Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro cây diệp hạ châu (phyllanthus urinaria l )

Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên .... Kết

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN - 2018

I I

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướngdẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luậnvăn là trung thực và chưa được ai công bố

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2018

Tác giả

Phạm Thị Hồng Loan

và hoàn thành luận văn.

Trong quá trình nghiên cứu, em đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuậtviên Trần Thị Hồng (Phòng Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học

Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quýbáu đó

Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Bộ môn Sinh học hiện đại

và Giáo dục sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạomọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện quá trình nghiên cứu

Em xin bày tỏ lòng biết ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo KhoaSinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảngdạy, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình vàbạn bè đã giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2018

Tác giả

Phạm Thị Hồng Loan

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC .iii

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây Diệp hạ châu 4

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại

4 1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố sinh thái của cây Diệp hạ châu

4 1.1.3 Kỹ thuật trồng Diệp hạ châu 5

1.1.4 Tác dụng của một số thành phần hóa học trong cây Diệp hạ châu

7 1.1.5 Một số bài thuốc dân gian từ cây Diệp hạ châu 9

1.2 Quy trình nhân giống in vitro 9

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

11 1.3.1 Auxin 12

1.3.2 Cytokinin 13

1.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro 14

1.4.1 Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu trên thế giới

14 1.4.2 Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu ở Việt Nam 16

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .

2.1 Vật liệu, hoá chất 19

2.1.1 Vật liệu thực vật 19

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 19

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Pha môi trường nuôi cấy 19

2.2.2 Khử trùng hạt 20

2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên

20 2.2.4 Nghiên cứu môi trường tạo rễ 21

2.2.5 Nghiên cứu giá thể đưa cây ra tự nhiên 22

2.2.6 Xử lí và tính toán số liệu 23

2.3 Điều kiện thí nghiệm 23

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Kết quả khử trùng hạt 24

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 26

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đọan thân mang mắt chồi bên 26

3.2.2 Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 28

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA, BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 30

3.3.1 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên 31

3.3.2 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sựsinh trưởng của chồi tái sinh từ mắt chồi bên 333.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA đến khả năng

ra rễ của chồi Diệp hạ châu trong ống nghiệm 343.4.1 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Diệp hạ châu 353.4.2 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Diệp hạ châu 363.5 Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của câycon trong vườn ươm 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC

DNA : Deoxyribonucleic acid

IAA : Indole-3-acetic acid

IBA : Indole-3-butyric acid

Kinetin : 6-furfurylaminopurine

MS : Murashige và Skoog, 1962

NAA : Naphthalene acetic acid

châu (sau 45 ngày) 39

sinh chồi và sự sinh trưởng chồi của từ đoạn thân mang mắt chồibên (sau 8 tuần) 34Hình 3.5 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ (sau 8 tuần) 36Hình 3.6 Rễ Diệp hạ châu trong môi trường bổ sung IBA 0.5mg/l (sau 8 tuần)

38Hình 3.7 Cây Diệp hạ châu trong chậu (45 ngày) 39

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Viêm gan B là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến trên thếgiới, một trong những nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất Hiện nay, trên toàncầu có ít nhất 2 tỷ người đang mang trên người virus viêm gan B, khoảng 400triệu người đang bị viêm gan B mãn tính và sẽ có ít nhất 250 ngàn người thiệtmạng mỗi năm Việt Nam là thuộc các nước với tỷ lệ viêm gan B cao nhất thếgiới Cứ 6 đến 7 người Việt Nam thì có 1 người đang bị nhiễm virus viêm gan

B Căn bệnh này nếu được phát hiện ở giai đoạn đầu điều trị khỏi bệnh là rấtlớn Hiện nay nhu cầu thuốc chữa viêm gan B và các loại bệnh khác rất cao đặcbiệt các chế phẩm thuốc từ cây dược liệu [5]

Trong tài liệu “Chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam giaiđoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (được ban hành theo quyếtđịnh số 68/QĐ -TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tướng Chính phủ) đã đưa ra mụctiêu cụ thể, đến năm 2020 Việt Nam phấn đấu sản xuất được 20% nhu cầunguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nước Thuốc được sản xuất trong nướcchiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm Trong đó, thuốc từ dược liệuchiếm 30% Để thực hiện một trong các trọng điểm của định hướng chiến lượcphát triển của ngành Y - Dược là đẩy mạnh công tác trồng trọt cây thuốc trênquy mô lớn, phát triển nguồn dược liệu hàng hoá phục vụ cho việc điều trịtrong nước và xuất khẩu, mở ra cơ hội lớn cho việc giao thương, tham gia thịtrường quốc tế về dược liệu và dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên Vì thế, việctrồng và bảo tồn cây dược liệu rất cần thiết Đẩy mạnh nghiên cứu, ứng dụngcác tiến bộ khoa học kỹ thuật để tạo ra các loại giống dược liệu có năng suất,chất lượng đáp ứng yêu cầu sản xuất [26]

Diệp hạ châu là cây thuốc có dược tính sử dụng để chữa nhiều bệnh ởngười Vùng phân bố của Diệp hạ châu khá rộng, cây mọc hoang tại Việt Nam

và nhiều nước khác trên thế giới, như Ấn Độ, Trung Quốc, Cu Ba, Peru,Nigeria, Malaysia, Philippines, Guam, Brazil [2], [3], [27].

Cây Diệp hạ châu có nhiều tác dụng trong việc điều trị viêm gan B.Trong cây Diệp hạ châu có chứa phyllathin, hypophyllanthin, triacontanal cónhiều tác dụng chữa bệnh, đặc biệt là khả năng giải độc, khôi phục chức năngbình thường của gan, tốt trong các trường hợp suy giảm chức năng gan do sửdụng nhiều bia rượu Các chất này làm gia tăng lượng glutathione - chất bảo vệgan thường bị thiếu trầm trọng ở những người thường xuyên sử dụng bia rượu.Năm 1995, các nhà khoa học Brazil cũng phát hiện tác dụng giảm đau mạnh vàbền vững của loài cây này Tác dụng này là do gallic acid, có khả năng bảo vệkhi gan bị viêm, tổn thương gan do bia rượu Theo y học cổ truyền, Diệp hạchâu vị đắng hơi ngọt, tính mát, quy kinh vào can, đởm nên có tác dụng kíchthích tiêu hóa, tăng tiết mật, giải độc [13], [28], [29]

Hàm lượng các dược chất trong Diệp hạ châu tự nhiên rất thấp, lá khôchứa các chất đắng hypophylathin (0,05%), phylanthin (0,35%) [29] Một trongnhững biện pháp tăng lượng phyllathin, hypophyllanthin, triacontanal trongdiệp hạ châu là phương pháp chuyển gen tăng hoạt tính của enzyme xúc tác cácphản ứng tạo dược chất Tuy nhiên, để chuyển gen thành công điều kiện tiênquyết là phải xây dựng hệ thống tái sinh phù hợp

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài luận văn:

“Nghiên

cứu tái sinh đa chồi in vitro cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tối ưu được môi trường tái sinh đa chồi cây Diệp hạ châu Xác địnhđược giá thể phù hợp để đưa cây ra ngoài tự nhiên

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu khử trùng hạt

(2) Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của chất kích thích sinhtrưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởngchồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách lá mầm

(3) Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA, IBA đến khả năng ra rễ của Diệp

hạ châu trong ống nghiệm

(4) Xác định loại giá thể thích hợp để đưa cây ra ngoài tự nhiên

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây Diệp hạ châu

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Tên gọi:

Tên Việt Nam: Diệp hạ châu

Tên khoa học: Phyllanthus urinaria L.

Tên khác: Chó đẻ răng cưa, cây Cau trời, Diệp hậu châu, nhật khai dạ bế,Diệp hòe thái, Lão nha châu

Phân loại:

Diệp hạ châu thuộc giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ Sơ ri ( M alp ig h i a l e s ) HọThầu dầu (E up h o r b ia ce a e ) Chi P h y ll a nth u s [ 2], [3], [15]

1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố sinh thái của cây Diệp hạ Châu

Cây Diệp hạ châu là một loại cỏ mọc hằng năm, cao chừng 30cm, thângần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang cành Lá mọc so le, phiến lá thuôn, dài

từ 5 đến 15 mm, rộng từ 2-5 mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép nguyên hơi có răngcưa rất nhỏ, mặt dưới lá trắng xanh, không cuống hay có cuống rất ngắn Hoamọc ở kẽ lá, nhỏ, màu đỏ nâu, đơn tính, hoa đực ở đầu cành hoa, cái ở dưới.Hoa có cuống rất ngắn Quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống ở dưới lá, cókhía mờ và có gai, hạt hình 3 cạnh Đường kính quả có thể đạt tới 2 mm, treodưới lá (Diệp hạ châu nghĩa là hạt dưới mặt lá) Hạt ba cạnh, hình trứng, màunâu nhạt, có vân ngang Mùa hoa: tháng 4 – 6 Mùa quả: tháng 7 – 9 [32]

Diệp hạ châu phân bố trên các cánh đồng khô, ven đường, vùng đất bỏhoang, bìa rừng; dưới độ cao 100 – 600m tại Ấn Độ, Đ à i L

o a n , I n do n e si a , L à o , l a y siaMa , M y a n m a , N e p a l , Nh ật Bả n , S r i L a n ka , T h á i L

a n , T r u n g Qu ố c ( các tỉnh An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, QuýChâu, Hải Nam, Hà Bắc, Hà Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tô, Giang Tây,

Thiểm Tây, Sơn Đông, Sơn Tây, Tứ Xuyên, Tây Tạng, Vân Nam, ChiếtGiang), V i ệ t N am v à N a m M ỹ [ 2], [3].

Hình 1.1 Cây Diệp hạ châu

1.1.3 Kỹ thuật trồng Diệp hạ châu

Cách làm đất trồng cây:

Cây có thể phát triển trên mọi loại đất, trừ đất trũng, nơi úng ngập Tốtnhất là đất pha cát và đặc biệt đất phải đủ ẩm Có thể trồng riêng rẽ hoặc xencanh trong vườn cây ăn quả chưa khép tán

Diệp hạ châu trồng trên đất pha cát hay đất cát pha và đất bạcmàu,được cày bừa kỹ, trừ hết cỏ dại

Nếu đất có pH dưới 5, cần bón lót tới 1 tấn vôi bột/ha Để thuận lợicho việc chăm sóc, đất trồng diệp hạ châu cần lên luống rộng 1 -1,5m, cao20-25cm và rãnh rộng 30cm

Cách chọn hạt giống:

Đảm bảo việc chọn lựa hạt giống chất lượng Việc lựa chọn hạt giốngrất quan trọng vì nó sẽ giúp cây phát triển tốt, chọn giống tốt, thuần chủngthì dược liệu sẽ có năng suất và hiệu quả chữa bệnh cao.

Sau 2 tuần gieo hạt: Đất vườn ươm được cày bừa kỹ, vơ hết cỏ, bónlót phân quy ra 1 ha: phân chuồng 30 tấn, phân vi sinh 10 tấn; vôi bột 500kg.Đất vườn ươm lên luống rộng 1m, cao 20 - 25cm Lượng hạt giống gieotrong vườn ươm 3g/m2 đất (Nếu gieo thẳng vào luống thì lượng hạt giống là1g hạt giống/10m2 đất) Trước khi gieo cần xử lý bằng Atonik với tỷ lệ 1 góiAtonik 10g pha với 40 lít nước cho 8 kg hạt giống Hạt ngâm trong dungdịch này 4 giờ, sau vớt ra để ráo nước, trộn với cát ẩm ủ 3 -4 ngày cho đếnkhi thấy nứt nanh thì đem gieo

Đề phòng kiến ăn hạt, sau khi gieo cần phun thuốc basudi n (theo liềulượng được nhà sản xuất ghi trên bao bì)

Gieo vãi đều trên mặt luống, xoa nhẹ mặt luống cho lấp hạt, dùng rơm

rạ che phủ rồi tưới nước cho ướt rơm rạ để giữ ẩm cho đất Sau 10 ngày cóthể bỏ vật che phủ

Hạt Diệp hạ châu sẽ mọc sau 5-7 ngày Khi câu con có 3-4 lá thật cầntỉa bỏ những cây yếu, chỉ để lại mật độ 2x2 cm/cây Quá trình chăm sóc câycon ở vườn ươm đơn giản, luôn tưới nước cho đất ẩm, sau 20 -25 ngày nhổ đitrồng Lúc này cây giống cao 10cm, thân mập, có bộ rễ phát triển thì chúng

ta tiến hành đánh cây đi trồng ra hốc

sau 7 ngày xới đất phá váng lần 1, sau 10 ngày phun dung dịch Atonik lần 2, cây trồng cần làm cỏ và xới đất 1 lần nữa trước khi tán lá giao nhau.

Lưu ý: do trồng vào mùa khô nên thường xuyên phải tưới nước Thờigian tưới nước tốt nhất là lúc chiều tối hoặc trước 9h sán

- Thu hoạch quả: Chọn cành có nhiều quả già Diệp hạ châu thu hoạchlứa đầu tiên khi 3/4 số cây có hoa quả.Thu hoạch cây: Cắt cây, chừa khoảng20cm gốc (để các cành ngủ mau tái sinh)

- Bảo quản phơi khô: Khi phơi phải trải mỏng, dưới lót tấm vải nhựa

để tránh rơi mất hạt, sau 3 ngày phơi nắng trực tiếp hoặc hong gió, quả già sẽtách vỏ hết Để kiểm tra độ khô thì ta tiến hành bẻ thân, thấy cây khô giòn làđược Thu lấy hạt và cành lá rụng để bảo quản Hạt để làm giống (thu lấy hạt,loại bỏ tạp chất, phơi lại 1-2 nắng cho khô), lá và cành khô làm thuốc Để hạtkhô trong chai, lọ sạch khô kín Cành và lá diệp hạ châu- cây chó đẻ sau khi thuhạt cho vào túi khô, sạch kín và đây là dược liệu chính phẩm [33]

1.1.4 Tác dụng của một số thành phần hóa học trong cây Diệp hạ châu

Các hợp chất có hoạt tính trong Diệp hạ châu là ligan (phyllanthin,hypophyllanthin, nirurin niranthin, phytetralin, niranthine…), flavonoids,amariinn, furosin, amariinn acid, amarulone, triterpenes, sterol, alkaloids…Nirtetralin, niranthin và phyltetralin ức chế carrageenan tạo ra trong quá trìnhviêm và sự lan tràn bạch cầu trung tính Trong vai trò kháng virus viêm gan,niranthin cũng thể hiện hoạt tính chống HBsAg còn henokinin thể hiện hoạttính chống HBeAg Ellagitanins garaniin và corilagin được chứng minh là chấttrung gian có tiềm năng kháng lại sự nhân lên của HIV-1 trong tế bào HelaCD4+ Các phức chất phenol trong dịch chiết với nước của Diệp hạ châu cóhoạt tính chống oxi hóa mạnh nhất là phyllanthin, amriin, repandusinic acid vàphyllanthin D Hoạt tính chống ung thư được thử nghiệm trên chuột với hỗnhợp phyllanthin và hypophyllathin (1:1) Phyllanthin được chứng minh vai tròbảo vệ tế bào gan chuột gây đọc với ethanol hoặc CCl4 [21], [30]

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng bảo vệ gan của chất chiếtDiệp hạ châu hoặc những hoạt chất từ Diệp hạ châu Chirdchupunseree vàPramyothin (2010) chứng minh vai trò của phyllanthin trong việc bảo vệ tế bàogan do đối kháng với những ảnh hưởng gây độc gan của cồn ethanol Chất nàycũng phục hồi lại khả năng chống oxy hóa của tế bào gan chuột, bao gồmglutathione tổng số, hoạt tính của glutathione tổng số và hoạt tính củaglutathione reductase [20], [21].

Theo nghiên cứu của Raphael và Khutan (2003), dịch chiết thân và rễDiệp hạ châu trong methanol với liều 50, 200 và 1000 mg/kg thể trọng dùngtheo đường uống đã ức chế loét dạ dày của chuột Wistar gây bệnh thực nghiệmbằng ethanol tuyệt đối Các thông số gồm hệ số loét, chảy máu giảm đáng kểkhi dùng Diệp hạ châu đắng Một nghiên cứu khác của Odetola và Akojenu(2000), dịch chiết diệp hạ châu đắng thử nghiệm có khả năng trì hoãn thời gianbắt đầu tiêu chảy, giảm tần số đi phân dẫn đến ức chế nhu động ruột 79,9% sovới 86,9% do tác động của morphine được dùng như đối chứng [30]

Theo bài tổng hợp năm 2011, Patel và cộng sự đã tóm lược nhiều kết quảnghiên cứu chứng minh quan trọng cả về cơ bản và ứng dụng của chất chiếtDiệp hạ châu hoặc các hoạt chất với nhiều tác dụng khác như chống ung thư,chống sốt rét, lợi tiểu, hạ đường huyết và giảm cholesterol trong máu, điều hòamiễn dịch bảo vệ thận Ngoài ra, bài báo này cũng cho biết rằng sau nhiều nămnghiên cứu, người ta chưa phát hiện ra tác dụng phụ hay độc tính của Diệp hạchâu [30]

Tại Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gancủa Diệp hạ châu đã được tiến hành Nhóm nghiên cứu của Lê Võ Định Tường(Học Viện Quân Y) đã thành công với chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthusamarus Nhóm nghiên cứu của Trần Danh Việt, Nguyễn Thượng Dong (ViệnDược Liệu) với bột Phyllanthin (2001) [31]

Đã có một số công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gan củaDiệp hạ châu Song các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào chiết xuất các chất códược tính và ứng dụng trong điều trị bệnh.

1.1.5 Một số bài thuốc dân gian từ cây Diệp hạ châu

Tác dụng chữa viêm gan siêu vi B, cách làm: 30g cây Diệp hạ châu,12gnhân trần,12g sài hồ,8g chi từ,12g hạ khô tảo.Tất cả sấy khô dùng để sắc lấynước uống ngày 1 tháng

Chữa viêm gan do virus: Diệp hạ châu sao khô 20 g, sắc nước 3 lần.Trộn chung các nước sắc, thêm 50g đường đun sôi cho tan, chia làm 4 lần uốngtrong ngày Khi kết quả xét nghiệm HBsAg (-) thì ngừng thuốc

Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Cây Diệp

hạ châu sao khô 20g, cam thảo đất sao khô 20g Sắc nước uống hằng ngày

Chữa nhọt độc sưng đau: Dùng một nắm cây Diệp hạ châu với một ítmuối giã nhỏ, chế nước chín vào, vắt lấy nước cốt uống, dùng bã đắp chỗ đau

Chữa bị thương ứ máu: Dùng lá, cành Diệp hạ châu và Mần tưới, mỗithứ một nắm, giã nhỏ chế nước đồng tiện vào, vắt lấy nước uống, bã thì đắphoặc hòa thêm bột Ðại hoàng 8-12g càng tốt (Hoạt nhân toát yếu)

Chữa xơ gan cổ trướng: Cây Diệp hạ châu sao khô 100g sắc nước 3 lần.Trộn chung nước sắc, thêm 150g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lầnuống trong ngày (thuốc rất đắng), liệu trình 30 – 40 ngày Khẩu phần hằngngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ)

Chữa ăn không ngon miệng, đau bụng, sốt, nước tiểu màu sẫm: Dùngcây Diệp hạ châu 1g, nhọ nồi 2g, xuyên tâm liên 1g Tất cả các vị thuốc trênphơi khô trong bóng râm và tán bột Sắc bột thuốc này và uống hết ngay mộtlúc Uống mỗi ngày 3 lần (y học dân gian Ấn Độ) [2], [3]

1.2 Quy trình nhân giống in vitro

Quy trình nhân giống in vitro gồm các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng

cây mẹ ban đầu nên trong giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ

thường là cây khỏe, có giá trị kinh tế cao Sau đó chọn cơ quan để lấy mẫuthường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non Mô chọn để nuôicấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạchbệnh, giữ được các đặc điểm sinh học quý của cây, ít nguy cơ biến dị Tùy theođiều kiện giai đoạn này có thể kéo dài 3 – 6 tháng [9], [18].

Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài môi trường vào nuôi cấy để tạonguyên liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai đoạn này được tiến hành theo cácbước:

(1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy

(2) Cấy mẫu vật vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường

nhân tạo (giai đoạn này gọi là giai đoạn cấy mẫu in vitro).

Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôitrong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thờigian nhất định, từ mẫu nuôi cấy đã bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào, hoặc các

cơ quan, hoặc các phôi vô tính Giai đoạn này phụ thuộc vào đặc điểm sinh lýsinh thái của từng đối tượng đem nhân giống Thông thường kéo dài từ 2 – 12tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển [18]

Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô, cây đượcnhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khi mẫu sạch đã được tạo ra và

từ đó nhân được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trìnhnuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhấttrong điều kiện nuôi cấy Thành phần và điều kiện môi trường cần được tối ưuhóa nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh Đối với môi trường nhân chồi, sửdụng các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, kinetin) vớinồng độ khác nhau tùy từng đối tượng Giai đoạn nhân nhanh chồi từ vài chồiban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh hình thành các biến dị soma [18]

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát triển rễ tự sinh,nhưng thông tường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác đểkích thích tạo rễ Đối với môi trường tạo rễ người ta thường sử dụng chất kíchthích sinh trưởng thuộc nhóm auxin như: α – NAA, IAA, IBA Thông thườnggiai đoạn này kéo dài từ 2 – 8 tuần tùy từng đối tượng Khi cây có đạt kíchthước về rễ, thân, lá đảm bảo cho sinh trưởng, phát triển bình thường ngoài tựnhiên, mới tiến hành giai đoạn cuối là đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên[18]

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu cây được chuyển từ điều kiện vô trùng trong ốngnghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên Giai đoạn này quyết định khả năng ứng

dụng của quy trình nhân giống in vitro Cây nuôi cấy in vitro được sinh trưởng

và phát triển trong những điều kiện tối ưu về nhiệt độ, độ ẩm, pH, dinh dưỡng

Vì vậy, trước khi đưa ra trồng, người ta cần huấn luyện để thích nghi với điềukiện tự nhiên Cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườnươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần phải đáp ứng cácyêu cầu: che cây con bằng nilon và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm vàlàm mát cây Giá thể trồng cây có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạokhông chứa đất, mùn cưa và bọt biển Giai đoạn này đòi hỏi 4 – 16 tuần [18]

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung mộthoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rấtcần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan Tuy vậy,yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàmlượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hòa sinhtrưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin và

1.3.1 Auxin

Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indolaxetic (IAA) và là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng Trong thực vậtauxin không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở dạng liên kết không có hoạt tínhsinh học như IAA-glucose, IAA-myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn xuất khác của indol cũng thể hiện hoạt tính của auxin là indoltryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol ethanol [7]

Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn vàchủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thựcvật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổnghợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [7]

Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tớihàng loạt các quá trình sinh lý như: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kíchthích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có cácảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chíncủa quả, sự ra hoa… Do hoocmon thực vật tác động đến sinh trưởng thông quamối tương quan nồng độ giữa các loại hoocmon nên các quá trình trên đâykhông chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hoocmon khác Tùy thuộc vàonồng độ hoocmon mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác nhau đối vớiauxin Phản ứng nhanh nhất khi xử lý auxin là tăng độ kéo dài của tế bào thôngqua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào [7]

Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài chất đãđược sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp Chỉ một thời gian ngắn sau khi IAAđược tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp chất cógiá trị Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ dàng bịphân hủy thành các chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh sáng và vi sinhvật Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình thành rễ củanhững lát cắt thân Một số chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự như IAA,

trong đó có IBA IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu nhưng nó có khả năng

ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin [7], [17]

Auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sựphân bào và sinh trưởng của mô sẹo, tạo phôi vô tính, tạo rễ… Những auxindùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA, IAA, NAA, 2,4-D Trong số các auxin,IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ, auxin phối hợp vớicytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi Auxin tan trong ethanol hoặc NaOHpha loãng [7], [17]

Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) làmột phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950 Những năm

1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BAđược sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng

độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy [7]

Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúngtương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phầncủa các glycoside [17]

Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây,đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein Cytokininđiều chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách như điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADNkhi phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng tháingủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả,

gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá dokích thích sự lớn lên của tế bào [17].

Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào,tạo và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi

vô tính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồiđỉnh, tăng cường phát sinh chồi phụ Các loại cytokinin thường được dùng là:kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng [7]

1.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro 1.4.1 Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu trên thế giới

Với những ưu thế của công nghệ nuôi cấy mô tế bào, việc ứng dụng

chúng trong nuôi cấy in vitro cây dược liệu được nhiều tác giả trên thế giới

quan tâm như:

Năm 2016, nhóm nghiên cứu của Wang CL và cs đã tiến hành tái sinh

cây Lúa mạch đen (một loại thảo dược hàng năm lâu đời) trong nuôi cấy in vitro Việc tái sinh cây lúa mạch đen bằng cách tạo ra phôi soma được điều tra

bằng hai loại lúa mạch khác nhau, Yuanzi và Xichang Khả năng phục hồi củaYuanzi tốt hơn so với Xichang, đoạn thân có khả năng tái sinh tốt hơn lámầm Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo callus là môi trường cơ bản của MS

bổ sung 2mg/l 2,4D và 1mg/l Kinetin, có thể đạt đến 98,96% phát sinh mô sẹo

Tỷ lệ tái sinh cây từ callus của lúa mạch đạt 55,77% trong môi trường MS bổsung 2,0mg/l BAP và 1,0mg/l Kinetin Tỷ lệ tái sinh cây tối đa từ callus là69,05% trong môi trường MS cơ bản bổ sung 3,0mg/l BAP và 1,0mg/lThidiazuron Cây tái sinh chuyển vào môi trường cơ bản 1/2 MS bổ sung1mg/l IAA cho tỷ lệ sống sót 75% sau khi chuyển cây tái sinh ra ngoài môitrường tự nhiên trong điều kiện đồng ruộng [25]

Nghiên cứu của Shinde S và cs (2016) đã thiết lập một quy trình cho việcnhân giống in vitro của cây ngải tây Ấn Độ Một callus phát sinh thu được trênmôi trường MS bổ sung 2.5μMM IAA Ngoài ra, các mẫu còn được nuôi cấy trên

môi trường MS bổ sung với các chất kích thích sinh trưởng khác nhau Tần sốtái sinh cây cao nhất (83,3%) từ mô sẹo khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổsung BAP 2,5mM và 7,5mM 2-iP Hiệu quả tạo chồi tối ưu 10.16 ±2.24 chồi được tái sinh trên môi trường bổ sung 2,5μMM BAP + 7,5μMM 2-iP Môitrường MS bổ sung 10μMM IBA có hiệu quả ra rễ của chồi cao Các nghiên cứucho thấy cây tái sinh có sự ổn định về di truyền trong các cây trồng vi nhângiống [24].

Agnieszka Pietrosiuk và CS (2007) đã nghiên cứu phương pháp nuôi cấy

Catharanthus roseus trong điền kiện in vitro, cung cấp nguồn nguyên liệu thực

vật để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp từ alkaloid Dưới sự tác động củaenzyme, alkaloid monomerice, vindoline và catharanthine hình thành

vinblastine trong tế bào nuôi cấy in vitro Kết quả quan trọng của nghiên cứu

này là, ajmalicine tổng hợp với lượng lớn từ mô sẹo, catharanthine thu đượctrong lá và tế bào nuôi cấy trong bình bioreactor Rễ tơ được tạo ra bằng cáchnhiễm vi khuẩn Ag r o b a c t e r iu m r h i z o g e n e s v ào mô sẹo Các chất chuyển hóathứ cấp mức thu được từ rễ tơ cao hơn so với các cây ngoài tự nhiên Cácalkaloid chiếm ưu thế trong rễ tơ là ajmalicine, serpentine, vindoline vàcatharanthine hàm lượng cao hơn trong rễ chưa chuyển gen [19]

Nghiên cứu nuôi cấy tái sinh callus ở Chlorophytum borivilianum sử dụng

các loại Phytohormones khác nhau của Nakasha và cs (2016) để đánh giá ảnhhưởng của các phytohormon khác nhau đối với sự phát triển của callus và

nghiên cứu tái tạo callus ở C borivilianum chồi non của C borivilianum được

cấy trên môi trường MS được bổ sung 3% sucrozo và NAA hoặc 2,4-Dvới cácnồng độ khác nhau (0, 1, 5, 10, và 15mg/l) Sự kích thích callus đã được đánhgiá trong bốn chu kỳ nuôi cấy Sự tái sinh từ callus được nghiên cứu trên cácmôi trường được bổ sung BAP và kinetin hoặc thidiazuron ở nồng độ khácnhau (0, 0.5, 1, 2 và 3mg/l) Chồi được tạo ra từ môi trường MS bổ sung 1,0

mg/L IAA : Khả năng tạo callus đã được chứng minh tốt hơn trên môi trường

MS có chứa 2,4-D 5mg/L Callus phát triển thành chồi mạnh trên môi trường

MS bổ sung BAP hoặc kinetin Thidiazuron đạt hiệu quả thấp trong việc tạo

ra chồi Các cây con rễ đã được cải tạo thành công trong đất với 88,3% câysống sót [23]

Nghiên cứu quy trình nhân giống nhanh Prunus dulcis bằng sử dụng chồi nách Choudhary và cs (2015) đã tiến hành hiệu quả phương pháp in vitro cho việc nhân giống Prunus dulcis bằng cách sử dụng các chồi nách Các thí

nghiệm được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các phytohormones ở nồng

độ khác nhau Môi trường MS cơ bản cho thấy hiệu quả tạo chồi thấp nhất Môitrường MS bổ sung BAP (0.5mg/l) cho kết quả nhân chồi cao Các mẫu nuôicấy ra rễ kém trong tất cả các tổ hợp của các chất kích thích sinh trưởng thựcvật và để tạo chồi trong 90 ngày Tỉ lệ ra rễ cao nhất (33,33%) trong môi trường

½ MS bổ sung 0,1mg/l IBA Môi trường MS bổ sung với IBA 0,1mg/l hiệu quảhơn NAA trong việc tạo rễ Khả năng tạo rễ cao 25% trong môi trường MSđược bổ sung với NAA 0,1mg/l, môi trường MS cơ bản đạt 20% [22]

1.4.2 Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu ở Việt Nam

Hiện nay, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu nuôi cấy cây dược

liệu trong điều kiện in vitro của nhiều tác giá khác nhau như:

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh (2008) đã tiến hành nhân

giống vô tính in vitro cây Lô hội và cho thấy, môi trường MS bổ sung BAP 2,5

mg/l cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt Bổ sung than hoạt tính 1,5 - 2g/l

cho khả năng ra rễ đạt cao nhất Giá thể ra cây Lô hội in vitro thích hợp là cát mịn, tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng phát triển tốt [11].

Tác giả Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010) đã đưa ra môi trường

tái sinh chồi in vitro cây Ba kích tím là MS bổ sung kinetin 0,25mg/l, môi

trường nhân chồi là MS bổ sung BAP 3,5mg/l + IBA 0,2mg/l, môi trường tạo

rễ là MS bổ sung IBA 0,2 - 0,25mg/l [14]

Vũ Thị Lan và cs (2011) đã đề xuất môi trường thích hợp cho sự sinhtrưởng mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung để thu sinh khối là: SB1 (MS + NAA

2,0mg/l + BAP 0,5mg/l) và SB2 (MS + NAA 2,0mg/l + 1,0mg/l BAP); SK6(MS + NAA 2,0mg/l + kinetin 1,0mg/l) và SK7 (MS + NAA 2,0mg/l + kinetin1,5mg/l); SN9 (MS + NAA 2,0mg/l + 10% nước dừa) và SN10 (MS + NAA2,0mg/l + 20% nước dừa) [8] Cũng thông qua giai đoạn mô sẹo để nhân nhanh

in vitro cây Hoắc hương, tác giả Vũ Thanh Sắc và cs (2012) đã đi đến kết luận:

Môi trường phù hợp nhất cho tạo mô sẹo từ lá và thân cây Hoắc hương là môitrường MS bổ sung 2,4-D 1,5mg/l; nồng độ than hoạt tính thích hợp nhất cho

tạo mô sẹo từ lá hoắc hương in vitro là 0,5g/l; môi trường tái sinh chồi từ mô

sẹo cây hoắc hương tốt nhất là MS bổ sung than hoạt tính 0,5mg/l, kinetin1,0mg/l [10]

Nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và cs (2012) đã cho thấy: môi

trường thích hợp nhất để thực hiện nhân nhanh in vitro Lan Kim Tuyến là Knud

+ BAP 0,5 mg/l+ kinetin0,3 mg/l + NAA 0,3mg/l + sucrose 20g/l + nướcdừa

100ml/l + dịch chiết khoai tây 100ml/l + agar 7g/l Môi trường thích hợp nhấtcho sự hình thành rễ tạo cây hoàn chỉnh là: Knud + IBA 0,5 - 1mg/l hoặc NAA1mg/l

+ sucrose 20g/l + than hoạt tính5%+ nước dừa100ml/l + agar 7g/l

thước 1320 bp, mã hóa 439 amino acid Xây dựng được quy trình tái sinh, quy

trình chuyển gen thông qua A.tumefaciens và tạo được 4 dòng dừa cạn chuyển gen CrDATở thế hệ T1 (T1-1; T1-3; T1-6; T1-7) có hàm lượng alkaloid tổng số

tăng từ 3,16 lần đến 15,17 lần so với đối chứng không chuyển gen [6]

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat (AgNO3) lên

sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro của