MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINHCỦA BA GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ HEO VÀ BÒ

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI -THÚ Y ************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINHCỦA BA GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ HEO VÀ BÒ Họ tên sinh viên : NGUYỄN THỊ HẢI LINH MSSV : 05142037 Ngành : Dược thú y Niên khóa : 2005 – 2010 Tháng 08/ 2010 i BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI -THÚ Y ************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ Họ tên sinh viên : NGUYỄN THỊ HẢI LINH MSSV : 05142037 Ngành : Dược thú y Niên khóa : 2005 – 2010 Tháng 08/ 2010 i BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI -THÚ Y ************** NGUYỄN THỊ HẢI LINH MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINHCỦA GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ HEO VÀ BỊ Khóa luận đệ trình để áp ứng yêu cầu cấp bác sỹ thú y Giáo viên hướng dẫn TS VÕ THỊ TRÀ AN Tháng 08/ 2010 i PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Hải Linh Tên khóa luận : “Mức độ mẫn cảm với kháng sinh giống vi khuẩn phân lập từ heo bị” Sinh viên hồn thành luận văn tốt nghiệp theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến đóng góp hội đồng chấm bảo vệ luận văn tốt nghiệp ngày Giáo viên hướng dẫn TS VÕ THỊ TRÀ AN i LỜI CẢM ƠN  Xin tỏ lòng biết ơn: Con xin tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ, Người sinh thành, nuôi nấng, dạy dỗ động viên suốt thời gian qua  Lời cảm ơn sâu sắc: - TS Võ Thị Trà An, Người giáo viên tận tình, hướng dẫn động viên sống thời gian thực đề tài - Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM - Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Ni Thú Y, tồn thể q thầy truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian thực tập  Chân thành cảm ơn: - BSTY Lê Hữu Ngọc giúp đỡ, hướng dẫn, góp ý tạo điều kiện thật tốt để tơi hồn thành đề tài - Các bạn phòng thực hành Kiểm Nghiệm Thú Sản Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi, bạn Minh Thành, chị Tuyền, bạn Tri Thức… an ủi giúp đỡ nhiều thời gian thực tập  Xin cảm ơn: Đến tất bạn lớp Dược Thú Y 31 chia vui buồn học tập, bên cạnh động viên, trợ giúp tơi q trình thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Linh i TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Khảo sát mức độ mẫn cảm với kháng sinh số loài vi khuẩn phân lập từ vật ni” tiến hành phịng thực hành Kiểm Nghiệm Thú Sản Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y, Trường Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, thời gian từ 10/2009 đến 6/2010 Qua phân lập 22 mẫu sữa bò 15 mẫu dịch mũi heo thu số kết Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus spp mẫu sữa bò 90,91%, mẫu dịch mũi heo 80% Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Streptococcus spp mẫu sữa bò 36,36% mẫu dịch mũi heo 40% Thực kháng sinh đồ 32 chủng Staphylococcus spp, 14 chủng Streptococcus spp 20 chủng Salmonella cho thấy Staphylococcus spp có mức độ nhạy cảm cao với kháng sinh vancomycin, ciprofloxacin, rifamycin, gentamicin, cephalothin Streptococcus spp có mức độ nhạy cảm cao với kháng sinh doxycycline, penicillin, rifamycin, chloramphenicol Salmonella có mức độ nhạy cảm cao với kháng sinh nitrofurantoin, cefepime, cefotaxime, ciprofloxacin Kháng sinh tetracycline khơng cịn hiệu (trong phịng thí nghiệm) với Salmonella i MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt luận văn vi Mục lục vii Danh sách từ viết tắt v Danh sách bảng vi Danh sách hình .vii Danh sách sơ đồ xi Danh sách biểu đồ xii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược vi khuẩn 2.1.1 Salmonella 2.1.2 Staphylococcus 2.1.3 Streptococcus 2.2 Những kiến thức kháng sinh 11 2.2.1 Khái niệm 11 2.2.2 Phân loại 11 2.3 Đề kháng kháng sinh 12 2.4 Biện pháp hạn chế đề kháng 15 2.5 Biện pháp kiểm soát đề kháng kháng sinh 15 2.6 Các phương pháp khảo sát nhạy cảm vi khuẩn kháng sinh 16 2.6.1 Phương pháp định tính 16 2.6.2 Phương pháp định lượng 17 2.7 Tình hình nghiên cứu nước 18 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 i 3.1 Thời gian địa điểm 20 3.1.1 Thời gian 20 3.1.2 Địa điểm 20 3.2 Nội dung nghiên cứu 20 3.3 Vật liệu 20 3.3.1 Đối tượng khảo sát 20 3.3.2 Môi trường, hoá chất dùng để phân lập vi khuẩn 20 3.4 Phương pháp tiến hành 21 3.4.1 Cách lấy mẫu thực 21 3.4.2 Phân lập, định danh vi khuẩn 23 3.4.3 Đọc kết quả, thử sinh hoá 26 3.4.4 Phương pháp kháng sinh đồ 26 3.5 Chỉ tiêu khảo sát 28 3.6 Xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết phân lập vi khuẩn mẫu sữa mẫu dịch mũi 29 4.1.1 Loài vi khuẩn phân lập 22 mẫu sữa bò 29 4.1.2 Loài vi khuẩn phân lập 15 mẫu dịch mũi heo 29 4.1.3 Mức độ tương đồng kết nghiên cứu với kết kiểm chứng APUA Đại học Tuft, Hoa Kỳ 30 4.2 Khảo sát nhạy cảm vi khuẩn số loại kháng sinh 31 4.2.1 Xác định độ mẫn cảm chủng vi khuẩn Salmonella 31 4.2.2 Xác định độ mẫn cảm chủng vi khuẩn Staphylococcus spp 35 4.2.3 Xác định độ mẫn cảm chủng vi khuẩn Streptococcus spp 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 49 i DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT BA : Blood Agar BHI : Brain Heart Infusion NA : Nutrient Agar XLD : Xylose Lysine Desoxycholate EMB : Eosin Methylene Blue MHA : Mueller Hinton Agar MHB : Mueller Hinton Broth BGA : Brilliant Green Agar i DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Phản ứng sinh hóa số lồi vi khuẩn Bảng 2.2 Đặc tính phân biệt loài Staphylococcus Micrococcus Bảng 2.3 Các đặc điểm khác loài Streptococci động vật 10 Bảng 4.1 Loài vi khuẩn phân lập 22 mẫu sữa 30 Bảng 4.2 Loài vi khuẩn phân lập 15 mẫu dịch mũi 31 Bảng 4.3 Mức độ tương đồng kết nghiên cứu với kết kiểm chứng APUA 30 Bảng 4.4 Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Salmonella 32 Bảng 4.5 Tính nhạy cảm với kháng sinh Staphylococcus spp theo nguồn gốc phân lập 41 Bảng 4.6 Tính nhạy cảm với kháng sinh Streptococcus spp theo nguồn gốc phân lập 45 i 100 90 80 T ỉ l ệ (% ) 70 60 50 Tỉ lệ 40 30 20 10 21,43 21,43 14,29 14,29 7,14 7,14 Pn 7,14 Ci Rf Ge Cl Te Er Dx Va Of Kháng sinh Biểu đồ 4.9 Mức độ nhạy cảm trung gian vi khuẩn Streptococcus spp với loại kháng sinh Biểu đồ 4.9 cho thấy mức độ nhạy cảm trung gian vi khuẩn Streptococcus spp với loại kháng sinh thấp, đa số có tỷ lệ 30% Tỷ lệ thấp so với nghiên cứu Nguyễn Minh Hải (2005), Nguyễn Hoàng Trúc (2005) Lê Ngọc Thủy (2001) i Bảng 4.6 Tính nhạy cảm với kháng sinh Streptococcus spp theo nguồn gốc phân lập Mức độ nhạy cảm vi khuẩn Streptococcus spp (Số lượng %) Kháng sinh Sữa bò (n= 8) Dịch mũi heo (n= 6) Penicillin (Pn) (87,5%) (100%) Ciprofloxacin (Ci) (62,5%) (83,33%) Rifamycin (Rf) (75%) Gentamicin (Ge) (75%) (83,33%) (87,5%) (100%) Tetracycline (Te) (75%) (50%) Erythromycin (Er) (62,5%) (50%) Doxycycline (Dx) (100%) (100%) Vancomycin (Va) (62,5%) (100%) Ofloxacin (Of) (100%) (66,67%) Chloramphenicol (Cl) Qua Bảng 4.6 cho thấy mức độ nhạy cảm với kháng sinh vi khuẩn Streptococcus spp phân lập từ sữa bò cao so với chủng vi khuẩn Streptococcus spp phân lập từ dịch mũi heo i Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian thực đề tài “Khảo sát mức độ mẫn cảm với kháng sinh số loại vi khuẩn phân lập từ vật nuôi” rút số kết luận sau: Đã phân lập định danh loài vi khuẩn Salmonella spp (trên thịt heo), Staphylococcus spp Streptococcus spp (trên sữa bò dịch mũi heo) heo bị khơng có triệu chứng lâm sàng bệnh (khoẻ mạnh) Kết định danh vi khuẩn Salmonella spp, Staphylococcus spp, Streptococcus spp phù hợp với kết kiểm chứng tổ chức APUA xác đến 98% Vi khuẩn Salmonella phân lập từ thịt heo nhạy cảm cao với kháng sinh ciprofloxacin (100%), cefotaxime (100%), cefepime (100%), nitrofurantion (100%), ampicillin/sulbactam (95%), gentamicin (80%), chloramphenicol (70%) Các kháng sinh bị Salmonella đề kháng cao tetracycline (70%), nalidixic acid (55%) trimethoprim/sulfamethoxazole (55%) Vi khuẩn Staphylococcus spp có tính nhạy cảm cao với kháng sinh vancomycin (100%), kháng sinh ciprofloxacin, rifamycin, gentamicin, cephalexin đề có tỷ lệ 96,88% doxycycline (93,75%) Staphylococcus đề kháng với kháng sinh clindamycin (43,75%), erythromycin (43,75%) Vi khuẩn Streptococcus spp nhạy cảm hoàn toàn với kháng sinh doxycycline (100%) nhạy cảm cao với kháng sinh penicillin, rifamycin, chloramphenicol (92,86%) Streptococcus có tính đề kháng thấp với kháng sinh đa số 30% i 5.2 Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu mức độ nhạy cảm với kháng sinh vi khuẩn Salmonella, Staphylococcus spp, Streptococcus spp phân lập từ bệnh giúp đưa chọn lựa kháng sinh việc điều trị hợp lý đến người chăn nuôi - Khuyến cáo cho người chăn nuôi nên thận trọng việc sử dụng kháng sinh vật nuôi i TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Võ Thị Trà An, 2007 Kháng sinh cho vật nuôi Nhà xuất Đà Nẵng 184 trang Tô Minh Châu Trần Thị Bích Liên, 2001 Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Giáo trình chun ngành khoa Chăn Ni Thú Y, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Phùng Quốc Chướng, 2005 Kết kiểm tra tính mẫn cảm với số thuốc kháng sinh Salmonella phân lập từ vật ni Đăk Lăk Tập chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XII, số 1, trang 47-53 Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Kim Loan, 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật Nhà xuất nông nghiệp 123 trang Nguyễn Minh Hải, 2005 Phân lập vi khuẩn – thử kháng sinh đồ mẫu sữa bò bi viêm vú tiềm ẩn đếm tổng số vi khuẩn Staphylococcus aureus trước sau điều trị khu vực Quận 12 Tp HCM Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, Đại học Nông Lâm Tp HCM Lê Đình Hùng, 1997 Đại cương phương pháp kiểm tra vi sinh thực phẩm Trung tâm kiểm tra chất lượng vệ sinh thực phẩm Chi nhánh IV TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Huy, 2007 Khảo sát bệnh đường hơ hấp chó, phân lập vi khuẩn gây bệnh từ dịch mũi chó thực kháng sinh đồ vi khuẩn i phân lập Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, Đại học Nông Lâm Tp HCM Nguyễn Thị Kim Loan, 2000 Phân lập vi khuẩn mẫu sữa bò bị viêm vú tiềm ẩn thử kháng sinh đồ Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, Đại học Nông Lâm Tp HCM Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết Thí nghiệm cơng nghệ sinh tập 2- Thí nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Thị Thành Thảo, 2008 Khảo sát bệnh đường hô hấp chó, phân lập định danh thực kháng sinh đồ vi khuẩn phân lập từ dịch mũi chó Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, Đại học Nông Lâm Tp HCM 11 Tô Liên Thu, 2004 Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn Salmonella E.coli phân lập từ thịt lợn thịt gà vùng Đồng Bằng Bắc Bộ Tập chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XI, số 4, trang 29-35 12 Lê Ngọc Thuỷ, 2001 Phân lập vi khuẩn mẫu sữa bò bị viêm vú tiềm ẩn thử kháng sinh đồ Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, Đại học Nông Lâm Tp HCM 13 Tô Thị Thuỳ Trang, 2008 Phân lập, định danh, thử kháng sinh đồ thử độc lực chuột bạch thí nghiệm vi khuẩn Salmonella xí nghiệp chăn ni bò An Phú Củ Chi Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, Đại học Nông Lâm Tp HCM i 14 Nguyễn Hoàng Trúc, 2005 Phân lập vi khuẩn thử kháng sinh đồ từ sữa bị viêm vú lâm sàng dịch tử cung bò sữa khu vự Tp HCM Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, Đại học Nơng Lâm Tp HCM NƯỚC NGỒI 15 Bonnie M M, Dorothy J O, Stuart B L, 2009 Commensals: Underappreciated Reservoir of Antibiotic Resistance Microbe / Volume 4, Number 5, Page 231237 16 Collins C.H, Lyne Patricia.M, Grange J.M, 1988 Collins and Lyne’s Microbiological Methods London Page 261 – 276, 301 – 316 17 Kumar R., Yadav B R., Singh R S., 2010 Genetic Determinants of Antibiotic Resistance in Staphylococcus aureus Isolates from Milk of Mastitic Crossbred Cattle Curr Microbiol 60:379–386 18 Quin PJ, Carter ME, Markey B, Carter G R., 1998 Clinical veterinary microbiology Wolfe, London Page 118 – 126 i PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các mức độ nhạy cảm vi khuẩn khảo sát Bảng Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Staphylococcus spp Số Kháng sinh lượng mẫu khảo sát Nhạy Trung gian Kháng Số Tỉ lệ Số Tỉ lệ Số Tỉ lệ lượng (%) lượng (%) lượng (%) Penicillin (pn) 32 27 84,38 0 15,63 Clindamycin (cl) 32 13 40,63 15,63 14 43,75 Ciprofloxacin (ci) 32 31 96,88 0 3,13 Rifamycin (rf) 32 31 96,88 0 3,13 32 22 68,75 9,38 21,88 Oxacillin (ox) 32 25 78,13 0 21,88 Gentamicin (ge) 32 31 96,88 0 3,13 32 24 75 9,38 15,63 Tetracycline (te) 32 18 56,25 12 37,50 6,25 Erythromycin (er) 32 16 50 6,25 14 43,75 Doxycycline (dx) 32 30 93,75 6,25 0 Vancomycin (va) 32 32 100 0 0 Cephalothin (cp) 32 31 96,88 0 0 Trimethoprim/sulf amethoxazole (bt) Chloramphenicol (cl) i Bảng Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Streptococcus spp Nhạy Số lượng Kháng sinh Trung gian Kháng mẫu khảo Số Tỉ lệ Số Tỉ lệ Số Tỉ lệ sát lượng (%) lượng (%) lượng (%) Penicillin (pn) 14 13 92,86 0 7,14 Ciprofloxacin (ci) 14 10 71,43 21,43 7,14 Rifamycin (rf) 14 13 92,86 7,14 0 Gentamicin (ge) 14 12 85,71 7,14 7,14 13 92,86 0 7,14 Chloramphenicol (cl) 14 Tetracycline (te) 14 64,29 21,43 14,29 Erythromycin (er) 14 57,14 14,29 28,57 Doxycycline (dx) 14 14 100 0 0 Vancomycin (va) 14 11 78,57 14,29 7,14 Ofloxacin (of) 14 12 85,71 7,14 7,14 i Phụ lục 2: Các chuẩn mực đường kính vịng vơ khuẩn theo NCCLS Bảng Đường kính chuẩn vi khuẩn Salmonella ký Hàm hiệu lượng Ciprofloxacin Ci µg Trimethoprim/sulfamethoxazole Bt Gentamicin Ge Chloramphenicol Đĩa kháng sinh Đường kính vịng vơ khuẩn đo mm đường tròn Kháng Trung gian Nhạy ≤ 15 16 – 20 ≥ 21 ≤ 10 11 – 15 ≥ 16 10 µg ≤ 12 13 – 14 ≥ 15 cL 30 µg ≤ 12 13 – 17 ≥ 18 Tetracycline Te 30 µg ≤ 14 15 – 18 ≥ 19 Doxycycline Dx 30 µg ≤ 12 13 – 15 ≥ 16 Cefotaxime Ct 30 µg ≤ 14 15 – 22 ≥ 23 Nalidixic acid Ng 30 µg ≤ 13 14 – 18 ≥ 19 Nitrofurantoin Fr 300 µg ≤ 14 15 – 16 ≥ 17 Ampicillin Am 10 µg ≤ 13 14 – 16 ≥ 17 Ampicillin–sulbactam As < 19 - ≥ 19 Cefipime Cm ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 1.25/23.75 µg 30 µg (Nguồn cơng ty TNHH Nam Khoa) i Bảng Đường kính chuẩn vi khuẩn Staphylococcus spp Kháng sinh Ký Hàm hiệu lượng Đường kính vịng vơ khuẩn đo mm đường tròn Kháng Trung gian Nhạy Penicillin (pn) Pn 10 units ≤ 28 - ≥ 29 Clindamycin (cl) cL µg ≤ 14 15 -20 ≥ 21 Ciprofloxacin (ci) Ci µg ≤ 15 16 – 20 ≥ Rifamycin (rf) Rf µg ≤ 16 17 – 19 ≥ 1.25/23.75 ≤ 10 Trimethoprim/sulfame thoxazole (bt) Bt µg 11 – 15 ≥ Oxacillin (ox) Ox µg ≤ 17 - ≥ Gentamicin (ge) Ge 10 µg ≤ 12 13 – 14 ≥ Chloramphenicol (cl) Cl 30 µg ≤ 12 13 – 17 ≥ Tetracycline (te) Te 30 µg ≤ 14 15 – 18 ≥ Erythromycin (er) Er 15 µg ≤ 13 14 – 22 ≥ Doxycycline (dx) Dx 30 µg ≤ 12 13 – 15 ≥ Vancomycin (va) Va 30 µg - - ≥ Cephalothin (cp) Cp 30 µg ≤ 14 15 - 17 ≥ (Nguồn công ty TNHH Nam Khoa) i Bảng Đường kính chuẩn vi khuẩn Streptococcus spp Ký Hàm hiệu lượng Penicillin (pn) Pn Ciprofloxacin (ci) Đĩa kháng sinh Đường kính vịng vơ khuẩn đo mm đường tròn Kháng Trung gian Nhạy 10 units ≤ 14 - ≥ 15 Ci 30 µg ≤ 15 16 – 20 ≥ 21 Rifamycin (rf) Rf µg ≤ 15 17 – 19 ≥ 20 Gentamicin (ge) Ge 120 µg ≤6 7–9 ≥ 10 Chloramphenicol (cl) Cl 30µg ≤ 12 13 – 17 ≥ 18 Tetracycline (te) Te 30 µg ≤ 14 15 – 18 ≥ 19 Erythromycin (er) Er 15 µg ≤ 13 14 – 22 ≥ 23 Doxycycline (dx) Dx 30 µg ≤ 12 13 – 15 ≥ 16 Vancomycin (va) Va 30 µg ≤ 14 15 – 16 ≥ 17 Ofloxacin (of) Of µg ≤ 12 13 - 15 ≥ 16 (Nguồn công ty TNHH Nam Khoa) Phụ lục 3: Thành phần công thức pha chế môi trường 3.1 Môi trường NA (Nutrient Agar) Pancreatic Digest of Gelatin g/l Beff Extract g/l Agar 15 g/l pH cuối (250C) = 6,8 ± 0,2 Cách pha chế Cân 28g môi trường khô cho vào lọ thuỷ tinh với 1000ml nước cất khuấy cho tan Sau đem tiệt trùng autoclave 1210C 15 phút Để nguội khoảng 500C chiết vào đĩa petri (khoảng 15 ml/đĩa) 3.2 Môi trường MHA (Muller Hinton Agar) Beef, infusion from 300 g/l Casein acid hydrosate 17,5 g/l Starch 1,5 g/l i Agar 17 g/l pH cuối (250C) = 7,3 ± 0,2 Cách pha chế Cân 38 g môi trường khô cho vào lọ thuỷ tinh 1000ml nước cất khuấy cho tan Sau đem tiệt trùng autoclave 1210C 15 phút Để nguội khoảng 500C đổ vào đĩa petri (khoảng 17-20 ml/đĩa) 3.3 BHI (Brain Heart Infusion Broth) Calf brain, infusion from 200 g/l Beef, infusion from 250 g/l Proteose peptone 10 g/l Dextrose g/l Sodium chloride g/l Disodium phosphate 2,5 g/l pH cuối (25 C) = 7,4 ± 0,2 Cách pha chế Cân 37 g môi trường cho vào lọ thuỷ tinh, cho nước vào cất Khuấy cho tan đều, phân ống nghiệm 3ml cho ống, tiệt trùng 1210C/15 phút Để nguội, sử dụng trữ ngăn mát tủ lạnh Phụ lục 4: 4.1 Nhuộm Gram - Thuốc nhuộm hoá chất  Thuốc nhuộm: + Crystal violet + Fuchsin kiềm lỗng (màu đỏ)  Hố chất: + Dung dịch Lugol (dung dịch Iod): dung dịch tác dụng với Crystal violet tạo nên hợp chất bền màu, đóng vai trị việc cố định màu tím vi khuẩn i + Cồn 960: có tác dụng tẩy màu tím vi khuẩn Gram âm, tạo điều kiện cho chúng bắt màu đỏ Fuchsin - Kỹ thuật nhuộm  Lấy giọt nước muối sinh lý để lên lam kính, sau lấy vi khuẩn hoà tan giọt nước muối sinh lý cố định vết bơi lam kính  Đặt mảnh giấy lọc lên vết bôi, nhỏ thuốc nhuộm Crystal violet lên miếng giấy lọc cho đủ thấm xuống vết bôi, để phút  Rửa nước  Nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi vừa nhuộm, để khoảng phút  Rửa nước  Tẩy màu nhanh cồn 960, khoảng 15-30 giây  Rửa nước  Đặt mảnh giấy lọc khác lên vết bôi, nhỏ thuốc nhuộm Fuchsin kiềm loãng lên miếng giấy lọc cho đủ thấm xuống vết bôi, để khoảng phút  Rửa nước  Để khô tiêu xem kính hiển vi (Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Kim Loan, 2009) Kết nhuộm Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím thuốc nhuộm Crystal violet, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng Fuchsin 4.2 Phản ứng catalase - Nguyên tắc: Các vi sinh vật hiếu khí bắt buộc hay hiếu khí tuỳ nghi nhờ có enzyme catalase nên thường có khả phân giải H2O2 tạo thành nước oxy Trong phản ứng catalase dương tính, oxy bay lên tạo thành bọt khí i Catalase H2O2 H2O + ½ O2 - Thuốc thử: Nước oxy già (H2O2) - Thực hiện: Nhỏ vài giọt nước oxy già lên lam kính Sau dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng, lấy trải vi sinh vật kiểm định lên giọt oxy già Phản ứng xảy - Đánh giá kết quả: Quan sát xuất bọt khí:  Có xuất bọt khí: oxy sinh bay lên Phản ứng catalase dương tính  Khơng có xuất bọt khí: khơng có oxy sinh Phản ứng catalase âm tính 4.3 Phản ứng oxidase - Nguyên tắc: Tính chất thường có vi sinh vật hiếu khí Enzyme cytochrome oxidase vi sinh vật oxy hoá tetramethyl paraphenylen diamine chlohydrate có thuốc thử tạo thành hợp chất có màu tím đen - Thuốc thử; Dung dịch 1% tetramethyl paraphenylen diamine chlohydrate tẩm sẵn giấy thử - Thực hiện: Dùng que cấy thẳng, thao tác vô trùng, lấy trải vi sinh vật kiểm định lên mẫu giấy có tẩm thuốc thử Đọc kết sau vài giây (không cần ủ nuôi cấy) - Đánh giá kết quả: Quan sát xuất màu mẫu giấy tẩm thuốc thử:  Có xuất màu tím đen: phản ứng oxidase dương tính  Khơng xuất màu tím đen: phản ứng oxidase âm tính i ... tài “KHẢO SÁT KHÁNG SINH ĐỒ CỦA GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ THỊT HEO, DỊCH MŨI HEO VÀ SỮA BÒ TƯƠI” phần nghiên cứu nêu i 1.2 Mục đích Xác định mức độ mẫn cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn Salmonella... Streptococcus spp phân lập từ thịt heo, dịch mũi heo sữa bò 1.3 Yêu cầu Lấy mẫu, phân lập, định danh giữ gốc chủng vi khuẩn thu Khảo sát mức độ mẫn cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn thu i Chương... GIÁO VI? ?N HƯỚNG DẪN Họ tên sinh vi? ?n thực tập: Nguyễn Thị Hải Linh Tên khóa luận : ? ?Mức độ mẫn cảm với kháng sinh giống vi khuẩn phân lập từ heo bị” Sinh vi? ?n hồn thành luận văn tốt nghiệp theo