ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLIĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….WUX… NGUYỄN THANH TÙNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….WUX… NGUYỄN THANH TÙNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI Chuyên ngành: Thú Y Mã số: 60.62.50 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn khoa học: TS VÕ THỊ TRÀ AN PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2010 ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI NGUYỄN THANH TÙNG Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: Thư ký: Phản biện 1: Phản biện 2: Ủy viên: ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Nguyễn Thanh Tùng, sinh ngày 25 tháng 03 năm 1979 Tân Un – Bình Dương, ơng Nguyễn Hồng Xuân bà Nguyễn Thị Gái Tốt nghiệp tú tài trường Trung học phổ thơng Bình Long – Bình Phước năm 1997 Tốt nghiệp Đại học ngành Thú y hệ qui trường Đại học Nơng Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh năm 2003 Sau tơi làm việc Bình Dương Tháng 09 năm 2006, tơi theo học cao học ngành Thú y trường Đại học Nơng Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: vợ Huỳnh Thị Mỹ Diệu Địa liên lạc: tổ 4, khu phố Bình Ninh 2, phường Hưng Chiến, thị xã Bình Long, Bình Phước Điện thoại: 0906 747 719 Email: nguyenthanhtung250379@yahoo.com ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công bố luận văn trung thực phần đề tài IFS (International Foundation for Science) mã số B/4464-1 TS Võ Thị Trà An làm chủ nhiệm Những số liệu luận văn phép công bố với đồng ý chủ nhiệm đề tài Nguyễn Thanh Tùng iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn ni – Thú y Phòng Đào tạo Sau Đại học tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Kính tri ân Quí Thầy Cơ tận tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm q báu cho tơi q trình học tập thời gian thực đề tài Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy Nguyễn Ngọc Tuân tận tình hướng dẫn, động viên cung cấp nhiều tài liệu quí báu giúp tơi hồn thành đề tài Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Cơ Võ Thị Trà An cho tham gia nghiên cứu với IFS (International Foundation for Science), tận tình hướng dẫn, động viên, cung cấp tài liệu kinh phí cho tơi hồn thành đề tài Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Chi cục Thú y Thành phố Hồ Chí Minh, trạm Thú y Thủ Đức Anh Chiếu, anh Long anh chị – Bộ Môn Vi sinh, Lợi, chị Thẩm – Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm, Chi cục Thú y Thành phố Hồ Chí Minh Cảm ơn bác Bích – trưởng Khoa Nhi, Hải trưởng khoa, chị Tuyết anh chị – Khoa Vi sinh, Bệnh viện Nhân dân Gia Định Thành phố Hồ Chí Minh Cảm ơn Cơ Kim Hồng – Bộ mơn Vi sinh, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Cảm ơn Thầy Hiền, anh Ngọc, em Trang, Tuyền, Thành, Thức – Phòng Thực hành Kiểm nghiệm Thú sản – Mơi trường Sức khỏe Vật nuôi, Khoa Chăn nuôi Thú y Cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ môi trường, anh, chị, em Phòng Cơng nghệ Sinh học Động vật Cảm ơn em Hưng, Lẫm, Phương anh Bá – môn Công nghệ Sinh học, cảm ơn em Bình, Dương, Lê, Phi, Thơ lớp cao học Công nghệ Sinh học 2006, trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Xin cảm ơn tất người gia đình người bạn tốt hỗ trợ, giúp đỡ động viên tơi hồn thành đề tài Xin cảm ơn người vợ Huỳnh Thị Mỹ Diệu với lòng chân thành tình u thương tha thiết, em ln bên tơi, giúp tơi có thêm sức mạnh ý chí để vượt qua khó khăn q trình học tập sống iv TÓM TẮT Đề tài “Đề kháng kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli”được tiến hành trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng năm 2008 đến tháng năm 2010 Đề tài thực nhằm phát kiểu hình kiểu gene đề kháng kháng sinh có liên quan đến integron lớp vi khuẩn Escherichia coli (E coli) phân lập từ bệnh phẩm phân, máu, đàm nước tiểu bệnh nhân Bệnh viện Nhân dân Gia Định từ thịt heo (ở lò mổ Chi cục Thú y) Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Integron hệ thống bẫy bắt gene, chủ yếu gene đề kháng kháng sinh, đóng vai trò quan trọng lan tràn đề kháng kháng sinh Tổng cộng 197 gốc E coli (81 gốc phân lập từ người bệnh 116 gốc phân lập từ thịt heo) thử nghiệm với 12 loại kháng sinh phổ biến thú y nhân y Mức độ mẫn cảm với kháng sinh thực phương pháp khuếch tán đĩa thạch, theo hướng dẫn CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) Kết cho thấy có 86,3 % (n=170) gốc E coli phân lập đề kháng với loại kháng sinh Gần 75 % (n=147) gốc E coli phân lập có kiểu hình đa đề kháng (đề kháng từ loại kháng sinh trở lên) Có 11 (5,6 %) gốc nhạy cảm hoàn toàn với 12 loại kháng sinh thử nghiệm Các gốc E coli từ thịt heo có tỉ lệ đề kháng 90,5 %, cao so với E coli từ người bệnh (80,2 %) Các gốc E coli đề kháng với ceftazidime (Cephalosporin hệ thứ 3: TGC) thử nghiệm tìm diện ESBL (Extended spectrum β-lactamase, men beta-lactamase phổ rộng) double disk test AmpC disk test Có (2,5 %) gốc dương tính với double disk test gốc có nguồn gốc từ người bệnh Các gốc E coli đề kháng với kháng sinh kiểm tra diện integron lớp PCR Có 136 (80 %) gốc E coli đề kháng kháng sinh có integron Tỉ lệ gốc E coli (đề kháng kháng sinh) phân lập từ người bệnh có mang integron lớp 87,7 % (n=57), cao so với gốc E coli (đề kháng kháng sinh) phân lập từ thịt heo 75,2 % (n=79) Với 41,9 % gốc E coli v mang integron lớp có gene cassette khuếch đại PCR Tỉ lệ khuếch đại gene cassette integron gốc E coli từ người bệnh cao gốc E coli từ thịt heo (56,1 % so với 31,6 %) Khuếch đại gene cassette với kiểu kích thước Phân loại gene cassette RFLP với loại enzyme cắt giới hạn (BclI HpaII) giải trình tự số gene đại diện cho thấy integron có gene cassette dfrA7, dfrA12, dfrA17, aadA1, aadA2 aadA5 mã hóa cho đề kháng trimethoprim, streptomycin spectinomycin vi ABSTRACT The study “Antimicrobial resistance of Escherichia coli” was carried out to determine the phenotypes and genotypes of antimicrobial resistance of Escherichia coli (E coli) isolates from 09/2008 to 05/2010 In this study, E coli isolates from patients at Nhan Dan Gia Dinh hospital, and from pork (retail fresh pork and pork at slaughterhouse) in Ho Chi Minh City, Vietnam to determine the prevalence of anitimicrobial resistance, class integron, phenotypes and gene patterns of resistance An integron is a gene capture system that capable capturing mobile gene cassettes (most commonly antimicrobial-resistance genes) A total of 197 isolates, included 81 isolates from patients and 116 isolates from pork were tested for resistance to 12 antimicrobial agents The antimicrobial susceptibility of the isolates was determined according to the guidelines of the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), using the disk diffusion method on Mueller-Hinton agar Overall, 86.3 % of E coli isolated were resistance to at least one of 12 antimicrobials tested Up to 75 % (n=147) of the isolates were multidrug-resistant (resistant against ≥ antimicrobials) Eleven (5.6 %) E coli isolates were fully susceptible to all 12 antimicrobials tested All 30 ceftazidime resistant E coli isolates from patients (n=28) and pork (n=2) were screeened for the presence of ESBL (Extended spectrum β-lactamase) by double disk test and AmpC disk test No ESBL producing isolates was found from AmpC disk test Five isolates (2.5 %) were positive tested in the double disk test They are all human origins The presence of class integron was determined by PCR and sequenced for patterns inserted of gene cassette Class integrons were detected in 136 (80 %) E.coli isolates Integrons were found predominantly in human isolates (n=57; 87.7%) compared to swine isolates (n=79; 75.2 %) Gene cassette amplification was detected in 57 (41.9 %) class 1-integron-positive-isolates Three kinds of profiles in class integron profiles could be defined based on the number and size of the amplifications obtained Using BclI and HpaII restriction enzyme, the RFLP vii patterns of these amplicons were found Sequencing of the representative amplicons of each pattern, resistance genes were dfrA7, dfrA12, dfrA17, aadA1, aadA2 and aadA5 which encoding resistance to trimethoprim, spectinomycin and streptomycin viii Bước 10: ly tâm 13.000 vòng/phút phút → loại bỏ dịch lọc Bước 11: cho 700 µl Membrane Wash Solution vào (minicolum + collection tube), ly tâm 13.000 vòng/phút phút → loại bỏ dịch lọc Bước 12: thêm 500 µl Membrane Wash Solution vào (minicolum + collection tube), ly tâm 13.000 vòng/phút phút → loại bỏ dịch lọc Bước 13: ly tâm 13.000 vòng/phút phút Bước 14: chuyển Minicolum vào eppendorf (sạch vơ trùng) Bước 15: cho 50 µl nước cất (khử ion) vào Minicolum, ủ nhiệt độ phòng phút, ly tâm 13.000 vòng/phút phút → thu DNA (đã tinh sạch) 82 Phụ lục Quy trình thực enzyme cắt Chuẩn bị: eppendorf, đầu tip, pipette, bao tay, DNA tinh sạch, bồn ủ nhiệt, enzyme cắt hóa chất kèm theo Thực hiện: 20 µl/1 phản ứng Nước cất khử ion = 16,3 µl Buffer RE 10x = µl Acetylated BSA 10 µg/µl = 0,2 µl DNA µg/µl = µl Dùng pipette trộn đều, sau thêm Restriction enzyme 10 U/µl = 0,5 µl Trộn nhẹ nhàn pipette, ủ nhiệt độ thích hợp (tùy loại enzyme mà có nhiệt độ ủ thích hợp khác nhau) 1-4 Sản phẩm điện di với gel agarose 1,5 %, 65 V 60 phút, sau nhuộm ethidium bromide xem tia UV 83 Phụ lục Một số môi trường nuôi cấy E coli NA (Nutrient Agar) Pancreatic Digest of Gelatin…………………… 5,0 g/l Beef Extract…………………………………… 3,0 g/1 Agar………………………………………… …15,0 g/l pH cuối (250C) = 6,8 ± 0,2 EC broth (Enrichment coli broth) Casein enzymic hydrolysate…………… … 20,00 g/l Lactose………………………………… …….5,00 g/l Bile salt mixture………………………… …….1,50 g/l Dipotasium phosphat …………………… …….4,00 g/l Monopotassium phosphate……………… …….1,50 g/l Sodium chloride………………………… ……5,00 g/l pH cuối (250C) = 6,9 ± 0,2 EMB Agar (Eosin methylen blue) Peptic digest of animal tissue………………….10,00 g/l Dipotassium phosphate…………………………2,00 g/l Lactose…………………………………… .5,00 g/l Sucrose…………………………………… .5,00 g/l Eosin – Y……………………………………… 0,40 g/l Methylene blue…………………………… .0,065 g/l Agar…………………………………………….3,50 g/l pH cuối (250C) = 7,2 ± 0,2 84 LTB (Lauryl Sulfate Tryptose Broth) Trytose…………………………………… 20,00 g/l Lactose…………………………………… 5,00 g/l Sodium chloride…………………………… 5,00 g/l Dipotassium phosphate…………………… 2,75 g/l Monopotassium phosphate……………… 2,75 g/l Sodium lauryl sulphate…………………… 0,10 g/l pH cuối (250C) = 6,9 ± 0,2 MHA ( Mueller Hinton Agar) Beef, infusion from…………………… 300,00 g/l Casein acid hydrosate…………………… 17,50 g/l Starch…………………………………… 1,50 g/l Agar……………………………………… 17,00 g/l pH cuối (250C) = 7,3 ± 0,2 BHI (Brain Heart Infusion Broth) Calf brain, infusion from ……………… 200,00 g/l Beef heart, infusion from……………… 250,00 g/l Proteose peptone………………………… 10,00 g/l Dextrose…………………………………….2,00 g/l Sodium chloride…………………………….5,00 g/l Disodium phosphate……………………… 2,50 g/l pH cuối (250C) = 7,4 ± 0,2 MR – VP Buffered Peptone…………………………….…7g/l Dextrose …………………………………….….5g/l Dipotassium Phosphate………………………1,5 g/l 85 Simmon Citrat Agar Magnesium sulphate…………………………………… 0,20 g/l Ammonium dihydrogen phosphate…………………… .1,00 g/l Dipotassium phosphate……………………………… … 1,00 g/l Sodium chloride………………………………………… 5,00 g/l Bromo thymol blue…………………………………… …0,08 g/l Agar…………………………………………………… 15,00 g/l pH cuối (250) = 6,8 ± 0,2 TBX (tryptone-bile-glucoronic medium) Enzymatic digest of casein ………………………………… 20,0 g Bile salts …… ……………………………………………… 1,5 g 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucoronic acid (BCIG) 144 µmol Dimethyl sulfoxide (DMSO) ………………………………… ml Agar ………………………………………………………….9-18 g Water …………………………………………………… 1.000 ml Hóa chất cho điện di TBE (0,5 X) Tris HCl ……………………………………………… 3,94 mg Acid boric……………………………………………………1,39 g Na2EDTA…………………………………………………93,03 mg pH = 8,3 Hóa chất cho nhuộm gel TBE ………………………………………………….……….0,5 X Ethidium bromide …………………………………….….10 mg/ml 86 Phụ lục Quy trình phân lập E coli Bệnh viện Nhân Dân Gia Định Bệnh phẩm Huyền phù Mac-Conkey (chọn khuẩn lạc điển hình) IMViC Vi khuẩn E coli 87 Phụ lục Quy trình phân lập E coli Chi cục Thú y Tp HCM Mẫu Huyền phù TBX (44oC/18-24 giờ) Chọn khuẩn lạc điển hình (E coli) 88 ... Bình Ninh 2, phường Hưng Chiến, thị xã Bình Long, Bình Phước Điện thoại: 0906 747 719 Email: nguyenthanhtung250379@yahoo.com ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công bố luận văn trung thực phần đề... COLI NGUYỄN THANH TÙNG Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: Thư ký: Phản biện 1: Phản biện 2: Ủy viên: ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Nguyễn Thanh Tùng,... BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….WUX… NGUYỄN THANH TÙNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI Chuyên ngành: Thú Y Mã số: 60.62.50