Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của loài Viễn chí hoa vàng Polygala arillata Buch.-Ham. ex D. Don, họ Viễn chí (Polygalaceae).

ĐẶT VẤN ĐỀ Từ ngàn năm nay, con người đã biết sử dụng cây cỏ và nguồn nguyên liệu từ thiên nhiên để làm thuốc phòng và chữa bệnh. Trong suốt hơn 200 năm qua đã có rất nhiều cây thuốc được nghiên cứu về thành phần hóa học, về tác dụng dược lý trên thực nghiệm để giải thích cho công dụng trong y học cổ truyền, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và phát triển sản phẩm, thuốc theo hướng hiện đại. Tuy nhiên, đến nay vẫn còn phần nhiều cây thuốc chưa được nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học cũng như chưa có dẫn chứng khoa học để minh chứng công dụng của chúng trong y học cổ truyền. Chi Polygala là chi lớn nhất thuộc họ Viễn chí (Polygalaceae), phân bố ở khắp mọi nơi trên thế giới ngoại trừ Bắc Cực, Nam Cực và New Zealand [78], [176], [184]. Một số loài thuộc chi này như P. japonica, P. tenuifolia, P. senega, P. paniculata, P. sabulosa, P. arillata...được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở nhiều quốc gia để làm thuốc bổ, điều trị ho, cải thiện trí nhớ và các chứng bệnh liên quan đến viêm. Tác dụng dược lý của cao chiết cũng như các hợp chất phân lập được từ những loài này cũng đã được các nhà khoa học nghiên cứu trên nhiều mô hình thực nghiệm [78]. Viễn chí hoa vàng có tên khoa học là Polygala arillata Buch.-Ham. ex D. Don, thuộc họ Viễn chí (Polygalaceae) là cây thuốc phân bố ở một số quốc gia Châu Á như Việt Nam, Ấn Độ, Myanma, Trung Quốc...Ở nước ta, một số tài liệu có ghi chép rễ cây Viễn chí hoa vàng được dùng với tác dụng khư đàm lợi khiếu, an thần ích trí, hạ sốt [2], [5]. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu điều tra thấy đồng bào dân tộc Dao đỏ và Mông tại Sa Pa còn dùng rễ cây Viễn chí hoa vàng chữa đau nhức xương khớp, làm thuốc bổ, chữa suy nhược cơ thể [12]. Ở Trung Quốc, rễ và vỏ cây Viễn chí hoa vàng được sử dụng để chữa các bệnh đau nhức xương khớp, tê thấp, dùng làm thuốc bổ, chữa cảm mạo, kinh nguyệt không đều, viêm gan, cải thiện trí nhớ, các bệnh về lao phổi [2], [68], [79]. Mặc dù là một cây thuốc được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền để điều trị nhiều chứng bệnh (đặc biệt là các chứng bệnh liên quan đến đau nhức xương khớp), tuy nhiên cho đến nay không những ở Việt Nam mà cả trên thế giới cũng có ít nghiên cứu về thành phần hóa học và đặc biệt là các nghiên cứu dược lý trên thực nghiệm của loài Polygala arillata đã được báo cáo. Một vấn đề nữa là theo bản mô tả gốc cũng như các tài liệu về phân loại, Viễn chí hoa vàng - P. arillata Buch.- Ham. ex D. Don có nhiều đặc điểm rất gần với loài P. fallax Hemsl., một loài cũng được nêu có phân bố ở Sa Pa, Lào Cai. Do đó, việc thẩm định tên khoa học là cần thiết để làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về hóa học và tác dụng dược lý của Viễn chí hoa vàng. Nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc giải thích công dụng của rễ cây Viễn chí hoa vàng trong y học cổ truyền và góp phần làm phong phú thêm tri thức khoa học cho một cây thuốc dân gian Việt Nam, đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của loài Viễn chí hoa vàng Polygala arillata Buch.-Ham. ex D. Don, họ Viễn chí (Polygalaceae)” được thực hiện với 3 mục tiêu sau: 1. Thẩm định được tên khoa học của cây Viễn chí hoa vàng. 2. Định tính thành phần hóa học; phân lập và xác định cấu trúc hóa học một số hợp chất từ rễ cây Viễn chí hoa vàng. 3. Đánh giá được một số tác dụng sinh học của cao chiết, các phân đoạn và một số hợp chất phân lập từ rễ cây Viễn chí hoa vàng. Để đạt được 3 mục tiêu trên, luận án tiến hành với các nội dung nghiên cứu sau:  Thẩm định tên khoa học - Mô tả đặc điểm hình thái, phân tích đặc điểm của cơ quan sinh sản (hoa, quả, hạt) để thẩm định tên khoa học của mẫu Viễn chí hoa vàng nghiên cứu. - Xác định các đặc điểm vi phẫu của cây Viễn chí hoa vàng.  Nghiên cứu về hóa học - Định tính các nhóm chất chính có trong rễ Viễn chí hoa vàng. - Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ rễ Viễn chí hoa vàng  Nghiên cứu một số tác dụng sinh học - Đánh giá tác dụng ức chế sự sản sinh NO trên đại thực bào RAW264.7 bị kích thích bởi LPS của các cao chiết và một số hợp chất phân lập từ rễ cây Viễn chí hoa vàng. - Đánh giá tác dụng chống viêm (chống viêm cấp và viêm mạn), tác dụng giảm đau của cao chiết ethanol (VCE) và cao phân đoạn n-butanol (VCB) rễ cây Viễn chí hoa vàng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU ĐOÀN THÁI HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LOÀI VIỄN CHÍ HOA VÀNG POLYGALA ARILLATA BUCH.-HAM ex D DON, HỌ VIỄN CHÍ (POLYGALACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2019 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH NỘI DUNG Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG T NG QUAN 1.1 T NG QUAN VỀ CHI POLYGALA………………………………… 1.1.1 V o ự ố ủ Polygala ị trí phân loại chi Polygala……………………………… Đặc điểm thực vật chi Polygala…………………………… Phân bố chi Polygala……………………………………… Các loài thuộc chi Polygala phân bố iệt Nam……… 1.1.2 Thành phần hóa học chi Polygala……… 1.1.2.1 Các hợp chất xanthon………………………………………… 1.1.2.2 Các hợp chất saponin…………………………………………… 12 1.1.2.3 Các hợp chất oligosaccharid…………………………………… 18 1.1.2.4 Các nhóm hợp chất khác……………………………………… 23 1.1.3 Cơng dụng số lồi thuộc chi Polygala y học cổ truyền……………………………………………………………………… 1.1.4 Tác dụng sinh học cao chiết hợp chất phân l ược từ số loài thuộc chi Polygala……………………………………… 1.2 T NG QUAN VỀ CÂY VIỄN CHÍ HOA VÀNG…………………… 1.2.1 V trí phân lo m thực v t, phân bố sinh thái Viễn chí hoa vàng Polygala arillata Buch.-Ham ex D Don……………… 27 29 37 37 1.2.1.1 Vị trí phân loại Viễn chí hoa vàng…………………… 37 .2 Đặc điểm thực vật Viễn chí hoa vàng………………… 37 1.2.1.3 Phân bố sinh thái Viễn chí hoa vàng……………… 38 1.2.2 Thành phần hóa học Viễn chí hoa vàng Polygala arillata Buch.-Ham ex D Don……………………………………………………… 38 1.2.2.1 Các hợp chất xanthon………………………………………… 38 1.2.2.2 Các hợp chất saponin…………………………………………… 39 1.2.2.3 Các hợp chất phenolic glycosid………………………………… 39 1.2.2.4 Các hợp chất khác……………………………………………… 40 1.2.3 Một số công dụng tác dụng sinh học Viễn chí hoa vàng Polygala arillata Buch.-Ham ex D Don…………………………… 41 1.2.3.1 Tính vị, tác dụng……………………………………………… 41 1.2.3.2 Cơng dụng……………………………………………………… 41 1.2.3.3 Tác dụng sinh học……………………………………………… 41 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 42 42 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU………………………………………… N uyê ệu ê 2 Độ T uố ó 42 ệ ……………………………………………… 42 ô …………………………………… 42 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 22 ử ứu…………………………………………… ấ du N ê ứu ề ự 222 N ê ứu ề ó ọ nh tên khoa học 43 ọ 43 2.2.2 Phương pháp định tính 43 2.2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 43 2.2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 44 223 N dượ ý 44 2.2.3.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 44 2.2.3.2 Địa điểm nghiên cứu 45 2.2.3.3 Thiết bị sử dụng nghiên cứu tác dụng sinh học 45 2.2.3.4 Đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi 45 2.2.3.5 Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh NO độc tế bào 46 2.2.3.6 Đánh giá tác dụng chống viêm cấp 47 2.2.3.7 Đánh giá tác dụng chống viêm mạn 49 224 P ê ứu dụ thẩ xử ý số ệu 50 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 52 3.1 THẨM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CÂY VIỄN CHÍ HOA VÀNG 52 3.1.1 Đ ì ự 52 3.1.2 Đ ọ 55 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu thân 55 3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu 56 3.1.2.3 Đặc điểm vi phẫu rễ 57 THÀNH PHẦN HÓA HỌC………………………………………… 58 32 Đ nh tính nhóm hợp chất hữu …………………………… 3.2.2 Chiết xuất phân l p hợp chất……………………………… 3 Xá nh cấu trúc hóa học hợp chất phân l p từ rễ Viễn chí hoa vàng………………………………………………………………… 58 59 62 3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RỄ VIỄN CHÍ HOA VÀNG……… 94 u 94 3.3.2 Tác dụng chống viêm……………………………………………… 95 3.3.2.1 Tác dụng ức chế sản sinh NO đại thực bào RAW264.7 95 3.3.1 Tác dụng giả 3.3.2.2 Tác dụng chống viêm cấp cao VCE VCB mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenan 3.3.2.3 Tác dụng chống viêm mạn cao VCE VCB mơ hình gây u hạt thực nghiệm 97 98 CHƯƠNG BÀN LUẬN 100 4.1 VỀ THẨM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC VIỄN CHÍ HOA VÀNG 100 4.2 VỀ HÓA HỌC 102 4.2.1 Kết nh tính 4.2.2 Kết phân l xá nh cấu trúc hợp chất……… 4.3 VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RỄ CÂY VIỄN CHÍ HOA VÀNG 102 102 110 u……………………………………………… 110 4.3.2 Về tác dụng ức chế sản sinh NO……………………………… 112 4.3.3 Về tác dụng chống viêm in vivo…………………………………… 113 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………… 116 4.3.1 Về tác dụng giả TÀI LIỆU THAM KHẢO CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT BuOH: Butanol COSY: Correlation Spectroscopy COX: Cyclooxygenase (COX-1; COX-2) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO: Dimethylsulfoxid DPPH: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS: Electron Spray Ionization Mass Spectrometry (Phổ khối lượng ion hóa phun điện tử) EtOAc: Ethyl acetat EtOH: Ethanol FBS: Fetal Bovine Serum HIV: Human Immunodeficiency Virus HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC: High Perfomance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence Hx: n-hexan IC50: Inhibitory Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) IL: Interleukin IR: InfraRed (Phổ hồng ngoại) LPS: Lipopolysacharide MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid MeOH: Methanol Na CMC: Natri Carboxyl Methyl Cellulose NMR: Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) NO: Nitric Oxide NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy p: Probability (Xác suất) P/ư: Phản ứng ROS: Reactive Oxygen Species (Các dạng oxy phản ứng) SD: Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) SE: Standard Error (Sai số chuẩn) SOD: Superoxid Dismutase TNF: Tumor Necrosis Factor (Yếu tố hoại tử khối u) UV: Ultraviolet (Phổ tử ngoại) VCB: Cao chiết phân đoạn n-butanol từ rễ Viễn chí hoa vàng VCE: Cao chiết ethanol từ rễ Viễn chí hoa vàng VCEA: Cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ rễ Viễn chí hoa vàng VCH: Cao chiết phân đoạn n-hexan từ rễ Viễn chí hoa vàng DANH MỤC BẢNG Trang Bả Các loài thuộc chi Polygala iệt Nam Bả Phân bố số loài thuộc chi Polygala iệt Nam…………… Bảng 1.3 Các hợp chất xanthon phân lập từ chi Polygala……………… Bảng 1.4 Các hợp chất saponin phân lập từ chi Polygala 12 Bảng 1.5 Các hợp chất oligosaccharid phân lập từ chi Polygala……… 18 Bảng 1.6 Các nhóm hợp chất khác phân lập từ chi Polygala…………… 23 Bảng 1.7 Tổng hợp tác dụng sinh học số loài thuộc chi Polygala 30 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất rễ Viễn chí hoa vàng phản ứng hóa học…………………………………………… 58 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC1 62 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC2………………………… 63 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC3………………… ……… 64 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC4…… …………………… 66 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC5………………………… 67 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC6………………… ……… 68 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC7………………………… 69 Bảng 3.9 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC8…………………………… 71 Bảng 3.10 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC9……………………… … 72 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC10………… …………… 74 Bảng 3.12 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC11…………… ………… 77 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC12………………… …… 79 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC13………… …………… 81 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC14 83 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC15… …………………… 85 Bảng 3.17 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VC16………… …………… 89 Bảng 3.18 Ảnh hưởng cao CE CB đến số quặn đau chuột nhắt…………………………………………………………………… Bảng 3.19 Kết sàng lọc tác dụng ức chế sản sinh NO mẫu cao chiết từ Viễn chí hoa vàng………………………………………… 94 95 Bảng 3.20 Tác dụng ức chế sản sinh NO mẫu chiết từ rễ Viễn chí hoa vàng…………………………………………………………… Bảng 3.21 Tác dụng cao VCE VCB lên mức độ phù chân chuột…… Bảng 3.22 Ảnh hưởng cao VCE VCB lên khối lượng u hạt chuột cống…………………………………………………………………… 96 97 98 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo xanthon phân lập từ chi Polygala… 12 Hình 1.2 Công thức cấu tạo saponin phân lập từ chi Polygala…… 18 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo oligosaccharid phân lập từ chi Polygala………………………………………………… Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo nhóm hợp chất khác phân lập từ Viễn chí hoa vàng ……………………………………………… Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenan…………………………… Hình 2.2 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm mạn mơ hình gây u hạt thực nghiệm viên bơng………………………………… Hình 3.1 Cơ quan sinh dưỡng Viễn chí hoa vàng (P arillata Buch.-Ham.ex D Don)……………………………………………………… Hình 3.2 Hoa Viễn chí hoa vàng (P arillata Buch.-Ham.ex D.Don)……………………………………………………………………… Hình 3.3 Quả hạt Viễn chí hoa vàng (P arillata Buch.- Ham ex D Don)……………………………………………………………………… 22 40 48 50 53 54 55 Hình 3.4 Vi phẫu thân Viễn chí hoa vàng……………………………… 56 Hình 3.5 Vi phẫu Viễn chí hoa vàng………………………………… 57 Hình 3.6 Vi phẫu rễ Viễn chí hoa vàng………………………………… 58 Hình 3.7 Quy trình phân lập hợp chất từ phân đoạn EtOAc rễ Viễn chí hoa vàng……………………………………………………………………… Hình 3.8 Quy trình phân lập hợp chất từ phân đoạn BuOH rễ Viễn chí hoa vàng……………………………………………………………………… 60 61 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học hợp chất VC1… ………………………… 62 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học hợp chất VC2………… ………………… 64 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học hợp chất VC3……………… …………… 65 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học hợp chất VC4…… ……………………… 66 Hình 3.13 Cấu trúc hóa học hợp chất VC5……… …………………… 68 Hình 3.14 Cấu trúc hóa học hợp chất VC6………………………… … 69 Hình 3.15 Cấu trúc hóa học hợp chất VC7………… ………………… 70 Hình 3.16 Cấu trúc hóa học hợp chất VC8………………… ……… 71 Hình 3.17 A: Cấu trúc hóa học; B: tương tác (H→C) phổ HMBC tương tác (H↔H) phổ COSY hợp chất VC9……………… Hình 3.18 A: Cấu trúc hóa học; B: tương tác (H→C) phổ HMBC tương tác (H↔H) phổ COSY hợp chất VC10…… 73 75 Hình 3.19 Cấu trúc hóa học hợp chất VC11………………… ……… 78 Hình 3.20 Cấu trúc hóa học hợp chất VC12………………… ……… 80 Hình 3.21 Cấu trúc hóa học hợp chất VC13…… …………………… 82 Hình 3.22 Cấu trúc hóa học hợp chất VC14…………………… …… 84 Hình 3.23A Cấu trúc hóa học hợp chất VC15…………… ………… 87 Hình 3.23B Các tương tác (H→C) phổ HMBC tương tác (H↔H) phổ COSY (B) hợp chất VC15……………………… … Hình 3.24A Cấu trúc hóa học hợp chất VC16…………… ………… Hình 3.24B Các tương tác (H→C) phổ HMBC hợp chất VC16………………………………………………………………………… Hình 4.1 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ rễ Viễn chí hoa vàng………………………………………………………………………… 88 92 92 104 65 PHỔ COSY CỦA HỢP CHẤT VC15 (CD3OD, 400 MHz) 66 PHỔ HRESI-MS CỦA HỢP CHẤT VC15 67 PHỤ LỤC 17 CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT VC16 Công thức cấu tạo hợp chất VC16 (arilloside A) 68 PHỔ IR CỦA HỢP CHẤT VC16 PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT VC16 (C5D5N, 500 MHz) 69 70 PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT VC16 (C5D5N, 125 MHz) 71 72 PHỔ HSQC CỦA HỢP CHẤT VC16 (C5D5N, 500 MHz) 73 74 PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT VC16 (C5D5N, 500 MHz) 75 76 77 78 PHỔ MS CỦA HỢP CHẤT VC16 79 ... bơng………………………………… Hình 3.1 Cơ quan sinh dưỡng Viễn chí hoa vàng (P arillata Buch.-Ham .ex D Don)……………………………………………………… Hình 3.2 Hoa Viễn chí hoa vàng (P arillata Buch.-Ham .ex D.Don)………………………………………………………………………... TÊN KHOA HỌC VIỄN CHÍ HOA VÀNG 100 4.2 VỀ HÓA HỌC 102 4.2.1 Kết nh tính 4.2.2 Kết phân l xá nh cấu trúc hợp chất……… 4.3 VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RỄ CÂY VIỄN CHÍ HOA VÀNG... lập từ loài cũng nhà khoa học nghiên cứu nhiều mơ hình thực nghiệm [78] Viễn chí hoa vàng có tên khoa học Polygala arillata Buch.-Ham ex D Don, thuộc họ Viễn chí (Polygalaceae) thuốc phân