KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨNESCHERICHIA COLI SINH β-LACTAMASES PHỔRỘNG TRÊN GÀ KHỎE VÀ MÔI TRƯỜNG CHĂNNUÔI TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ Ở HUYỆN TRÀ ÔN,TỈNH VĨNH LONG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG PHẠM THỊ THÙY LINH KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI SINH β-LACTAMASES PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE VÀ MÔI TRƯỜNG CHĂN NUÔI TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ Ở HUYỆN TRÀ ÔN, TỈNH VĨNH LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH THÚ Y KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI SINH β-LACTAMASES PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE VÀ MÔI TRƯỜNG CHĂN NUÔI TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ Ở HUYỆN TRÀ ÔN, TỈNH VĨNH LONG Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực PSG TS Lưu Hữu Mãnh Phạm Thị Thùy Linh MSSV: B1207161 Lớp: CN12Y4A1 – K38 Cần Thơ, 2016 CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi gà nghề không cung cấp thực phẩm cho bữa ăn hàng ngày gia đình mà đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho người chăn nuôi nên năm gần ngành chăn nuôi gà Vĩnh Long phát triển mạnh Theo báo cáo sơ kết tháng đầu năm 2014 Sở Nông Nghiệp Phát triển nông thôn tỉnh Vĩnh Long, tổng đàn gà toàn tỉnh triệu con, tăng 24,7% so với kỳ năm 2013 (Chi cục Thú y tỉnh Vĩnh Long, 2014) Hơn nữa, việc phát triển nhanh chóng đồng thời làm tăng nguy lây lan dịch bệnh, ảnh hưởng không nhỏ tới suất hiệu chăn nuôi Theo Hồ Việt Thu (2012), hầu hết loài gia cầm lứa tuổi mẫn cảm với vi khuẩn E coli Trong bệnh nhiễm cầu trùng gà E coli phổ biến nhất, xảy mức độ ngày tăng trở thành vấn nạn ngành công nghiệp chăn nuôi gia cầm (Võ Thị Trà An, 2012) Để chăn nuôi hạn chế rủi ro, tăng hiệu thức ăn, kích thích tăng trưởng nhiều nơi sử dụng kháng sinh cách liên tục, đặc biệt gà khỏe, gà chưa có biểu bệnh, làm cho vi khuẩn khơng đề kháng với kháng sinh mà đề kháng chéo với nhiều kháng sinh khác (Trần Huy Hoàng, 2013) Hiện xuất chủng vi khuẩn gram âm sinh men β-lactamases phổ rộng (ESBL) có khả đề kháng với kháng sinh nhóm βlactamases bao gồm kháng sinh phổ rộng cephalosporin hệ Trên giới có nhiều báo cáo E coli ESBL gà công bố, Zagazig - Ai Cập tiến hành nghiên cứu 106 mẫu thịt gà bán lẻ có 69 chủng E coli ESBL tìm thấy, chiếm 65,09% (Abdallah et al., 2015) Theo Hetty Blaak et al (2015), nghiên cứu mẫu phân trại gà thịt gà đẻ Hà Lan cho thấy tỉ lệ E coli dương tính với ESBL gà thịt gà đẻ 65% (46/71) 81% (57/70) Tuy nhiên Việt Nam nghiên cứu vấn đề đa phần thực người bệnh viện lớn, có nghiên cứu E coli ESBL vật ni nói chung gà nói riêng Xuất phát từ tình hình trên, đề tài “Khảo sát diện vi khuẩn Escherichia coli sinh β-lactamases phổ rộng gà khỏe môi trường chăn nuôi số nơng hộ huyện Trà Ơn tỉnh Vĩnh Long” thực với mục tiêu: Xác định tỉ lệ diện vi khuẩn E coli ESBL gà khỏe môi trường chăn nuôi số nông hộ huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long Kiểm tra tính nhạy cảm chủng E coli ESBL phân lập số loại kháng sinh CHƯƠNG CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Tổng quan vi khuẩn Escherichia coli Bác sĩ nhi khoa người Đức Theodor Echerich phân lập tìm đặc điểm vi khuẩn lần tả lót trẻ em vào năm 1885, Munchen công bố tên Bacterium coli commune E.coli lồi quan trọng tìm thấy phân (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970).Năm 1991, vi khuẩn định danh thống toàn cầu Escherichia coli hay E coli E.coli xếp vào giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gramma Proteobacteria, Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae Là vi khuẩn Gram âm thường trực ruột, chiếm 80% vi khuẩn hiếu khí; số chủng vi khuẩn cộng sinh giúp tổng hợp số vitamin B, E K cân hệ vi sinh đường ruột hầu hết vi khuẩn gây bệnh đường ruột quan khác Ở ruột, vi khuẩn E.coli sống kháng với số vi khuẩn khác Salmonella Shigella nhờ có khả tạo loại chất ức chế có tên colicin (Lê Xuân Phương, 2009) Theo Đậu Ngọc Hào (2012) E coli sống khắp nơi môi trường đặc biệt sống phổ biến ruột, đường hô hấp động vật khỏe mạnh Tuy nhiên, thể suy yếu, số chủng E.coli gây bệnh.Vi khuẩn E.coli diện thường xuyên đường ruột gà thải qua phân với số lượng lớn (Hồ Thị Việt Thu, 2012) 2.1.1 Đặc điểm hình thái Theo Lưu Hữu Mãnh (2010) E.coli trực khuẩn Gram âm, có hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 2-3 x 0,6 µm, khơng sinh nha bào Trong thể có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ xếp thành chuỗi ngắn Phần lớn E.coli di động có lơng nhung bao xung quanh thân nên có khả di dộng, gặp số chủng đột biến không lông không thấy di động Dưới kính hiển vi điện tử, người ta phát cấu trúc pili – yếu tố mang kháng nguyên bám dính vi khuẩn E coli (Lê Thị Hồi, 2008) 2.1.2 Đặc tính ni cấy E.coli phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thơng thường Một số phát triển mơi trường tổng hợp nghèo dinh dưỡng Là vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy ý Có thể phát triển nhiệt độ từ – 40 0C, nhiệt độ thích hợp 37oC, pH tối ưu 7,4 (Hồ Thị Việt Thu Nguyền Đức Hiền, 2012) Môi trường nước thịt: sau 24 nuôi cấy 370C, vi khuẩn E.coli phát triển nhanh, môi trường đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đơi có màng màu xám nhạt mặt mơi trường, mơi trường có mùi thối (do vi khuẩn phát triển sinh H2S ) (Phùng Thị Minh, 2008) Mơi trường thạch MC (MacConkey Agar): vi khuẩn hình thành khuẩn lạc to, tròn đều, màu hồng nhạt, khuẩn lạc lồi, kích thước 2-3 mm (Nguyễn Ngọc Hải, 2012) Môi trường NA (Nutrient Agar): sau khoảng đến 10 ni cấy , dung 37oC kính lúp quan sát khuẩn lạc Sau 24 khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm, hình tròn, ướt bóng láng, khơng suốt, màu tro trắng nhạt, lồi Nếu ni lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt mọc rộng ra, quan sát thấy khuẩn lạc dạng R (Rough) M (Mucoid) (Theo Lê Thị Hồi, 2008) Mơi trường MHA (Mueller Hinton Agar): qua 18-24 ủ tủ ấm 37 oC, hình thành khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc lồi, đường kính 2-3 mm (Đào Trọng Đạt, 2001) Môi trường EMB (Eosin Methylen Blue Agar): sau 24 ni cấy 37 oC, vi khuẩn hình thành hững khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim (Nguễn Ngọc Hải, 2012) Môi trường TBX (Tryptone Bile X-Glucurnide Agar): phương tiện phát triển môi trường chọn lọc để phân lập định lượng Escherichia coli mẫu thực phẩm Dựa Tryptone Bile Agar kết hợp tác nhân chromogenic X-glucuronide, phát hoạt động enzyme glucuronidase, enzyme phát thuốc thử MUG chứng minh cụ thể cho Escherichia coli, phân biệt với sinh vật coliform khác Kết khuẩn lạc màu xanh, coliforms khác không màu (Bavo Verhaegen, 2015) 2.1.3 Đặc tính sinh hóa Hầu hết trường hợp E coli lên men số loại đường bao gồm arabinose, glucose, galatose, fructose, saccharose maltose Khả lên men glucose với việc sản xuất acid, sinh sinh Indole đặc tính E coli (Soja, 1965; Bettelheim, 1994; trích dẫn Anna Milena Ulmer Franco, 2011) Phản ứng Voges Proskauer oxidase âm tính Có thể dung xét nghiệm sinh hóa phân biệt E coli từ loài Escherichia khác vi khuẩn thuộc họ Enterobaccteriaceae E coli phân lập từ gia cầm có đặc tính sinh hóa tương tự E coli phân lập từ nguồn khác (Hồ Việt Thu Nguyễn Đức Hiền, 2012) Theo Nguyễn Tiến Dũng (2007), vi khuẩn E.coli xuất sớm động vật sau sinh khoảng giờ, chúng thường phần sau ruột Trong nhiều trường hợp tìm thấy niêm mạc nhiều phận khác thể Để phân biệt vi khuẩn E.coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử dụng phản ứng IMViC qua môi trường Tryton (thử nghiệm sinh indole), MR (Methyl Red), VP (Voges Prokauer), Simmons citrate (Nguyễn Ngọc Hải, 2012) Phản ứng sinh Indole Tiến hành phản ứng: cấy vi khuẩn vào môi trường tryptone, ủ 37 oC Sau 24 giờ, nhỏ giọt dung dịch thuốc thử Kovac ’s vào môi trường, để yên vài phút, theo dõi tạo màu đỏ trrong lớp dung môi hữu Phản ứng (+): vòng thuốc thử chuyển màu đỏ, phản ứng (-): có lớp màu vàng thuốc thử bề mặt mơi trường Ngun tắc: Một số vi khuẩn sản xuất indol từ axit amin tryptophan cách sử dụng enzyme tryptophanase (Trần Linh Thước, 2003) Tryptophan tryptophanase > Indole + pyruvic acid + NH3 H2 O Phản ứng Methyl Red (MR) Tiến hành phản ứng: vi khuẩn thử nghiệm cấy vào nước dùng phosphate glucose, có chứa glucose đệm phosphate ủ 37oC 48 Trong 48 hỗn hợp sản xuất axit sinh vật phải sản xuất đủ axit để vượt qua đệm phosphate axit Độ pH mơi trường kiểm tra cách cho thêm giọt thuốc thử methyl red Phát triển màu đỏ thu tích cực Methyl red với sinh vật âm tính mơi trường khơng đổi màu (Stephan et al., 2013) Nguyên tắc: Điều để phát khả sinh vật để sản xuất trì sản phẩm axit cuối ổn định từ trình lên men glucose Một số vi khuẩn sản xuất lượng lớn axit từ trình lên men glucose mà vượt qua tác dụng đệm hệ thống Methyl red số pH, mà màu đỏ độ pH 4,4 Glucose + H2O > Lactic acid + acetic acid + ethanol + CO2 + H2 Phản ứng Voges Proskauer (VP) Tiến hành phản ứng: cấy vi khuẩn vào môi trường lỏng VP-MR, ủ 37 oC 24 giờ, nhỏ vào môi trừng nuôi cấy vi khuẩn mẫu giọt dung dịch thuốc thử VP1 (alpha-naphthol) giọt dung dịch VP2 (NaOH 40%), đọc kết sau 20 phút Phản ứng (+): có màu đỏ bề mặt mơi trường, phản ứng (-): môi trường không đổi màu Nguyên tắc: trình lên men glucose, E coli cho sản phẩm cuối khác nhau, số acetonin Khi bổ sung vào môi trường vài giọt VP1 VP2 aceton tạo phức hợp máu đỏ (Trần Linh Thước, 2003) Glucose + 1/2O2 2,3-butanediol > 2,3-butanediol + H2O + CO2 Oxi hóa 2,3-butanediol dehydrogenase Acetoin + α – Naphthol 40% NaOH O2 Diacetyl + Guanidine > Acetoin > Diacetyl > màu đỏ Sử dụng Citrate Tiến hành phản ứng: khuẩn lạc vi khuẩn cấy vào thạch Simmon citrate ủ qua đêm 37oC Nếu sinh vật có khả sử dụng citrate, tạo sản phẩm cuối có tính kiềm, chúng thay đổi màu sắc môi trường từ màu xanh sang màu xanh dương Âm tính, môi trường không đổi màu Sử dụng citrate liên quan đến enzyme citrase, mà phá vỡ citrate thành oxaloacetate acetate Oxaloacetate tiếp tục bị tách thành pyruvate CO2 Sản xuất Na2CO3 NH3 từ việc sử dụng sodium citrate muối amoni tương ứng tạo kết pH kiềm Điều dẫn đến thay đổi màu sắc môi trường từ màu xanh sang màu xanh dương Nguyên tắc: kiểm tra phát khả sinh vật với sử dụng citrate làm nguồn carbon (Quinn et al., 2004) Citrate > Oxaloacetate + Acetate Oxaloacetate > Pyruvate + CO2 CO2 + Na + H2O > Na2CO3 + H2 NH3 + CO2 + H2O > (NH4)2CO3 2.1.4 Sức đề kháng Trong tự nhiên, vi khuẩn E coli tồn khắp nơi: chuồng, máng ăn, nước uống, chuồng trại ẩm thấp chật chội, mật độ nuôi cao, biên độ nhiệt thường xuyên thay đổi, stress điều kiện phát sinh mầm bệnh (Nguyễn Xuân Bình, 2005) E coli vi khuẩn không sinh nha bào nên không chịu nhiệt độ cao, bị vơ hoạt nhiệt độ 60 0C sau 30 phút, 70oC sau phút, điều kiện đơng khơ vi khuẩn sống lâu (Hồ Thị Việt Thu, 2012) Các chất sát trùng thông thường acid phenic, formol, hydroperoxide 1% diệt vi khuẩn vài phút Sự sinh sôi hầu hết chủng bị ức chế pH < 4,5 pH > không chết E coli dày ruột sống sót pH 2,5 Muối 8,5 % ngăn ngừa tăng trưởng không bất hoạt vi khuẩn (Barnes et al., 2008) Escherichia coli thường vi khuẩn đường ruột không gây bệnh Tuy nhiên, số chủng có yếu tố độc tính gây nhiều bệnh động vật sức đề kháng chúng bị giảm sút (Stenutz, 2006) Dựa đặc điểm gây bệnh, chúng phân thành tám nhóm nhỏ sau (Antão et al., 2008) EPEC (Enteropathogenic E coli): E coli gây bệnh đường ruột ETEC (Enterotoxicgenic E coli): E coli sinh độc tố ruột EIEC (Enteroinvasive E coli): E coli xâm nhập ruột EAEC (Enteroaggregative E coli): E coli ngưng tập ruột DAEC (Diffusely adherent E coli) : E coli bám dính phân tán EHEC (Enterohaemorrhagic E coli) : E coli gây xuất huyết ruột MAEC (Meningitidis-associated E coli): E coli gây bệnh viêm màng não UPEC (Uropathogenic E coli): E coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu 2.1.5 Phương thức lây truyền bệnh Tính gây bệnh Theo Wilson et al (2002), để gây bệnh trước hết vi khuẩn E coli phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột yếu tố bám dính Sau nhờ yếu tố xâm nhập vi khuẩn xâm nhập vào tế bào biểu mơ thành ruột Ở vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá hủy lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột đồng thời sản sinh độc tố đường ruột Độc tố đường ruột tác động vào trình trao đổi muối, nước, làm rối loạn chu trình Nước từ thể tập trung vào lòng ruột làm căng ruột, với khí lên men ruột gây nên tác dụng học làm nhu động ruột tăng, đẩy nước chất chứa ngoài, gây nên tượng tiêu chảy Sau phát triển thành ruột vi khuẩn vào hệ lâm ba đến hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu Trong máu, vi khuẩn chống lại tượng thực bào gây dung huyết làm cho thể thiếu máu Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn đến tổ chức, quan khác Ở vi khuẩn phát triển lên lần thứ hai, phá hủy tế bào tổ chức gây tụ huyết xuất huyết Các yếu tố gây bệnh E coli gồm khả kháng khuẩn, yếu tố bám dính, khả xâm nhập, yếu tố gây dung huyết khả sản xuất độc tố E coli có sẵn ruột động vật tác động gây bệnh sức đề kháng vật giảm Bệnh E coli xảy bệnh truyền nhiễm kế phát sở thiếu vitamin mắc bệnh virus kí sinh trùng Khi tỉ lệ E coli giảm xuống 20% so với tổng số vi sinh vật đường ruột xuất triệu chứng rối loạn tiêu hóa loạn khuẩn E.coli có sẵn ruột động vật tác động gây bệnh sức đề kháng vật giảm Tuy loại mà chế gây bệnh có khác nhau: EPEC (Enteropathogenic E.coli) gây viêm ruột non: ETEC (Enterotoxigenic E.coli) gây bệnh sinh độc tố; EIEC (Enteroinvasive E.coli) gây bệnh có khả xâm nhập vào niêm mạc ruột già, chế giống vi khuẩn Shigella gây tiêu chảy có đờm lẫn máu; EAEC (Enteroaggregative E.coli) gây bệnh bám vào niêm mạc làm tổn thương chức ruột; EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli) gây bệnh làm tổn thương xuất huyết ruột (Lê Hồng Hinh, 2008) Các chủng EHEC mối đe dọa cho sức khỏe người, đặc biệt serotype O157:H7 Vi khuẩn truyền sang người chủ yếu thông qua việc sử dụng thực phẩm sống chưa nấu chín kỹ, ngồi vi khuẩn bị lây nhiễm vào thực phẩm thơng qua môi trường xung quanh Chỉ cần lượng nhỏ vi khuẩn đủ gây bệnh EHEC thường dẫn đến hội chứng tán huyết-tăng ure máu (HUS) phổ biến trẻ em EHEC thường tìm thấy nhiều động vật nhai lại, chúng diện động vật khác heo, chó mèo gà (WHO, 2011) Vi khuẩn E coli gây bệnh gia cầm thuộc nhóm APEC (Avian Pathogenic E.coli), chúng gây bệnh Colibacillosis (nhiễm khuẩn E.coli) gà, bệnh cấp tính, dẫn đến thiệt hại kinh tế đáng kể ngành cơng nghiệp chăn ni gà tồn giới (Ewers C, 2003) Tỉ lệ nhiễm đàn thường 10%, tỉ lệ chết thường thấp 5% lên đến 20% (Hồ Thị Việt Thu, 2012) Gà mắc bệnh E coli có biểu đờ đẩn, giảm tăng trọng, có triệu chứng hơ hấp Sau gà bị nhiễm trùng huyết, nhiệt độ tăng cao 420C- 430C Lơng xù có bết phân, sau gà chết Một số gia cầm mắc bệnh cố triệu chứng què từ mức độ nhẹ nặng, dứng khó khăn Nguồn lây nhiễm Theo Hồ Thị Việt Thu Nguyễn Đức Hiền (2012), hầu hết loài động vật có E coli thường trú ống tiêu hóa Ở ống tiêu hóa gia cầm, mật độ E coli đến 106CFU/g Sự lây nhiễm E coli từ trứng phổ biến nguyên nhân gây tỉ lệ chết cao cho gia cầm nở Bình thường có khoảng 0,5-6% trứng gia cầm khỏe có chứa E coli, 26,5% gà mái nhiễm E coli đẻ trứng có vi khuẩn E coli Tuy nhiên đường lây nhiễm qua phân cách lây truyền quan trọng Vi khuẩn E coli diện thường xuyên đường ruột thải qua phân với số lượng lớn Sự tiếp xúc trực tiếp, gián tiếp với phân đưa chủng vào bầy đàn Bệnh lây qua đường tiêu hóa, qua vết thương da, qua niêm mạc bị tổn thương (Barnes et al., 2008) Ngồi ra, E coli truyền qua trứng thể gà mẹ bị nhiễm bệnh, truyền lây qua đường hô hấp niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn từ môi trường xâm nhập qua vết thương vào thể, truyền qua vỏ trứng bị nhiễm bẩn từ phân môi trường chuồng trại bị nhiễm trùng, lây qua thức ăn nước uống bị nhiễm trùng (Nguyễn Xuân Bình ctv., 2005) Mặt khác, E coli có sẵn ruột động vật tác động gây bệnh sức đề kháng vật bị giảm sút (do chăm sóc, ni dưỡng, thời tiết thức ăn,…) Bệnh trực khuẩn E coli xảy bệnh truyền nhiễm kế phát sở thiếu vitamin, mắc bệnh virus ký sinh trùng E coli thường gây bệnh cho gia súc đẻ từ - ngày - ngày Người ta gọi Colibacillosis bệnh đường ruột ngựa, bê, cừu, lợn gia cầm non E coli gây (Lưu Hữu Mãnh, 2009) Nguồn gây bệnh E coli chủ yếu từ bệnh khỏe mang trùng xuất mầm bệnh môi trường nuôi nhốt, ngồi nguồn bệnh cầu khuẩn gram dương, Staphylococcus aureus Streptococcus pneumonia, gặp vi khuẩn gram âm Trong số vi khuẩn gram âm, chế đề kháng thấy vi khuẩn Neisseria gặp Haemophilus influenza Biến đổi vị trí gắn kết ribosom: Biến đổi bên tế bào vi khuẩn tiểu đơn vị ribosom đích làm giảm hoạt tính kháng sinh macrolides, clindamycine, nhóm aminosides, chloramphenicol Sự biến đổi làm cho kháng sinh không đủ khả ức chế tổng hợp protein tăng trưởng vi khuẩn, gắn kết vào vị trí tác dụng ribosom Biến đổi men DNA-gyrase men topoisomerase: DNA-gyrase men cần thiết cho hoạt tính quinolone Sự đột biến thời độc acid amine DNA-gyrase gây đề kháng Tương tư đột biến men topoisomerase Biến đổi tiền chất đích thành tế bào vi khuẩn: Hiện tượng bị xảy dùng vancomycine, trường hợp cầu khuẩn đề kháng với vancomycine Biến đổi enzyme đích: Sự biến đổi men dihydropteroate synthetase kháng lại gắn kết với sulfamide men dihydropteroate reductase làm nhạy cảm với trimetoprime đồng thời gây kháng thuốc Sự đề kháng vi khuẩn gram âm sulfamide plasmide tạo enzyme đề kháng Bơm đẩy Kháng sinh đạt đến vị trí tác dụng bơm đẩy chủ động đẩy kháng sinh khỏi tế bào vi khuẩn (efflux) Các chất vận chuyển đẩy thuốc thành phần bình thường tế bào vi khuẩn góp phần lớn cho tính đề kháng nội sinh vi khuẩn chống lại nhiều thuốc kháng sinh Các bơm cần lượng Việc tiếp xúc với thuốc kháng sinh làm thuận lợi cho việc tăng số lượng bơm đột biến chất mang, làm tăng mạnh tính đề kháng vi khuẩn Đây ngun nhân gây đề kháng chéo Ví dụ, ciprofloxacine làm thuận lợi việc phát tán đề kháng với cephalosporine theo chế bơm đẩy Các vi khuẩn gây bệnh quan trọng lâm sàng có mang bơm đẩy gây kháng thuốc E Coli Shigella Staphylococcus aureus có bơm đẩy làm cho vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm Macrolides 2.3 Tổng quan men beta-lactamase phổ rộng (Extended Spectrum βLactamases) 14 2.3.1 Khái niệm men beta-lactamase phổ rộng (ESBL) ESBL β-lactamases phổ rộng có khả tác động lên penicillin, cephalosporin hệ 1, hệ 2, hệ aztreonam (trừ kháng sinh cefamycin carbapenem) chúng có khả ly giải kháng sinh chúng lại bị ức chế các chất ức chế β-lactamases acid clavulanic, sulbactam, tazobactam (Nguyễn Thị Khánh Ly, 2013) Các chất khơng có hoạt tính kháng khuẩn, dùng phối hợp với β – lactams để có tác động β – lactamase (Trần Đức Hậu, 2007) Men β-lactamase phân loại dựa vào khả thủy phân chất thuộc kháng sinh β-lactam mức độ bị ức cheesbowir acid clavulanic, đột biến làm thay đổi phân loại Ví dụ TEM-1 peniccilinase đơn giản hoạt động chúng bị ức chế acid clavulanic tazobactam, Tuy nhiên, đột biến điểm enzyme TEM có phổ hoạt động rộng dẫn đến đề kháng với cephalosporin hệ thứ Sự bất hoạt aztreonam, ceftazidime, cefotaxime ceftriaxone xem thị cho diện men β-lactamase có phổ rộng (Võ Thị Trà An, 2010) Cơ chế đề kháng kháng sinh vi khuẩn E coli sinh ESBL Theo Nguyễn Sâm (2012) vi khuẩn sinh ESBL thường đề kháng cao với nhiều nhóm kháng sinh Các ngun nhân đươc ghi nhận là: Các ESBL thường mã hóa qua trung gian plasmide gen đề kháng kháng sinh thường liên kết theo nhóm, dẫn đến gen đề kháng bị đột biến với kháng sinh nhóm khác Khi đề kháng kháng sinh ESBL có thay háng sinh điều trị dẫn tới tăng đột biến cảm ứng tạo gen đề kkhangs kháng sinh nhóm kháng sinh thay nhiều vi khuẩn thơng thường, Vi khuẩn sinh ESBL có khả đề kháng chéo với nhóm kháng sinh khác Nhờ vậy, nhìn từ lịch sử phát đặc điểm phân loại chế đề khấng kháng sinh thi chất vi khuẩn ESBL có đặc điểm sau Gen mã hóa ESBL nằm plasmide đột biến từ gene β-lactam cổ điển TEM-1, SHV-1 ESBL sinh đột biến cảm ứng từ việc sử dụng cephalosporin phổ rộng hệ 3,4 aztreonam Kháng chéo kèm với kháng sinh nhóm aminoglycosides, flouroquinolones nhiều kháng sính khác Tuy nhiên, nhạy ảm với β-lactam kết hợp chất ức chế, nhạy cảm carbapenem, cephamicins, temocillin nhóm kháng sinh có cấu trúc tương tự 15 2.3.2 Các phương pháp phát vi khuẩn sinh ESBL Sự gia tăng tỷ lệ lưu hành Enterobacteriaceae sinh ESBL tạo nhu cầu lớn cho phương pháp kiểm tra phòng thí nghiệm để xác định xác diện enzym phân lập lâm sàng Dựa nguyên lý chung: Các ESBL bị ức chế chất ức chế βlactamase acid clavulanic, sulbactam, tazobactam Từ dựa vào chất ức chế nói kết hợp với kháng sinh điểm để phát ESBL Nhiều phương pháp phát ESBL đề nghị dựa nguyên tắc đĩa khuyếch tán Kirby – Bauer sử dụng rộng rãi là: Phương pháp đĩa đôi, phương pháp đĩa kết hợp phương pháp E – test (Bradford, 2001) Phương pháp đĩa đôi (Double disk diffusion test) Phương pháp đĩa đôi được nhà nghiên cứu người Pháp Jarlier cộng tiến hành năm 1988 Sau tác giả người Anh David M Livermore cộng tiếp tục nghiên cứu đề xuất thêm số tiêu chuẩn kỹ thuật cho thử nghiệm Dựa nguyên tắc clavulanic acid ức chế ESBL nên làm giảm mức độ đề kháng cephalosporins mở rộng vòng vô khuẩn đĩa kháng sinh cephalosporins đặt gần đĩa kháng sinh chứa clavulanic acid Vi khuẩn cấy đĩa thạch Mueller – Hinton agar (MHA) Đặt đĩa cephalosporin (30µg) với đĩa amoxicillin – clavulanate (20µg) cách 20 – 25mm mặt thạch Trước đây, khoảng cách yêu cầu 30mm, nay, khoảng cách giảm xuống để tăng độ nhảy cảm phương pháp Có cộng hưởng có mở rộng vòng vô khuẩn đĩa cephalosporin vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanate Ưu điểm: phương pháp dễ thực hiện, rẻ tiền, độ nhạy đặc hiệu cao > 95% Nhược điểm: khó lựa chọn khoảng cách tối ưu khoanh giấy vi khuẩn, âm tính giả với ESBL hoạt tính thấp, khơng phát vi khuẩn P.aeruginosa số vi khuẩn có ESBL giảm ức chế clavulanic acid thường gặp ESBL type OXA- (Pitout, 2003) 16 Hình 2.1 Phương pháp đĩa đôi phát ESBL (Pitout, 2003) Phương pháp đĩa kết hợp (Combination disk test) Phương pháp Jacoby Hans mô tả lần vào năm 1999 Bằng cách sử dụng hai loại đĩa kháng sinh cephalosporins hệ cephalosporins hệ tương ứng phối hợp với clavulanic acid Vi khuẩn tiết ESBL hiệu số đường kính vòng vơ khuẩn đĩa cephalosporins có phối hợp với clavulanic acid so đĩa cephalosporins ≥5mm Các loại đĩa kháng sinh sử dụng cefotaxime (30µg)/ cefotaxime – clavulanic acid (30/10µg); ceftazidime (30µg)/ ceftazidime – clavulanic acid (30/10µg); cefpodoxime (10 µg)/ cefpodoxime (10/10 µg) (CLSI, 2014) Ưu điểm: phương pháp dễ thực tốn u cầu phòng thí nghiệm phải có đĩa kháng sinh cefotaxime – clavulanic acid ceftazidime – clavulanic acid Nhược điểm: số trường hợp cho kết dương tính giả số vi khuẩn sinh AmpC xuất gia tăng đường kính vòng vơ khuẩn có clavulanic acid 17 Hình 2.2 Phương pháp đĩa kết hợp phát ESBL (Sohei Harada, 2008) Chú thích CAZ: ceftazidime CTX: cefotaxime CAZ/CVA: ceftazidime /clavulanic acid CTX/CVA: cefotaxime /clavulanic acid Phương pháp E-test Các Etest ESBL (AB biodisk, Solna, Thụy Điển) dải nhựa tẩm thuốc với bên chứa thang nồng độ ceftazidime 0,5-32 mg/ml bên chứa thang nồng độ ceftazidime 0,064 - mg/ml cộng với nồng độ cố định clavulanate acid (4 mg/ml) (TZ / TZL) Một Etest ESBL tương tự ngâm tẩm với cefotaxime nồng độ 0,25 - 16 mg/l cefotaxime 0,064 - mg/l cộng với clavulanate acid (4mg/l) (CT / CTL) lúc có sẵn Các nhà sản xuất khuyến cáo việc sử dụng dải TZ / TZL CT / CTL để xác nhận sản xuất ESBL (Enno Stürenburg, 2004) Kết ESBL đọc dương tính giá trị MIC giảm lần trở lên quan sát thấy diện clavulanate so với đầu lại quan sát vòng kháng khuẩn thang CTL, TZL biến dạng hình elip giảm dần phần cuối sản xuất ESBL, tỷ lệ MIC họ kháng sinh) Hơn nữa, 79% chủng kháng tám kháng sinh, 98% kháng ciprofloxacin Ngoài ra, 100% chủng kháng ampicillin, cephalosporin, trimethoprim, florphenicol tetracycline, 98% kháng sulfamethoxazol; 86% kháng streptomycin; 45% kháng chloramphenicol; 36% kháng gentamicin; 17% kháng cho kanamycin; 2% kháng colistin Ruồi hồ chứa nguy hiểm vectơ cho mầm bệnh vi khuẩn kháng thuốc đến người động vật tiếp xúc với phân chuồng, thức ăn, người Nghiên cứu Abdallah HM (2015) tiến hành phân tích từ mẫu thịt gà bán lẻ mua Zagazig, Ai Cập cho thấy có 69 số 106 (65,09%) sản xuất ESBL Đây nghiên cứu Ai Cập báo cáo tỷ lệ cao ESBL phân lập từ thịt gà bán lẻ Những kết nêu lo ngại nghiêm trọng y tế công cộng an toàn thực phẩm từ thịt bán lẻ hồ chứa vi khuẩn kháng thuốc truyền qua cho người thông qua chuỗi thức ăn Tại Ghana, Mette Marie Rasmussen (2015) tiến hành lấy mẫu phân tích 188 mẫu từ thịt gà sản xuất nước Có 153 vi khuẩn phân lập thành công nuôi cấy xác định E Coli Trong 29 E.coli sản xuất beta-lactamase (18,95%) số kháng với ≥ loại kháng sinh chiếm 56,9%, Tần số kháng kháng sinh cao cefpodoxime kháng 100%, với tetracycline (88,9%), sulphonamide (75,0%), ampicillin (69,4%) trimethoprim (66,7%) Theo Yang Lauderdale (2015) nghiên cứu Đài Loan cho thấy phổ biến vi khuẩn kháng thuốc từ trang trại chăn nuôi gia súc gia cầm mối đe dọa tiềm ẩn sức khỏe cộng đồng Tổng cộng 95 mẫu thịt 20 nghiên cứu (23 mẫu thịt bò, 35 mẫu thịt gà, 37 mẫu thịt lợn) Trong đó, E.coli ESBL phát 60 mẫu (chiếm 63,2%), cụ thể có 30,4% (7/23) mẫu thịt bò dương tính với ESBL, mẫu thịt gà thịt lợn dương tính với ESBL với tỉ lệ 80% (28/35), 64,9% (24/37) Ở Hàn Quốc, Lim Jong-Soo (2015) điều tra xuất kháng kháng sinh E coli ESBL từ xác thịt gà (n = 156) lò mổ Hàn Quốc Kết phân lập 62 mẫu dương tính E coli ESBL lấy từ 156 mẫu (39,7%) Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng cao E coli ESBL mẫu thịt gà thu thập từ lò mổ Hàn Quốc Theo nghiên cứu Tao Yu et al (2015) tiến hành phân lập E coli từ mẫu thịt gà bán lẻ tỉnh Hà Nam, Trung Quốc phát 179 645 mẫu (27,7%) Trong số 179 chủng phân lập, 30 (16,7%) sản xuất ESBL Trong có 78,2% chủng đề kháng với streptomycin, kháng với tetracycline kháng với trimethoprim/sulfamethoxazole 54,2% 74,3% Tại Zambia, Chishimba (2016) tiến hành thu thập phân tích 384 mẫu thịt gà bán lẻ chợ Trong tổng số mẫu phân tích có 20,1% (77/384) chứa E.coli ESBL Các thử nghiệm độ nhạy cảm kháng sinh cho thấy 85,7% (66/77) E coli ESBL phân lập kháng với beta-lactam kháng sinh khác Những kết gia cầm hồ chứa tiềm tạo E.coli ESBL Sự diện E.coli ESBL gia cầm dành làm thực phẩm cho người đòi hỏi phải tăng cường sách quản lý, sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi phải đảm bảo an toàn hiệu Theo nghiên cứu Po-An Chen (2016) tiến hành thu thập 40 mẫu nước sông từ trạm trang trại chăn nuôi gia súc gia cầm miền Nam Đài Loan, tỉ lệ E coli ESBL chiếm 186 621 chủng E coli (chiếm 30%) Kết cho thấy nước thải từ trang trại chăn nuôi, đặc biệt nước thải chưa qua xử lý góp phần vào lây lan gen kháng thuốc vào môi trường xung quanh 2.4.1 Tình hình nghiên cứu nước Nghiên cứu Phạm Thị Cẩm Tú (2015), phân lập E coli từ mẫu phân gà khỏe Bến Tre cho thấy diện E coli ESBL 55,18% (181/328) Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ kết cho thấy đề kháng cao với 10 loại kháng sinh (>80%) ampicillin, cefuroxime, cefalor, gentamicin, streptomycin, kanamycin, tetracycline, norfloxacin, ofloxacin, trimethoprim/sulfamethoxazole 21 Theo Đỗ Kim Huệ (2014), tiến hành thu thập 60 mẫu phân gà đẻ Sóc Trăng phân tích, kết cho thấy tỉ lệ diện E coli ESBL 30% Các E coli ESBL đề kháng mạnh với số kháng sinh ampicillin 100%, trimethoprim/sulfamethoxazole 98%, streptomycin 96,6%, cefalor 96,6%, cefuroxime 92,6%, gentamicin 88,6% Theo nghiên cứu Ngô Văn Thống (2014), tỉ lệ diện vi khuẩn E coli ESBL mẫu phân gà khỏe Trà Vinh 65,45% Trong có 99,10% chủng đề kháng với ampicillin, 93,94% kháng với cefalor trimethoprim/sulfamethoxazole, đề kháng với cefuroxime streptomycin 90,91% 85,28% Trương Thị Xuân Ngân (2014), kết phân lập từ mẫu phân gà đẻ nuôi nông hộ tỉnh Vĩnh Long có tỉ lệ diện E coli ESBL 51,66% Các khuẩn lạc E coli ESBL đề kháng cao với amikacin 99,01%, cefalor 96,04%, ampicillin 92,08%, cefuroxime 86,14%, fosfomycin 82,18% 22 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu Thời gian thực hiện: từ tháng 08 năm 2016 đến tháng 12 năm 2016 Địa điểm lấy mẫu nghiên cứu: huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long Địa điểm phân tích mẫu: Bộ mơn Thú Y, khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ Đối tượng nghiên cứu: mẫu phân gà khỏe môi trường chăn nuôi (thức ăn máng, không khí, nước máng uống, nước nguồn) số hộ chăn ni gà thuộc huyện Trà Ơn, tỉnh Vĩnh Long 3.2.2 Dụng cụ hóa chất Dụng cụ: máy autoclave, máy lắc vortex, tủ sấy vô trùng,tủ nung,buồng cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ ấm, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que chang, đèn cồn, micropipet loại, cốc thủy tinh, cân điện tử, ống đong loại, kéo, kẹp, tăm bơng vơ trùng, đũa thủy tinh, thước đo vòng vô khuẩn, thùng trữ lạnh, túi nylon, trang, găng tay Hóa chất: cồn 70o, 90o, nước cất, NaCl 0,9% Các môi trường sử dụng: MacConkey Agar (MC), Nutrient Agar (NA),Tryptone Bile X-Glucuronide Agar (TBX), Muller-Hilton Agar (MHA) Các kháng sinh sử dụng: ceftazidime 30µg (Cz), ceftazidime/acid clavulanic 30/10µg (Zc), cefotaxime 30µg (Ct), cefotaxime/acid clavulanic 30/10µg (Tc), ampicillin 10µg (Am), cefuroxime 30µg (Cu), cefaclor 30µg (Cr), gentamycin 10µg (Ge) , streptomycin 10µg (Sm), kanamycin 30µg (Kn), amikacin 30µg (Ak), tetracycline 30µg (Te), doxycycline 30µg (Dx), norfloxacin 10µg (Nr) , ofloxacin 5µg (Of), fosfomycin 50µg (Fo), trimethoprim+ sulfamethoxazole 1,25/23,75 µg (Bt), colistin 10µg (Col) 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu Đề tài thu thập ngẫu nhiên mẫu phân 30 gà khỏe mạnh (15 gà ≤ tuần tuổi, 15 gà ≥ tháng tuổi) mẫu thức ăn, khơng khí, nước mơi trường chăn nuôi hộ chăn nuôi huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long 23 Lấy mẫu phân: dùng cồn sát trùng xung quanh hậu môn gà, dùng tăm vô trùng đưa vào lỗ huyệt gà để lấy phân, sau cho vào mơi trường vận chuyển Cary Blair Mẫu thức ăn máng, nước máng uống nước nguồn: dùng muỗng lấy mẫu gộp máng, cho vào bọc nilon Mẫu khơng khí: lấy cách đặt đĩa nhựa MC có chứa kháng sinh ceftazidime (2mg/l) góc chuồng cho gà không với tới được, khoảng 20 - 30 phút Sau đó, ghi ký hiệu cho mẫu bảo quản lạnh trình vận chuyển phòng thí nghiệm để phân tích Số liệu thu thập trình bày bảng 4.1 Đối tượng Số hộ Số mẫu/ hộ Tổng cộng Phân gà thịt 30 Thức ăn máng 5 Nước máng uống 5 Nước nguồn 5 Khơng khí 5 25 Tổng 70 Bảng 4.1 Số lượng mẫu thu thập 3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn E coli sinh ESBL Sau lấy mẫu từ gà thịt, ta tiến hành phân lập E.coli đề kháng kháng sinh Mẫu phân, nước uống, nước nguồn, thức ăn sau đồng mẫu ta lấy tăm phết trực tiếp lên đĩa thạch môi trường MC (Mac Conkey Agar) bổ sung ceftazidime mg/l Sau ủ nhiệt độ 37oC 24 Khuẩn lạc E.coli mọc mơi trường MC có màu hồng đậm, tròn đều, lồi, mọc rời rạc Sau tiến hành chọn 10 khuẩn lạc nghi ngờ E coli cấy môi trường NA, ủ ấm 37oC 24 Sau cấy lên mơi trường TBX (Tryptone Bile X-Glucuronide) để khẳng định vi khuẩn E.coli kết đường cấy màu xanh dương sau ủ ấm 37oC 24 giờ, 24 Sau xác định vi khuẩn E.coli đề kháng kháng sinh phương pháp sàng lọc Tiếp tục thực phương pháp đĩa kết hợp môi trường MHA (Mueller Hinton Agar) để xác định vi khuẩn E.coli sinh beta-lactamase phổ rộng theo tiêu chuẩn CLSI (2014) Trước cấy vào môi trường MHA ta lấy vài khuẩn lạc E.coli đề kháng kháng sinh cho vào ống nghiệm chứa ml nước muối sinh lý so độ đục chuẩn Mac Farland 0.5 Nếu không đủ độ đục ta đem ống nghiệm ủ tăng sinh cho đạt 108 CFU/ml Phương pháp thực hiện: Dùng que tăm vô trùng nhúng vào hỗn dịch vi khuẩn, ép vào thành ống cho bớt nước phết lên mặt thạch Sau mặt thạch khô ta tiến hành đặt khoanh giấy kháng sinh sau: đĩa A chứa ceftazidime 30ug, đĩa B chứa ceftazidime 30ug acid clavulanic 10 ug; đĩa C chứa cefotaxime 30 ug, đĩa D chứa cefotaxime 30ug acid clavulanic 10ug Ủ nhiệt độ 370C 16-24 Nếu có khác biệt đĩa A B C D lớn 5mm khẳng định E.coli sinh beta-lactamase phổ rộng.Quy trình phân lập vi khuẩn E coli ESBL thể qua hình 3.1 25 Mẫu phân, nước uống, nước nguồn, thức ăn, không khí Cấy mơi trường MC chứa ceftazidime (2mg/l) ủ 37oC/24h Cấy môi trường NA ủ 37oC/24h Cấy khuẩn lạc lên môi trường TBX ủ 37oC/24h Khẳng định E Coli Pha huyễn dịch vi khuẩn có nồng độ 108 CFU/ml (đã lắc đều) Cấy môi trường MHA Đặt khoanh giấy kháng sinh (Cz, Zc, Ct, Tc) 37oC /24h Đo đường kính vòng kháng khuẩn kết luận E.coli ESBL(≥ 5mm) Giữ giống Hình 3.1 Quy trình ni cấy phân lập vi khuẩn E.coli ESBL 3.2.3 Phương pháp kiểm tra tính nhạy cảm vi khuẩn E coli ESBL phân lập kháng sinh Kiểm tra độ nhạy cảm vi khuẩn E.coli sinh ESBL với 14 loại kháng sinh bắng phương pháp khuếch tán thạch Kirbry-Bauer Chọn vi khuẩn E coli ESBL cho vào 9ml dung dịch nước muối vô trùng so độ đục với ống chuẩn Mac Farland 0.5 ta huyễn dịch vi khuẩn có nồng độ 108CFU ml Dùng tăm vô trùng nhúng vào ống nước muối sinh lý lắc kĩ ép thành ống nghiệm cho bớt nước, tiến hành phết mơi trường MHA có độ dày mặt thạch tốt 4mm 26 Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt đĩa giấy kháng sinh lên mặt thạch, kkhoong nên đặt đĩa giấy lên mặt thạch 90mm, mép đĩa giấy kháng sinh cách thành đĩa 15mm, đĩa cách 20mm, không di chuyển đĩa giấy tiếp xúc với mặt thạch để tránh vòng ức chế chồng chéo lên gây sai số đo vòng ức chế Để đĩa thạch nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng sinh từ đĩa giấy khuếch tán mặt thạch, ủ ấm 37OC Sau 16-18 giờ, dùng thước palme để đo đường kính vòng kháng khuẩn đối chiếu theo tiêu chuẩn Clinical and Laboratory Standards Inslitute CLSI (2014) (Bảng 3.1) để xác định loại kháng sinh nhạy, trung gian kháng vi khuẩn Hình 3.2 Kết kháng sinh đồ (Nguồn: http://http://www.cdc.gov/meningitis/lab-manual/images/chapt11figure01.gif) 27 Bảng 3.1 Tiêu chuẩn đường kính vòng kháng khuẩn số kháng sinh với vi khuẩn họ Enterobacteriaceae (CLSI, 2014) Tên kháng sinh Ký hiệu Lượng kháng sinh Kết đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Nhạy Ampicillin Cefuroxime Cefaclor Gentamicin Streptomycin Kanamycin Amikacin Tetracycline Doxycycline Ofloxacin Norfloxacin Fosfomycin Am Cu Cr Ge Sm Kn Ak Te Dx Of Nr Fo 10μg 30μg 30μg 10μg 10μg 30μg 30μg 30μg 30μg 5μg 10μg 50μg Colistin Col 10μg ≥ 17 ≥ 18 ≥ 18 ≥ 15 ≥ 15 ≥ 18 ≥ 17 ≥ 15 ≥ 14 ≥ 16 ≥ 17 ≥ 16 ≥ 11 Bt 1,25/23,75µg ≥ 16 Trimethoprim/ Sulfamethoxazole Trung gian 14 - 16 15 - 17 15 - 17 13 - 14 12 - 14 14 - 17 15 - 16 12 - 14 11 - 13 13 - 15 13 - 16 13 - 15 Kháng ≤ 13 ≤ 14 ≤ 14 ≤ 12 ≤ 11 ≤ 13 ≤ 14 ≤ 11 ≤ 10 ≤ 12 ≤ 12 ≤ 12 - ≤ 10 11 - 15 ≤ 10 3.2.3 Phương pháp xử lý thống kê So sánh khác biệt tỉ lệ diện phương pháp Chi square yatest sử dụng phần mềm Minitab 16.0 Microsoft excel 2010 28