Trong tổng hợp peptid trên pha rắn, có 2 phương pháp hay được sử dụng hiện nay là phương pháp tổng hợp sử dụng nhóm bảo vệ amin là Boc (hay còn gọi là tổng hợp Merrifield) và Fmoc. Ở đây, chúng ta sẽ lần lượt đề cập đến hai phương pháp đó.
Phương pháp tổng hợp Boc
Phương pháp này có đặc tính sử dụng nhóm bảo vệ tạm thời tert-Boc là nhóm bảo vệ amin, còn nhóm benzyl hoặc dẫn chất của benzyl làm nhóm bảo vệ
cố định mạch nhánh. Cho đến nay có hơn một trăm resin khác nhau phù hợp cho tổng hợp peptid. Resin truyền thống sử dụng cho phương pháp tổng hợp Merrifield là resin dẫn chất cloromethylphenyl. Acid amin đầu tiên được gắn vào resin thông qua việc thay thế clorid bởi muối caesium của Boc-acid amin (sơ đồ 2.11). Sau đó, việc tách loại nhóm bảo vệ tạm thời Boc được thực hiện bằng dung dịch acid trifluoroacetic (TFA) 20 – 50% trong dicloromethan và tiếp theo bởi sự trung hòa của muối amoni thu được với base bậc 3. Cuối cùng, việc tách khỏi resin cũng như loại bỏ nhóm bảo vệ side-chain thu được bằng cách dùng acid mạnh, thường hay dùng dung dịch HF hoặc acid trifluoromethan sulfonic. Do vậy, quy trình này đòi hỏi trang thiết bị chuyên dụng và các điều kiện acid mạnh có thể xúc tác một số quá trình hỗ biến [13].
Sơ đồ 2.11. Quy trình tổng hợp peptid theo phương pháp tổng hợp Boc
Sự khác nhau cơ bản giữa tổng hợp Fmoc và phương pháp Merrifield là các phản ứng được thực hiện dòng liên tục và điều kiện để tách loại nhóm α- amino và tách khỏi resin nhẹ nhàng hơn. Có được điều này là nhờ nhóm bảo vệ Fmoc không bền với base. Mạch nhánh thông thường được bảo vệ bởi nhóm
tert-butyl và nói chung liên kết với resin được cắt bởi TFA trong sự có mặt của nhóm quét dọn. Resin truyền thống hay được sử dụng là dẫn chất 4- hydroxymethylphenoxy [13].
Sơ đồ 2.12. Quy trình tổng hợp peptid bằng phương pháp tổng hợp Fmoc
Năm 2009, Iijima Y. Và cộng sự đã ứng dụng phương pháp tổng hợp peptid sử dụng nhóm bảo vệ Fmoc để tổng hợp toàn phần spiruchostatin A [3]. Spiruchostatin A (13) được phân lập từ Pseudomonas sp., là chất mới được tìm thấy gần đây, có cấu trúc tương tự Depsipeptid (FK228). FK228 và spiruchostatin A là các chất ức chế histon deacetylase (HDAC). FK228 đã thành
công trong thử nghiệm lâm sàng và đã được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da vào tháng 11 năm 2009. Người ta thấy rằng hoạt tính của spiruchostatin A còn mạnh hơn cả FK228. Cả 2 chất đều là depsipeptid 2 vòng có cầu nối disulfid nội phân tử. Cũng giống như FK228, cơ chế ức chế HDAC của spiruchostatin A là cầu nối disulfid bị khử hóa trong tế bào và kết quả nhóm –SH tạo thành ở cầu nối sẽ gắn kết với ion Zn2+ trong túi enzym HDAC [6]. Để tổng hợp 13, quá trình lắp ráp trên pha rắn của 15-19 sẽ thu được chất 14 (sơ đồ 2.13). Sau đó, chất 14 được tách khỏi resin bởi hexafluoroisopropyl 30% trong dicloromethan. Hiệu suất của 14 sau khi chạy cột là 56%. Cuối cùng, vòng lacton được tạo thành bởi phương pháp Shiina (MNBA/DMAP/DCM/1 Mm, nhiệt độ phòng), tiếp theo là tạo liên kết disulfid (I2/MeOH) thu được spiruchostatin A trong pha lỏng với hiệu suất 89%.
Sơ đồ 2.13. Sơ đồ tổng hợp ngược của spiruchostatin A (13) trên pha rắn [3]
Ban đầu, các tác giả sử dụng resin có cầu nối là Kenner sulfonamid và cầu nối hydrazinobenzoyl nhưng không thành công. Do đó, cầu nối 2-clorotrityl được dùng để tạo tiền chất đóng vòng bởi phương pháp Fmoc. Nhưng đáng ngạc nhiên là nhóm Fmoc không thể tách loại khỏi resin bởi phương pháp thông thường (20% piperidin trong DMF). Tuy nhiên, việc tách loại hoàn toàn nhóm
bảo vệ đã được thực hiện bởi ngâm resin trương nở với hỗn hợp 2% DBU và 2% piperidin trong DMF 5 lần. Ngoài ra, may mắn thay là 4-amino-3-hydroxy-5- methyl-hexanoat 22 bền trong điều kiện base mạnh mà không tạo vòng lactam