NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH RA HOA IN VITRO CÂY HOA MẮT MÈO (TORENIA FOURNIERI L.) ỨNG DỤNG TRONG CHỌN LỌC ĐỘT BIẾN PHÓNG XẠ

Quá trình chuyển đổi từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự ra hoa cây Torenia in vitro. Kết quả cho thấy: chồi 60 ngày tuổi cho tỷ lệ hoa cao nhất sau 30 ngày đạt 65%. Chồi Torenia được nuôi cấy trên môi trường ¼MS không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung 60 gl sucrose, 1 gl than hoạt tính và nuôi cấy trong bình thủy tinh 500 ml sử dụng nắp đậy là film nylon có gắn màng milipore hoặc nút bông gòn không thấm đặt dưới điều kiện chiếu sáng 10 giờngày với cường độ là 45 µmol.m2.s1 cho tỷ lệ hình thành hoa cao nhất (đạt 89,18%, 2,80 nụ hoamẫu cấy). Bên cạnh đó, cây nuôi cấy trong cả hai điều kiện in vitro và ex vitro không có sự khác biệt về hình dạng và màu sắc hoa. Quy trình ra hoa in vitro cây Torenia có thể áp dụng vào chọn lọc đột biến phóng xạ để xác định hình dạng và màu sắc hoa ngay trong điều kiện in vitro mà không cần chọn lọc cồng kềnh ngoài đồng ruộng.

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH RA HOA IN VITRO CÂY HOA MẮT MÈO (TORENIA FOURNIERI L.) ỨNG DỤNG TRONG CHỌN LỌC ĐỘT BIẾN PHÓNG XẠ LÊ VĂN THỨC, LÊ THỊ BÍCH THY, LÊ THỊ THÙY LINH, ĐẶNG THỊ DIÊN, HÁN HUỲNH DIỆN 1 , TRẦN TRỌNG TUẤN, TRƯƠNG THỊ DIỆU HIỀN, NGUYỄN PHÚC HUY, DƯƠNG TẤN NHỰT 2 1 Viện Nghiên cứu hạt nhân, 01 Nguyên Tử Lực - Đà lạt - Lâm Đồng 2 Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên, 116 Xô Viết Nghệ Tĩnh - Đà lạt - Lâm Đồng Email: thucbiovhn@gmail.com TÓM TẮT Quá trình chuyển đổi từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự ra hoa cây Torenia in vitro. Kết quả cho thấy: chồi 60 ngày tuổi cho tỷ lệ hoa cao nhất sau 30 ngày đạt 65%. Chồi Torenia được nuôi cấy trên môi trường ¼MS không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung 60 g/l sucrose, 1 g/l than hoạt tính và nuôi cấy trong bình thủy tinh 500 ml sử dụng nắp đậy là film nylon có gắn màng milipore hoặc nút bông gòn không thấm đặt dưới điều kiện chiếu sáng 10 giờ/ngày với cường độ là 45 µmol.m -2 .s -1 cho tỷ lệ hình thành hoa cao nhất (đạt 89,18%, 2,80 nụ hoa/mẫu cấy). Bên cạnh đó, cây nuôi cấy trong cả hai điều kiện in vitro và ex vitro không có sự khác biệt về hình dạng và màu sắc hoa. Quy trình ra hoa in vitro cây Torenia có thể áp dụng vào chọn lọc đột biến phóng xạ để xác định hình dạng và màu sắc hoa ngay trong điều kiện in vitro mà không cần chọn lọc cồng kềnh ngoài đồng ruộng. Từ khóa: chất ĐHSTTV, giai đoạn sinh dưỡng, giai đoạn sinh sản, hoa in vitro, phóng xạ, Torenia fournieri L. 1. GIỚI THIỆU Kỹ thuật tạo hoa trong ống nghiệm (hoa in vitro) không những cung cấp sản phẩm hoa mini mà còn đi sâu tìm hiểu cơ chế nội sinh và các yếu tố ngoại sinh tác động lên quá trình biệt hóa chồi sinh dưỡng thành chồi sinh sản và hoa in vitro đã và đang được nghiên cứu trên rất nhiều đối tượng thực vật khác nhau. Trong đó, cây Torenia (hay cây hoa mắt mèo) cũng được Chlyah và Trần Thanh Vân bắt đầu tìm hiểu cơ chế ra hoa từ những năm 1971 vì Torenia là một loài cây thân thảo có vẻ đẹp giản dị, cánh hoa mềm mại, nhiều màu sắc, vòng đời ngắn và đáp ứng khá nhanh với điều kiện nuôi cấy in vitro nên rất phù hợp trong nghiên cứu sinh lí cơ bản [8, 9]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về ra hoa in vitro chỉ dừng ở giai đoạn lựa chọn mẫu cấy hay khảo sát một số yếu tố đến quá trình ra hoa nhưng tỷ lệ hình thành hoa còn thấp và thời gian ra hoa không đồng đều nên khó áp dụng vào chọn lọc đột biến trong điều kiện in vitro bởi tác nhân phóng xạ. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu, thành phần môi trường, điều kiện chiếu sáng và nuôi cấy lên sự sinh trưởng và ra hoa in vitro cây Torenia với mong muốn tạo ra quy trình ra hoa với tỷ lệ ra hoa cao và đồng đều nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu Nguồn mẫu là các chồi cây Torenia fournieri L. màu trắng viền tím và màu trắng viền hồng tái sinh từ mẫu lá nuôi cấy in vitro đã ổn định qua 3 lần cấy chuyền (20 ngày/lần) trên môi trường MS cơ bản [11], đạt chiều cao khoảng 3,5 cm được làm vật liệu cho tất cả các thí nghiệm. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của tuổi mẫu lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro Chồi Torenia 3,5 cm được lấy ở các giai đoạn khác nhau (30, 45 và 60 ngày) nuôi cấy trên môi trường ½MS (thành phần đa lượng giảm đi một nửa) có bổ sung 30 g/l sucrose và 8 g/l agar. 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số thành phần môi trường lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro Muối khoáng: chồi 3,5 cm được nuôi cấy trên các môi trường 2MS, MS, ¾MS, ½MS, ¼MS, MS¾, MS½, MS¼ có bổ sung 30 g/l sucrose và 8 g/l agar (trong đó: môi trường 2MS tăng thành phần đa lượng lên 2 lần; ¾MS, ½MS, ¼MS giảm thành phần đa lượng theo tỷ lệ tương ứng; môi trường ¼MS, MS¾, MS½ giảm cả thành phần đa lượng và vi lượng theo tỷ lệ tương ứng). α-naphthaleneacetic acid (NAA) và 6-benzylaminopurine (BAP): chồi 3,5 cm được nuôi cấy trên môi trường ¼MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 0,1 mg/l NAA và BA ở các nồng độ (0,0; 0,1; 0,3; 0,5 và 1,0 mg/l) hoặc 0,1 mg/l BA và NAA ở các nồng độ (0,0; 0,1; 0,3; 0,5 và 1,0 mg/l). Gibberellin (GA 3 ): chồi 3,5 cm được nuôi cấy trên môi trường ¼MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và GA 3 ở các nồng độ (0,0; 0,1; 0,5; 0,7 và 1,0 mg/l). Than hoạt tính: chồi 3,5 cm được nuôi cấy trên môi trường ¼MS tương tự có hoặc không có bổ sung 1 g/l than hoạt tính. Đường sucrose: chồi 3,5 cm được nuôi cấy trên môi trường ¼MS có bổ sung 8 g/l agar và đường sucrose ở các nồng độ (0; 15; 30; 45; 60; 75 và 90 g/l). 2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng và thời gian chiếu sáng lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro Chồi 3,5 cm được nuôi cấy trên môi trường ¼MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và cường độ chiếu sáng được điều chỉnh từ 18 - 45 µmol.m -2 .s -1 với thời gian chiếu sáng (6, 10 và 14 giờ/ngày). Nguồn sáng là đèn huỳnh quang ánh sáng trắng (C.ty Bóng đèn phích nước Rạng Đông). 2.2.4. Khảo sát độ thoáng khí lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro Chồi 3,5 cm được cấy trên môi trường ¼MS, 60 g/l sucrose, nắp đậy là bông gòn không thấm hoặc film nylon có và không có màng millipore (đ.kính: 1,8 cm, k.thước lỗ màng 0,5 µm). 2.2.5. Đánh giá sự phát sinh hình thái hoa cây Torenia ra hoa trong điều kiện in vitro và ex vitro Chồi Torenia (khoảng 300 chồi) được nuôi cấy trên môi trường ra hoa in vitro và 300 chồi nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản. Sau 15 ngày cây tạo rễ trên môi trường MS được được đưa ra trồng ngoài vườn ươm (ex vitro) để so sánh sự phát sinh hình thái giữa hoa nuôi cấy trong điều kiện in vitro và hoa nuôi trồng ở điều kiện ex vitro. 2.3. Điều kiện thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi Điều kiện in vitro: mẫu được cấy vào bình thủy tinh 500 ml chứa 60 ml môi trường. Mỗi nghiệm thức 15 mẫu (3 mẫu/bình) và được lặp lại 5 lần. Các thí nghiệm được giữ ở nhiệt độ 25 ± 2ºC, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày với cường độ 45 µmol.m -2 .s -1 (trừ thí nghiệm khảo sát ánh sáng) và ẩm độ trung bình 75 - 80%; Điều kiện ex vitro: nhiệt độ nhà lưới 18 - 27ºC, độ ẩm trung bình 85 - 90%, sử dụng nguồn ánh sáng tự nhiên và có che sáng 40%. Các chỉ tiêu theo dõi: chiều cao cây (cm), tỷ lệ (%) và thời gian hình thành nụ hoa (ngày), số nụ hoa/chồi, hình thái hoa và tình trạng mẫu cấy. Kết quả thí nghiệm được thu thập sau 20, 30, 45 và 60 ngày nuôi cấy. Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0 (SPSS Inc. Headquarters, United States) với phép thử Duncan ở mức xác suất có ý nghĩa P = 0,05 [5]. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của tuổi mẫu lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro Bảng 1. Sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro sau 30 ngày nuôi cấy Chỉ tiêu theo dõi Tuổi mẫu (ngày) 30 45 60 Trọng lượng tươi (mg) 1434a 1192ab 758b Trọng lượng khô (mg) 119ab 123a 99ab Chiều cao cây (cm) 9,62a 8,34b 7,95b Số lá/cây 14,50a 10,00b 8,50c Tỷ lệ ra hoa (%) 33,67c 42,86b 56,19a Số nụ hoa/cây 0,35c 1,33b 2,47a Ghi chú: Các chữ cái (a, b, c…) khác nhau trong cùng một dòng biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy P = 0,05 (Duncan’s test). Kết quả thu được cho thấy, tỷ lệ cây hình thành nụ hoa và số nụ hoa/cây tăng dần khi tuổi mẫu càng cao, hiệu quả cao nhất khi mẫu ở giai đoạn 60 ngày tuổi (56,19% và 2,47 nụ/cây) và thấp nhất ở giai đoạn 30 ngày tuổi (33,67% và 0,35 nụ/cây) (Bảng 1). Ngoài ra, kết quả số liệu như chiều cao cây, số lá/cây, trọng lượng tươi và trọng lượng khô cũng thể hiện rõ ảnh hưởng của tuổi mẫu lên quá trình sinh trưởng phát triển. Tuổi mẫu còn non (30 ngày tuổi) thì quá trình phát triển sinh dưỡng chiếm ưu thế, chiều cao cây và số lá/cây cao hơn hẳn so với mẫu ở giai đoạn 45 và 60 ngày tuổi (Bảng 1). Kết quả này có thể khẳng định, mẫu cấy ở giai đoạn 60 ngày tuổi là sự lựa chọn tốt nhất cho quá trình ra hoa in vitro ở cây Torenia, vì trong quá trình cấy chuyền mẫu cấy ở giai đoạn 75 ngày và 90 ngày tuổi cây phát triển lên đến nắp bình nuôi cấy làm cho các chồi đỉnh bị dị dạng, lá nhỏ và có hiện tượng úa vàng do nguồn dinh dưỡng đã cạn kiệt. 3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro 3.2.1. Muối khoáng Bảng 2. Ảnh hưởng của thành phần muối khoáng lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro MT Tỷ lệ cây tạo nụ hoa (%) H (cm) Số nụ hoa/cây TLT (mg) TLK (mg) 20 ngày 30 60 30 30 ngày 30 ngày 30 ngày ngày ngày ngày 2MS 0,00b 0,00h 0,00g 0,00g 0,00e 0,00d 0,00e MS 0,00b 5,17g 10,02f 8,90d 0,51cd 758c 68,90cd ¾M S 0,00b 16,67e 20,41e 9,83b 0,67cd 1015a 84,58b ½M S 0,00b 42,86c 56,19c 9,60c 1,15c 983a 95,22a ¼M S 6,38a 51,06a 75,14a 6,10f 2,30a 892b 89,20b MS ¾ 0,00b 28,57d 38,09d 8,15e 0,85cd 715c 65,00d MS ½ 0,00b 15,39f 20,37e 9,03d 0,79cd 867bc 72,25c MS ¼ 0,00b 44,00b 60,00b 11,60a 1,95b 875bc 67,31d Ghi chú: H: chiều cao cây; TLT: trọng lượng tươi; TLK: trọng lượng khô. Các chữ cái (a, b, c…) khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy P = 0,05 (Duncan’s test). Tỷ lệ hình thành nụ hoa Torenia trong điều kiện in vitro phụ thuộc rất lớn vào hàm lượng chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy. Tỷ lệ ra hoa và số nụ hoa/cây trên môi trường ¼MS là cao nhất so với các môi trường còn lại, đạt 51,06% với 2,30 nụ/cây (sau 30 ngày) và sau 60 ngày đạt 75,14% (Bảng 2). Sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia chịu ảnh hưởng mạnh của các yếu tố đa lượng (chủ yếu là N, P, K), nếu xét từ môi trường 2MS, MS, ¾MS, ½MS và ¼MS thì môi trường ¼MS có hàm lượng đa lượng thấp nhất. Môi trường 2MS mẫu bị chết hoàn toàn sau khoảng 1 tuần nuôi cấy. Vì vậy, đây có thể xem là giới hạn trên của nó; còn trong môi trường ¼MS thành phần đa lượng thấp, nghĩa là hàm lượng nitrogen (cung cấp dưới dạng NH 4 NO 3 ) giảm, trong khi đó lượng cacbon (đường) không đổi, điều này dẫn đến tỷ lệ C/N tăng và đã kích thích sự ra hoa, ngược lại các môi trường khác tỷ lệ C/N thấp hơn nên sự phát triển sinh dưỡng chiếm ưu thế (chiều cao tăng khi tỷ lệ C/N giảm). Kết quả này cũng tương tự ở Arabidopsis khi hàm lượng nitrogen cao đã làm chậm sự ra hoa (480 mg/l so với 8 mg/l NH 4 NO 3 ) [12]. Mặt khác, môi trường MS¾, MS½ và MS¼ thì sự phát triển chiều cao chiếm ưu thế, cây mảnh, yếu ớt, trọng lượng tươi và trọng lượng khô giảm đáng kể so với những môi trường chỉ thay đổi thành phần khoáng đa lượng (Hình 1a). Điều này luận chứng rõ hơn về tầm quan trọng của khoáng vi lượng trong quá trình phát sinh hình thái ở cây Torenia. 3.2.2. α-naphthaleneacetic acid (NAA) và 6-benzyaminopurin (BAP) Kết quả thu được cho thấy, quá trình biệt hóa từ chồi sinh dưỡng thành chồi sinh sản vẫn diễn ra sau 30 ngày nuôi cấy dù trong môi trường không bổ sung BAP ngoại sinh (51,06%). Khi lần lượt tăng nồng độ BAP (0,1; 0,3; 0,5 và 1,0 mg/l) và giữ nguyên nồng độ NAA (0,1 mg/l) thì sự cảm ứng hình thành nụ hoa và số nụ hoa/cây giảm dần. Tương tự, khi cố định BAP (0,1 mg/l) và thay đổi nồng độ NAA (0,1; 0,3; 0,5 và 1,0 mg/l) thì kết quả tạo nụ hoa vẫn theo khuynh hướng giảm dần khi nồng độ NAA tăng và hệ rễ phát triển nhiều hơn. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Tang và cộng sự (1983) ở cây Sắn (Manihot esculenta Crantz.) [1]. Tuy nhiên, không phải lúc nào auxin cũng ức chế quá trình cảm ứng tạo hoa, trong một số trường hợp auxin đóng vai trò chính quyết định sự hình thành hoa ở loài Capsicum annuum và Pisum sativum [6], [7]. Như vậy, sự ra hoa in vitro của cây Torenia không cần sự có mặt của BAP và NAA. 3.2.3. Gibberellin (GA 3 ) Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy GA 3 có thể là một yếu tố giới hạn quá trình ra hoa ở cây Torenia. Môi trường không bổ sung GA 3 cho sự cảm ứng tạo hoa đạt tỷ lệ cao nhất (75,14%) sau 60 ngày nuôi cấy. Ngược lại, môi trường bổ sung GA 3 ở nồng độ cao (1,0 mg/l) tỷ lệ cảm ứng tạo hoa là thấp nhất (16,03%). Bên cạnh đó, khi môi trường có bổ sung 0,7 mg/l GA 3 cho chiều cao cây là cao nhất (9,44 cm). Điều này có thể giải thích, khi bổ sung GA 3 vào môi trường ở nồng độ thấp đã làm cho giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng kéo dài hơn, sau 30 ngày mới bắt đầu hình thành nụ hoa, trong khi môi trường không có bổ sung GA 3 ngoại sinh là 20 ngày. 3.2.4. Than hoạt tính Trong quá trình nhân giống cây Torenia, chúng tôi đã bổ sung 1 g/l than hoạt tính (activated charcoal - AC) vào môi trường nuôi cấy và nhận thấy cây xanh tốt, cứng cáp hơn. Do đó, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng môi trường có và không có AC để xác định AC ảnh hưởng như thế nào đến quá trình ra hoa. Thực vậy, khi bổ sung 1 g/l AC vào môi trường nuôi cấy cho thấy, cây có thân lớn, lá xanh, rễ phát triển mạnh và thời gian hình thành nụ hoa sớm hơn. Sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường ¼MS bổ sung AC tỷ lệ hình thành nụ hoa cao hơn (56,33%) so với môi trường không bổ sung AC (51,06%). Ở giai đoạn 60 ngày nuôi cấy thì sự khác biệt này không đáng kể (77,25% so với 75,14%). Tuy nhiên, môi trường bổ sung AC sau 60 ngày nuôi cấy có hoa đồng đều, cây có màu xanh đậm, cứng cáp hơn so với cây trên môi trường không bổ sung AC. Bagadekar và Jayaraj (2011) cũng chứng minh được ảnh hưởng của AC lên sự ra hoa khi nghiên cứu loài Heliotropium indicum L. nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l IBA, 1 mg/l BAP và 5 g/l AC cho tỷ lệ ra hoa lên đến 85% [2]. 3.2.5. Đường sucrose Bảng 3. Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro Nồng độ đường (g/l) Tỷ lệ cây hình thành nụ hoa (%) Số nụ hoa/cây Hình thái 15 0,00f 0,00f Thân mảnh, yếu và sinh trưởng chậm 30 51,06d 0,60d Thân cao, lá xanh và hình thành nụ đơn 45 61,75c 1,67c Thân to, cây thấp, hình thành nụ hoa đôi 60 87,18a 2,80a Thân to, cứng cáp, nụ hoa xuất hiện nhiều 75 80,47b 2,33b Thân lùn, lá gốc vàng, đốt thân ngắn 90 27,78e 0,35e Cây yếu, lá và thân cây hóa vàng Ghi chú: Số liệu thu thập sau 30 ngày nuôi cấy; các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy P = 0,05 (Duncan’s test). Các nghiên cứu in vitro đã chứng minh, môi trường nuôi cấy với mục đích tạo hoa thì hàm lượng đường sucrose cao hơn so với môi trường nuôi cấy để phát triển sinh dưỡng [4]. Tỷ lệ chồi hình thành nụ hoa tăng dần khi tăng nồng độ sucrose và đạt hiệu quả cao nhất ở nồng độ 60 g/l (87,18%) (Bảng 3). Tuy nhiên, khi tăng nồng độ đường lên 90 g/l thì cây chậm phát triển, lá và thân cây hóa vàng (Hình 1b). Ngược lại, đường bổ sung ở nồng độ thấp (15 g/l) thì sự ra hoa không xảy ra (Bảng 3). Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Nguyễn Hồng Vũ và cộng sự (2006) trên đối tượng hoa Hồng (Hybrid tea cv. “Frist Prize”) khi tăng hàm lượng đường sucrose từ 15 g/l lên 45 g/l thì tỷ lệ hình thành hoa tăng lên từ 0,00 - 33,33% [10]. Trong thí nghiệm này, nồng độ 60 g/l sucrose là tối ưu cho quá trình tạo hoa in vitro ở cây Torenia. Thời gian (ngày) 3.3. Ảnh hưởng của cường độ và thời gian chiếu sáng lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro Sự sinh trưởng, phát triển của cây Torenia chịu ảnh hưởng nhiều bởi cường độ ánh sáng, khi cường độ chiếu sáng thay đổi 18 - 45 µmol.m -2 .s -1 và giữ nguyên thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày. Kết quả sau 60 ngày cho thấy, cây Torenia đặt dưới ánh sáng cường độ thấp (18 và 25 µmol.m -2 .s -1 ), cây phát triển yếu ớt, thân mảnh, rễ phát sinh ít, lá chuyển sang màu trắng hay vàng dần và không có mẫu nào hình thành nụ hoa. Hiện tượng này có thể là do khi đặt cây trong điều kiện thiếu ánh sáng, cây sẽ chuyển sang giai đoạn suy thoái ngay khi sử dụng hết chất dinh dưỡng dự trữ. Cây đặt dưới cường độ chiếu sáng 45 µmol.m -2 .s -1 thì hoàn toàn ngược lại, cây phát triển tốt, lá xanh, sinh nhiều nhánh, rễ phát triển mạnh, tỷ lệ tạo nụ hoa cao (75,14%), nụ to và chiều cao chồi đạt (7,97 cm). Khi xác định được cường độ chiếu sáng 45 µmol.m -2 .s -1 là tốt nhất, thí nghiệm về thời gian chiếu sáng được tiến hành với ba mốc thời gian 6, 10, 14 giờ/ngày. Kết quả thu được cho thấy, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày cho tỷ lệ hình thành nụ hoa cao nhất (75,14%). Kết quả này tương tự với kết quả trong nghiên cứu ra hoa cây Kinnow mandarin (Citrus nobilis Lour x C. Deliciosa Tenora) in vitro sự ra hoa cao nhất khi chiếu sáng 12 giờ (đạt 31,94%), trong khi ở chu kỳ 8 giờ chỉ có 1,38% [3]. Như vậy, cường độ chiếu sáng 45 µmol.m -2 .s -1 trong thời gian 10 giờ/ngày là tốt nhất cho quá trình ra hoa in vitro ở cây Torenia. 3.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro Bảng 4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí lên sự sinh trưởng và ra hoa cây Torenia in vitro Chỉ tiêu theo dõi Nghiệm thức Nút bông gòn Màng millipore Film nylon Trọng lượng tươi (mg) 1167 ns 1263 ns 1158 ns Trọng lượng khô (mg) 162,67a 154,50a 96,50b Chiều cao cây (cm) 8,73b 8,92b 11,57a Số nụ hoa/cây 2,75 ns 2,80 ns 2,80 ns Tỷ lệ hình thành nụ hoa (%) 89,18a 89,25a 75,14b Đường kính lá (mm) 15,5a 16,33a 12,26b Chiều dài lá (mm) 26,41a 25,54a 18,59b Ghi chú: Số liệu thu thập sau 60 ngày nuôi cấy; ns: sự khác biệt không có ý nghĩa (non-significant difference); các chữ cái (a, b, c…) khác nhau trong cùng một dòng biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy P = 0,05 (Duncan’s test). Nuôi cấy thoáng khí tác động đến sự trao đổi khí, hoạt động của nước, vi môi trường và sự cân bằng hormone trong các bình nuôi cấy. Trong thí nghiệm này, trọng lượng tươi của các cây nuôi cấy trong cả ba nghiệm thức không có sự khác biệt đáng kể về phương diện thống kê nhưng trọng lượng khô thu được có sự khác biệt rất rõ, ở hai nghiệm thức nút bông gòn và film nylon có dán màng millipore là cao hơn so với sử dụng film nylon không gắn màng. Mặt khác, kết quả về tỷ lệ hình thành nụ hoa cũng cho thấy sự khác biệt rõ (Bảng 4). Hì nh 1. Sự ra hoa in vitro và ex vitro ở cây Torenia. a. Ảnh hưởng của thành phần muối khoáng lên sự hình thành nụ hoa cây Torenia in vitro (từ trái qua phải tương ứng với môi trường 2MS, MS, ¾MS, ½MS, ¼MS, MS¾, MS½ và MS¼); b. Ảnh hưởng của nồng độ đường khác nhau lên sự ra hoa in vitro cây Torenia; c. Hoa Torenia trong điều kiện in vitro; d. Hoa Torenia ở điều kiện ex vitro. 3.5. Đánh giá sự phát sinh hình thái hoa ở cây Torenia trong điều kiện in vitro và ex vitro Tổng số 300 cây Torenia đưa ra vườn ươm được trồng trên giá thể đất mùn trong các vỉ xốp 66 lỗ (6 x 11), chế độ tưới 2 lần/ngày vào lúc sáng sớm và chiều mát, tưới dung dịch dinh dưỡng (¼MS) mỗi tuần/lần. Số liệu thu được cho thấy, cây có tỷ lệ sống sót cao (> 90%), bộ rễ phát triển mạnh, cây xanh tốt, sinh trưởng, phát triển đồng đều và ít bị nấm bệnh. Những cây trồng trong điều kiện ex vitro sau khoảng 40 ngày thì cây bắt đầu hình thành nụ hoa và một số cây đã nở hoa. Kết quả so sánh quá trình phát sinh hình thái giữa cây trồng trong điều kiện in vitro và cây trồng ex vitro không có sự khác biệt đáng kể về hình thái lá, thân và màu sắc hoa (Hình 1c, d). Đặc biệt, hình dạng cánh hoa, nhị và nhụy hoa cũng tương đồng so với giống bố mẹ. Như vậy, hoa Torenia nuôi cấy trong điều kiện in vitro hoàn toàn giống với hoa Torenia được trồng ở điều kiện ex vitro. Kết quả này là một tín hiệu khẳng định, có thể sử dụng mô hình ra hoa in vitro cây Torenia vào chọn lọc đột biến phóng xạ. 4. KẾT LUẬN Chồi 60 ngày tuổi là nguồn mẫu phù hợp cho sự ra hoa in vitro cây Torenia. Môi trường thích hợp cho sự ra hoa là ¼MS có bổ sung 60 g/l đường sucrose, có hoặc không có bổ sung 1 g/l than hoạt tính, 8 g/l agar nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng với cường độ chiếu sáng 45 µmol.m - 2 .s -1 và thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày cho tỷ lệ hình thành nụ hoa là 89,18% và đạt 2,80 nụ/chồi. Sự ra hoa in vitro ở loài Torenia không cần sự có mặt của phytohormone. Hoa nuôi cấy trong hai điều kiện in vitro và ex vitro không có sự khác biệt về hình dạng, kích thước và màu sắc hoa. Chồi 60 ngày tuổi là nguồn mẫu phù hợp cho sự ra hoa in vitro ở cây Torenia fournieri L. Môi trường thích hợp cho sự ra hoa là ¼MS có bổ sung 60 g/l đường sucrose, 1 g/l than hoạt tính, 8 g/l agar nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng với cường độ chiếu sáng 45 µmol.m -2 .s -1 và thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, sử dụng nắp bình là film nylon có gắn màng Millipore hoặc sử dụng nút bông gòn không thấm cho tỷ lệ cây hình thành nụ hoa là cao nhất (89,18%). Sự ra hoa in vitro ở loài T. fournieri L. không cần sự có mặt của phytohormone. Cây nuôi cấy trong hai điều kiện in vitro và ex vitro cây không có sự khác biệt về hình dạng và màu sắc hoa. Kết quả này sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu cơ bản, cũng như nghiên cứu về lai tạo giống trong điều kiện in vitro. Đặc biệt, quy trình ra hoa in vitro có thể ứng dụng vào chọn tạo giống đột biến phóng xạ và phân lập những biến dị về hình thái, cấu trúc và màu sắc hoa cây Torenia fournieri L. ngay trong điều kiện in vitro mà không cần phải thông qua chọn lọc đột biến cồng kềnh phức tạp ở điều kiện ngoài đồng ruộng. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A.F. Tang, M. Cappadocia and D. Byrne, “In vitro flowering in Cassava (Manihot esculenta Crantz)”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2, 199-206, 1983. [2] A.N. Bagadekar and M. Jayaraj, “In vitro flowering of Heliotropium indicum L. An important medicinal herb”, Asian Journal of Experimental Biological Sciences, 2(1), 90-95, 2011. [3] B. Singh, S. Sharma, G. Rani, G.S. Virk, A.A. Zaidi and A. Nagpal, “In vitro flowering in embryogenic cultures of Kinnow mandarin (Citrus nobilis Lour x C. deliciosa Tenora)”, African Journal of Biotechnology, 5(16), 1470-1474, 2006. [4] C.W.S. Dickens and J. Van Staden, “The induction and evocation of flowering in vitro” South African Journal of Botany, 54, 325-344, 1988. [5] D.B. Duncan, “Multiple range and multiple F test” Biometrics 11, 1-42, 1995. [6] G. Franklin, P.K. Pius and S. Ignacimuthu, “Factors affecting in vitro flowering and fruiting of green tea (Pisum Sativum L.)”, Euphytica, 115, 65-74, 2000. [7] K. Bodhipadma and D.W.M. Leung, “In vitro fruiting and seed set of Capsicum annumi cv. sweet banana”, In vitro Plant Cell and Developmental Biology, 39, 536-539, 2003. [8] L. Chlyah and M. Tran Thanh Van, “Distribution pattern of cell division centers on the epidermis of stem segments of Torenia fournieri during de novo bud formation”, Plant Physiology, 56, 28-33, 1975. [9] M.P. Bridgen, M.Z. Hadi and M. Spencer-Barreto, “A laboratory exercise to demonstrate direct and indirect shoot organogenesis from leaves of Torenia fournieri”, Hort Tech., 4, 320- 322, 1994. [10] N.H. Vu, P.H. Anh and D.T. Nhut, “The role of sucrose and different cytokinins in the in vitro floral morphogenesis of Rose (hybrid tea) cv. “First Prize””, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 87, 315-320, 2006. [11] T. Murashige and F. Skoog, “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue culture”, Physiol. Plant, 15, 473-497, 1962. [12] W. Schulze, E.D. Schulze, J. Stader, H. Heilmeier, M. Stitt and H.A. Mooney, “Growth and reproduction of Arabidopsis thaliana in relation to storage of strarch and nitrate in the wild type and in starch-deficient and nitrate-uptake-deficient mutants”, Plant Cell and Environment, 17, 795-809, 1994. ABSTRACT STUDY ON PROCEDURE OF IN VITRO FLOWERING OF TORENIA (TORENIA FOURNIERI L.) TO APPLYING ON MUTATION SELECTING BY IRRADIATION LE VAN THUC, LE THI BICH THY, LE THI THUY LINH, DANG THI DIEN, HAN HUYNH DIEN 1 , TRAN TRONG TUAN, TRUONG THI DIEU HIEN, NGUYEN PHUC HUY, DUONG TAN NHUT 2 1 Nuclear Research Institute, 01Nguyen Tu Luc - Dalat - Lam Dong 2 Tay Nguyen Institute for Scientific Research, 116 Xo Viet Nghe Tinh - Dalat - Lam Dong Email: thucbiovhn@gmail.com The transformation from vegetative to reproductive stage depends on a lot of different elements. In this study, we examined some elements that affect to the differentiating ability of in vitro Torenia fournieri L. flower shoot. Results showed that the older the shoots were, the higher the percentage of flowering shoot formation would be. 60-day-old shoots gave the highest percentage of flowering shoot formation (65%) after 30-day culture. Moreover, the amount of macronutrients and micronutrients, sucrose concentration, growth regulators, activated charcoal and lighting conditions affect significantly the flowering ability. Shoots cultured on plant growth regulator free ¼MS media supplemented with 60 g.l -1 sucrose and 1 g.l -1 activated charcoal in vessels covered with either plastic wrap with milipore filter or unabsorbable cotton-wool plug under a 10h light (45 µmol.m -2 .s -1 )/14h dark photoperiod resulted in the best flowering shoot formation of Torenia shoots cultured in vitro (89.18%, 2.80 flower buds/explant). In vitro flowers and the ex vitro ones have no significant difference in their morphology and color. Procedure of in vitro flowering of Torenia can be applied to select mutation form by irradiation. Base on this method, we earier to study on the variation in morphology and color of flowers in vitro conditions without taking a lot of time to select on the field. Keyword: in vitro flowering, phytohormone, reproductive stage, Torenia fournieri L., irradiation, vegetative stage . MUTATION SELECTING BY IRRADIATION LE VAN THUC, LE THI BICH THY, LE THI THUY LINH, DANG THI DIEN, HAN HUYNH DIEN 1 , TRAN TRONG TUAN, TRUONG THI DIEU HIEN, NGUYEN PHUC HUY, DUONG TAN NHUT 2 1 Nuclear. D.W.M. Leung, “In vitro fruiting and seed set of Capsicum annumi cv. sweet banana”, In vitro Plant Cell and Developmental Biology, 39, 536-539, 2003. [8] L. Chlyah and M. Tran Thanh Van, “Distribution. 01Nguyen Tu Luc - Dalat - Lam Dong 2 Tay Nguyen Institute for Scientific Research, 116 Xo Viet Nghe Tinh - Dalat - Lam Dong Email: thucbiovhn@gmail.com The transformation from vegetative to reproductive