ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH VÀ INTEGRON CỦA BỐN GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VÀ NƯỚC

ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH VÀ INTEGRON CỦA BỐN GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VÀ NƯỚC DƯƠNG THỊ BÍCH HỢP Hội đồng chấm luận văn: 1.. TÓM TẮTĐề tài “Đề kháng kháng sinh và integron của bốn giố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

**************

DƯƠNG THỊ BÍCH HỢP

ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH VÀ INTEGRON CỦA BỐN GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP

TỪ ĐẤT VÀ NƯỚC

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 1/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*****************

DƯƠNG THỊ BÍCH HỢP

ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH VÀ INTEGRON CỦA BỐN GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP

ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH VÀ INTEGRON CỦA BỐN GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP

TỪ ĐẤT VÀ NƯỚC DƯƠNG THỊ BÍCH HỢP

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: TS TRẦN XUÂN HẠNH

Công ty Navetco

2 Thư ký: TS NGUYỄN TẤT TOÀN

Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3 Phản biện 1: TS PHẠM HÙNG VÂN

Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh

4 Phản biện 2: TS HỒ THỊ KIM HOA

Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

5 Uỷ viên: TS VÕ THỊ TRÀ AN

Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Dương Thị Bích Hợp sinh ngày 17 tháng 08 năm 1982 tại ấp Cồn

Cù xã Dân Thành huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh

Tốt nghiệp PTTH tại Trường Trung học phổ thông Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh năm 2001

Tốt nghiệp Đại học ngành Bác sĩ Thú y hệ chính quy tại Đại học Cần Thơ, tỉnh Cần Thơ

Tháng 09 năm 2008 theo học Cao học ngành Thú Y tại trường Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Tình trạng gia đình: độc thân

Địa chỉ liên lạc: ấp Cồn Cù, xã Dân Thành, huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh

Điện thoại: 0987 967 187

Email: dtbhty@yahoo.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này hoàn toàn trung thực và là một phần trong đề tài nghiên cứu của APUA (the Alliance for Prudent Use of Antibiotic) do TS Võ Thị Trà An làm chủ nhiệm Các số liệu, kết quả của luận văn được công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài

Dương Thị Bích Hợp

CẢM TẠ

Chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành phố

Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi – Thú y và Phòng Đào tạo Sau Đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Con xin gửi tấm lòng biết ơn vô hạn đến Ba, Má Người đã cực khổ nuôi dạy con khôn lớn và luôn tạo điều kiện cho con hoàn thành khóa học này

Kính tri ân Quí Thầy Cô đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quí báu cho tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Cô Võ Thị Trà An đã cho tôi tham gia nghiên cứu trong đề tài của APUA (the Alliance for Prudent Use of Antibiotic),

đã tận tình hướng dẫn, động viên, cung cấp tài liệu và kinh phí cho tôi hoàn thành

đề tài này

Xin chân thành cảm ơn Thầy Lê Hữu Ngọc, anh Mẫn, anh Tùng, bạn Tuyền, Tài, em Ái Linh, Hải Linh, Thành, Thức, Tuấn Phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản – Môi trường và Sức khỏe Vật nuôi, Khoa Chăn nuôi – Thú y Cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ môi trường, trường Đại học Nông Lâm Tp HCM và các chú, anh, chị cùng các bạn lớp Cao học Thú y khóa

2008 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Xin cảm ơn tất cả mọi người trong gia đình (anh - chị Tư, chị Phương, các

em thân yêu ) và những người bạn tốt (Phúc Khánh, Kim Thái, Thẩm, Khải, Dương, Bé Lan, Hoàng Phương, Kiệm, Hạnh, Phương- Châu, Tuyền, Hiếu ) đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành đề tài này

Kính dâng hương hồn anh Dương Thanh Nhanh

Xin cảm ơn anh, luôn ở bên cạnh và động viên tôi

TÓM TẮT

Đề tài “Đề kháng kháng sinh và integron của bốn giống vi khuẩn phân lập từ đất và nước” được tiến hành tại trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, trong thời gian từ 11/2009 đến 5/2011 Đề tài được thực hiện nhằm xác định kiểu hình đề kháng kháng sinh và sự hiện diện integron lớp 1 và integron lớp 2 của

các giống vi khuẩn (Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Stenotrophomonas)

được phân lập từ đất và nước Tổng số 145 gốc vi khuẩn của bốn giống đã được

phân lập (64 gốc Acinetobacter, 21 gốc Aeromonas, 38 gốc Pseudomonas và 22 gốc Stenotrophomonas) và được kiểm tra mức độ mẫn cảm với 14 loại kháng sinh phổ

biến trong nhân y, thủy sản và thú y bằng phương pháp khuếch tán trên thạch Kết

quả cho thấy tỉ lệ phát hiện của Acinetobacter trong môi trường nước là 58,07 % và đất là 57,69 % Tỉ lệ phát hiện Aeromonas trong môi trường nước là 33,87 % Tỉ lệ phát hiện Pseudomonas trong môi trường nước là 45,16 % và trong đất là 19,23 %

Tỉ lệ phát hiện Stenotrophomonas trong đất là 42,31 % Cả bốn giống vi khuẩn phân

lập từ môi trường đều đề kháng cao với hai kháng sinh nalidixic acid, ampicillin

Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas đề kháng cao với nitrofurantoin (> 60,00

%) Ngoài ra, Pseudomonas còn đề kháng với trimethoprim/ sulfamethoxazole (73,68 %) và amoxicillin/clavulanic acid (60,53 %) Riêng Stenotrophomonas đề

kháng với kháng sinh streptomycin (72,73 %), amoxicillin/clavulanic acid (59,09

%), polymycin B (45,45 %) và gentamicin (40,91 %) Integron lớp 1 được phát

hiện trong hai gốc Pseudomonas trong tổng số 133 gốc vi khuẩn kiểm tra Hai gốc

vi khuẩn này là từ mẫu nước ao và đa đề kháng với 5 và 8 loại kháng sinh Gene cassette có kích thước khoảng 900 bp và 1500 bp cũng đã được khuếch đại từ hai gốc vi khuẩn này Không phát hiện sự hiện diện của integron lớp 2

ABSTRACT

The thesis “Antibiotic resistance and the integrons of four bacteria genus from soil and water” was conducted at Nong Lam University, Ho Chi Minh City, from 11/2009 to 5/2011 The aim of the study is to detect antibiotic resistance

phenotype of bacteria including Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Stenotrophomonas which isolated from pond water, livestock sewage, river water,

soil samples Antibiotic resistance and the present class 1 and class 2 integron also were determined A total 145 isolates were classified in to four bacteria genus (64

isolates Acinetobacter, 21 isolates Aeromonas, 38 isolates Pseudomonas and 22 isolates Stenotrophomonas) These isolates were tested susceptibility to antibiotics

for with 14 common antibiotics in human, aquaculture and veterinary medicine The

percentage of Acinetobacter was 58.07 % in water samples, 57.69 % in the soil samples The percentage of Aeromonas in the aquatic environment was 33.87 % The percentage of Pseudomonas in water samples was 45.16 % The occurrence rate of Stenotrophomonas in the soil environment was 42.31 % Bacterial isolates of four genus were highly resistant to nalidixic acid and ampicillin Acinetobacter, Aeromonas and Pseudomonas were highly resistant to nitrofurantoin (> 60.00 %) Pseudomonas isolates were resistant to trimethoprim/ sulfamethoxazole (73.68 %) and amoxicillin/clavulanic acid (60.53 %) Stenotrophomonas isolates were

resistant to streptomycin (72.73 %), amoxicillin/ clavulanic acid (59.09 %), polymycin B (45.45 % ) and gentamicin (40.91 %) Among 133 isolates of four

bacteria genus tested two isolates of Pseudomonas contained class 1 integron These

two isolates were from pond water samples and multi-resistant against 5 and 8 antibiotics Gene cassettes of these isolate were approximately 900 bp and 1500 bp

in size No class 2 integron was detected among the collection

MỤC LỤC

Trang tựa i

Trang Chuẩn Y ii

Lý Lịch Cá Nhân iii

Lời Cam Đoan iv

Cảm tạ v

Tóm tắt .vi

Mục lục viii

Danh sách các chữ viết tắt xi

Danh sách các hình xii

Danh sách các bảng xiii

Danh sách các sơ đồ và biểu đồ xiv

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Yêu cầu 2

2.TỔNG QUAN 3

2.1 Vi khuẩn trong môi trường 3

2.1.1 Vai trò của vi khuẩn trong môi trường 3

2.1.2 Phương thức lan truyền đề kháng kháng sinh của vi khuẩn trong môi trường 4

2.1.3 Bốn giống vi khuẩn môi trường được nghiên cứu 5

2.1.3.1 Vi khuẩn Acinetobacter 5

2.1.3.2 Vi khuẩn Aeromonas 5

2.1.3.3 Vi khuẩn Pseudomonas 6

2.1.3.4 Vi khuẩn Stenotrophomonas 8

2.2 Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh 9

2.2.1 Kháng sinh 9

2.2.2 Đề kháng kháng sinh 9

2.2.2.1 Cơ chế đề kháng kháng sinh 10

2.2.2.2 Phân loại đề kháng kháng sinh 13

2.3 Các phương pháp xác định sự đề kháng 14

2.3.1 Phương pháp kháng sinh đồ 14

2.3.1.1 Định nghĩa 14

2.3.1.2 Phương pháp khuếch tán trên thạch 14

2.3.1.3 Phương pháp pha loãng kháng sinh trong môi trường lỏng 16

2.4 Integron và gene cassette 16

2.4.1 Integron lớp 1 17

2.4.2 Integron lớp 2 18

2.4.3 Gene cassette 18

2.5 Những nghiên cứu có liên quan đến nội dung đề tài 19

2.5.1 Vi khuẩn Acinetobacter 19

2.5.2 Vi khuẩn Aeromonas 21

2.5.3 Vi khuẩn Pseudomonas 22

2.5.3 Vi khuẩn Stenotrophomonas 23

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Thời gian và địa điểm 25

3.2 Đối tượng khảo sát và số lượng mẫu 25

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Nội dung 1: Phân lập các giống vi khuẩn Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Stenotrophomonas 27

3.3.1.1 Vật liệu thí nghiệm 27

3.3.1.2 Phương pháp tiến hành 28

3.3.2 Nội dung 2: Thực hiện kháng sinh đồ trên các giống vi khuẩn phân lập được32 3.3.2.1 Các loại kháng sinh được sử dụng 32

3.3.2.2 Phương pháp tiến hành 32

3.3.3 Nội dung 3: Xác định mối liên hệ đề kháng kháng sinh với sự hiện diện của

integron lớp 1 và integron lớp 2 34

3.3.3.1 Vật liệu được dùng trong phương pháp PCR 34

3.3.3.2 Phương pháp PCR xác định sự hiện diện của integron ở các giống vi khuẩn 35

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn 38

4.1.1 Tỉ lệ phát hiện vi khuẩn Acinetobacter trong môi trường đất và nước 38

4.1.2 Tỉ lệ phát hiện vi khuẩn Aeromonas trong môi trường nước 39

4.1.3 Tỉ lệ phát hiện vi khuẩn Pseudomonas trong môi trường đất và nước 40

4.1.4 Tỉ lệ phát hiện vi khuẩn S maltophilia trong môi trường đất 41

4.1.5 Tỉ lệ phát hiện bốn giống vi khuẩn ở các vùng địa lý khác nhau 42

4.2 Mức độ mẫn cảm kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 44

4.2.1 Mức độ mẫn cảm kháng sinh của các gốc vi khuẩn Acinetobacter 45

4.2.2 Mức độ mẫn cảm kháng sinh của các gốc vi khuẩn Aeromonas 47

4.2.3 Mức độ mẫn cảm kháng sinh của các gốc vi khuẩn Pseudomonas 50

4.2.4 Mức độ mẫn cảm kháng sinh của các gốc vi khuẩn S maltophilia 53

4.2.5 Mức độ đề kháng với các loại kháng sinh của bốn giống vi khuẩn 54

4.3 Mối liên hệ đề kháng kháng sinh với integron lớp 1 và integron lớp 2 56

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Đề nghị 59

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APHA American Public Health Association

APUA The Alliance for Prudent Use of Antibiotic

ATCC America type culture collection

Cat Chloramphenicol acetyltransferase

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

DHFR Dihydrofolate reductase

DHPS Dihydropteroate synthase

FAO Food and Agriculture Organization

MIC Minimal Inhibitory Concentration

MRSA Methicillin–resistance Staphylococcus aureus

MRSE Methicillin–resistance Staphylococcus epidermidis

PBP Penicillin binding protein

PCR Polymerase Chain Reaction

Tn Transposon

XDRSM Extensively drug-resistant S maltophilia

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Bốn phương thức lan truyền đề kháng kháng sinh của vi sinh 4

Hình 2.2: Integron lớp 1 và gene cassette (Võ Thị Trà An, 2005) 17

Hình 3.1: Cách lấy mẫu nước 26

Hình 3.2: Cách lấy mẫu đất 26

Hình 3.3: Đối chứng dương của integron lớp 1 và integron lớp 2 36

Hình 4.1: Vi khuẩn Pseudomonas với sự hiện diện của integron lớp 1 58

Hình 4.2: Gene casstte trong integron lớp 1 của vi khuẩn Pseudomonas 58

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các gene cassette chèn vào integron lớp 1 19 Bảng 3.1: Số lượng mẫu nước được thu thập trong nghiên cứu 27 Bảng 3.2: Số lượng mẫu đất được thu thập trong nghiên cứu 27

Bảng 4.1: Tỉ lệ phát hiện vi khuẩn Acinetobacter trong môi trường nước và đất 38 Bảng 4.2: Tỉ lệ phát hiện vi khuẩn Aeromonas trong các loại môi trường nước 39 Bảng 4.3: Tỉ lệ phát hiện vi khuẩn Aeromonas vào mùa nắng và mùa mưa 40 Bảng 4.4: Tỉ lệ phát hiện vi khuẩn Pseudomonas trong các loại môi trường nước và

đất 41

Bảng 4.5: Tỉ lệ phát hiện vi khuẩn Stenotrophomonas trong môi trường đất được

trồng các loại rau khác nhau 42

Bảng 4.6: Mức độ mẫn cảm kháng sinh của các gốc vi khuẩn Acinetobacter (n=64)

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Qui trình phân lập Aeromonas và Pseudomonas từ mẫu nước 29

Sơ đồ 3.2: Qui trình phân lập Acinetobacter và Pseudomonas từ đất và nước 30

Sơ đồ 3.3: Qui trình phân lập S maltophilia từ mẫu đất 31

Sơ đồ 3.4: Quy trình nhiệt của phản ứng int1–PCR 35

Sơ đồ 3.5: Quy trình nhiệt của phản ứng int2–PCR 36

Sơ đồ 3.6: Qui trình nhiệt phản ứng CS – PCR 36

BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Tỉ lệ phát hiện Acinetobacter, Aeromonas và Pseudomonas trong môi trường nước ở các vùng khác nhau 43

Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ phát hiện Acinetobacter, Pseudomonas và Stenotrophomonas trong môi trường đất ở các vùng khác nhau 43

Biểu đồ 4.3: Mức độ đề kháng kháng sinh của 4 giống vi khuẩn 44

Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ đề kháng với các kháng sinh thử nghiệm của vi khuẩn Acinetobacter phân lập từ mẫu nước và đất 47

Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ đề kháng với các kháng sinh thử nghiệm của vi khuẩn Acinetobacter phân lập từ các nguồn nước 47

Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ đề kháng với các kháng sinh thử nghiệm của vi khuẩn Aeromonas phân lập từ các nguồn nước 50

Biểu đồ 4.7: Tỉ lệ đề kháng với các kháng sinh thử nghiệm của vi khuẩn Pseudomonas phân lập từ mẫu nước và đất 52

Biểu đồ 4.8: Tỉ lệ đề kháng với các kháng sinh thử nghiệm của vi khuẩn Pseudomonas phân lập từ các nguồn nước 52

Biểu đồ 4.9: Số gốc vi khuẩn của 4 giống nghiên cứu có biểu hiện đa đề kháng với số kháng sinh thử nghiệm 55

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam cũng như một số nước trong khu vực, kháng sinh được mua bán

tự do, việc sử dụng thuốc kháng sinh chưa được kiểm soát đầy đủ, sự hiểu biết của người sử dụng về thuốc kháng sinh cũng bị hạn chế (Vo Thi Tra An, 2007) Trong chăn nuôi (heo, gà…) và nuôi trồng thủy sản (tôm, cá), kháng sinh được trộn vào thức ăn thường xuyên với mục đích phòng bệnh và kích thích tăng trọng Khi có dịch bệnh xảy ra, kháng sinh cũng được sử dụng với số lượng lớn và nồng độ cao hơn để phòng trị những bệnh nhiễm trùng kế phát do những vi khuẩn cơ hội gây ra

Vi khuẩn Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Stenotrophomonas phân

bố rộng rãi trong thiên nhiên (đất, nước, thực vật…) Chúng là tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện do đa đề kháng thuốc kháng sinh, nhiễm trùng cơ hội ở đường hô hấp, gây nhiễm trùng máu và viêm màng não (Bergogne-Berezin và Towner, 1996; Wroblewska và cs, 2004; Quinn và cs, 1998)

Có nhiều cơ chế gây đề kháng kháng sinh như integron, plasmid, transposon Integron là một hệ thống bẫy bắt gene, chủ yếu là các gene đề kháng kháng sinh Integron được tìm thấy trên transposon, plasmid và nhiễm sắc thể Có 5 lớp integron, trong đó integron lớp 1 và lớp 2 có liên quan đến đề kháng kháng sinh và đóng vai trò quan trọng trong sự lan tràn của đề kháng kháng sinh (Fluit và Schmitz, 2004; Võ Thị Trà An, 2005)

Nhằm mục tiêu xác định kiểu hình đề kháng kháng sinh và sự hiện diện

integron của các giống vi khuẩn (Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Stenotrophomonas) được phân lập từ đất và nước, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài “Đề kháng kháng sinh và integron của bốn giống vi khuẩn phân lập từ đất

và nước” dưới sự hướng dẫn của TS Võ Thị Trà An

Đề tài này là một phần trong nghiên cứu của APUA (the Alliance for Prudent Use of Antibiotic) APUA là một tổ chức phi chính phủ với chức năng nghiên cứu, giáo dục và kiểm soát sử dụng kháng sinh

1.2 Mục tiêu

- Xác định kiểu hình đề kháng kháng sinh của các giống vi khuẩn

Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Stenotrophomonas phân lập được

- Xác định mối liên hệ giữa đề kháng kháng sinh với sự hiện diện của integron lớp 1 và integron lớp 2

1.3 Yêu cầu

- Thu thập mẫu, phân lập, định danh và giữ gốc các giống vi khuẩn

Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Stenotrophomonas từ môi trường chăn

nuôi (nước thải trực tiếp từ trang trại, nước ao nuôi cá, đất trồng rau được tưới bằng nước thải chăn nuôi hoặc sử dụng phân chuồng ) tại các tỉnh Đồng Nai, Tp Hồ Chí Minh, Long An, Bình Dương, Tiền Giang

- Thực hiện kháng sinh đồ với các giống vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch

- Thực hiện PCR (Polymerase Chain Reaction) để xác định sự hiện diện của integron lớp 1 và integron lớp 2 từ các giống vi khuẩn phân lập được

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Vi khuẩn trong môi trường

2.1.1 Vai trò của vi khuẩn trong môi trường

Vi khuẩn có nhiều vai trò quan trọng và nhiều tác hại trong môi trường sống của chúng ta, chúng có khắp mọi nơi trong môi trường (đất, nước ) Chúng tham gia vào quá trình hình thành đất trồng trọt, phân hủy, chuyển hóa các hợp chất bền vững thành các hợp chất đơn giản hơn và các chất dinh dưỡng cung cấp cho cây

trồng (vi khuẩn Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas spp sẽ chuyển hóa NH3

và O2 trong đất thành các muối nitrite và nitrate) Các hợp chất chứa lưu huỳnh được các nhóm vi khuẩn tự dưỡng không sinh nha bào chuyển hóa thành H2SO4 sau

đó sẽ phản ứng với các baz trong đất tạo thành sunfat Một số vi khuẩn có khả năng đồng hóa N2 không khí làm giàu dinh dưỡng N2 cho đất, cung cấp dinh dưỡng N2

cho cây trồng tạo nốt sần của cây như vi khuẩn Azobacter, Bacterium radicicola

(Nguyễn Xuân Thành và cs, 2004)

Vi khuẩn trong nước có nguồn gốc từ đất và chất thải Khi nước ngấm xuống đất thì phần lớn vi khuẩn trong nước bị tách ra do tác dụng lọc của đất nhưng không hoàn toàn Do đó nước ở sâu trong đất, nước dưới đáy sâu các giếng, hồ, sông đều

có mang vi khuẩn Vi khuẩn có tác dụng phân hủy các chất độc hại, các chất thải công nghiệp, nông nghiệp, làm sạch môi trường như trong nước thải chứa dầu có sự

hiện diện của vi khuẩn Nocardia, Pseudomonas phân giải hydrocarbon, trong

nước thải sinh hoạt do chứa nhiều chất hữu cơ giàu dinh dưỡng nên có các vi khuẩn

gây thối như Enterobacter cloacae, Pseudomonas fluorecens, Psedomonas aeruginosa Ngoài ra P fluorecens còn là vi khuẩn nitrate hóa có khả năng phân

giải Ca3(PO4)2 và bột apatit (Nguyễn Xuân Thành và cs, 2004)

Đất và nước cũng là môi trường tồn giữ các vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc Các vi khuẩn gây bệnh từ nguồn chất thải của con người và động vật rất dễ

bị nhiễm vào môi trường nhất là những vi khuẩn cơ hội (Acinetobacter, Aeromonas,

E coli, Pseudomonas, Staphylococcus ) gây nguy hiểm trong việc tồn trữ, phát tán

và lan truyền gene đề kháng kháng sinh vào môi trường bởi các yếu tố (plasmid, transposon, integron) Có nhiều nguyên nhân gây ra sự đề kháng kháng sinh của các

vi khuẩn môi trường Một trong số đó là do việc sử dụng kháng sinh để phòng và điều trị bệnh nhiễm khuẩn ở người và động vật một cách bừa bãi nên xuất hiện nhiều giống vi khuẩn đề kháng kháng sinh thải vào nguồn nước hoặc theo phân chuồng vào đất (Nguyễn Xuân Thành và cs, 2004; Baquero, 2008)

2.1.2 Phương thức lan truyền đề kháng kháng sinh của vi khuẩn trong môi trường

Hình 2.1: Bốn phương thức lan truyền đề kháng kháng sinh của vi sinh

vật

Sử dụng kháng sinh

Trong môi trường, vi sinh vật có 4 phương thức lan truyền tính đề kháng kháng sinh (1) từ vi sinh vật của con người với vi sinh vật của động vật (2) giữa các

vi sinh vật của bệnh viện, cơ sở chăm sóc sức khỏe dài hạn, trang trại (3) các vi sinh vật của nước thải có nguồn gốc từ phương thức thứ hai với vi sinh vật nước thải (xử lý thực vật, ủ phân compost ) (4) các vi sinh vật có nguồn gốc từ 3 phương thức trên sẽ trộn lẫn, trao đổi gene và chống lại các vi sinh vật trong môi trường đất, nước trên bề mặt, nước từ môi trường

2.1.3 Bốn giống vi khuẩn môi trường được nghiên cứu

thành bào tử, không di động (Holt, 1994) Acinetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt

buộc, phát triển được ở nhiệt độ từ 20 – 300C (nhiệt độ thích hợp 33 – 350C)

Acinetobacter có các đặc tính sinh hóa catalase (+), oxidase (-), TSI (đỏ/ nguyên chất), nitrate (-), indol (-), urease (-), citrate (+) (APUA, 2009) Acinetobacter phân

bố rộng rãi trong thiên nhiên (đất, nước và nước thải) Chúng còn được biết là tham gia vào quá trình phân hủy sinh học, lọc và loại bỏ một số chất thải hữu cơ và vô cơ

nguy hại do con người thải ra (Holt, 1994; Haleem, 2003) Acinetobacter là tác

nhân gây nhiễm trùng ở nhiều bệnh viện, nhiễm trùng cơ hội do sử dụng ống thông nội mạch và đường hô hấp ở những bệnh nhân được chăm sóc đặc biệt và chúng đã gây dịch viêm màng não ở 7 bệnh nhân nằm viện (Cisneros và Rodriguez-Ban, 2002; Wroblewska và cs, 2004)

2.1.3.2 Vi khuẩn Aeromonas

Aeromonas thuộc họ Vibrionaceae, giống Aeromonas Chúng được chia làm

2 nhóm là nhóm không di động, ưa lạnh A salmonicida (A salmonicida, A masoucida…) và nhóm di động, ưa ấm A hydrophila (A caviae, A sobria, A

hydrophila…) (Collins và Lyne, 1989; FAO, 1992) Vi khuẩn Gram âm, trực khuẩn

nhỏ, di động bởi 1 tiên mao, kích thước 0,3 - 1,0 µm x 1,0 - 3,5 µm, tồn tại dưới

dạng đơn, bắt cặp hoặc chuỗi ngắn (Holt, 1994; Collins và Lyne, 1989) Aeromonas

là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi Nhiệt độ thuận lợi cho sự phát triển của

vi khuẩn là 22 – 280C (nhóm A salmonicida), ở 370C (nhóm A hydrophila) Khuẩn lạc trên môi trường Aeromonas Agar (AA) có dạng tròn lớn với kích thước 0,5 – 3

mm, đục, hơi hồng (Holt, 1994; Collins và Lyne, 1989; APUA, 2009) Aeromonas

có thể lên men các loại đường như glucose, manitol, succrose, arabinose Một số phản ứng sinh hóa đặc trưng là catalase (+), oxidase (+), TSI (đỏ/vàng), arginine dihydrolase (+), ornithine decarboxylase (-), urease (-), gelatinase và DNase (+)

(Holt, 1994) Aeromonas là vi khuẩn cư trú trong môi trường nước tự nhiên trên

toàn thế giới Chúng có mặt trong nước vào tất cả các mùa, nhưng mật độ nhiều nhất vào những tháng nước ấm Chúng có thể được phân lập từ nguồn nước ao nuôi

cá, nước sông, nước ao hồ, nước bề mặt, nước thải, nước thải trong sinh hoạt… Đây

cũng là vi khuẩn có thể gây bệnh cơ hội trên cá Hai loài Aeromonas gây bệnh trên

cá nước ấm là A hydrophila và A sobria; A salmonicida gây bệnh ung nhọt trên

cá hồi Ở cá, Aeromonas gây xuất huyết trên vây, da, bụng căng phồng và mắt lồi (Francis - Floyd, 2009; APHA, 1999) Ở người, Aeromonas gây nhiễm trùng (nhiễm

trùng vết thương) và bệnh cơ hội (tiêu chảy, nhiễm trùng huyết, viêm màng não)

A hydrophila nhiễm vào nguồn nước uống có thể gây tiêu chảy cho khách đi du lịch do vi khuẩn sản sinh enterotoxin… Nhóm A hydrophila gây ngộ độc thực

phẩm chưa được nghiên cứu rõ ràng nhưng chúng vẫn có thể phát triển ở nhiệt độ

đông lạnh, khoảng 13 % bệnh viêm dạ dày, ruột được cho là do Aeromonas (Collins

và Lyne, 1989; FAO, 1992)

2.1.3.3 Vi khuẩn Pseudomonas

Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadaceae Vi khuẩn này gồm P aeruginosa (P alcaligenes, P anguilliseptica, P argentinensis, P borbori, P citronellolis, P flavescens, P mendocina, P nitroreducens, P oleovorans, P pseudoalcaligenes, P resinovorans, P straminea), P fluorescens (P antarctica, P azotoformans, P brassicacearum, P brenneri, P cedrina, P corrugata, P fluorescens, P gessardii,

P libanensis, P mandelii, P marginalis, P mediterranea, P meridiana, P migulae, P mucidolens, P orientalis, P panacis, P proteolytica, P rhodesiae, P synxantha, P thivervalensis, P tolaasii, P veronii), P putida (P cremoricolorata,

P fulva, P monteilii, P mosselii, P oryzihabitans, P parafulva, P plecoglossicida,

P putida), P stutzeri (P balearica, P luteola, P stutzeri) Pseudomonas là trực

khuẩn thẳng hoặc hơi cong, nhưng không xoắn ốc, đường kính 0,5 – 1,0 µm, dài 1,5 – 5,0 µm Vi khuẩn Gram âm, di động bởi một hay nhiều tiên mao, hiếm khi không

di động (Holt, 1994) Đây là những vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, dễ dàng nuôi cấy trên các môi trường thông thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu Nhiệt độ thích hợp để vi khuẩn phát triển từ 30 – 370C (chúng có thể phát triển ở 420C) Vi khuẩn

phát triển ở pH từ 7,2 – 7,5 P aeruginosa có thể phát triển trên môi trường kị khí

Chúng tăng trưởng được trên môi trường nghèo dinh dưỡng chỉ gồm khoáng và một nguồn cacbon thích hợp duy nhất như acetate, pyruvate, succinate, glucose, 2-ketogluconate, L-valine, β-alanine, DL-arginine Trong môi trường ít chất dinh

dưỡng thì P aeruginosa vẫn có thể sống được Vì vậy người ta còn tìm thấy chúng

trong nước tinh khiết, nước uống đóng chai (Trần Linh Thước, 2004; APUA, 2009)

Pseudomonas không lên men đường lactose, lên men không sinh hơi glucose Một

số phản ứng sinh hóa oxidase (+), catalase (+), TSI (đỏ/đỏ), indol (-), H2S ), MR

(-), VP (-(-), nitrate (+(-), citrate (+(-), đa số di động trừ P mallei không di động do không

có tiên mao, có khả năng tan chảy gelatin (Holt, 1994; Nguyễn Năng Thiện, 1996)

Pseudomonas là vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên động vật gồm hai loài chính P aeruginosa và P pseudomallei Vi khuẩn P mallei, P aeruginosa và P pseudomallei hiện diện trong đất và nước P aeruginosa có mặt khắp mọi nơi trên

thế giới nhưng chúng không phát triển ở những vùng nước biển vì nồng độ muối cao trong nước biển được xem là yếu tố ức chế sự phát triển của chúng

(Vasconcelos và Swartz, 1976) P pseudomallei chỉ có ở những vùng nhiệt đới P fluorescens chỉ có trong đất và nước, chúng làm hư hỏng thực phẩm và có liên quan

đến một số bệnh ở loài bò sát và cá (Quinn và cs, 1999)

Một số loài gây bệnh đặc trưng của Pseudomonas

P aeruginosa có thể tiết ra 4 loại sắc tố: Pyocyanin là sắc tố có màu xanh lơ,

có thể tan trong nước, không phát huỳnh quang và đây là vi khuẩn duy nhất tiết ra pyocyanin Pyoverdin có màu xanh lá cây, phát huỳnh quang dưới tia cực tím nên còn gọi là fluorescein Pyorubin có màu đỏ sẩm và pyomelanin có màu nâu đen

P pseudomallei: còn gọi là trực khuẩn Whitmore bao gồm P mallei, P

pseudomallei, P cepacia mọc ở môi trường muối kiềm Chúng thường được phân

lập từ đất và nước ở vùng có dịch bệnh Vi khuẩn gây bệnh khi da bị rách hay dập nát sau chấn thương (Nguyễn Năng Thiện, 1996)

2.1.3.4 Vi khuẩn Stenotrophomonas

Stenotrophomonas gồm các loài S maltophilia, S koreenis, S dokdonensis Pseudomonas maltophilia được gọi là Xanthomonas maltophilia (Swings và cs,

1981) và được đổi thành Stenotrophomonas maltophilia (Palleroni và cs, 1993) Vi

khuẩn Gram âm, thẳng hay hơi cong, kích thước 0,5 – 1 µm, tồn tại ở dạng đơn

hoặc bắt cặp S maltophilia là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, không phát triển được ở

nhiệt độ dưới 50C hoặc cao hơn 400C, phát triển thích hợp ở 350C (Denton và Kerr, 1998) Trên môi trường CHROMagar™ Acinetobacter, khuẩn lạc nhỏ, lồi, đục, màu

đỏ, rìa mờ sau 48 giờ ủ ở nhiệt độ 300C Nếu để lâu hơn ở nhiệt độ 300C hoặc nhiệt

độ phòng thì khuẩn lạc sẽ trở nên có màu tối, tím xanh S maltophilia phát triển tốt

trên môi trường MCK với khuẩn lạc nhỏ, tròn, không màu và cũng phát triển trên thạch máu sau khi ủ ở 350C trong 18 – 24 giờ (APUA, 2009) S maltophilia đề

kháng với imipenem và cần có methionine cho sự phát triển Một số phản ứng sinh hóa đặc trưng oxidase (-), catalase (+), esculin hydrolysis (+), gelatin hydrolysis (+), DNase (+), ONPG (+), urease (-) (APUA, 2009)

S maltophilia là vi khuẩn phổ biến sống tự do trong môi trường như nước, đất, thực phẩm đông lạnh, rễ thực vật (Palleroni và cs, 1993) Ở người, S maltophilia ngày càng được công nhận là nguyên nhân quan trọng của bệnh nhiễm

trùng Chúng là tác nhân gây bệnh cơ hội ở những bệnh nhân suy nhược cơ thể, gây nhiễm trùng máu và viêm phổi đối với những người suy giảm miễn dịch, chúng tồn

tại trên bề mặt của thiết bị y tế và có thể gây bệnh cho những người nằm viện, chúng kháng lại nhiều thuốc kháng sinh và gây nhiễm trùng bệnh viện Chúng đề

kháng tự nhiên với imipenem bởi vì sản xuất imipenemase S maltophilia cũng kháng hầu hết với các kháng sinh β – lactam vì nó tiết enzyme β – lactamase

(Denton và Kerr, 1998; Bollet và cs, 1995; Looney và cs, 2009)

2.2 Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh

2.2.1 Kháng sinh

Kháng sinh là những chất hóa học có nguồn gốc sinh học hay tổng hợp, tác động một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu trong sự chuyển hóa của các vi khuẩn hay nấm Hệ số trị liệu của kháng sinh rất cao, có khả năng ức chế vi sinh vật (bacteriostatic) hoặc tiêu diệt chúng (bactericidal) ngay ở liều nhỏ (Huỳnh Kim Diệu, 2010)

2.2.2 Đề kháng kháng sinh

Mặc dù việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho người và thú đem lại nhiều thành công và có hiệu quả kinh tế, việc dùng kháng sinh đã đồng thời tạo nên một áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn Việc dùng kháng sinh sẽ luôn tạo ra

sự đề kháng với chính nó ở một mức độ nhất định trong quần thể vi khuẩn Bằng chứng rõ ràng nhất là khi kiểm tra các giống vi khuẩn thời tiền kháng sinh, các nhà khoa học không phát hiện ra sự đề kháng với kháng sinh cũng như bất kỳ gene liên quan đến tình trạng đề kháng thường gặp ở các giống vi khuẩn đương thời Áp lực chọn lọc đối với sự đề kháng kháng sinh xuất phát từ nhiều nguồn như việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho động vật và thực vật, kháng sinh dùng với mục đích kích thích tăng trọng trong thức ăn gia súc

Hiện tượng đề kháng kháng sinh đang ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm của toàn xã hội Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết các kháng sinh dùng trong lâm sàng Hơn thế nữa, các giống vi khuẩn không gây bệnh nhưng

đề kháng kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác (Võ Thị Trà An, 2007)

2.2.2.1 Cơ chế đề kháng kháng sinh

Theo Byarugaba (2010), trước những năm 1990, đề kháng kháng sinh chưa được xem là mối đe dọa đối với các nhà quản lý bệnh truyền nhiễm Tuy nhiên, sự thất bại trong điều trị và hiện tượng đề kháng với một hay nhiều hơn hai loại thuốc đang càng tăng lên Để sống sót được vi sinh vật phải đề kháng với sự tác hại của thuốc Sự đề kháng kháng sinh đã được ghi nhận với các cơ chế như sản xuất enzyme làm vô hoạt kháng sinh, tạo ra enzyme thay thế cho enzyme mà kháng sinh tác động vào, đột biến ở điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận, sửa đổi điểm tiếp nhận để giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận, giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn, đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào giảm, tạo quá nhiều điểm gắn kết với kháng sinh

Đề kháng kháng sinh nhóm β–lactam

Sự đề kháng xảy ra do (1) sự hiện diện của enzyme β–lactamase làm hư

hỏng vòng lactam hoặc sự hiện diện của các enzyme thay thế PBP (penicillin

binding protein) của vi khuẩn mà penicillin không gắn kết được (2) các β– lactamase có thể được phân loại dựa vào khả năng thủy phân của các cơ chất thuộc

kháng sinh beta–lactam và mức độ bị ức chế bởi acid clavulanic, nhưng các đột biến điểm đơn giản có thể làm thay đổi sự phân loại này (3) các enzyme thay thế PBP

liên quan đến sự đề kháng với methicillin ở staphylococci, Streptococcus pneumonia MRSA (methicillin–resistance Staphylococcus aureus) và MRSE (methicillin–resistance Staphylococcus epidermidis) đều là những tác nhân gây

nhiễm trùng bệnh viện Điều trị các nhiễm trùng này rất khó vì cả MRSA và MRSE

thường đa đề kháng và chỉ nhạy với một số ít kháng sinh (Võ Thị Trà An, 2010)

Đề kháng với kháng sinh nhóm aminoglycoside

Các aminoglycoside bị vô hoạt bởi (1) các enzyme (aminoglycoside phosphotransferase–APH, sử dụng ATP để phosphoryl hóa các nhóm hydroxyl

chuyên biệt; aminoglycoside acetyltransferase–AAC, sử dụng acetyl CoA để điều chỉnh nhóm amino chuyên biệt và aminoglycoside adenyltransferase-ANT, sử dụng

ATP để adenyl hóa các nhóm hydroxyl chuyên biệt) (2) tế bào mục tiêu bị thay đổi như ribosome bị sửa đổi do đột biến ở protein S12 của tiểu đơn vị 30S (3) sự thay đổi khả năng thẩm thấu kháng sinh vào tế bào Trong đó, sự vô hoạt kháng sinh bởi các enzyme giữ vai trò quan trọng nhất Vi khuẩn có mang các yếu tố đề kháng này

có thể đề kháng với 1 hoặc vài kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside Đề kháng với aminoglycoside phổ biến ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Võ Thị Trà

An, 2010)

Đề kháng với kháng sinh nhóm polypeptide: sự đề kháng với kháng sinh

nhóm này rất hiếm xảy ra (chỉ xảy ra đối với P aeruginosa do vi khuẩn giảm tính

thẩm thấu với thuốc) (Huỳnh Kim Diệu, 2010)

Đề kháng với kháng sinh nhóm tetracycline

Thông qua hệ thống bơm thoát dòng (Tet A, B, C, D, E, H, G ), kháng sinh

từ trong tế bào được đẩy ra ngoài nên làm giảm nồng độ kháng sinh trong tế bào chất của vi khuẩn

Thông qua các protein có khả năng bảo vệ ribosome (TetO, M, Q, X ), từ đó kháng sinh không gắn kết được với ribosome

Các nhân tố đề kháng với tetracycline bằng 2 cơ chế này đã được phát hiện ở

cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm Các nhân tố đề kháng này hiện diện ở cả chromosome và plasmid của vi khuẩn Tuy nhiên, một cơ chế khác cũng được mô tả

bao gồm gene tetX mã hóa cho một enzyme làm thay đổi phân tử tetracycline Gene tetB liên quan đến đề kháng tetracycline, doxycycline và minocycline thông qua

protein bảo vệ ribosome trong khi những gene thoát dòng chỉ liên quan đến tetracycline và doxycycline (Võ Thị Trà An, 2010)

Đề kháng với kháng sinh nhóm sulfonamide và diaminopyrimidine

Đề kháng với sulfonamide do đột biến điểm ở chromosome xảy ra chậm và

có thể cản trở sự xâm nhập của thuốc vào tế bào vi khuẩn hoặc tạo thành các

enzyme dihydropteroate không nhạy cảm, hoặc sản xuất quá nhiều PABA Đề

kháng thông qua plasmid phổ biến hơn với các dihydropteroate synthase (DHPS) đề

kháng với sulfonamide

Đề kháng với trimethoprim qua gene nằm trên chromosome có thể qua việc

sản xuất quá mức dihydrofolate reductase (DHFR) hoặc những đột biến trên gene folA mã hóa cấu trúc của DHFR hoặc đột biến gây bất hoạt thymidylate synthetase

Đề kháng với trimethoprim thường gặp ở Enterobacteria khi chúng thu nhận gene (dfr) mã hóa cho enzyme DHFR đề kháng với trimethoprim do vị trí hoạt động bị

biến đổi

Sự đề kháng phổ biến của các giống vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae

với sulfonamide hoặc với sulfonamide/trimethoprim phải kể đến là do có mang integron, đặc biệt là integron lớp 1 Hầu hết các integron lớp 1 có mang gene kháng

sulfonamide (sulI) và trong nhiều trường hợp gene kháng trimethoprim (dfr) là một

trong những gene cassette chèn vào integron Khi ấy, vi khuẩn kháng cả sulfonamide và trimethoprim Nhiều nghiên cứu cho thấy các giống vi khuẩn mang integron thường đa đề kháng với nhiều kháng sinh khác nữa (Võ Thị Trà An, 2010)

Đề kháng với kháng sinh nhóm fluoroquinolone

Đột biến điểm tại các gene mã hóa cho enzyme DNA gyrase dẫn đến giảm

gắn kết của kháng sinh với enzyme là một trong những cơ chế dẫn đến đề kháng với

quinolone gặp ở cả vi khuẩn Gram âm, Gram dương và Mycobacterium spp

Đề kháng với kháng sinh nhóm phenicol

Sự đề kháng với chloramphenicol chủ yếu do sự bất hoạt kháng sinh bởi

enzyme acetyltransferase Enzyme này mã hóa bởi gene cat (chloramphenicol acetyltransferase) và có khả năng acetyl hóa 2 nhóm hydroxyl của

chloramphenicol Ở vi khuẩn Gram âm, đề kháng với chloramphenicol còn do đột biến ở chromosome dẫn đến giảm thẩm thấu của kháng sinh này qua màng tế bào

Đề kháng thông qua cơ chế giảm thể hiện porin màng tế bào OmpA và OmpC

(outer membrane porin) cũng đã được phát hiện ở P aeruginosa (Võ Thị Trà An,

2005)

2.2.2.2 Phân loại đề kháng kháng sinh

Đề kháng tự nhiên (instrinsic resistance): Bản thân vi khuẩn bình thường

đã có sẵn những enzyme hay một chất nào đó có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh Có thể vi khuẩn không có vị trí công kích, điểm tác động của chất kháng sinh Ví dụ, các vi khuẩn Gram âm không chịu tác dụng của penicillin (Bùi Thị Tho, 2003)

Đề kháng thu nhận (acquired resistance): Sự đề kháng thu nhận xuất hiện

trong quần thể vi khuẩn nhạy với kháng sinh do có sự biến đổi về di truyền trong quần thể đó

Đề kháng do đột biến nhiễm sắc thể chiếm tỉ lệ 10 – 20 % trong đề kháng thu nhận, vi khuẩn có được yếu tố kháng thuốc trong quá trình sống do quá trình tích lũy đột biến ngẫu nhiên xảy ra một cách từ từ Sự đột biến nhiễm sắc thể thường do

sử dụng kháng sinh liều thấp và gián đoạn (Huỳnh Kim Diệu, 2010)

Ngoài ra, đề kháng thu nhận còn do vi khuẩn thu nhận các cơ chế nằm ngoài nhiễm sắc thể như thu nhận gene plasmid, chiếm tỉ lệ cao đến 80 – 90% Đó là hiện tượng thu nhận thêm mã di truyền tạo cho vi khuẩn có thêm những tính chất mới trong đó có tính đề kháng với kháng sinh

Plasmid là các phân tử DNA nhỏ không thuộc nhiễm sắc thể (ở ngoài nhân),

có khả năng nhân đôi độc lập, có nhiều gene và mỗi gene xác định tính đề kháng đối với một loại kháng sinh Vì vậy mỗi plasmid có khả năng đề kháng với nhiều loại kháng sinh cùng lúc Một điều nguy hiểm là plasmid có khả năng trao đổi giữa các

vi khuẩn không phân biệt loài này hay họ khi có sự tiếp xúc giữa các vi khuẩn với nhau nên gia tăng tỉ lệ và tốc độ đề kháng một cách đáng kể

Giữa các vi khuẩn với nhau, gene kháng thuốc có thể được trao đổi qua 3 cách: Tải nạp (transduction) là quá trình DNA được thực khuẩn thể sát nhập và chuyển cho một vi khuẩn khác Biến đổi hay còn gọi là chuyển dạng (transformation) là quá trình một đoạn DNA trần (có nguồn gốc từ một vi khuẩn chết) đi vào một tế bào vi khuẩn và gắn vào các yếu tố di truyền của vi khuẩn đó nhờ tương đồng nhiễm sắc thể Tiếp hợp (conjugation) là quá trình tế bào vi khuẩn

cho (donor) tổng hợp lông giới tính (sex pili) và gắn vào tế bào vi khuẩn nhận (recipient) Từ cầu nối này, một bản sao gene kháng thuốc nằm trên plasmid được chuyển cho vi khuẩn nhận

Trong quá trình tải nạp, vi khuẩn cần có điểm tiếp nhận phù hợp với phage trên bề mặt của chúng Trong tiến trình biến đổi, DNA phải chèn vào bộ gene nhờ tương đồng về di truyền Như vậy, với cả hai tiến trình này, vi khuẩn phải tương đồng về di truyền để sự tái tổ hợp có thể xảy ra Dạng trao đổi này chỉ có thể xảy ra

ở những loài vi khuẩn có mối liên hệ về di truyền Trong khi đó tiến trình tiếp hợp

không có giới hạn này (Võ Thị Trà An, 2007)

2.3.1.2 Phương pháp khuếch tán trên thạch

Nguyên lý: Các giống vi khuẩn khác nhau có độ nhạy cảm với các loại kháng sinh ở mức độ khác nhau và chúng biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh có chứa một đậm độ xác định khi có sự tiếp xúc giữa vi khuẩn–kháng sinh

Mục đích: Phương pháp kháng sinh đồ giúp ta tìm hiểu tính kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh, giúp cho phương hướng điều trị lâm sàng đúng với những kháng sinh đặc hiệu Từ đó, chúng góp phần đánh giá tình hình kháng thuốc của vi khuẩn ở các địa điểm và thời gian khác nhau; xác định sớm sự xuất hiện, lan

rộng những vi khuẩn kháng thuốc Kháng sinh đồ không chỉ rất quan trọng trong nghiên cứu dịch tễ học kháng thuốc mà còn quan trọng trong nghiên cứu các kháng sinh mới

Môi trường nuôi cấy cơ bản dùng để kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh của

vi khuẩn phải là môi trường được chuẩn hoá cao để giúp cho hầu hết các vi khuẩn gây bệnh thông thường mọc tốt (thí dụ môi trường Mueller-Hinton) Môi trường đó phải có sự khác nhau rất nhỏ giữa các mẻ môi trường với nhau Trong đó, không có bất cứ một chất ức chế nào đối với kháng sinh và có khả năng đệm tốt

Loại đĩa petri có đường kính 9 cm thường được sử dụng Chúng phải có đáy phẳng Các đĩa có thể được làm bằng chất dẻo hoặc thuỷ tinh trung tính

Các khoanh giấy kháng sinh được bảo quản trong hộp riêng Các khoanh giấy dự trữ phải giữ ở –20oC Các khoanh giấy làm hàng ngày được giữ ở 2 - 8oC tuỳ theo sự chỉ dẫn của hãng sản xuất và phải được để thăng bằng 30 phút ở nhiệt

độ phòng trước khi sử dụng

Độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 được làm bằng cách lấy 0,5 ml BaCl2 nồng độ 0,048 M (1,175% BaCl2.2H2O) pha đều với 99,5 ml H2SO4 nồng độ 0,18 M (1 %

H2SO4) Độ đục này tương ứng với khoảng 108 vi khuẩn trong 1ml

Nước muối sinh lý vô trùng được dùng để pha huyễn dịch vi khuẩn Thước thẳng với đơn vị đo (mm) được sử dụng để đo đường kính vòng ức chế vi khuẩn Mức độ mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn được xem xét theo tiêu chuẩn CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)

Kháng sinh đồ nên được tiến hành từ những giống thuần nhất trên môi trường nuôi cấy cơ bản (không chọn lọc) Kháng sinh đồ nên tiến hành càng sớm càng tốt (tránh sự cấy truyền nhiều lần) Thường xuyên thực hiện kiểm tra chất

lượng bằng thử song song với những giống quốc tế như ATCC Escherichia coli

25922, ATCC Staphylococcus aureus 25923, ATCC Streptococcus faecalis 29212, ATCC Pseudomonas aeruginosa 27853, ATCC Haemophilus influenzae 49247, ATCC Streptococcus pneumoniae 49619

Phương pháp khuếch tán trên thạch là một phương pháp dễ thực hiện để thử tính nhạy cảm kháng sinh của những vi khuẩn gây bệnh quan trọng, dễ phát triển và

ưa khí Sự chính xác của phương pháp hoàn toàn phụ thuộc vào việc sử dụng vật liệu chính xác, có chất lượng tốt (môi trường, khoanh giấy) và kỹ thuật thực hiện phép thử chuẩn thức

Giới hạn của phương pháp: Không áp dụng để thử tính nhạy cảm của kháng sinh đối với những vi khuẩn đòi hỏi điều kiện kỵ khí Những vi khuẩn này phát triển chậm và nghèo trên Mueller-Hinton

Những yếu tố ảnh hưởng đến kích thước vòng vô khuẩn bao gồm việc đọc sai khi đo đường kính vòng vô khuẩn, vi khuẩn ngoại lai, mật độ nuôi cấy, không lắc trộn đều huyễn dịch, nhiệt độ ủ không đúng, kháng sinh, môi trường thử, thời gian ủ (CLSI, 2006)

2.3.1.3 Phương pháp pha loãng kháng sinh trong môi trường lỏng

Phương pháp này được sử dụng để xác định mức độ đề kháng hoặc nhạy cảm của vi khuẩn với một loại kháng sinh nào đó Bằng phương pháp này người ta có thể xác định giá trị MIC (Minimal Inhibitory Concentration) của một kháng sinh đối với từng loại vi khuẩn MIC là hàm lượng kháng sinh tối thiểu có thể ức chế sự phát triển của một loại vi khuẩn nhất định trong điều kiện nhất định (nuôi cấy ở 370C/24 giờ)

Nguyên tắc: Ở một nồng độ tối thiểu nhất định, kháng sinh sẽ có tác dụng ức chế không cho vi khuẩn phát triển trên môi trường nuôi cấy

Môi trường: Môi trường canh dinh dưỡng (Nutrient Broth-NB) hoặc môi trường BHI (Beef Heart Infusion) (Nguyễn Ngọc Hải và Nguyễn Thị Kim Loan, 2009)

2.4 Integron và gene cassette

Integron là một hệ thống gene bẫy bắt, được tìm thấy trên plasmid, nhiễm sắc thể và transposon Integron có khả năng nhận biết, bắt giữ một hoặc nhiều gene cassette kháng thuốc Integron được cấu trúc bởi một gene mã hóa integrase và một

vị trí để gene cassette chèn vào Do integron có khả năng thu giữ một hay nhiều

gene cassette, các giống vi khuẩn có mang integron thường là đa đề kháng (đề kháng với nhiều kháng sinh) Gene cassette khác plasmid do thiếu hệ thống sao chép, và khác transposon do thiếu các hệ thống chuyển vị (Vo Thi Tra An, 2007)

Integron có 5 lớp, được chia thành 2 nhóm chính là integron đề kháng và super-integron Cả năm lớp đều có liên quan với DNA di động bao gồm insertion sequence (IS), yếu tố chuyển vị (transposon) và sự tiếp hợp plasmid (Fluit và Schmitz, 2004; Mazel, 2006)

(1) Integron đề kháng bao gồm integron lớp 1, lớp 2 và lớp 3 Chúng là phương tiện truyền vật chất di truyền cho vi khuẩn cùng loài hay khác loài Integron

đề kháng mang tối đa khoảng 10 gene cassette, hầu hết mã hóa cho sự đề kháng kháng sinh và chất sát trùng, chúng có thể nằm trên nhiễm sắc thể và trên plasmid (Mazel, 2006; Võ Thị Trà An, 2005)

(2) Super-integron (integron lớp 4 và lớp 5) chứa trên 100 gene cassette, mã hóa nhiều loại protein với những enzyme hoạt động khác nhau và luôn nằm trên nhiễm sắc thể (Mazel, 2006)

2.4.1 Integron lớp 1

Hình 2.2: Integron lớp 1 và gene cassette (Võ Thị Trà An, 2005)

Integron lớp 1 mã hóa integrase có chiều dài 337 amino acid Integron lớp 1

(Hình 2.2) có đoạn bảo toàn 3’, có mang gene qac liên quan đến đề kháng với chất

sát trùng và gene sul1 mã hóa cho đề kháng sulfonamide Đoạn bảo toàn 5’ mang gene mã hóa integrase, có vai trò chèn và tháo gene cassette và promotor (Võ Thị

Trà An, 2005)

2.4.2 Integron lớp 2

Integron lớp 2 có chiều dài 325 amino acid, được tìm thấy trên transposon Tn7 Tn7 chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn, trao đổi gene từ tế bào vi khuẩn này sang tế bào vi khuẩn khác thông qua sự tiếp hợp của plasmid như trao

đổi gene cassette dfrA1, sat và aadA1 (Hansson và cs, 2002)

Transposon (Tn) là yếu tố di truyền di động, gây đột biến và được gọi là

”gene nhảy” Các transposon đọc mã cho các tính trạng dễ nhận thấy về kiểu hình như tính đề kháng kháng sinh (penicillin, tetracycline ) Sự nhảy hoặc sự chuyển chỗ của một transposon thường không liên quan với việc mất của transposon ở vị trí lắp vào ban đầu mà là kết quả của sự sao chép transposon (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2008)

2.4.3 Gene cassette

Các gene được gọi là các cassette vì chỉ khi chèn vào integron chúng mới có thể biểu hiện được tính trạng đề kháng Gene cassette là một yếu tố di truyền có khả năng di động, thường nhỏ hơn 2 kb, có thể tự tồn tại dưới dạng vòng hoặc có thể hòa nhập vào integron Ở trạng thái tự do, gene cassette là những gene không hoàn chỉnh (thiếu promoter cho quá trình giải mã di truyền) nên chúng không thể hiện tính trạng Cấu trúc của gene cassette gồm một gene mã hóa tính trạng nhất định thường là đề kháng với kháng sinh và một vị trí kết hợp với integron (59-base element) (Vo Thi Tra An, 2007)

Gene cassette không phải là phần tất yếu của integron, nhưng nó trở nên quan trọng sau khi đã chèn vào integron Nhiều gene cassette có thể chèn vào integron Lúc này, mức độ thể hiện kiểu hình của gene cassette sẽ phụ thuộc vào vị

trí của nó so với promotor Mức độ đề kháng cao nhất khi gene đề kháng nằm gần promotor nhất (Võ Thị Trà An, 2005)

Bảng 2.1: Các gene cassette chèn vào integron lớp 1

Đề kháng β-lactam

blaP1(bla PSE-1 ), blaP2, blaP3

bla CEF-1 , bla GES-1 , bla GES-2 , bla IBC-1 , bla IBC-2 , bla VEB-1 , bla VIM-3 , oxa1, oxa2a, oxa2b,

oxa3, oxa5, oxa7, oxa9, oxa20, oxa21, oxa-10, oxa-11, oxa-13, oxa-15, oxa-16,

oxa-17, oxa-18, oxa-19, oxa-28, oxa-31, oxa-32

bla IMP-1, bla IMP-2, bla IMP-3, bla IMP-4, bla IMP-6, bla IMP-7, bla VIM-1, bla VIM-2 , bla ESP

beta-lactamase extended-spectrum β-lactamase

carbapenemase

Đề kháng aminoglycoside

aadA1a, aadA1b, aadA2, aadB, aadA5, aadA6, aadA8, aadA10,

ant(3”)-Ii-aac(6’)-Ia, aac(6’)-Ib, aac(6’)-Id, aac(6’)-Il, aac(6’)-Iq, aacA7, aac(6’)-IIa,

IIb, aac(3)-Ia, aac(3)-Ib, aac(3)-VIa, aac29a, aac29b, aacA1b,

aac(6’)-IId

aphA15

aminoglycoside adenyltransferase aminoglycoside acetyltransferase aminoglycoside phosphotransferase

Đề kháng trimethoprim

Đề kháng chloramphenicol

catB2, catB3, catB5, catB6, catB8

cmlA, cmlA2, cmlB, cmlA4, cmlA5

acetyltransferase Bơm thoát dòng

(Vo Thi Tra An, 2007)

2.5 Những nghiên cứu có liên quan đến nội dung đề tài

2.5.1 Vi khuẩn Acinetobacter

Tại Thổ Nhĩ Kỳ, một nghiên cứu vào năm 1996 về tính nhạy cảm kháng sinh

của 80 gốc Acinetobacter phân lập ở bệnh viện với kết quả nhạy cảm là 5 %

cefotaxime và ceftriaxone, 7,5 % ceftazidime, 11,2 % cefepime, 71,2 % imipenem

Nhưng năm 1997, một nghiên cứu lặp lại khác với 164 gốc Acinetobacter phân lập

tại bệnh viện thì chỉ có 49,3 % nhạy cảm với imipenem (Aksaray và cs, 2000)

Ở Pháp, theo Ploy và cs (2000) phân tích 20 chủng A baumannii đề kháng

với nhiều loại kháng sinh (β-lactam, aminoglycoside, chloramphenicol, sulfonamide ), phát hiện 16 chủng mang integron lớp 1; 2 chủng mang integron lớp 1 và lớp 2; không có chủng nào mang integron lớp 3 Trong 18 chủng mang integron, có 13 chủng được phát hiện chỉ có 1 gene cassette, 5 chủng còn lại không

có sự hiện diện của gene cassette

A baumannii được phân lập từ bệnh nhân ở một bệnh viện đại học tại Ý Bằng phương pháp PCR và giải trình tự DNA, Zarrilli và cs (2004) đã xác định A baumannii đa đề kháng kháng sinh như ampicillin-sulbactam, piperacillin,

piperacillin-tazobactam, ceftazidime, ceftriaxone, aztreonam, amikacin, gentamicin, ciprofloxacin, levofloxacin

Ở Ấn Độ, Oberoi và cs (2009) phân lập 255 chủng Acinetobacter từ 3024

mẫu ở bệnh nhân (dịch cơ thể, máu, nước tiểu…), kết quả nhạy cảm với 66,6 %

amikacin, 95 % cefaperazone/sulbactam 164 chủng A baumannii được phân lập từ

164 bệnh nhân (từ 2001 - 2008) đều đề kháng với carbapenem do vi khuẩn mang

gene blaOXA-58(Papa và cs, 2009)

Ở Tây Ban Nha, vào năm 1997 tại bệnh viện Cajal có 29 bệnh nhân nội trú bị

nhiễm A baumannii đề kháng với imipenem và meropenem (IMRBA) Bằng phương pháp PCR, Bou và cs (2000) đã xác định (OXA-24) mã hóa enzyme thủy

phân carbapenem

Ở Ireland, bằng phương pháp PCR và giải trình tự gene, Boo và cs (2009) đã

xác định A baumannii đề kháng carbapenem do vi khuẩn mang gene β - lactamase OXA-23, blaOXA-23, blaADC-25

Ở Iran, tổng số 67 gốc Acinetobacter (có 21 A baumannii và 46 không phải

A baumannii), bằng phương pháp PCR, Ranjbar và cs (2007) đã xác định A baumannii đề kháng với 11 loại kháng sinh (cefoprazone, ceftazidime, ticarcillin/

clavulanic acid, aztreonam, meropenem, ceftizoxime, carbenicillin, cefixime, ticarcillin, ceftriaxone, cephotaxime) nhưng nhạy cảm với tobramycin, polymixin

B, piperacillin/ tazobactam và colistin

Ở Vương Quốc Anh, Kurcik-Trajkovska (2009) đã phân lập 25 gốc

Acinetobacter gây nhiễm trùng bệnh viện Trong đó, có 17 gốc mang integron lớp 1;

1 gốc mang integron lớp 2; không có gốc nào mang integron lớp 3 Các gene cassette chèn vào các integron đa dạng về số lượng và kích thước Tuy chúng được phân lập từ nhiều nơi khác nhau trên thế giới, có kiểu gene riêng biệt nhưng chúng lại giống nhau do có khả năng tích lũy, di động và tiếp hợp trên nhiễm sắc thể

(Seward và Towner, 1999) Acinetobacter phát triển tính đề kháng sinh do sự tiếp

hợp của plasmid, transposon hoặc integron Những yếu tố này mang 1 cụm gene mã hóa tính đề kháng cho nhiều loại kháng sinh

2.5.2 Vi khuẩn Aeromonas

Urriza và cs (2000) đã phân lập được 138 gốc Aeromonas từ các mẫu nước sông ở Châu Âu Các tác giả này đã ghi nhận sự xuất hiện đề kháng kháng sinh của Aeromonas như nalidixic acid 59 %, tetracycline 14 %, fosfomycin 8 %,

tobramycin and cotrimoxazole 7 %, cefotaxime 4 %, chloramphenicol 2 % và gentamicin 1 %

Abulhamd (2009) đã phân lập được 10 chủng A hydrophilia từ mẫu nước

thủy sản Trong đó 100 % nhạy cảm với gentamicin, sulfamethoxazole/ trimethoprim 80 %, chloramphincol 70 %, ciprofloxacin 50 %, neomycin 40 %, tetracycline 30 %, streptomycin 20 % và erythromycin 10 % Tất cả các chủng đều

đề kháng với novobiocin và bacitracin

Ở Tây Ban Nha, theo Altanlar và cs (2003), trong 166 mẫu nước uống được

phân lập có 66 chủng Aeromonas thuộc nhóm di động Tất cả các chủng này đều đề

kháng với ampicillin và erythromycin nhưng nhạy cảm với ciprofloxacin, cefazolin, cefixime, ceftriaxone, trimetoprim, sulfamethoxazole và genetamicin

Ở Đan Mạch, Schmidt và cs (2001) đã phân lập 313 chủng Aeromonas thuộc nhóm di động trên cá hồi Những chủng này đề kháng với oxytetracycline 69 %,

sulfadiazine/ trimethoprim 43 % Trong 313 chủng, có 135 chủng kháng sulphonamide/trimethoprim liên quan đến integron lớp 1; 23 chủng mang integron trống; 40 chủng kháng tetracycline có chứa plasmid trong đó có 27 chủng có integron lớp 1 và các chủng còn lại không mang integron

Ở Oklahoma (Nhật Bản), A hydrophila được phân lập từ heo tiêu chảy mang

1 cụm gene (mphA-mrx-mphR) của integron lớp 1 gây bất hoạt macrolide được xác

định bằng phương pháp PCR và giải trình tự gene (Poole và cs, 2006)

Ở Đài Loan, 133 gốc Aeromonas được phân lập từ thực phẩm, thủy sản và

gia cầm Bằng phương pháp PCR và giải tình tự gene, Chang và cs (2007) đã xác

định trong 133 gốc Aeromonas, có 74 gốc mang integron lớp 1 và không có gốc nào

mang integron lớp 2 Trong 74 gốc mang integron lớp 1, có 50 gốc là integron

trống, 24 gốc mang integron lớp 1 liên quan đến đề kháng trimethoprim (dfr12 và dfr2d), aminoglycoside (aadA1 và aadA2), β-lactam (oxa2), chloramphenicol (catB3 và catB8), (qacE2) và 2 khung đọc mở ORFs (orfD và orfF) chưa biết chức năng Lee và cs (2008) đã phân lập 267 gốc Aeromonas từ người, có 37 gốc mang integron lớp 1 với sự đề kháng aminoglycoside (aadA1, aadA2, aaC4, aac(6’)-II, aac(6’)-Ib), chloramphenicol (catB3, catB8, cmlA1), rifampin (arr-2, arr-3), trimethoprim (dfrA1, dfrA5,dfrA12, dfrA17, dfr2d, dfrV), oxacillin (blaOXA-21)

Ở Pháp, P aeruginosa đề kháng với tất cả kháng sinh thuộc nhóm

cephalosporin mở rộng và aminoglycoside Trong integron lớp 1 có gene cassette

blaGES-1 mã hóa ESBL (extended-spectrum-β-lactamase), 2 gene cassette mã hóa enzyme OXA-32, OXA-2 (Dubois và cs, 2002; Poirel và cs, 2002) Ở Úc, integron

lớp 1 được xác định hiện diện ở P stutzeri được phân lập từ môi trường đất ngoài tự nhiên Trên integron lớp 1 có intI, attI và 59-be (Holmes và cs, 2003)

Ở Ý, P aeruginosa sản sinh enzyme PER-1 ESBL và

metallo–beta-lactamase, gây đa đề kháng thuốc và nhiễm trùng bệnh viện (Docquier và cs, 2001)

P aeruginosa gây bùng phát dịch do đa đề kháng với carbapenem (imipenem,

meropenem), cephalosporin mở rộng (ceftazidime, cefepime), gentamicin, tobramycin, fluoroquinolones (ciprofloxacin, levofloxacin) nhưng chúng vẫn còn nhạy cảm với piperacillin–tazobactam, amikacin Ổ dịch xảy ra có liên quan đến việc sản sinh metallo-β-lactamase (MBL), bằng phương pháp PCR, Pagani và cs

(2005) đã xác định integron lớp 1 có mang gene cassette (blaIMP-13, aacA4) chèn vào, gene aacA4 đề kháng aminoglycoside mã hóa enzyme AAC(6’)-Ib

Ở Nhật Bản, P aeruginosa gây bùng phát dịch do đa đề kháng thuốc trong nhiễm trùng thần kinh, nhiễm trùng ống thông đường tiết niệu 284 chủng P aeruginosa được phân lập ở 19 bệnh viện và 1 trung tâm thí nghiệm Bằng phương

pháp đo nồng độ MIC, PCR, giải trình tự gene, Sekiguchi và cs (2007) đã xác định

trong 284 chủng P aeruginosa có 214 chủng đa đề kháng thuốc (MDR: multidrug

resistance); 70 chủng không đa đề kháng thuốc (non-MDR) Các chủng MDR đề kháng với các kháng sinh amikacin (100 %), aztreonam (99,5 %), ceftazidime (100

%), ciprofloxacin (100 %), doripenem (99,1 %), gentamicin (57,5 %), imipenem (100 %), meropenem (100 %), ofloxacin (100 %), piperacillin (100 %), streptomycin (100 %), piperacillin-tazobactam (100 %)

Ở Trung Quốc, 118 chủng P aeruginosa được phân lập từ người bệnh, đề kháng với imipenem Trong 118 chủng P aeruginosa, có 74 chủng mang integron

bao gồm 51 chủng mang integron lớp 1 (đoạn bảo toàn 3’,qacE 1-sull và sul3), 20 chủng mang integron lớp 2 (với 3 gene cassette: dfrA1- sat1- aadA1 được xác định trong Tn7) và 3 chủng mang cả 2 lớp integron này Đây cũng là bài báo cáo đầu tiên

về integron lớp 2 ở P aeruginosa (Xu và cs, 2009)

2.5.3 Vi khuẩn Stenotrophomonas

Berg và cs (1999) đã phân lập được 40 chủng S maltophilia từ mẫu bệnh

phẩm và từ môi trường đất, nước Các chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh gentamicin 84 %, doxycycline 57 %, ciprofloxacin 26 %, imipenem 84 %,

chloramphenicol 11 % và tetracycline 53 % nhưng chúng vẫn nhạy cảm với trimethoprim-sulfamethoxazole 100 %

Ở Argentina, 31 chủng S maltophilia được phân lập và có 3 chủng đề kháng

với trimethoprim/sulfamethoxazole Theo Barbolla (2004), sự lây lan đề kháng

kháng sinh có liên quan đến sự hiện diện của sul1 và integron lớp 1

Ở Nhật Bản, một nghiên cứu hồi cứu được thực hiện từ năm 1999 – 2004

nhằm xem xét sự lây lan đề kháng thuốc của S maltophilia (XDRSM: extensively drug-resistant S maltophilia) có liên quan đến nhiễm trùng bệnh viện Trong 5 năm qua S maltophilia gây tăng 49 % nhiễm trùng bệnh viện, 85 % nhiễm trùng máu, đề

kháng 7 loại kháng sinh 17 bệnh nhân dương tính với XDRSM có tỉ lệ chết cao hơn với 10 bệnh nhân dương tính với non-XDRSM Tất cả các chủng phân lập được đều mang integron lớp 1 (Tan và cs, 2008)

S maltophilia đề kháng β-lactams, quinolones, aminoglycosides, tetracycline

do các gene mã hóa β-lactamases, aminoglycoside-modifying, đề kháng

co-trimoxazole có liên quan gene sul1 và sul2 của integron lớp 1 (Looney và cs, 2009)

Theo Nguyễn Sử Minh Tuyết và cs (2008), nhóm trực khuẩn Gram âm không lên men đường được phân lập từ bệnh phẩm đàm và dịch rửa phế quản ở các

bệnh nhân bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính bao gồm P aeruginosa, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., S maltophilia nhạy cảm với các kháng sinh ticarcillin-

clavulanic acid, cefoperazone, ceftazidime, cefepime, imipenem, các aminoglycosige và quinolone Tại Việt Nam, vấn đề đề kháng kháng sinh có liên

quan đến sự hiện diện của integron ở bốn giống vi khuẩn Aeromonas, Acinetobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas phân lập từ môi trường cho đến

nay chưa có tài liệu nghiên cứu nào được công bố

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: Đề tài được tiến hành từ tháng 11/2009 đến tháng 05/2011

Các phản ứng PCR: Được thực hiện tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM

3.2 Đối tượng khảo sát và số lượng mẫu

Đối tượng khảo sát

Mẫu nước bao gồm nước thải chăn nuôi, nước nuôi trồng thủy sản và nước

từ cống thoát nước chung của các trại chăn nuôi tại các tỉnh, thành phố: Long An, Bình Dương, Đồng Nai, Tiền Giang, Tp Hồ Chí Minh để phân lập vi khuẩn

Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas Từ địa điểm lấy mẫu nước cống đến nơi

có khu vực chăn nuôi hoặc nước sông là khoảng 1 km

Mẫu đất được thu thập từ những hộ trồng rau có sử dụng phân chuồng tại

huyện Củ Chi, các quận ở Tp Hồ Chí Minh, Đồng Nai để phân lập vi khuẩn Acinetobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas Khu vực lấy mẫu nước và mẫu

đất khác nhau hoàn toàn