ứng dụng mốt số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp peptid

Phần ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, Peptid ngày đóng vai trị quan trọng nghiên cứu phát triển thuốc Ngày nhiều thuốc có chất peptid, kháng thể, vaccin enzym phát Do đó, phương pháp tổng hợp peptid nhà khoa học nghiên cứu nhằm mang lại phương pháp hiệu quả, hiệu xuất cao tiết kiệm thời gian Bên cạnh phương pháp tổng hợp peptid theo truyền thống tiến hành dung dịch, có nhiều phương pháp phát triển phải kể đến phương pháp tổng hợp pha rắn Merrifield: sử dụng resin polystyren để tổng hợp peptid, phương pháp mở kỷ nguyên cho tổng hợp hợp chất làm thuốc nói riêng ngành tổng hợp hóa học nói chung Đó tổng hợp hóa học pha rắn hóa tổ hợp Cùng với đó, nhà khoa học nghiên cứu cải tiến phương pháp tổng hợp peptid dung dịch Đó sử dụng chất mang tan dung dịch để tổng hợp peptid Như vậy, áp dụng số kỹ thuật đại tổng hợp peptid khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống Quá trình tổng hợp rút ngắn từ vài tháng vài tuần xuống vài ngày vài Các chất cần tổng hợp luận án trải qua bước tạo liên kết peptid Do vậy, để cung cấp kiến thức hỗ trợ cho trình viết luận án, chuyên đề: “Ứng dụng số kỹ thuật đại tổng hợp peptid” thực với mục tiêu: Tóm tắt nguyên tắc chung số kỹ thuật đại tổng hợp peptid Ứng dụng kỹ thuật đại tổng hợp peptid Phần NỘI DUNG 2.1 MỘT SỐ KỸ THUẬT HIỆN ĐẠI TRONG TỔNG HỢP PEPTID 2.1.1 Nguyên tắc chung Peptid ngày đóng vai trị quan trọng nghiên cứu phát triển thuốc Ngày nhiều thuốc có chất peptid, kháng thể, vaccin enzym phát Cách thức tổng hợp peptid thông thường địi hỏi nhiều nhân cơng mà lại cho hiệu suất thấp Do vậy, áp dụng số kỹ thuật đại tổng hợp peptid khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống Dưới số kỹ thuật đại áp dụng tổng hợp peptid 2.1.1.1 Tổng hợp peptid pha rắn Trong thực hành hóa học, việc tổng hợp chất qua nhiều bước vấn đề gây khó khăn cho nhà khoa học đặc biệt bước tinh chế Theo phương pháp truyền thống, peptid tổng hợp pha lỏng Phương pháp tốn thời gian, đòi hỏi người làm phải thành thạo, sau bước tổng hợp phải tinh chế xác định cấu trúc, đồng thời khả hòa tan peptid trở nên khó dự đốn trước mà độ dài chuỗi tăng lên Phát minh Merrifield tổng hợp peptid pha rắn mở cách mạng lĩnh vực tổng hợp peptid Tổng hợp pha rắn lần thực Bruce Merrifield vào năm 1963 ông sử dụng resin polystyren để tổng hợp peptid ông đoạt giải Nobel vào năm 1984 nhờ vào nghiên cứu Tiếp theo đó, vào năm 1970 kỷ trước, tổng hợp pha rắn tiếp tục phát triển Leznoff, Camps, Frechet Rapaport Với đời tổng hợp peptid pha rắn (SPPS), thời gian cho trình tổng hợp rút ngắn từ vài tháng hay tuần xuống vài ngày hay Tổng hợp pha rắn mở rộng sang tổng hợp phân tử sinh học khác ADN, acid nucleic peptid, oligisaccharid tiền đề cho hóa tổ hợp phát triển ngày [4] Tổng hợp hữu pha rắn phương pháp tổng hợp tiến hành cách: chất phản ứng liên kết cộng trị với polymer (resin), bất động pha (pha tĩnh) chất gắn đưa vào rửa sau giai đoạn phản ứng Phương pháp sử thành phần quan trọng polymer (pha rắn) không tan dung mơi, có tác dụng tạo liên kết với chất cần tham gia phản ứng thông qua cầu liên kết định [] Chất tham gia gắn vào polymer liên kết cộng hóa trị với cầu nối, tạo nhờ phản ứng nucleophin (nếu cầu nối mang nhóm halogen), phản ứng cộng hợp (nếu cầu nối OH, NH2 ) [] Hình 2.1 minh họa trình tổng hợp peptid nhờ hỗ trợ pha rắn Chất ban đầu sau gắn vào pha rắn bất động trọng hệ thống đặc biệt (các ống tiêm, cột ) sau chất tham gia dung mơi thêm vào (pha động) để tiến hành phản ứng Sau phản ứng thành phần thừa, sản phẩm phụ dung mơi loại bỏ, pha rắn cịn lại rửa với loại dung môi khác DMF, MeOH, DCM phức hợp pha rắn thu pha rắn- sản phẩm thứ Phức hợp tiếp tục tham gia phản ứng (phản ứng nhiều bước) loại bỏ pha rắn bước cuối thu sản phẩm mong muốn Hình 2.2 [1] Hình 2.1 Minh họa thành phần phương pháp tổng hợp pha rắn Quá trình tổng hợp pha rắn có nhiều ưu điểm so với tổng hợp dung dịch: - Chất ban đầu tham gia phản ứng sản phẩm gắn pha rắn nên tất chất tham gia phản ứng dư, chất xúc tác sản phẩm phụ dễ dàng lọc khỏi phức hợp resin-sản phẩm rửa resin dung mơi thích hợp - Có thể sử dụng lượng dư chất tham gia phản ứng để đưa phản ứng mong muốn đến hồn tồn Vì vậy, hiệu suất phản ứng thường cao (có thể đạt đến >99%) - Các phản ứng phụ thường xảy so với phản ứng thực dung dịch - Nếu trình tổng hợp cần nhiều giai đoạn sau giai đoạn không cần tinh chế sản phẩm trung gian mà cần lọc loại chất tham gia phản ứng dư, chất xúc tác sản phẩm phụ Sau đó, phức hợp resin-chất trung gian lại sử dụng cho phản ứng Đây lợi vô lớn tổng hợp pha rắn - Sau trình tổng hợp, resin tách khỏi sản phẩm tái sử dụng - Quá trình tổng hợp pha rắn sử dụng thiết bị tự động hóa Tuy nhiên, phương pháp tổng hợp pha rắn đòi hỏi số điều kiện tiên [1]: - Polymer sử dụng phải trơ với dung môi, bền điều kiện phản ứng - Polymer phải có phần liên kết với nhóm chức phù hợp để gắn chất tham gia phản ứng lên polymer - Phản ứng pha rắn phải chọn lọc đặc hiệu Liên kết chất phản ứng với polymer phải bền điều kiện phản ứng lại phải nhạy cảm với điều kiện đặc hiệu để giai đoạn cuối tách sản phẩm khỏi resin dễ dàng, cho hiệu suất cao không làm phân hủy sản phẩm khơng tạo sản phẩm phụ Hình 2.2 Pha rắn cố định hệ thống đặc biệt (pha tĩnh) Trong tổng hợp pha rắn, việc lựa chọn polymer phần liên kết gắn với nhóm chức đóng vai trị quan trọng thành cơng q trình tổng hợp Hiện nay, có nhiều loại polymer khác dùng tổng hợp pha rắn Dựa đặc tính vật lý, chúng chia thành nhóm sau [3,7]: Polymer dạng gel: loại hay sử dụng nhất, phân bố nhóm chức thơng qua hệ thống polymer trơ solvat hóa cao, lý tưởng để tổng hợp hợp chất có phân tử lượng lớn Hệ thống polymer mềm dẻo, resin trương nở ngăn cản dung môi để giúp phân tử trương nở gel Polymer dạng bề mặt: Các loại vật liệu khác sử dụng để dẫn chất hóa bề mặt, bao gồm bead làm từ polyethylen nung, sợi cellulose (cotton, giấy, sepharose), polystyren polymethacrylat xốp liên kết chéo cao, thủy tinh lỗ silica Composite gel hỗ trợ: Để tăng độ bền học, polymer dạng gel gia cố cốt cứng ví dụ xốp polystyren liên kết chéo cao bên polyamid ghép liên kết cộng trị Màng teflon biến đổi polymethylacrylat để tạo gel bền Polymer dạng bó: hợp phần dài polystyren ghép lên màng polyethylen Chuỗi polymer mở rộng từ bề mặt cứng giống dạng bó Do đó, dẫn chất hóa đạt thơng qua chuỗi mở rộng nhóm chức biến đổi với cầu nối trước tổng hợp pha rắn Trong nhóm trên, polymer dạng gel loại thông dụng tổng hợp pha rắn  Các resin polystyren (PS resin) Đây loại resin sử dụng nhiều sẵn có, giá thấp ổn định hóa học Các dẫn chất resin polystyren sử dụng rộng rãi cấu trúc khung bên alkyl với nhân aryl nên dễ dàng thay đổi Loại cấu trúc thông thường polystyren với - 2% divinylbenzen liên kết chéo [2] Hình 2.3 Resin polystyren Ba resin polystyren chủ yếu sử dụng là: i) Cloromethylpolystyren: (Merrifield resin) Cloromethylpolystyren gắn với - 2% divinylbenzen Các hợp chất gắn lên resin thông qua tính nhân ngun tử clo Merrifield resin cịn dùng nguyên liệu ban đầu để phân loại resin biến đổi Bằng cách gắn với phần liên kết khác nhau, nhiều loại resin khác tạo [2] Hình 2.4 Merrifield resin ii) Hydroxymethylpolystyren: Resin tạo từ Merrifield resin cách ester hóa với kali acetat, saponin hóa khử hóa ester [2] Đại diện cho resin loại Wang resin, đơi cịn gọi PABA resin (hình 2.4) Hình 2.5 Wang resin iii) Aminomethylpolystyren: Mitchell tạo resin cách thay kali phtalimid Merrifield resin, thủy phân hydrazin tạo trực tiếp cách aminomethyl hóa polystyren resin [2] Aminomethyl resin cho phép nhiều phần liên kết gắn thêm vào resin thơng qua liên kết amid, mà bền mơi trường acid Ngồi loại resin polystyren trên, cịn nhiều resin polystyren với nhóm chức gắn vào khác sử dụng tổng hợp (hình 2.5) [1,4] Hình 2.6 Một số nhóm chức gắn resin polystyren thương mại  Các resin polyacrylamid (PAM resin) Sheppard cộng [4] người phát triển resin polyamid liên kết chéo có cấu trúc giống với chuỗi peptid (hình 2.6) Resin polyacrylamid solvat hóa tốt dung mơi phân cực DMF tổng hợp điều kiện phân cực cải thiện đặc tính so với resin polystyren Hình 2.7 Polyacrylamid resin  Resin polyethylen glycol ghép với polystyren Các đặc tính polymer polystyren thay đổi ghép với polyethylen glycol (PEG) Việc polymer hóa oxyethylen với nhóm chức hydroxymethyl giúp gắn PEG với chuỗi dài khoảng – 10 phần ethylen glycol [10] Tỷ lệ khối lượng PEG polystyren thường 1:1 resin Sự có mặt PEG làm thay đổi khả solvat hóa Resin trương nở tốt dung môi phân cực không phân cực, trừ nước [11] Quan trọng resin đạt trạng thái solvat hóa hồn tồn từ đầu trình tổng hợp Vì vậy, resin PEG-PS hay sử dụng tổng hợp hữu pha rắn mà điều kiện dung môi thay đổi rộng tùy vào mục đích tổng hợp sử dụng tổng hợp peptid lớn pha rắn Sự đồng kích thước polymer (thơng thường 90 – 130 µm) làm cho resin lý tưởng để tổng hợp thư viện hợp chất theo phương pháp “một tiểu phân – chất” Hình 2.8 PEG gắn với aminomethylpolystyren Đại diện cho loại resin resin Tentagel Tentagel dạng thương mại bao gồm 30% polystyren (1%) liên kết chéo (cross-linked) với 70% PEG (phân tử lượng khoảng 3000 mg/mol) [10] Hình 2.9 Cấu trúc hóa học resin Tentagel  Resin dựa tảng polyethylen glycol (PEG) Người ta thấy đặc tính tốt polymer đạt sử dụng PEG thành phần resin Phân tử PEG có đặc tính lưỡng cực tự nhiên solvat hóa tốt dung môi phân cực không phân cực.[11] Hiện nay, có loại polymer dựa cấu trúc PEG, [4]: - Resin PEGA: thu cách acryloyl hóa phần bis-2aminopropyl PEG với acryloyl clorid PEGA bền trơ mặt hóa học điều kiện tổng hợp peptid kể trình tách loại resin acid mạnh base mạnh - Resin polyoxyethylen-polystyren (POEPS): Alkyl hóa phần PEG với cloromethylstyren tạo hỗn hợp mono bis PEG alkyl hóa, PEG khơng alkyl hóa, cho phép polymer hóa tạo POEPS Resin chứa khoảng 10% polystyren, solvat hóa tốt nước dung mơi không phân cực toluen - Resin polyoxyethylen-polyoxypropylen (POEPOP): Phản ứng phần PEG với NaH epi-clorohydrin tạo hỗn hợp PEG mono- bismethyloxiran Hỗn hợp polymer hóa nhiệt độ cao với có mặt tBuOK để tạo resin POEPOP - Resin ethoxylat liên kết chéo với acrylat (CLEAR): Đây resin liên kết chéo cao (>95%) mang lại đặc tính solvat hóa tốt hiệu suất cao tổng hợp lô tổng hợp dịng chảy liên tục Có phương pháp để tổng hợp peptid pha rắn tổng hợp bậc thang (stepwise SPPS) tổng hợp hội tụ (convergent SPPS)  Tổng hợp peptid bậc thang (stepwise SPPS) Thông thường, tổng hợp peptid bậc thang xuất phát theo hướng từ C → N (tổng hợp peptid theo hướng từ N → C tiến hành số trường hợp bị hạn chế nhược điểm biến đổi cấu hình bất đối khó kiểm soat đồng phân tạo ra) Q trình tổng hợp bước tạo liên kết, loại bỏ nhóm bảo vệ lặp lặp lại Cuối cùng, thu peptid có chiều dài mong muốn tách khỏi pha rắn, đồng thời nhóm bảo vệ mạch nhánh loại bỏ Tổng hợp peptid bậc thang hiệu để tổng hợp peptid ngắn trung bình có chuỗi dài tối đa 40 acid amin Sơ đồ 2.1 Quá trình tổng hợp peptid bậc thang [4]  Tổng hợp peptid hội tụ (convergent SPPS) Phương pháp tổng hợp peptid bậc thang khó khăn áp dụng để tổng hợp peptid dài protein Vì q trình tổng hợp móc nối loại bỏ nhóm bảo vệ khơng hồn tồn, phản ứng phụ yếu tố khác tạo nhiều sản phẩm không lại có đặc tính tương tự với sản phẩm cần tổng hợp Vì vậy, phương pháp hội tụ phát triển để tổng hợp peptid dài protein Phương pháp hội tụ lại chia thành loại: - Phương pháp gắn kết liên tục: Sử dụng nhóm phản ứng đặc hiệu lên đoạn peptid không bảo vệ dung dịch nước để hoàn thành ngưng tụ Phương pháp tránh hạn chế khả hòa tan kém, tốc độ phản ứng chậm, khó khăn xác định cấu trúc sản phẩm trung gian Tổng hợp peptid bậc thang hiệu cho peptid ngắn trung bình, tương 10 Hình 2.19 Callipeltin E Năm 2006, Lipton cộng công bố tổng hợp pha rắn callipeltin E không dùng điều kiện acid nghiên cứu chất nhạy cảm với acid phần βMeOTyr [5] Nhưng Kikuchi cộng lại thấy βMeOTyr không bị phá hủy TFA Do đó, ơng cộng định dùng phương pháp tổng hợp peptid pha rắn Fmoc truyền thống Trước tổng hợp callipeltin E, cần tổng hợp acid amin không thông thường với nhóm bảo vệ Đó Fmoc-MeAla-OH (26), Fmoc-βMeOTyr(OMEM)-OH (27), FmocMeGln-OH (28) Fmoc-D-all-oThr-OH (31) (sơ đồ 2.9) 31 Sơ đồ 2.15 Sơ đồ tổng hợp ngược callipeltin E [5] Callipeltin E tổng hợp theo phương pháp tổng hợp pha rắn Fmoc (sơ đồ 2.16) với pha rắn resin 2-clorotrityl clorid Sau bước 13, sản phẩm thô callipeltin E tách khỏi resin TFA/CH 2Cl2 (1:3 thể tích/thể tích)với hiệu suất 0,93% 32 Sơ đồ 2.16 Sơ đồ tổng hợp pha rắn callipeltin E [5] Như vậy, tổng hợp pha rắn nói chung tổng hợp peptid pha rắn có ý nghĩa lớn tổng hợp tồn phần thuốc có chất peptid phân lập từ tự nhiên, ví dụ chất spiruchostatin A callipeltin E nêu 2.2.1.2 Các phương pháp định tính sản phẩm tổng hợp pha rắn Trong trình tiến hành tổng hợp pha rắn, vấn đề đặt tiến hành theo dõi phản ứng sắc lý lớp mỏng (TLC) chất gắn pha rắn khơng tan Để đảm bảo độ tinh khiết sản phẩm, sau bước phản ứng cần đảm bảo toàn chất gắn pha rắn tham gia phản ứng hết Khắc phục điều đó, phương pháp định tính màu phát triển áp dụng rộng rãi thực hành tổng hợp pha rắn Tùy thuộc vào nhóm chức hình thành sau giai đoạn phản ứng, nhà khoa học sử dụng phương pháp định tính khác nhằm phát hình thành sản phẩm:  Các dẫn chất halogen Sự có mặt loại bỏ dẫn chất halogen định tính phương pháp sử dụng phản ứng định tính với chất mang mầu, sau soi kính hiển vi [] Mặc dù phương pháp hữu hiệu nhiên cần lượng lớn pha rắn resin khoảng 20mg (thông thường pha rắn sử dụng để tiến hành phản ứng 60-100 mg) Sự có mặt loại bỏ nhóm halogen làm thay đổi mầu sắc hạt resin pha rắn, cách sử dụng nhóm nucleophin mang mầu đặc chưng thay nhóm halogen, sau sử dụng kính hiển vi phát thay đồi màu sắc Ví dụ sử dụng fuchsin định tính nhóm halogen hình Sơ đồ 2.17 Định tính nhóm halogen 33  Nhóm chức rượu Sự có mặt nhóm chức rượu pha rắn nhận biết cách tạo tosylat, nhóm chức rượu thay phản ứng với PNBP (4-[(4nitrophenyl)methyl]-pyridine), sản phẩm tạo thành dạng muối pyridinium kiềm hóa tạo hạt mang mầu xanh tím (dương tính) Nhóm chức amin cacboxylic cho phản ứng âm tính với điều kiện Ngồi cịn có thuốc thử 2,4,6-trichloro[1,2,5]triazine Dichlorodiphenylsilan 9-anthroylnitrile để phát có mặt nhóm chức rượu Sơ đồ 2.18 Định tính nhóm rượu  Nhóm Thiol Phát có mặt nhóm thiol thuốc thử Ellman, dựa phản ứng 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) với nhóm thiol tạo ion có màu vàng đặc trưng bước sóng 412 nm 34 Sơ đồ 2.18 Định tính nhóm Thiol  Nhóm chức axit cacboxylic Nhóm axit cacboxylic phát phản ứng loại proton với triethyl amine DMF tạo muối làm cho hạt pha rắn (resin) có mầu đặc trưng sử dụng kính hiển vi để phát thay đổi mầu Ngồi cịn sử dụng thuốc thử 9-anthroylnitril tương tự phát nhóm OH sơ đồ 2.19 Các thuốc thử sử dụng liệt kê bảng 2.3 Sơ đồ 2.19 Định tính nhóm acid cacboxylic  Nhóm chức aldehyd ceton Phát nhóm aldedyd hay ceton nhờ vào phản ứng chuyển hai nhóm thành dạng dansyl hydrazon mang mầu đặc trưng, làm biến đổi mầu hạt resin Phản ứng chọn lọc, cần sử dụng khoảng 3- 10 mg resin (1-1.3 mmol/g) có mặt nhóm chức chiếm tỉ lệ thấp Ngồi sắt (III) sử dụng nhằm tạo phức mang mầu đặc trưng (gỉ mầu nâu) Ngồi cịn số thuốc thử khác dung dịch p-anisaldehyd, 4amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole Sơ đồ 2.20 Định tính nhóm aldehyd ceton 35  Nhóm Amin:  Amin bậc Thuốc thử đặc trưng amin bậc sử dụng pha rắn ninhydrin (thuốc thử Kaiser) Hạt resin thêm vào dung dich ninhydrin phenol, đốt nóng, chuyển sang dung dịch màu xanh (hạt có mầu xanh) Với amin bậc liên kết với vòng thơm, thuốc thử đặc hiệu chloranil DMF Dung dịch sau thêm amin thơm chuyển từ màu vàng sáng sang nâu tím Sơ đồ 2.21 Phản ứng định tính chloranil  Amin Bậc hai Amin bậc hai phát thuốc thử chloranil giống amin thơm bậc cho kêt dương tính, cho kêt âm tính sử dụng ninhydrin Kết hợp hai thuốc thử để xác định xác phân biệt với amin bậc  Nhóm nitro phenyl Nhóm nitro phenyl liên kết với resinc phát phản ứng giải phóng nhóm p-nitrophenat mơi trường kiểm tạo dung dịch có mầu, bước sóng đặc trưng 434 nm sơ đồ 2.22 Sơ đồ 2.22 Phản ứng định tính chloranil 36 Ngồi phương pháp màu, sử dụng phản ứng giải phóng chất trung gian từ pha rắn tiến hành đo phổ khối, nhiên phản ứng thường kéo theo phản ứng phụ (sản phẩm đóng vịng, tách loại ) nên phương pháp dùng thuốc thử lựa chọn tối ưu Các thuốc thử đặc trưng sử dụng định tính phản ứng tổng hợp pha rắn liệt kê bảng 2.3 Bảng 2.3 Bảng tổng kết phản ứng mầu nhóm chức tương ứng Âm tính (-), dương tính (+) 2.2.2 Ứng dụng tổng hợp peptid dung dịch Với peptide mạch ngắn trung bình, phương pháp tổng hợp dung dịch thích hợp cả, đặc biệt peptide có cấu trúc phức tạp điều kiện phản ứng khó kiểm sốt để áp dụng pha rắn Có hai phương pháp tổng hợp peptid dung dịch truyền thống phương pháp sử dụng chất mang tan  Tổng hợp peptid nhờ chất mang tan Phương pháp tổng hợp peptid nhờ chất mang tan dung dịch hiên nhà khoa học nghiên phát triển Trong số trường hợp, tổng hợp peptid pha rắn, trình loại pha rắn thường tạo sản phẩm 37 phụ khơng mong muốn chất q trình tách loại- cơng xảy đồng thời dẫn đến sản phẩm đóng vịng khơng mong muốn Việc sử dụng chất mang tan dung dịch giảm thiểu trình Sau xin trình bày ví dụ vể sử dụng chất mang tổng hợp ngân hàng chất có cấu trúc mô hướng quay beta protein thể Năm 2014, Park cộng tiến hành tổng hợp ngân hàng chất mang khung Oxopiperazin phản ứng tổng hợp peptid áp dụng phương pháp sử dụng chất mang tan có huỳnh quang [], hình 2.20 Hình 2.20 Sử dụng chất mang tan perfluorosilane (ký hiệu Rf) có huỳnh quan tổng hợp ngân hàng chất mang khung Oxopiperazin Tác giả sử dụng chất mang tan có huỳnh quang perfluorosilane gắn vào phần OH phenol chất ban đầu Nếu tiến hành sử dụng phương pháp tổng hợp pha rắn, chất tạo tra thơng qua q trình loại bỏ pha rắn khỏi sản phẩm, đóng vịng Oxopiperazin đồng thời giải phóng nhóm cacboxylic tự Do áp dụng phương pháp tổng hợp pha rắn trường hợp không khả quan Chất mang perfluorosilane bền giai đoạn tạo chất trung gian 8, sử dụng chất mang tan lựa chọn thích hợp trường hợp Sản phẩm gắn với Rf có màu đặc trưng perfluorosilane tạo giúp cho trình tinh chế dễ dàng .Do chất phân cực chất mang gây mầu đặc trưng quan sát mắt thường, sản phẩm tinh chất phương pháp sử dụng cột silica, hỗn hợp chất cho lên cột 38 sản phẩm gwans với Rf bị giữ lại đỉnh hấp thụ silica mạnh, sau tiến hành rửa thành phần khác hệ dung môi khác nhau, cuối sản phẩm có mầu cịn lưu lại cột rửa rải dung môi phân cực cao thu sản phẩm tinh khiết, hình 2.21 Hình 2.21: Tinh chế: hỗn hợp phản ứng, sản phẩm mang mầu lưu lại cột thành phần rửa xuống ống nghiệm (màu xanh), sản phẩm loại khỏi cột thu ống nghiệm Các chất thu có độ tinh khiết cao, phương pháp tinh chế tiến hành nhanh hiệu quả, giúp cho việc thực hành tổng hợp ngân hàng chất trở nên dễ dàng có nhiều lợi ích so với áp dụng phương pháp tổng hợp pha rắn  Tổng hợp petid dung dịch truyền thống: tổng hợp toàn phần Feglymycin Feglymycin peptid tự nhiên tách từ Streptomyces sp DSM 11171, thử nghiệm in vivo cho thấy, Feglymycin có khả ức chế mạnh trình hình thành HIV syncytia [], cấu trúc phát vào năm 1990 khẳng định cấu trúc vào năm 2005 thông qua phương pháp phân tích phổ khối, NMR xác định cấu trúc thơng qua kỹ thuật x-ray [] Cấu trúc Feglymycin thể qua hình 2.20 39 Hình 2.20 Feglymycin Cùng với tác dụng kháng khuẩn, khấng virus, Feglymycin có chứa nhiều amino acid không thiết yếu 4-hydroxyphenylglycine (Hpg) 3,5dihydroxyphenylglycine (Dpg) nhóm Hydroxyl tạo liên kết hydro khiến cho Feglymycin mang nhiều đặc tính dược động học quan trọng Do việc tổng hợp tồn phần nghiên cứu hoạt tính sinh học Feglymycin nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Năm 2009, Roderich D Sssmuth cộng tiến hành tổng hợp tồn phần Feglymycin, nói, cấu trúc có chứa nhiều nhóm hydroxyl tương ứng với Hpg Dpg, việc tiến hành tổng hợp Feglymycin pha rắn khơng khả quan Do phương pháp tổng hợp dung dịch lựa chọn thích hợp trường hợp Feglymycin chia thành phân đoạn nhỏ, sử dụng phương pháp tổng hợp phần đoạn di- tripeptid, hình 2.21[] 40 Hình 2.21 phân đoạn tổng hợp toàn phần Feglymycin Như hình 2.11, trình tổng hợp chia thành đoạn nhỏ tương ứng với 4, 5, 6, 7, Nguyên tác tổng hợp theo hướng N-C kết hợp với C-N nêu phần Cấu trúc tương đồng 4-7 giúp cho việc tổng hợp thêm dễ dàng cách tổng hợp chất trung gian quan trọng 15 theo sơ đồ 2.23 Với đầu N bảo vệ nhóm Boc C tự do, 15 dễ dàng tham gia phản ứng tạo liên kết C-N cho sản phẩm dipeptid Sơ đồ 2.23: tổng hợp chất trung gian 15 41 Từ 15 qua hai bước thu dipeptid 6, phản ứng cộng hợp với amino acid có C bảo vệ, cuối loại bỏ nhóm bảo vệ đuôi C thu dipeptid với đuôi C tự sơ đồ 2.24 Sơ đồ 2.24: tổng hợp dipeptid 6,7 Mạch peptid tăng đần thành hexapeptid tetrapeptid với đầu N tự thể sơ đồ 2.25 Sơ đồ 2.25: tổng hợp mạch hexapeptid tetrapeptid giai đoạn 42 Sử dụng tổng hợp pha rắn theo nguyên tắc hợp kết hợp linh hoạt hướng N-C C-N thực được, trường hợp mạch peptid khơng q dàithì tổng hợp dung dịch lựa chọn phù hợp Tương tự trình tổng hợp mạch peptide giai đoạn 1, trình tổng hợp tripeptid heptapeptid giai đoạn với C tự trình bày sơ đồ 2.26 Sơ đồ 2.26: tổng hợp mạch tripeptid heptapeptid giai đoạn Các đoạn 2, gắn với sau loại bỏ nhóm bảo vệ thu sản phẩm cuối Feglymycin 43 Sơ đồ 2.27: Tổng hợp Feglymycin từ đoạn Phương pháp tổng hợp phần dung dịch Roderich D Sssmuth cộng cho phép việc lựa chọn nhóm bảo vệ hướng tổng hợp peptid dược dễ dàng Mặt khác, ưu điểm phương pháp việc thay đổi cấu trúc nhằm tạo dẫn chất Feglymycin dễ dàng so với phương pháp tổng hợp pha rắn Giúp cho nghiên cứu liên quan cấu trúc tác dụng sinh học dễ dàng, nhằm tìm chất có hoạt tính sinh học tốt Mặc dù ngày phương pháp tổng hợp pha rắn áp dụng rộng rãi việc tổng hợp peptid, nhiên với peptid có chứa khung phức tạp, nhiều nhóm chức đặc biệt, mạch ngắn trung bình, sử dụng phương pháp tổng hợp dung dịch hiệu hẳn Hiện thực hành tổng hợp hóa, nhà khoa học ln áp dụng kết hợp giai đoạn tổng hợp pha rắn với dung dịch nhằm tận dụng ưu điểm khắc phục nhược điểm hai phương pháp đó, mang lại hiệu tổng hợp cao Bên cạnh đó, phương pháp tổng hợp sử dụng chất mang tan dung dịch nhà khoa học nghiên cứu áp dụng 44 Phần KẾT LUẬN Một số kết đạt qua chuyên đề: Đã tóm tắt giới thiệu phương pháp tổng hợp peptid Bên cạnh phương pháp truyền thống tổng hợp dung dich, phương pháp tổng hợp nhờ chất mang nhà khoa học phát triển ứng dụng mang lại hiệu cao tổng hợp peptid mạch dài Có hai phương pháp sử dụng chất mang bao gồm: sử dụng polymer (resin) rắn liên kết với chất ban đầu, phương pháp sử dụng chất mang có mầu với độ phân cực thay đổi liên kết với chất ban đầu, phương pháp nhà khoa học phát triển cho việc thực hành tổng hợp hữu Đã nêu số thuốc thử để nhận biết sản phẩm tổng hợp pha rắn, nhằm kiểm sốt tiến trình phản ứng Các thuốc thử màu công cụ quan trọng tổng hợp pha rắn, sản phẩm trung gian cố định polyme nên việc sử dụng sắc ký lớp mỏng TLC không tiến hành Việc sử dụng linh hoạt thuốc thử màu thực hành tổng hợp peptid pha rắn chứng minh hiệu đặc hiệu Đã trình bày số ví dụ tổng hợp peptid pha rắn, bao gồm phương pháp tổng hợp Boc tổng hợp Fmoc Với nhiều ưu điểm, phương pháp tổng hợp Fmoc áp dung rộng rãi Đã trình bày ví dụ tổng hợp sử dụng chất mang tan dung dich phân tích ưu điểm phương pháp so với tổng hợp pha rắn Nêu ví dụ tổng hợp Feglymycin phương pháp tổng hợp dung dịch, áp dụng nguyên tắc tổng hợp tàn phần Với peptid có chứa khung phức tạp, nhiều nhóm chức đặc biệt, mạch ngắn trung bình, sử dụng phương pháp tổng hợp dung dịch hiệu hẳn 45 ... HIỆN ĐẠI TRONG TỔNG HỢP PEPTID 2.2.1 Các phương pháp tổng hợp peptid pha rắn Trong tổng hợp peptid pha rắn, có phương pháp hay sử dụng phương pháp tổng hợp sử dụng nhóm bảo vệ amin Boc (hay gọi tổng. .. trình tổng hợp peptid theo phương pháp hội tụ [4] 2.1.1.2 Tổng hợp peptid dung dịch Tổng hợp peptid dung dịch phương pháp tổng hợp thông dụng, ưu điểm so với tổng hợp peptid pha rắn phản ứng thực... tổng hợp peptid thông thường địi hỏi nhiều nhân cơng mà lại cho hiệu suất thấp Do vậy, áp dụng số kỹ thuật đại tổng hợp peptid khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống Dưới số kỹ thuật đại