Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ HẢI ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT HIỆN ĐẠI TRONG TỔNG HỢP ALTRETAMIN LÀM THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƯ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC H

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ HẢI

ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT HIỆN ĐẠI TRONG TỔNG HỢP ALTRETAMIN LÀM

THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ HẢI

ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT HIỆN ĐẠI TRONG TỔNG HỢP ALTRETAMIN LÀM

THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Lời cảm ơn

Quá trình học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Dược Hà Nội trong thời gian vừa qua, bằng những nỗ lực của cá nhân và sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, bản than tôi đã đạt được kết quả nhất định

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Nhà trường, Bộ môn Hóa hữu cơ, phòng Sau Đại Học và các bộ môn, phòng ban liên quan của nhà trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho thành công này

Tôi xin bày tỏ long biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đinh Thị Thanh Hải,

người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ trực tiếp tôi nghiên cứu

và hoàn thiên luận văn

Trong quá trình thực hiện luận văn tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ

của cá nhân, đơn vị trong và ngoài trường, tôi xin chân thành cảm ơn ThS

gia Hà Nội, ThS Phan Thị Tuyết Mai bộ môn Hóa vật liệu –Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Ths Đặng Vũ Lương phòng NMR – Viện Hóa học – Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia ThS Trần Thị Bích

Vân phòng Hóa lý, Viên Kiểm nghiệm thuốc Trung ương – Bộ Y tế

Tôi xin chân thành cảm ơn ban Giám hiệu Trường Cao đẳng Y tế Ninh Bình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia và hoàn thành khóa học

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Giáo sư, Phó Giáo sư, Tiến sĩ trong Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ cấp Quốc gia đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thiện Luận văn đạt chất lượng tốt nhất

Tôi xin bày tỏ long biết ơn tới những người than trong gia đình, cùng bạn bè và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày02 tháng 11 năm 2012

Tác giả

Đinh Thị Hải

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Anshu Dania bằng kỹ thuật vi sóng sử dụng xúc tác

1.4.2.4 Ánh sáng, độ ẩm và đồ bao gói 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

Arya và Anshu Dandia sử dụng xúc tác zeolit và kỹ thuật

đến hiệu suất của phản ứng tổng hợp altretamin

33

gia phản ứng đến hiệu suất của phản ứng tổng hợp

hiệu suất của phản ứng tổng hợp altretamin

37

và xúc tác HY zeolit

38

Arya và Anshu Dandia sử dụng xúc tác zeolit và kỹ thuật

siêu âm

40

3.1.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian tác động của

sóng siêu âm đến hiệu suất của phản ứng tổng hợp

40

suất phản ứng tổng hợp altretamin sử dụng sóng siêu âm

41

tổng hợp

42

3.2 Kết quả kiểm nghiệm chất lượng altretamin tổng hợp

được theo các tiêu chuẩn của Dược điển USP 30

47

3.3 Kết quả đánh giá độ ổn định của altretamin tổng hợp

được

48

theo dõi độ ổn định

49

mNa.Ta : Khối lượng của natri tartrat dihydrat

T(mg/ml) : Đương lượng nước của thuốc thử

DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

thời gian thử và số lô thử nghiệm tối thiểu đối với thuốc yêu

cầu bảo quản điều kiện thường

24

USP 30

30

ứng

35

từ hạt nhân 13C (13C-NMR) của altretamin chuẩn và

altretamin tổng hợp được

46

3.13 Kết quả kiểm nghiệm altretamin theo tiêu chuẩn chất lựơng

của Dược điển Mỹ USP 30

48

30/05/2010

49

của nguyên liệu tại các mốc thời gian theo dõi

51

tháng

57

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ TRONG KHOÁ LUẬN

chiếu sóng siêu âm

41

Sơ đồ

DNA

9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thời đại ngày nay, nền công nghệ khoa học kỹ thuật ngày càng tiên tiến, hiện đại thì cuộc sống của con người cũng ngày càng phát triển Nhưng đi đôi với điều đó là sự ô nhiễm môi trường toàn cầu ảnh hưởng tới khí hậu trái đất và môi trường sống của nhân loại Ô nhiễm môi trường sống và môi trường làm việc là một trong những nguyên nhân gây ra bệnh ung thư, một trong các căn bệnh nguy hiểm của thời đại Theo công bố của WHO, năm 2008 [39] có hơn 12,6 triệu người mắc mới bệnh ung thư và hơn 7,6 triệu người bị tử vong vì căn bệnh này Nguyên nhân phổ biến nhất là tử vong do ung thư phổi (1,4 triệu người, chiếm 18,2% số ca tử vong do ung thư) và ung thư dạ dày (0,7 triệu người, chiếm 9,7% số ca tử vong do ung thư) Hằng năm, số bệnh nhân mắc ung thư gia tăng liên tục, ước đoán đến năm

2015 sẽ có khoảng 9 triệu người chết do bệnh ung thư, con số này sẽ tăng lên là 11,4 triệu người năm 2030

Riêng ở Việt Nam, năm 2008 có 111.581 ca mắc mới bệnh ung thư và 82.006 ca tử vong do ung thư chủ yếu là do ung thư gan (21.748 trường hợp, chiếm 26,5% số ca tử vong do ung thư) và ung thư phổi (17.583 trường hợp, chiếm 21,4%

số ca tử vong do ung thư) Các bệnh ung thư thường gặp có tỷ lệ tử vong cao ở Việt Nam [3], [8], [39] là ung thư gan, ung thư phổi, ung thư buồng trứng, ung thư vú Hầu hết các loại thuốc điều trị ung thư đều phải nhập ngoại nên giá thành cao không phù hợp với điều kiện kinh tế của người bệnh

Altretamin là một trong rất nhiều thuốc chống ung thư được nghiên cứu, thử nghiệm lâm sàng thành công và đưa vào sử dụng hiệu quả trong điều trị ung thư phổi, ung thư buồng trứng, ung thư vú trên thế giới Loại thuốc này hiện đang được

sử dụng trong điều trị ung thư với các biệt dược như Hexastat (Pháp), Hexinawas (Tây Ban Nha), Altretamin (Mỹ), Hexalen (US Bioscience - Mỹ) … Altretamin có

thể được tổng hợp theo nhiều phương pháp khác nhau Trong đó, tổng hợp altretamin sử dụng xúc tác dị thể và kỹ thuật vi sóng là phương pháp tổng hợp hiện đại mang lại hiệu quả cao có thể triển khai áp dụng ở Việt Nam

Với mong muốn góp phần vào việc nghiên cứu quy trình sản xuất nguyên liệu

làm thuốc ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư” với ba mục tiêu như

sau:

1 Xây dựng được quy trình tổng hợp altretamin sử dụng xúc tác zeolit, kỹ

thuật vi sóng

2 Tổng hợp được altretamin đạt tiêu chuẩn Dược điển Mỹ USP30 (2007)

3 Đánh giá độ ổn định của altretamin tổng hợp được theo tiêu chuẩn Dược điển Mỹ USP 30 trong thời gian 15 tháng

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về altretamin (hexamethylmelamin)

Altretamin tên khoa học là

Biệt dược: Hexastat (Pháp), Hexinawas

(Tây Ban Nha), Hexamethylmelamin, Hexalen (Mỹ), Hemel, ALTRETAMIN, ENT 50852, NSC - 13875

1.1.1 Tác dụng điều trị ung thư

Quy trình tổng hợp altretamin được công bố đầu tiên bởi Donald W Kaiser

và cộng sự năm 1951 [19] Sau 25 năm, vào năm 1976, Sewa và cộng sự [37] đó nghiên cứu tìm ra tác dụng sinh học của altretamin có tác dụng chủ yếu trong điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vú và ung thư phổi Đặc biệt altretamin được sử dụng điều trị ung thư buồng trứng tiến triển sau khi phương pháp trị liệu đầu tiên thất bại [17], [20], [26], [30], [35-36]

Altretamin với biệt dược Hexalen (US Bioscience) đó được cục quản lý Dược và thực phẩm Mỹ (FDA) cấp phép lưu hành đưa vào sử dụng trong điều trị ung thư vào ngày 26 tháng 12 năm 1990

Hexalen cũng được cấp phép lưu hành tại châu Âu từ ngày 05 tháng 07 năm

Chu trình tế bào và tác động của altretamin:

Theo tài liệu “Bách khoa ung thư học”[8] các tế bào ung thư cũng như

các tế bào bình thường đều phải đi qua 4 pha của chu trình tế bào, bao gồm:

- Pha G1 là pha hoạt động cơ năng của tế bào, tế bào trao đổi chất chuẩn

bị cho quá trình tổng hợp DNA Ở pha G1, tế bào có 2n NST

- Pha S là pha của quá trình tổng hợp DNA

- Pha G2 là pha chuẩn bị phân bào, còn gọi là tiền nguyên phân trong đó

tế bào có 4n NST

- Pha M là pha phân bào (nguyên phân)

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ chu trình tế bào và vị trí tác động của altretamin

Ngoài ra, tế bào còn có thể đi vào tình trạng nghỉ ngơi, gọi là pha G0, từ pha G1 (chủ yếu) hoặc G2 Các tế bào được coi là “nằm ngoài chu trình” và không bị tác động của hóa chất Các tế bào này có thể quay trở lại chu trình tế bào theo một cơ chế chưa rõ

Tùy theo cơ chế tác động của từng loại hóa chất điều trị bệnh ung thư mà thời điểm tác động của nó vào chu trình tế bào khác nhau Altretamin là một thuốc trong nhóm tác nhân chống ung thư alkyl hóa [17], altretamin tác động

vào pha G1 sớm của chu trình tế bào[7], [16-17], [20], [25]

Altretamin

Cơ chế tác dụng kháng tế bào ung thư của altretamin:

Từ các nghiên cứu của Ames và cộng sự (1981) [14], Jackson và Harley (1991) [23] và một số nghiên cứu khác [15-16], [20], [29], [32], altretamin được xếp vào nhóm thuốc điều trị ung thư kìm tế bào nhóm alkyl hóa

Một số tài liệu đã công bố [14-16], [20], [25] cho rằng cơ chế tác dụng chống ung thư của altretamin có liên quan tới sự oxy hoá bởi enzym cytocrom

- Đầu tiên một nhóm methyl -CH3 / -N(CH3)2 bị oxy hoá thành alcol bậc

- Tiếp theo là bước dehydrat hoá tạo ra ion methyleniminium, một tác nhân ái điện tử Ion methyleniminium mang điện tích dương là tác nhân rất hoạt động có nhiệm vụ alkyl hoá DNA

Theo Garcia và cộng sự [20], ion methyleniminium tạo thành là chất trung gian có ái lực electrophil lớn đối với các trung tâm giàu điện tử trên phân tử DNA

Tác dụng trị liệu và gây độc tế bào của các tác nhân alkyl hoá chống ung thư liên quan trực tiếp và mật thiết tới việc alkyl hoá DNA Nguyên tử N ở vị trí số 1 (N-1) và vị trí số 3 (N-3) của hợp phần adenin, nguyên tử N ở vị trí số

7 (N-7) và nguyên tử O của hợp phần guanin, nguyên tử N ở vị trí số 3 của hợp phần cytosin đều dễ dàng tạo liên kết với tác nhân electrophil (ion methyleniminium)

dụng của altretamin có thể được mô tả như sơ đồ 1.2

Nghiên cứu của Jackson và cộng sự [23], và của Hopkins và cộng sự [20] cũng chỉ ra rằng cơ chế tác dụng của altretamin là do sự tạo thành liên kết cầu nối (cross-linking) liên kết cầu nối tạo thành bởi tác dụng của

formaldehyd được tạo ra bởi quá trình deformyl hoá của altretamin như sơ đồ

1.3 với các nguyên tử N ở vị trí số 6 (N-6) của vòng purin trong hợp phần

deoxyadenosin

1.1.2 Chỉ định, dạng bào chế, liều dùng của altretamin

Chỉ định: Altretamin được chỉ định cho điều trị các u ở phổi, buồng

trứng và vú [3], [12], [20]

Dạng bào chế: Viên nang 50mg, 100mg

Liều dùng: Liều hàng ngày, chia 3 – 5 lần, uống xa bữa ăn

- U phổi: 150 - 250mg/m2/ngày, đợt 5 ngày, nghỉ 5 ngày lại dùng đợt khác, phối hợp với thuốc kìm tế bào khác

- U buồng trứng: 150 - 250 mg/m2/ngày, trong 21 ngày/tháng

- U vú: 150 - 250 mg/m2/ngày, trong 15 ngày/tháng

Sau đây là một số phác đồ có sử dụng altretamine để điều trị ung thư biểu mô buồng trứng [3], [7]

1 Phác đồ CAP: (Chu kỳ 28 ngày)

2 Phác đồ Hexa – CAF: (Chu kỳ 28 ngày)

3 Phác đồ Hexalen: (Chu kỳ 28 ngày)

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ cơ chế hoạt húa altretamin và biến đổi DNA

N N N

OH

N N N

CH2

Nu

N N N

N O H

Một số tác nhân Nu (thường là những bazơ nitơ có trong cấu trúc của DNA):

H2O

Cytosin

N O H

Sơ đồ 1.3 Cơ chế deformyl hóa và tạo liên kết cầu nối giữa 2 phân tử DNA

N N N N

N N

N N

N N

OH H

H3C H OH

H OH _

N N N N

N N

O H O

H H

O H O

H H

H 2 CO derived linkage

1.2 Các phương pháp tổng hợp altretamin

Dựa vào nguyên liệu đầu và cơ chế phản ứng của phản ứng tổng hợp tổng hợp cho thấy altretamin được tổng hợp chủ yếu theo 3 hướng sau: [19], [33]

- Đóng vòng trime hóa từ N,N-dimethylcyanamid (CH3)2N-CN (phơng

pháp của Peter Dornan)

- Đóng vòng trime hóa từ imidic ester

- Thế Cl của cyanuric clorid bằng dimethylamin (phương pháp của Donald Kaiser, phương pháp của Kapril Arya và Anshu Dandia)

Sơ đồ 1.4 Các hướng tổng hợp altretamin

Dưới đây là một số phương pháp thường được sử dụng để tổng hợp altretamin:

1.2.1 Phương pháp tổng hợp altretamin của Donald W Kaiser

Sơ đồ phản ứng:

Cơ chế phản ứng:

Quy trình tổng hợp altretamin của Donald W Kaiser

Quy trình tổng hợp altretamin được Donald W Kaiser và cộng sự công

bố lần đầu tiên năm 1951 [19] đi từ nguyên liệu đầu là cyanuric clorid và dimethylamin với xúc tác là natri hydroxyd khan trong dung môi aceton

Sơ đồ 1.5 Sơ đồ quy trình tổng hợp altretamin của Donald Kaiser

Phản ứng tổng hợp gồm hai bước:

- Bước 1: Hoà tan 1 mol cyanuric clorid vào trong 800ml dung môi

aceton, thêm 3,3 mol dimethylamin, rồi thêm vào 1 mol natri hydroxyd, đun hồi lưu ở 500C trong 1 giờ Cất loại dung môi Phần cắn thô thu được thêm xylen, lắc đều rồi cất đẳng phí để loại hoàn toàn nước

- Bước 2: Thêm vào hỗn hợp phản ứng 2 mol bột natri hydroxyd khan

Kết tinh lại bằng methanol, thu được sản phẩm kết tinh màu trắng Hiệu suất

37%

Các thông số chính của phản ứng:

- Tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng: Cyanuric clorid/ dimethylamin/ NaOH là 1 : 3,3 : 3

- Sản phẩm kết tinh hình kim màu trắng

- Nhiệt độ nóng chảy là 172oC – 174oC

- Sản phẩm phụ là: 4,6-dicloro-2-dimethylamino-s-triazin và bis-(dimethylamino)-s-triazin Các sản phẩm này dễ tan trong MeOH, EtOH

2-cloro-4,6-lạnh nên có thể loại bằng cách kết tinh lại từ methanol hoặc ethanol

TS Đinh Thị Thanh Hải và cộng sự đã nghiên cứu cải tiến quy trình này [4] nhằm hạn chế dùng dung môi methanol độc hại để kết tinh và đạt hiệu suất cao hơn (đạt 71% sau cải tiến) Quy trình được cải tiến như sau:

- Tiến hành phản ứng không qua giai đoạn cất quay loại dung môi aceton

và nước

- Xử lý hỗn hợp sau phản ứng bằng cách dùng dung môi hữu cơ chiết sản phẩm thô, rửa sản phẩm thô với dung dịch NaCl bão hòa, làm khan bằng

Na2SO4 khan, lọc, cất quay loại dung môi

- Thay thế dung môi kết tinh MeOH bằng các dung môi EtOH

Sơ đồ 1.6 Sơ đồ quy trình tổng hợp altretamin theo Donald Kaiser đã cải tiến

1.2.2 Phương pháp tổng hợp altretamin của Kapil Arya và Anshu Diana bằng kỹ thuật vi sóng sử dụng xúc tác zeolit

Sơ đồ phản ứng:

Phản ứng tiến hành qua 1 giai đoạn, sử dụng xúc tác HY zeolit Quy trình phản ứng rất đơn giản, đặt cyanuric clorid, dimethylamin, HY zeolit vào trong lò vi sóng 6 phút, sau đó xử lý hỗn hợp phản ứng thu được altretamin với hiệu suất 88% [5], [28]

Phương pháp này không sử dụng các dung môi có thể gây ô nhiễm môi trường nên được đánh giá là phương pháp thân thiện với môi trường Ngoài

ra, do quy trình đơn giản, dễ tiến hành phù hợp với điều kiện ở Việt Nam

1.2.3 Phương pháp tổng hợp altretamin của Peter Dornan và cộng sự

Sơ đồ phản ứng:

Quy trình tổng hợp altretamin :

- Bước 1: Hòa tan N,N-dimethylcyanamid và

tris(dimethylamido)-aluminium trong n-hexan, khuấy ở nhiệt độ phòng, altretamin sẽ từ từ tạo

thành

- Bước 2: Xử lý hỗn hợp phản ứng và kết tinh lại từ ethanol, thu được

1.3 Tổng quan về vi sóng, zeolit và ứng dụng trong tổng hợp hữu cơ 1.3.1 Tổng quan về vi sóng

Vi sóng (micro-onde, microwave) là sóng cực ngắn hay còn gọi là sóng siêu tần, sóng UHF (Ultra High Frequence wave) [18]

Trong phổ điện từ (electromagnetic spectrum), vi sóng nằm ở khoảng giữa phổ, từ tần số 0,3GHz đến 300GHz, tương ứng với độ dài của sóng trong khoảng 100cm đến 1cm do đó vi sóng còn gọi là sóng cm

Nguyên tắc làm nóng vật chất của vi sóng:

Sự đun nóng bằng vi sóng là làm tăng nhiệt độ của vật chất một cách đặc biệt, không phụ thuộc vào sự dẫn nhiệt của bình chứa và vật chất Sự tăng nhiệt cục bộ tức thời của vật chất là do sự quay lưỡng cực và sự dẫn truyền ion Những hợp chất càng phân cực càng mau nóng dưới sự chiếu của vi sóng Với kết cấu có độ bất đối xứng cao, phân tử nước có độ phân cực mạnh, do đó nước là một chất lý tưởng, dễ đun nóng bằng vi sóng Ngoài ra, các nhóm định chức phân cực như: -OH, -COOH, -NH2 trong các hợp chất hữu cơ cũng là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ

Vi sóng được ứng dụng trong tổng hợp hữu cơ (xúc tác phản ứng):

Giảm thời gian phản ứng, giảm phản ứng phụ và tăng hiệu suất

1.3.2 Tổng quan về zeolit và ứng dụng trong tổng hợp hữu cơ [27]

Zeolit bắt đầu được phát hiện vào năm 1756 đến nay đã hơn 3 thế kỷ Năm 1756, Le Bron Bronstedt là một nhà khoáng học người Thụy Điển đã phát hiện ra một loại khoáng mới với tên gọi là zeolit, theo tiếng Hy Lạp

“zeo”: sôi, “lithot”: đá, vì vậy zeolit còn có nghĩa là đá sôi

1.3.2.1 Khái niệm

Zeolit là hợp chất vô cơ dạng aluminosilicat tinh thể có cấu trúc không gian ba chiều, lỗ xốp đặc biệt và trật tự cho phép chúng phân chia (rây) phân

tử theo hình dạng và kích thước Vì vậy, zeolit còn được gọi là hợp chất rây phân tử Thành phần chủ yếu của zeolit là Si, Al, O và một số kim loại kiềm, kiềm thổ khác

Công thức chung của zeolit là:

M2/nO Al2O3 x SiO2 y H2O

Trong đó: M: Cation có khả năng trao đổi

n: Hoá trị của cacbon

x: Tỉ số mol SiO2/Al2O3 y: Số phân tử nước trong đơn vị cơ sở ( khoảng từ 1 12 )

Tỷ số x 2 là sự thay đổi đối với từng loại zeolit cho phép xác định thành phần và cấu trúc của từng loại

Zeolit X có x = 2,3 3

Zeolit Y có x = 3,1 6

Gần đây người ta đã tổng hợp được các loại zeolit có thành phần đa dạng

có tỷ lệ mol SiO2/Al2O3 cao thậm chí có những loại cấu trúc tương tự zeolit

mà hoàn toàn không chứa các nguyên tử nhôm như các silicatic…

1.3.2.2 Cấu trúc của zeolit

Zeolit có cấu trúc tinh thể, các zeolit tự nhiên cũng như zeolit tổng hợp có

bộ khung được tạo thành bởi mạng lưới không gian 3 chiều của các tứ diện

TO4 ( T là Si hoặc Al )

Mỗi tứ diện TO4 có 4 ion O2- bao quanh một cation T(Si, Al) Mỗi tứ diện liên kết với 4 tứ diện bên cạnh bằng cách góp chung các nguyên tử oxy ở đỉnh Trong tứ diện AlO4 có hoá trị 3 nhưng số phối trí là 4 nên tứ diện AlO4 mang một điện tích âm Điện tích âm này được bù trừ bằng cation kim loại, còn gọi

là cation bù trừ điện tích khung và thường là cation kim loại kiềm Vì vậy, số

cation kim loại hoá trị 1 trong thành phần hoá học của zeolit chính bằng số nguyên tử nhôm (Al)

1.3.2.3 Tính chất xúc tác bề mặt của zeolit

- Tâm acid Bronsted hình thành từ quá trình xử lý zeolit trong môi trường acid, đối với các zeolit có tỉ số SiO2 /Al2O3 cao, có nồng độ thấp (  0,05 N)

- Sự trao đổi cation của zeolit với các cation đa hoá trị (như các kim loại kiềm thổ, đất hiếm, kim loại quý) cũng làm xuất hiện dạng proton hoá

Mn+HZ Các cation này được trao đổi dưới dạng phân tử ngậm nước

Mem+(H2O)x Nhờ tác dụng ion hoá của cấu trúc zeolit, dạng phân tử ngậm nước sẽ chuyển thành dạng [Mem-1(OH)2]H+ làm xuất hiện proton Sự biến đổi này có thể được biểu diễn như sau:

- Sự hình thành các tâm acid Lewis

-

-A l O

S i O

O

O O

A l

-

-A l O

S i O

O

O O

O

O Si

O

A l

A l O

O O

S i O

5 2

(a )

- Ngoài tâm acid Bronsted, zeolit còn có các tâm acid Lewis Sự hình thành tâm acid Lewis là do tồn tại Al trong mạng cấu trúc Khi nguyên tử oxy

bị tách ra, ở nhiệt độ cao, khỏi liên kết với Al thì sẽ xuất hiện tâm acid Lewis

SiAl

O

O

OOO

1.4 Tổng quan về độ ổn định của thuốc [1]

Khái niệm độ ổn định của thuốc: là khả năng của thuốc (nguyên liệu

hoặc thành phẩm) khi bảo quản trong điều kiện xác định giữ được những đặc tính vốn có về vật lý, hoá học, vi sinh, tác dụng dược lý và độc tính trong giới hạn qui định của tiêu chuẩn chất lượng thuốc

Sự liên quan giữa tuổi thọ của nguyên liệu và thành phẩm thuốc:

Độ ổn định, tuổi thọ của nguyên liệu dược chất có liên quan, ảnh hưởng đến độ ổn định, tuổi thọ của thành phẩm bào chế Đi từ nguyên liệu dược chất

có độ ổn định cao chắc chắn thu được thành phẩm bào chế có độ ổn định cao hơn khi sử dụng nguyên liệu có độ ổn định thấp Tuy nhiên, tuổi thọ của nguyên liệu và thành phẩm bào chế là các dữ liệu độc lập thu được từ các nghiên cứu cụ thể

Có thể phân loại độ ổn định của thuốc theo các đặc tính như sau:

- Độ ổn định hoá học: hàm lượng dược chất, các tạp chất và sản phẩm phân huỷ còn đáp ứng đạt yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng đề ra

Tâm Lewis Tâm Bronsted

- Độ ổn định vật lý: còn giữ được các tính chất vật lý ban đầu theo quy định như hình thức bảo quản (mùi vị, màu sắc ), độ đồng nhất, độ hoà tan, kích thước tiểu phân

- Độ ổn định trị liệu: hiệu lực điều trị không thay đổi

- Độ ổn định về độc tính: không có biểu hiện đáng kể sự tăng độ độc

- Độ ổn định vi sinh: độ vô khuẩn hoặc số vi sinh vật, khuẩn lạc, hiệu lực của các tác nhân diệt khuẩn còn đáp ứng yêu cầu trong giới hạn tiêu chuẩn

1.4.1 Các kiểu phân hủy nguyên liệu và một số biện pháp khắc phục 1.4.1.1 Phân hủy hóa học

- Thủy phân

Dược chất có các nhóm chức este, amid, lacton, lactam, imid, malonyl ure… thường dễ bị thuỷ phân dưới xúc tác của ion hydrogen, các tác nhân

dịch hoặc trong không khí ẩm tham gia tích cực vào phản ứng thuỷ phân

- Oxy hoá

Dược chất có các nhóm chức phenol, catechol, ether, thiol, nitrit, acid carboxylic, aldehyd… dễ bị oxy theo các phản ứng chuỗi, dây chuyền, xảy ra dưới tác động của oxy, đôi khi là phản ứng tự oxy hoá được khởi động bằng một lượng rất nhỏ của các tạp chất, vết ion kim loại

- Chuyển hoá đồng phân

Nhiều dược chất có thể bị chuyển hoá đồng phân quang học hoặc đồng phân hình học Các đồng phân khác nhau, nhất là đồng phân quang học có sự khác biệt về đặc điểm hấp thu, phân bố, chuyển hoá và thải trừ Vì sự chuyển hoá đồng phân được coi là sự phân huỷ thuốc, có thể làm thay đổi tác dụng

dược lý, gây ra các tác dụng không mong muốn hoặc làm giảm tác dụng điều trị

- Phân huỷ do ánh sáng

Nhiều dược chất có nhân phenothiazin, các hydrocarbon có nhân thơm,

có dị vòng aldehyd, ceton nhạy cảm với ánh sáng, bị phân huỷ nhanh khi có tác động của ánh sáng

- Sự loại nước trong cấu trúc hoá học và sự mất nước kết tinh trong tinh thể

Quá trình loại đi phân tử nước trong phân tử dược chất thường tạo dây nối đôi liên hợp tham gia vào sự cộng hưởng điện tử với các nhóm chức liền

kề trong phân tử, là quá trình phân huỷ hoá học, như trường hợp phân huỷ đối với prostaglandin, tetracyclin

- Sự polyme hoá

Sự polyme hoá là quá trình kết hợp hai hay nhiều phân tử dược chất tạo

ra một phân tử phức hợp Ví dụ sự polyme hoá xảy ra trong dung dịch natri ampicillin đậm đặc Một phân tử mở vòng -lactam để kết hợp với mạch nhánh của một phân tử khác tạo ra một dimer có thể tạo tiếp polyme lớn hơn Các polyme đó là một trong những tác nhân dẫn đến phản ứng mẫn cảm của kháng sinh họ -lactam trên người

1.4.1.2 Phân huỷ vật lý

- Chuyển thể đa hình

Đa hình là hiện tượng cùng một hợp chất nhưng có thể tồn tại dưới nhiều dạng tinh thể do quá trình kết tinh sử dụng dung môi, pH, nhiệt độ khác nhau Các thể đa hình này có độ tan, tốc độ tan và hoạt tính sinh học mạnh yếu khác nhau, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu lực điều trị

- Bay hơi

Một số dược chất dễ bay hơi ở nhiệt độ phòng có thể bay hơi ra ngoài qua đồ bao gói làm giảm hàm lượng thuốc Đó là các tinh dầu, este, ceton, alcol phân tử lượng nhỏ

- Thay đổi các tính chất cơ lý, cấu trúc hoá lý của dạng bào chế

Đối với thành phẩm bào chế Trong quá trình bảo quản, lưu thông, phân phối, theo thời gian, một số tính chất vật lý, hoá lý của dạng thuốc có thể bị biến đổi, không đạt các chỉ tiêu quy định theo tiêu chuẩn chất lượng

- Phân huỷ do vi khuẩn, nấm mốc

Sự phát triển của vi khuẩn, nấm mốc trong chế phẩm có thể làm cho thuốc không đạt các chỉ tiêu về độ vô khuẩn, nội độc tố, chí nhiệt tố, đồng thời cũng là nguyên nhân phân huỷ dược chất, làm giảm hàm lượng, thay đổi hình thức cảm quan, độ trong

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phân huỷ dược chất

1.4.2.1 Nhiệt độ

Cơ sở lý thuyết nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng dựa trên phương trình của Arhenius, thường dùng phương trình ở dạng tích phân:

1 1 303 , 2

lg

2

1

T T R

E k

k

T T

T: Nhiệt độ tuyệt đối E: Năng lượng hoạt hoá R: Hằng số khí lý tưởng Dựa vào quan hệ giữa tốc độ phản ứng và nhiệt độ, phương pháp lão hoá cấp tốc đã áp dụng biện pháp bảo quản thuốc ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ

bảo quản bình thường (điều kiện thực trong quá trình lưu thông phân phối thuốc) để thúc đẩy nhanh tốc độ phân huỷ, rút ngắn thời gian theo dõi, đánh giá để dự báo tuổi thọ của thuốc Tuy nhiên, phải đảm bảo nhiệt độ lão hoá cấp tốc không làm thay đổi cơ chế phân huỷ thuốc

1.4.2.2 pH

pH của dung dịch thuốc ảnh hưởng lớn đến độ ổn định của thuốc, sự thay đổi pH có thể làm tăng hay giảm tốc độ phân huỷ dược chất, đôi khi làm thay đổi cơ chế phân huỷ

1.4.2.3 Lực ion trong dung dịch

Tốc độ phản ứng có thể chịu ảnh hưởng của lực ion theo phương trình sau:



B A

Phương pháp thử cấp tốc là các thử nghiệm nghiên cứu làm tăng tốc độ phân hủy hóa học cũng như phân hủy vật lý của thuốc bằng cách bảo quản thuốc trong điều kiện có tác động cao hơn mức độ bình thường ở điều kiện thực Mục đích của lão hóa cấp tốc là xác định các thông số động hóa học của quá trình phân hủy, từ đó tính toán, dự báo tuổi thọ của thuốc

1.4.3.2.Phương pháp thử dài hạn

Phương pháp thử dài hạn là thử nghiệm bảo quản thuốc trong điều kiện thực, toàn bộ các chỉ tiêu chất lượng theo tiêu chuẩn đều được đánh giá kéo dài theo thời gian đến khi thuốc không còn đáp ứng chất lượng đề ra Thử nghiệm dài hạn có ý nghĩa xác định chính xác tuổi thọ, thời hạn sử dụng của

thuốc

Để có thể tiến hành thử nghiệm dài hạn phù hợp với điều kiện khí hậu thực, thuận lợi cho việc lập kế hoạch nghiên cứu độ ổn định, chọn điều kiện

bảo quản, đồ bao gói, người ta chia khí hậu của các nước làm bốn vùng:

Vùng khí hậu II: Vùng cận nhiệt đới, lục địa (tương đối ẩm) 25oC, 60%

RH

Bảng 1.1 Qui định về điều kiện bảo quản trong các loại thử nghiệm, thời gian thử và số lô thử nghiệm tối thiểu đối với thuốc yêu cầu bảo quản

điều kiện thường

Phương pháp

thử nghiệm Điều kiện bảo quản

Thời gian tối thiểu

Dài hạn (trong

điều kiện thực)

Với các nước châu Âu, Nhật, Mỹ: 25oC +

2oC, 60% + 5% RH 12 tháng Với các nước Đông Nam Á: 30oC + 2oC,

Theo quy định trên, Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu IV [2]

Để xây dựng nội dung nghiên cứu độ ổn định của một chế phẩm, chúng tôi tham khảo các hướng dẫn chi tiết của WHO [29], ICH [21], [22], ASEAN [13] và của một số nước

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Hóa chất sử dụng tại phòng thí nghiệm là các hóa chất thông thường, hóa chất tinh khiết, tinh khiết phân tích của công ty hoá chất Đức Giang (Việt Nam), công ty hoá chất Quảng Châu, công ty hoá chất Shanto Xilong Quảng Đông (Trung Quốc), hãng Aldrich (USA), hãng Merck Một số hóa chất sử dụng:

Bảng 2.1 Một số hóa chất sử dụng trong luận văn

STT Tên hoá chất Nguồn gốc STT Tên hoá chất Nguồn gốc

2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Phễu lọc hút chân không Buchner

- Cân điện tử Shimadzu EL – 300

- Cân phân tích Mettler AB 204

- Máy phản ứng vi sóng - siêu âm SINEO UWave 1000

- Tủ sấy Memmert

- Tủ sấy hút chân không Shellab

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Máy cất quay

- Bình định mức, pipet, dụng cụ thủy tinh đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm phân tích

- Bản mỏng silicagel Kieselgel 60 F254 (Merck)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Electrothermal Digital

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin – Elmer (phòng thí nghiệm Hóa vật liệu, khoa Hóa học, Trường ĐH khoa học tự nhiên, ĐH quốc gia Hà Nội)

- Phổ khối lượng (MS) ghi trên máy LTQ Obitaltrap XL (phòng thí nghiệm Hóa vật liệu, khoa Hóa học, Trường ĐH khoa học tự nhiên, ĐH quốc gia Hà Nội)

Bruker - AV500 (phòng Phân tích cấu trúc, viện Hoá học, viện Khoa học và

công nghệ Việt Nam)

2.3.2 Kiểm nghiệm Altretamin theo Dược điển Mỹ USP 30 [38]

Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm altretamin của Dược điển Mỹ USP 30:

Bảng 2.2 Chỉ tiêu chất lượng của altretamin theo Dược điển Mỹ USP 30

Định tính

Phổ IR: Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp

với phổ hồng ngoại của altretamin chuẩn

Phương pháp HPLC : Trong phần định lượng, trên sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ dung dịch altretamin chuẩn

định trên 1g chế phẩm)

Phương pháp HPLC dung dịch thử cho pic có thời gian lưu tương ứng

với thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ dung dịch altretamin chuẩn

c Kim loại nặng

 Hóa chất thuốc thử: Theo USP 30

 Tiến hành theo chỉ dẫn của USP 30 (phụ lục 231, phương pháp 2)

Chuẩn bị mẫu thử:

Cân khoảng 0,5g chế phẩm trong chén sứ, làm ẩm bằng H2SO4 và đun nhẹ cho đến khi chảy hoàn toàn Thêm 2ml HNO3, 5 giọt H2SO4 vàđun nóng cho đến khi không còn khói trắng bay ra Nung ở 600oC cho đến khi không còn carbon → làm nguội → thêm 4ml HCl 6N → đun cách thủy 15 phút → bốc hơi đến cắn Làm ẩm cắn với 1 giọt HCl, thêm 10ml nước nóng → để yên 2

→ pha loãng với nước đến 25ml Điều chỉnh pH 4,0 bằng acid acetic 1N → lọc → rửa chén sứ và giấy lọc với 10ml nước Kết hợp dịch lọc và pha loãng với nước thành 40ml

Ống thử: 2ml đệm acetat pH 3,5 + 1,2ml thioacetamid glycerin + 40ml dung dịch thử trên → pha loãng với nước thành 50ml, trộn đều và để yên 2 phút Ống chứng: 2ml đệm acetat pH 3,5 + 1,2ml thioacetamid glycerin + 40ml dung dịch chì 10ppm → pha loãng với nước thành 50ml, trộn đều và để yên 2 phút

 Yêu cầu: Màu của ống thử phải nhạt hơn màu của ống chứng

d Tro sulfat

 Hóa chất, thuốc thử: Theo USP 30

 Tiến hành theo chỉ dẫn của USP 30 (phụ lục 281)

Cân khoảng 2g chế phẩm trong chén sứ (đã được nung 600oC trong 30 phút), làm ẩm bằng 1ml H2SO4 và đun nhẹ cho đến khi cháy thành than Thêm 1ml H2SO4 và đun cho đến khi hết khói

Nung ở 600oC cho đến khi cháy thành tro

Để nguội trong bình hút ẩm Cân

e Nước:

Tiến hành theo chỉ dẫn của USP 30 (phụ lục 921, phương pháp 1)

Dung môi pha mẫu: hỗn hợp methanol – nước ( 65 : 35)

- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn altretamin trong dung môi pha mẫu có nồng độ altretamin khoảng 0,025mg/ml

Chuẩn altretamin: 25mg pha trong 50ml dung

môi → lấy 1ml pha trong 20ml dung môi → dung dịch chuẩn

- Dung dịch mẫu: Hòa tan một lượng chế phẩm trong dung môi pha mẫu

để thu được dung dịch có nồng độ altretamin khoảng 0,025mg/ml Thử altretamin: 25mg pha trong 50ml dung môi → lấy 1ml pha trong 20ml dung môi → dung dịch thử

 Kết quả: Hàm lượng altretamin trong chế phẩm, tính theo chế phẩm khan, được tính theo công thức:

St: Diện tích píc altretamin trên sắc đồ dung dịch thử (mAU × s)

Sc: Diện tích píc altretamin trên sắc đồ dung dịch chuẩn (mAU × s)

Ct: Nồng độ dung dịch thử (mg/ml)

a: Độ ẩm (%)