 28.55 78 31.16 28.14 Thời gian (giờ) Trang PL Phụ lục 4.5 So sánh hiệu suất lên men giữa kiể u lên men Kiểu lên men Glucose ban đầu (g/l) Lên men batch với tế bào tƣ̣ Lên men fed-batch với tế bào tự Lên men fed-batch với tế bào cố định Hiệu suất Lysine (g/l) (g Lysine/g Glucose ban đầu) 99.7 22.61 22.69 100.3 33.55 33.45 99.7 28.55 28.64 Phụ lục 4.6 Hàm lƣợng L-lysine sau mỗi lầ n tái sƣ̉ du ̣ng chế phẩ m cố đinh ̣ Số lầ n tái sƣ̉ du ̣ng L-lysine (g/l) 28.55 28.45 28.45 28.03 27.41 27.61 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Ngơ Nam Luân Ngày, tháng, năm sinh: 06/09/1983 Nơi sinh: Bà Rịa – Vũng Tàu Địa liên lạc: 2/39 B Cao Thắ ng, P.5, Q.3, Tp.Hờ Chí Minh QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO (Bắt đầu từ Đại học đến nay) Năm 2001 – năm 2005: Học Đại học trƣờng ĐH Mở Tp Hồ Chí Minh Năm 2009 – năm 2012: Học Cao học trƣờng ĐH Bách khoa Tp Hồ Chí Minh Q TRÌNH CƠNG TÁC (Bắt đầu từ làm đến nay) ... thô khảo sát hiệu suất lysine với trình l? ?n men fed-batch l? ?n men liên tục Kết sản l? ?ợng lysine tăng 2,5 l? ??n nhiệt độ 340C, 72 l? ?n men so với l? ?n men theo mẻ, nhƣng l? ??i l? ?n men fed-batch l? ?n men. .. phẩm cố định trình l? ?n men Tỷ l? ?? chế phẩm cố định sử dụng trình l? ?n men ảnh hƣởng l? ??n đến suất sản phẩm hiệu suất l? ?n men Tỷ l? ?? chế phẩm cố định thấp thì suất sản phẩm giảm, tỷ l? ?? chế phẩm cố. .. trình l? ?n men thu nhận L- lysine Chỉ tiêu theo dõi là l? ?ợng L -lysine thu đƣơ ̣c sau 72 giờ l? ?n men 2.3.4 L? ?n men fed-batch liên tục 2.3.4.1 L? ?n men batch Để làm sở so sánh với l? ?n men fed