Nghiên cứu sự hình thành tế bào đơn cây lan hồ điệp (phalaenopsis amabilis) và ứng dụng trong nhân giống (tóm tắt)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRỊNH THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH TẾ BÀO ĐƠN CÂY LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS AMABILIS) VÀ ỨNG DỤNG TRONG NHÂN GIỐNG Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 62 42 30 05 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh năm 2016 Công trình hoàn thành tại: Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Dương Tấn Nhựt PGS TS Võ Thị Bạch Mai Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Quỳnh Phản biện 2: TS Bùi Minh Trí Phản biện 3: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên Phản biện độc lập 1: PGS.TS Đặng Văn Đông Phản biện độc lập 2: TS Đoàn Thị Phương Thùy Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp vào lúc ngày tháng Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên năm MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NUÔI CẤY MÔ SẸO 1.2 NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 1.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN 1.4 NUÔI CẤY PHÔI 1.5 SỰ BIỂU HIỆN GENE TRONG QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI SOMA 1.6 QUÁ TRÌNH TÁI SINH CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI 2.1.1 Địa điểm tiến hành đề tài 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1 Vật liệu dùng nuôi cấy 2.2.2 Vật liệu dùng sinh trắc nghiệm 2.3 MÔI TRƯỜNG, ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN KẾT QUẢ 2.3.1 Môi trường thí nghiệm tạo mô sẹo, phôi, PLB, tế bào đơn, 2.3.2 Thiết kế thí nghiệm nuôi cấy lỏng lắc 2.3.3 Điều kiện nuôi cấy 2.3.3.1 Điều kiện nuôi cấy in vitro 2.3.3.2 Điều kiện vườn ươm 2.3.4 Phương pháp xác định số lượng tế bào, sinh khối (trọng lượng mô sẹo, sinh khối huyền phù, phôi, PLB con) 2.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.4.1 Nội dung 1: Tạo nguồn mẫu ban đầu cho nuôi cấy tế bào đơn 2.4.1.1 Qui trình tạo mẫu in vitro 2.4.1.2 Nuôi cấy in vitro tạo nguồn PLB ban đầu 2.4.1.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB 2.4.1.4 Khảo sát môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào 2.4.2 Nội dung 2: Nuôi cấy huyền phù tế bào thu nhận tế bào đơn 2.4.2.1 Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả phát sinh hình thái hình thành tế bào đơn huyền phù tế bào 2.4.2.2 Xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy tế bào đơn lan Hồ điệp i 2.4.2.3 Thí nghiệm 4.4 Xác định đường cong tăng trưởng huyền phù tế bào lan Hồ điệp 2.4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu tái sinh tế bào đơn 2.4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng giá thể, môi trường khoáng sucrose lên tái sinh 2.4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng loại đường (đường đơn, đường đôi) lên phát sinh phôi 2.4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng loại dịch chiết hữu có nguồn gốc tự nhiên lên phát sinh hình thái lan Hồ điệp 2.4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu chuẩn hóa in vitro 2.4.5 Nội dung 5: Chuyển nuôi cấy mô vườn ươm, trồng thử nghiệm, theo dõi sinh trưởng 2.4.6 Hình thái giải phẫu 10 2.4.7 Đo cường độ hô hấp 10 2.4.8 Đo hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh 10 2.4.9 Thống kê xử lý số liệu 10 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10 3.1 NỘI DUNG 1: TẠO NGUỒN MẪU BAN ĐẦU CHO NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN 10 3.1.1 Kết nuôi cấy phát hoa nuôi cấy in vitro tạo nguồn PLB ban đầu 10 3.1.2 Xác định môi trường nhân nhanh PLB có nguồn gốc từ mẫu cấy hình thành từ nuôi cấy phát hoa lan Hồ điệp 10 3.1.2.1 Thí nghiệm 1.1 Ảnh hưởng BA lên tăng sinh PLB từ mảnh có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy 10 3.2.2.2 Thí nghiệm 1.2 Ảnh hưởng NAA lên tăng sinh PLB từ mảnh có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy 11 3.1.2.3 Thí nghiệm 1.3 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng lên khả tăng sinh PLB từ mảnh có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy 11 3.1.3 Xác định môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào 12 3.1.3.1 Thí nghiệm 2.1 Ảnh hưởng mannitol đến tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau tuần nuôi cấy 12 3.1.3.2 Thí nghiệm 2.2 Ảnh hưởng adenine đến tạo mô sẹo có khả sinh phôi từ lTCL-PLB lan Hồ điệp sau tuần nuôi cấy 12 3.2 NỘI DUNG 2: NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO THU NHẬN TẾ BÀO ĐƠN 13 ii 3.2.1 Thí nghiệm Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả phát sinh hình thái hình thành tế bào đơn nuôi cấy huyền phù tế bào mô sẹo có khả sinh phôi sau 14 tuần nuôi cấy 13 3.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào tạo dòng tế bào có khả hình thành tế bào đơn 14 3.2.2.1 Thí nghiệm 4.1 Ảnh hưởng BA lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy 3.2.2.2 Thí nghiệm 4.2 Ảnh hưởng sucrose lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy 14 3.2.2.3 Thí nghiệm 4.3 Ảnh hưởng sucrose kết hợp với sorbitol lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy 15 3.2.2.4 Thí nghiệm 4.4 Xác định đường cong tăng trưởng tế bào đơn nuôi cấy huyền phù tế bào lan Hồ điệp 15 3.3 NỘI DUNG 3: NGHIÊN CỨU TÁI SINH TẾ BÀO ĐƠN 15 3.3.1 Ảnh hưởng giá thể, môi trường khoáng sucrose lên tái sinh 15 3.3.1.1 Thí nghiệm 5.1 Ảnh hưởng giá thể lên khả tạo mô sẹo phát sinh phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 15 3.3.1.2 Thí nghiệm 5.2 Ảnh hưởng khoáng sucrose lên trình phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy 16 3.3.2 Ảnh hưởng loại đường (đường đơn, đường đôi) lên phát sinh phôi lan Hồ điệp 17 3.3.2.1 Thí nghiệm 6.1 Ảnh hưởng D-glucose lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy 17 3.3.2.2 Thí nghiệm 6.2 Ảnh hưởng D-fructose lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy 17 3.2.2.3 Thí nghiệm 6.3 Ảnh hưởng sucrose thí nghiệm (TN) lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy 17 3.2.2.4 Thí nghiệm 6.4 Ảnh hưởng sucrose công nghiệp (CN) lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy 18 3.3.3 Ảnh hưởng loại dịch chiết hữu có nguồn gốc tự nhiên lên phát sinh hình thái lan Hồ điệp 18 iii 3.3.3.1 Thí nghiệm 7.1 Ảnh hưởng dịch chiết Cà chua lên phát sinh hình thái mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 18 3.3.3.2 Thí nghiệm 7.2 Ảnh hưởng Chuối nghiền lên phát sinh hình thái mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 18 3.3.3.3 Thí nghiệm 7.3 Ảnh hưởng Khoai tây nghiền lên phát sinh hình thái mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 19 3.4 NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CHUẨN HÓA CÂY CON IN VITRO 19 3.4.1 Thí nghiệm 8.1 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng hàm lượng nước dừa lên khả sinh trưởng có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 19 3.4.2 Thí nghiệm 8.2 Ảnh hưởng mật độ cấy chuyền lên khả sinh trưởng có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 20 3.4.3 Thí nghiệm 8.3 Ảnh hưởng chiều cao có nguồn gốc từ tế bào đơn cấy chuyền lên sinh trưởng chúng sau 12 tuần nuôi cấy 20 3.4.4 Thí nghiệm 8.4 Ảnh hưởng tuổi cấy chuyền lên sinh trưởng chúng điều kiện in vitro sau 12 tuần nuôi cấy 20 3.5 KẾT QUẢ QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẪU CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI, PLB VÀ RỄ 21 3.6 CHUYỂN CÂY NUÔI CẤY MÔ RA VƯỜN ƯƠM, TRỒNG THỬ NGHIỆM, THEO DÕI SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN 21 3.6.1 Thí nghiệm 9.1 Ảnh hưởng chế độ tưới nước đến khả sinh trưởng có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần vườn ươm 21 3.6.2 Thí nghiệm 9.2 Ảnh hưởng chiều cao có nguồn gốc từ tế bào đơn lên khả sinh trưởng chúng sau 20 tuần vườn ươm 21 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 23 4.1 KẾT LUẬN 23 4.2 ĐỀ NGHỊ 24 iv MỞ ĐẦU Mặc dù thị trường xuất phong lan giới có nhiều triển vọng song để đáp ứng nhu cầu nội địa, tiến vào thị trường giới, ngành công nghiệp hoa lan Việt Nam phải quan tâm nhiều đến vấn đề tạo giống, công nghệ sản xuất, canh tác, công nghệ sau thu hoạch, đóng gói, kiểm dịch đầu tư mở rộng sở hạ tầng Hàng năm Việt Nam hàng tỷ đồng để nhập phong lan từ nước láng giềng cho nhu cầu nội địa Hiện nay, việc nhân giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis) có nhiều triển vọng Tuy nhiên, hầu hết giống lan dễ xảy biến dị việc nuôi cấy hạt tạo đồng (Arditti, 1992) Do vậy, để tạo đồng cần phải áp dụng phương pháp nhân giống vô tính Khó khăn lớn nhân giống vô tính lan Hồ điệp nguồn mẫu hạn chế chúng lan đơn thân, sử dụng chồi đỉnh để nuôi cấy nhiều loài lan khác làm tổn thương mẹ (Intuwong Sagawa, 1974) Hơn nữa, lan Hồ điệp thường tiết nhiều hợp chất phenol từ bề mặt vết cắt môi trường nuôi cấy, gây độc cho mẫu (Fast, 1979) Đối với lan Hồ điệp quy trình tái sinh có tần số cao chưa xác định (Takuhara Mii, 2001) Trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nuôi cấy tế bào đơn có nhiều ưu điểm vượt trội Để tạo dòng tế bào đơn nuôi cấy huyền phù tế bào, việc loại bỏ cụm tế bào lớn, sau ly tâm giúp thu huyền phù tế bào lý tưởng chứa tế bào đơn Tế bào đơn đối tượng nghiên cứu sinh hóa, bệnh lý tế bào, đồng thời thông qua thu nhận tế bào trần Do tế bào có tính toàn nên từ tế bào sinh dưỡng thực vật tái sinh thành hoàn chỉnh, sau tạo khối tế bào dạng mô sẹo Về mặt lý thuyết nuôi cấy tế bào đơn thành công cho hệ số nhân giống cao vượt trội hẳn so với kỹ thuật khác, chất lượng đồng Nuôi cấy tế bào đơn mở ứng dụng việc tạo dòng tế bào đột biến, dòng siêu sản xuất sản phẩm thứ cấp khả tăng tần suất đột biến di truyền thực vật bậc cao, giúp rút ngắn thời gian lai tạo giống Xuất phát từ vấn đề trên, tác giả tiến hành luận án: “Nghiên cứu hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) ứng dụng nhân giống” CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NUÔI CẤY MÔ SẸO Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường tạo xáo trộn trình tạo quan Do đó, phần non thể thực vật (mô phân sinh ngọn, thân, rễ,…) dễ tạo mô sẹo điều kiện nuôi cấy in vitro, tác động auxin mạnh (như 2,4-D) sử dụng riêng rẽ hay kết hợp với auxin khác hay với cytokinin Ngược lại, mảnh quan trưởng thành thường khả tạo quan, khả tạo mô sẹo (Taiz Zeiger, 2006; George et al., 2008) Sự tạo mô sẹo in vitro thuộc ba trình: phản phân hóa tế bào nhu mô (xung quanh mộc hay libe, vỏ hay lõi), phân chia tế bào tượng tầng hay xáo trộn mô phân sinh sơ khởi để tạo mô sẹo, cần ý đến tuổi mô cấy, sử dụng auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin, chất loại auxin nồng độ auxin (Hopkin, 1995; Bùi Trang Việt, 2000; George et al., 2008; Suárez Bozhkov, 2008; Grafi et al., 2011) Quá trình hình thành mô sẹo chia ba giai đoạn: Giai đoạn 1: giai đoạn phát sinh mô sẹo, trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn phụ thuộc vào loại mô mẫu, tình trạng sinh lý mẫu điều kiện nuôi cấy Giai đoạn 2: phân chia tế bào, sau hình thành, tế bào mô sẹo phân chia nhanh tạo nhiều tế bào Giai đoạn 3: biệt hóa, tế bào mô sẹo vào giai đoạn biệt hóa, xuất đường trao đổi chất dẫn đến sản xuất hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học 1.2 NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO Nuôi cấy huyền phù tế bào khởi đầu cách chuyển khối mô sẹo vào môi trường B5, MS lỏng khuấy bổ sung thêm dịch chiết có nguồn gốc tự nhiên nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết malt,… Các tế bào tách khỏi khối mô sẹo phân tán vào môi trường lỏng, nơi chúng phân chia để tạo thành cụm tế bào nhỏ Nuôi cấy trì qua loạt cấy chuyền điều kiện dinh dưỡng thoáng khí thích hợp Việc bổ sung thêm dịch chiết có nguồn gốc tự nhiên nước dừa, dịch chiết nấm men, auxin cytokinin nồng độ tối ưu thúc đẩy phân bào tăng tốc độ tăng trưởng (Earle Torrey, 1965; King et al., 1973) Sự phân bố tế bào cụm tế bào phụ thuộc vào thành phần môi trường dinh dưỡng thông khí môi trường Theo King (1980) nuôi cấy huyền phù tế bào gần với nuôi cấy tế bào đơn Huyền phù tế bào lý tưởng có phân chia tế bào tích cực, cân tốt hai trình tạo nhóm tách rời tế bào, có tính đồng cao hình thái sinh hóa Huyền phù tế bào lý tưởng dịch mịn, bao gồm tế bào có khả sinh phôi, cô lập hay hợp lại thành nhóm nhỏ chứa từ vài đến vài chục tế bào có khả trì tính toàn tiến hóa thành phôi soma môi trường tái sinh điều kiện thích hợp (Bùi Trang Việt, 2000; Assani et al., 2002; George et al., 2008) Nhu cầu ánh sáng trình tạo huyền phù tế bào thường tương tự trình hình thành mô sẹo trước Sự hình thành tăng trưởng huyền phù tế bào xảy điều kiện tối hoàn toàn Solanum tuberosum L (De Vries Bokelmann, 1986); hay Daucus carota (Fujimura Komamine, 1979)]; xảy điều kiện chiếu sáng Pyrus communis [(Mehra Jaidka, 1985), Brassica nigra (Klimaszewska Keller, 1986) hay Solanum melongena (Gleddie et al., 1983) 1.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN Bản thân tế bào thực vật đơn vị độc lập, chứa đựng tất thông tin di truyền đặc trưng thể từ sinh Cho nên tế bào xây dựng lại toàn thể nhờ tính toàn Nuôi cấy tế bào đơn phương pháp nuôi cấy tế bào phân lập vô trùng môi trường dinh dưỡng điều kiện có kiểm soát (King, 1980) Các nguyên tắc nuôi cấy tế bào đơn cô lập số lượng lớn tế bào sống nguyên vẹn nuôi cấy chúng môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tăng trưởng phát triển Tế bào đơn thu nhận từ loạt mô quan thực vật từ mô sẹo huyền phù tế bào Theo phương pháp truyền thống tế bào đơn thu nhận từ nuôi cấy mô sẹo huyền phù tế bào hệ thống máy lắc Các tế bào đơn cô lập cách cẩn thận từ huyền phù tế bào kim tiêm Nhờ rung lắc máy lắc làm cho cụm mô sẹo tạo tế bào đơn cụm nhỏ tế bào môi trường Kết tạo thành huyền phù tế bào Huyền phù tế bào lọc để loại bỏ khối tế bào dịch lọc sau ly tâm để thu nhận tế bào đơn Các mô sẹo rời thường chọn để nuôi cấy tế bào đơn Tế bào đơn đối tượng nghiên cứu sinh hóa, bệnh lý tế bào, đồng thời thông qua thu nhận tế bào trần Do tế bào có tính toàn nên từ tế bào sinh dưỡng thực vật tái sinh thành hoàn chỉnh, sau tạo khối tế bào dạng mô sẹo Nuôi cấy tế bào đơn mở ứng dụng việc tạo dòng tế bào đột biến, dòng siêu sản xuất sản phẩm thứ cấp khả tăng tần suất đột biến di truyền thực vật bậc cao Mô sẹo sử dụng cho nuôi cấy tế bào đơn 1.4 NUÔI CẤY PHÔI Phôi soma (phôi vô tính, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ) phôi hình thành theo đường vô tính từ tế bào soma (tế bào sinh dưỡng 2n), theo đường sinh phôi soma Phôi soma phổ biến nuôi cấy in vitro mô tách rời môi trường dinh dưỡng có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh Trong trình sinh phôi soma, tế bào soma đóng vai trò sinh phôi hợp tử phát triển phôi trải qua giai đoạn trình sinh phôi hợp tử Sự diện phôi soma điểm kết thúc chuỗi bước bao gồm thu nhận tế bào có khả phát sinh phôi biệt hóa tế bào (Suárez Bozhkov, 2008) Để tạo thành phôi soma, tế bào thực vật biệt hóa cần phản biệt hóa (trừ tế bào mô phân sinh) tạo thành tế bào gốc, phát triển thông qua giai đoạn phôi đặc trưng để tạo tất loại tế bào Do đó, tế bào tiền thân phôi soma tế bào gốc có tính toàn Các đặc điểm để phân biệt phôi soma với chồi bất định giải phẫu hình thái cho thấy phôi có cấu tạo rời rạc, độc lập liên kết mạch với mô mô mẹ (Haccius, 1978; Rafael, 2009) Tuy nhiên, sau công bố nhiều báo phôi soma, nhà nghiên cứu không hiểu làm mà tế bào lập trình lại để có thẩm quyền tạo thành phôi soma (Michael et al., 2010) Quá trình phát sinh phôi soma thường xem đường trung tâm trình vi nhân giống thực vật có vai trò đặc biệt quan trọng nghiên cứu phát sinh hình thái thực vật Quá trình thu nhận phôi soma thường bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn tạo tế bào sinh phôi (mô sẹo dịch huyền phù tế bào) giai đoạn tiến hóa phôi soma từ tế bào sinh phôi Dưới điều kiện xác định, tế bào mô sẹo hay huyền phù tế bào cho sơ khởi quan (sinh quan) hay phôi (sinh phôi soma) dựa vào tính toàn tế bào thực vật (Ahloowalia, 1991; Bùi Trang Việt, 2005) Sự sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng phải trải qua hai giai đoạn: Giai đoạn 1: mô nuôi cấy môi trường có auxin tăng sinh nhanh, tế bào môi trường phản phân hóa tính hữu cực Giai đoạn 2: mô sẹo từ giai đoạn chuyển sang môi trường có auxin, môi trường tính hữu cực sinh phôi cảm ứng với trạng thái phôi từ hình cầu đến trạng thái hình tim trạng thái hình cá đuối Các phân tích trình phát triển phôi cho thấy hình thành phôi thực vật gồm hai giai đoạn chính: phân đoạn sinh quan phôi Các yếu tố ảnh hưởng đến trình phát sinh phôi: chất điều hòa sinh trưởng, nguồn carbohydrate, nguồn nitrogen, thành phần khoáng môi trường nuôi cấy, tính chất đồng tế bào Hiện nay, nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa trình sinh phôi huyền phù tế bào tạo phôi xảy không đồng tần số không cao Gần đây, người ta thành công việc tạo phôi đồng từ cụm tế bào kích thước nhỏ với tần số cao trước Nuôi cấy phôi soma xem kỹ thuật mang lại nhiều hiệu nhân giống trồng mà nhân giống vô tính theo phương pháp cổ điển có nhiều hạn chế 1.5 SỰ BIỂU HIỆN GENE TRONG QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI SOMA Mỗi giai đoạn phát triển phôi soma liên quan đến việc kích hoạt khử hoạt tính gene Quá trình phát triển số trồng kết loạt tương tác gene, đòi hỏi biểu gene khởi động (Torres-Ruiz et al.,1996) Sự cô lập gene cụ thể định sinh phôi, đặc tính vai trò chúng trình phát triển phôi tảng cho hiểu biết tổng quát trình điều khiển sinh phôi cấp độ phân tử (Magioli et al., 2001) Các giai đoạn chế tham gia vào trình biến đổi tế bào mô sẹo thành tế bào phôi chưa biết rõ Giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo chuyển hóa thành phôi gọi chung giai đoạn tạo phôi soma sớm (Kairong et al., 1999; Sato et al., 1995; Momiyama et al., 1995) Các nghiên cứu gần cố gắng xác định khác biệt biểu gene mô sẹo mô phôi Duncan cộng (2003) nhận thấy mô với hàm lượng cao protein globulin-1 (Glb1) mã hóa chuỗi polypeptid mô có thẩm quyền tạo phôi Trong mô phôi, nồng độ Glb1 thấp Các protein Glb1 tổng hợp phôi hợp tử sau hoa thụ phấn Sự biểu gene SERK phát Trọng lượng Số PLB Số chồi Số Tỷ lệ sống sót tươi (mg/mẫu) (PLB/mẫu) (chồi/mẫu) (cây/mẫu) (%) A0 1936,1b* 106,45b 8,72a 4,72a 100a A1 772,3d 40,38c 3,99c 1,66b 64,0c A2 2296,3a 532,24a 3,86c 1,89b 100a A3 1103,3c 23,31c 5,59b 5,52a 78,59b A4 268,2e 7,38d 1,41d 0,69c 25,72d A5 – – – – – *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 (-): Không có số liệu mẫu bị chết NT Kết thí nghiệm cho thấy có mặt chất điều hòa sinh trưởng thực vật môi trường nuôi cấy cho thấy hiệu rõ rệt tăng trưởng biệt hóa tế bào (Madhabi et al., 2014) Nhìn chung, nghiệm thức A2 tốt có tỷ lệ sống sót cao (100%), mẫu cấy tăng trưởng tốt, trọng lượng tươi đạt cao nhất, số PLB tạo nhiều 3.1.2.2 Thí nghiệm 1.2 Ảnh hưởng NAA lên tăng sinh PLB từ mảnh có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.2 Ảnh hưởng NAA lên tăng sinh PLB từ mảnh có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy Trọng lượng Số PLB Số chồi Số Tỷ lệ sống tươi (mg/mẫu) (PLB/mẫu) (chồi/mẫu) (cây/mẫu) sót (%) b b c a B0 1512,6 300,14 2,72 3,59 92,21b a a b b B1 2346,4 539,14 5,72 2,86 100a b b a B2 1576,0 312,28 10,86 – 90,0b B3 269,0c 16,83c 0,62d 0,41c 16,86d B4 133,1d 13,34c 0,48d 0,14c 24,31c B5 – – – – – *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 (-): Không có số liệu mẫu bị chết NT Trong thí nghiệm này, nghiệm thức B1 cho tăng trưởng hẳn so với nghiệm thức lại, nghiệm thức tăng sinh PLB tốt Như vậy, bổ sung vào môi trường nuôi cấy 20% nước dừa, 2,0 mg/l BA, NAA nồng độ 0,5 mg/l (B1) thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh PLB 3.1.2.3 Thí nghiệm 1.3 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng lên khả tăng sinh PLB từ mảnh có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng lên khả tăng sinh PLB từ mảnh có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy Môi Trọng lượng Số PLB Số chồi Số Tỷ lệ sống trường tươi (mg/mẫu) (PLB/mẫu) (chồi/mẫu) (cây/mẫu) sót (%) C0 MS 2286,9b 584,45b 4,00c 0,59b 100a C1 ½MS 2391,0a 1169,45a – – 100a *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 (-): Không có số liệu mẫu bị chết NT Kết thí nghiệm cho thấy, hàm lượng khoáng đa lượng môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến khả tăng sinh PLB Lan Hồ điệp vốn loài yêu cầu hàm lượng khoáng thấp, môi trường nuôi cấy có hàm lượng khoáng đa lượng giảm nửa C1 (½MS bổ sung 2,0 mg/l BA, 11 0,5 mg/l NAA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính) thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh PLB 3.1.3 Xác định môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào 3.1.3.1 Thí nghiệm 2.1 Ảnh hưởng mannitol đến tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau tuần nuôi cấy Bảng 3.4 Ảnh hưởng mannitol đến tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau tuần nuôi cấy Nồng độ Trọng lượng Trọng lương NT mannitol (g/l) tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) b D0 232,9 142,5c D1 10 503,8a 137,0d D2 20 283,2b 195,9a D3 30 248,4b 169,8b D4 40 201,9b 131,4d *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Bảng 3.5 Cường độ hô hấp mẫu cấy khảo sát ảnh hưởng mannitol đến tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau tuần nuôi cấy Cường độ hô hấp (µ µmol O2/g TLT/giờ) D0 4,338b D1 10 6,586a D4 40 3,705c *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Nồng độ mannitol (g/l) Bảng 3.6 Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật mẫu cấy khảo sát ảnh hưởng mannitol đến tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau tuần nuôi cấy Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật Nồng độ Tỷ lệ (mg/l/g TLT) mannitol IAA/Zeatin (g/l) IAA Zeatin GA3 ABA D0 0,880b 0,337b 1,015b 1,3 1,147a D1 10 1,050b 0,280c 1,0 1,055a 2,121a c c c a D4 40 0,118 0,114 0,066 1,0 1,586 *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Khi mẫu cấy mô sẹo tăng trưởng môi trường bổ sung 10 g/l mannitol, tương ứng với tiêu tăng trưởng trọng lượng tươi đạt cao cường độ hô hấp mẫu cấy cao (6,586 µmol O2/g TLT/giờ) Mannitol thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy với vai trò tương tự chất tạo stress áp suất thẩm thấu trao đổi chất nuôi cấy mô gỗ (George, 1993) Trong thí nghiệm này, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10 g/l mannitol (nghiệm thức D1) cho khả tăng trưởng hình thành mô sẹo từ mẫu cấy lát mỏng PLB cắt dọc tốt tương ứng với cường độ hô hấp mẫu cấy cao nhất, hoạt tính zeatin, GA3 cao 3.1.3.2 Thí nghiệm 2.2 Ảnh hưởng adenine đến tạo mô sẹo có khả sinh phôi từ lTCL-PLB lan Hồ điệp sau tuần nuôi cấy Bảng 3.7 Ảnh hưởng adenine đến tạo mô sẹo có khả sinh phôi từ lTCL-PLB lan Hồ điệp sau tuần nuôi cấy NT E0 Nồng độ adenin (mg/l) 0,0 Trọng lượng tươi (mg/mẫu) 364,7d Trọng lượng khô (mg/mẫu) 133,7e Số PLB (PLB/mẫu) 25,33a Tỷ lệ mô sẹo (%) 7,33e 12 380,0c 18,67b 16,67d E1 1,0 799,9c E2 2,0 1081,9b 574,0b 7,67d 70,67b E3 3,0 1747,8a 769,1a 6,00d 95,33a cd d bc E4 4,0 632,7 251,4 14,00 34,67c *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Bảng 3.8 Cường độ hô hấp mẫu cấy khảo sát ảnh hưởng adenine đến tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau tuần nuôi cấy Cường độ hô hấp (µ µmol O2/g TLT/giờ) E0 4,473b E3 5,729a E4 3,558c *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Nồng độ adenine (mg/l) Bảng 3.9 Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật mẫu cấy khảo sát ảnh hưởng adenine đến tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau tuần nuôi cấy Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật Nồng độ Tỷ lệ (mg/l/g TLT) adenine IAA/Zeatin (mg/l) IAA Zeatin GA3 ABA E0 1,283a 0,901a 1,959a 1,085b 1,4 E3 1,328a 0,750b 1,777 b 0,523c 1,8 E4 0,904b 0,259c 0,072c 1,291a 3,5 *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Kết nghiên cứu cho thấy adenine nồng độ mg/l (nghiệm thức E3) thích hợp cho việc tạo mô sẹo lan Hồ điệp Tóm lại, việc bổ sung adenine nồng độ mg/l (nghiệm thức E3) thích hợp cho việc tạo mô sẹo lan Hồ điệp tương ứng với cường độ hô hấp mẫu cấy cao nhất, hoạt tính IAA tăng cao hoạt tính ABA thấp 3.2 NỘI DUNG 2: NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO THU NHẬN TẾ BÀO ĐƠN 3.2.1 Thí nghiệm Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả phát sinh hình thái hình thành tế bào đơn nuôi cấy huyền phù tế bào mô sẹo có khả sinh phôi sau 14 tuần nuôi cấy Bảng 3.10 Khả tăng sinh, phát sinh phôi, PLB hình thành tế bào đơn nuôi cấy huyền phù tế bào mô sẹo sau tuần nuôi cấy Trọng lượng Số cụm Số lượng Tế bào đơn tươi (mg/bình) PLB PLB a a a Lỏng lắc (Lc) 10936,0 35,30 5600,59 Rất nhiều 1963,0b 9,17b 1024,41b Rất Lỏng tĩnh (Lt) Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Kiểu nuôi cấy Bảng 3.11 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ sống sót mẫu cấy Kiểu nuôi cấy Lỏng lắc Lỏng tĩnh 100a 100a 100a 100a Tỷ lệ sống sót (%) Thời gian nuôi cấy (tuần) 10 100a 100a 100a 80,37a b b b 90,21 80,72 67,81 20,00b 12 50,0a – 14 – – 13 Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 (-): Không có số liệu mẫu bị chết Kết thí nghiệm cho thấy thời điểm cấy chuyền phôi PLB môi trường nuôi cấy lỏng lắc khoảng tuần, lúc mẫu cấy đạt tỷ lệ tăng sinh tối ưu, cho hiệu cao 3.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào tạo dòng tế bào có khả hình thành tế bào đơn 3.2.2.1 Thí nghiệm 4.1 Ảnh hưởng BA lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy Bảng 3.12 Ảnh hưởng BA lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy NT Nồng độ BA (mg/l) Mật độ tế bào đơn (tế bào x 104/ml) F0 0,5 2,4452e F1 1,0 3,6193b F2 1,5 4,0272b F3 2,0 6,4562a F4 2,5 2,9852d *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Thí nghiệm này, cho thấy nồng độ BA thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào lan Hồ điệp 2,0 mg/l Ở nồng độ 2,0 mg/l BA thích hợp để nhân nhanh PLB lan Hồ điệp môi trường bán rắn (Sinha Jahan, 2011) 3.2.2.2 Thí nghiệm 4.2 Ảnh hưởng sucrose lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy Bảng 3.13 Ảnh hưởng sucrose lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy Mật độ tế bào đơn (tế bào x 104/ml) G0 30 3,1014c G1 40 4,0893a G2 50 3,5814b G3 60 2,2562d G4 70 1,7852e *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Nồng độ sucrose (g/l) NT Như vậy, nuôi cấy huyền phù tế bào lan Hồ điệp với mục đích tạo dòng tế bào nồng độ sucrose 40 g/l (nghiệm thức G2) thích hợp 3.2.2.3 Thí nghiệm 4.3 Ảnh hưởng sucrose kết hợp với sorbitol lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy Bảng 3.14 Ảnh hưởng sucrose kết hợp với sorbitol lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy NT Sucrose (g/l) Sorbitol (g/l) H0 H1 H2 H3 H4 H5 H6 30 30 30 30 30 40 40 10 20 30 40 10 Mật độ tế bào (tế bào x 104/ml) 2,9807c 0,1621g 0,3679fg 0,6869e 0,1520g 4,0110b 8,4771a 14 H7 40 20 1,4101d 0,7204e H8 40 30 0,4000ef H9 40 40 *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Các tế bào đơn hình thành nghiệm thức bổ sung kết hợp 40 g/l sucrose 10 g/l sorbitol (H6) trạng thái đẳng trương, tế bào thường có kích thước nhỏ, đẳng kính, tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ, hoạt động biến dưỡng mạnh giai đoạn phân chia tế bào 3.2.2.4 Thí nghiệm 4.4 Xác định đường cong tăng trưởng tế bào đơn nuôi cấy huyền phù tế bào lan Hồ điệp Bảng 3.15 Đường cong tăng trưởng tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào sau 20 ngày nuôi cấy Mật độ tế bào (tế bào x 104/ml) NT Thời gian nuôi cấy (ngày) 12 16 20 b b F3 0,5342 1,0741 4,2108b 6,4603b 2,6862b c c c c G1 0,2664 0,4861 1,8924 4,0912 2,2803c a a a a H6 1,7531 6,2031 8,1010 8,4631 6,6101a *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Đối với huyền phù tế bào lan Hồ điệp thiết lập để nuôi cấy thu tế bào đơn chu kỳ tăng trưởng tế bào khoảng 15 đến 16 ngày cần tiến hành cấy chuyền qua môi trường Môi trường tối ưu cho huyền phù tăng trưởng tạo tế bào đơn MS lỏng lắc bổ sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 40 g/l sucrose; 10 g/l sorbitol; g/l cao nấm men; 20% nước dừa (Nghiệm thức H6) 3.3 NỘI DUNG 3: NGHIÊN CỨU TÁI SINH TẾ BÀO ĐƠN 3.3.1 Ảnh hưởng giá thể, môi trường khoáng sucrose lên tái sinh 3.3.1.1 Thí nghiệm 5.1 Ảnh hưởng giá thể lên khả tạo mô sẹo phát sinh phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.16 Ảnh hưởng giá thể lên khả tạo mô sẹo phát sinh phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Trọng lượng Trọng lượng Tỷ lệ tạo Tỷ lệ tạo Tỷ lệ tạo tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) mô sẹo (%) phôi (%) PLB (%) I0 – Agar 877,0a 292,1a 74,52a 25,53b I1 – Bông gòn 657,9b 219,3b 38,44b 61,63a I2 Giấy lọc + agar 435,9c 145,2c 6,91c 14,21c 78,90a *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 (-): Không có số liệu mẫu bị chết NT Giá thể Bảng 3.17 Cường độ hô hấp mẫu cấy khảo sát ảnh hưởng giá thể lên khả tạo mô sẹo phát sinh phôi từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Cường độ hô hấp (µ µmol O2/g TLT/giờ) I0 Agar 4,851b I1 Bông gòn 5,648a I2 Giấy lọc + Agar 5,747a *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Giá thể 15 Bảng 3.18 Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật mẫu cấy khảo sát ảnh hưởng giá thể lên khả tạo mô sẹo phát sinh từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật Tỷ lệ (mg/l/g TLT) IAA/Zeatin IAA Zeatin GA3 ABA I0 Agar 0,843a 0,409c 1,555b 0,207a 2,1 a a a I1 Bông gòn 0,922 1,209 1,911 0,197a 0,8 I2 Giấy lọc + Agar 0,547b 0,672b 0,910b 0,193a 0,8 *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Giá thể Thí nghiệm cho thấy giá thể agar thích hợp cho hình thành mô sẹo, giá thể gòn thích hợp cho phát triển trì trạng thái phôi mẫu cấy tương ứng với hoạt tính IAA tăng cao 3.3.1.2 Thí nghiệm 5.2 Ảnh hưởng khoáng sucrose lên trình phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy Bảng 3.19 Ảnh hưởng khoáng sucrose lên trình phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy Khoáng MS Sucrose Trọng lượng Trọng lượng Số PLB Tỷ lệ phôi (g/l) tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) (PLB/mẫu) (%) d d f J0 30 2053,8 1073,4 9,00 95,67a f f g J1 40 1696,4 762,7 3,33 91,33d MS0 J2 50 1130,8g 476,3g 1,67h 43,67h J3 60 354,2j 133,9i 0,67i 4,67j J4 30 2305,7bc 1152,2c 15,00d 94,67bc J5 40 1862,8e 806,7f 16,67c 84,00e ½MS J6 50 671,6h 276,8h 17,67b 73,67f J7 60 392,1j 121,3i 12,67e 47,33g J8 30 2949,3b 1500,7b 17,00c 94,33c J9 40 3192,5a 1789,8a 18,67a 95,33ab MS J10 50 2084,8d 917,7e 14,67d 73,67f J11 60 523,1i 238,6h 18,33a 37,00i *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Bảng 3.20 Cường độ hô hấp mẫu cấy khảo sát ảnh hưởng khoáng sucrose lên trình phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy Cường độ hô hấp Nồng độ sucrose (g/l) (µ µmol O2/g TLT/giờ) J0 MS0 30 15,348c J4 ½MS 30 16,499a J9 MS 40 18,922b J11 MS 60 3,876d *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Khoáng MS Bảng 3.21 Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật mẫu cấy khảo sát ảnh hưởng khoáng sucrose lên trình phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy NT Khoáng MS J0 J4 J9 MS0 ½MS MS Nồng độ sucrose (g/l) 30 30 40 Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật (mg/l/g TLT) IAA Zeatin GA3 ABA 0,549c 0,872b 1,011c 0,224b 0,610b 0,793b 1,473b 0,181b 0,968a 1,086a 1,670a 0,120b Tỷ lệ IAA/Zeatin 0,6 0,8 0,9 16 J11 MS 60 0,468c 0,486c 0,670d 1,020a 1,0 *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Trong thí nghiệm việc bổ sung 40 g/l sucrose vào môi trường MS tối ưu cho hình thành phôi tương ứng với cường độ hô hấp đạt cao nhất, hoạt tính chất kích thích sinh trưởng (IAA, zeatin, GA3) cao hoạt tính ABA thấp 3.3.2 Ảnh hưởng loại đường (đường đơn, đường đôi) lên phát sinh phôi lan Hồ điệp 3.3.2.1 Thí nghiệm 6.1 Ảnh hưởng D-glucose lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy Bảng 3.22 Ảnh hưởng D-glucose lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy NT Trọng lượng tươi (mg/mẫu) Trọng lượng khô (mg/mẫu) Đặc điểm Phát sinh phôi tương đối đồng nhất, phôi M0 125,1a 51,1a cầu, vàng nhạt, nhỏ, số hóa nâu sức sống M1 116,2b 37,2b Phôi cầu, nhỏ, vàng nhạt M2 101,3c 34,3b Phôi cầu, nhỏ, khỏe Phôi vàng nhạt nâu Tỷ lệ sống sót M3 75,2d 26,0c 57,14% *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Nồng độ D-glucose thấp (10 g/l) thích hợp cho phát sinh phôi từ mô sẹo D-glucose thấy cần thiết cho tăng trưởng nhanh tế bào (Kim et al., 1995) Điều phù hợp với nuôi cấy mô sẹo P amabilis D-glucose ưu tiên làm nguồn carbon dòng tế bào (Fett-Neto et al., 1994) 3.3.2.2 Thí nghiệm 6.2 Ảnh hưởng D-fructose lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy Bảng 3.23 Ảnh hưởng D-fructose lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy NT N0 N1 N2 N3 Trọng lượng tươi Đặc điểm (mg/mẫu) – Mẫu chết, nghiệm thức không thích hợp cho phát sinh phôi – Mẫu chết, nghiệm thức không thích hợp cho phát sinh phôi – Mẫu chết, nghiệm thức không thích hợp cho phát sinh phôi – Mẫu chết, nghiệm thức không thích hợp cho phát sinh phôi *Ghi chú: (-): Không có số liệu mẫu bị chết Kết thí nghiệm cho thấy D-fructose không thích hợp cho nuôi cấy mô sẹo P amabilis 3.3.2.3 Thí nghiệm 6.3 Ảnh hưởng sucrose thí nghiệm (TN) lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy Bảng 3.24 Ảnh hưởng sucrose TN lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy NT Trọng lượng Trọng lượng tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) O0 338,3a 115,4a O1 248,1b 83,4b Đặc điểm Phôi xanh, nhiều lông hút trắng; mẫu phát sinh phôi không đồng nhất, số phôi vàng nhạt, hình cầu, xốp Phôi vàng nhạt, hình cầu, có số phôi trắng, mẫu cấy tạo cụm phôi 17 Phôi vàng tươi, hình cầu, có mô sẹo, số nâu đen, tỷ lệ sống sót 57,14% O3 98,3d 34,1d Duy trì trạng thái mô sẹo, chết nhiều, tỷ lệ sống sót 28,57% *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 171,2c O2 57,1c Kết thí nghiệm cho thấy môi trường O1 (20 g/l sucrose TN) thích hợp cho phát sinh phôi từ mô sẹo nuôi cấy 3.3.2.4 Thí nghiệm 6.4 Ảnh hưởng sucrose công nghiệp (CN) lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy Bảng 3.25 Ảnh hưởng sucrose CN lên phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần nuôi cấy NT Trọng lượng Trọng lượng tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) Đặc điểm Phôi vàng nhạt, hình cầu, kích thước nhỏ, xốp, khỏe có sức P0 149,0 51,4 sống, phát sinh phôi đồng Phôi vàng nhạt, đồng nhất, xốp, kích thước nhỏ, hình cầu, P1 332,3a 109,0a mẫu tạo phôi dạng cụm Mẫu tạo phôi chủ yếu tạo mô sẹo vàng đậm; phần lớn mẫu P2 108,4c 32,3c chết, có khoảng 28,57% mô sẹo P3 – – Mẫu chết 100%, nâu đen *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 (-): Không có số liệu mẫu bị chết b b Như vậy, thí nghiệm phát sinh phôi từ mô sẹo nồng độ sucrose CN 20 g/l thích hợp (nghiệm thức P1) Tóm lại, bốn loại đường sử dụng nghiên cứu sucrose CN nồng độ 20 g/l thích hợp cho phát sinh phôi từ mô sẹo 3.3.3 Ảnh hưởng loại dịch chiết hữu có nguồn gốc tự nhiên lên phát sinh hình thái lan Hồ điệp 3.3.3.1 Thí nghiệm 7.1 Ảnh hưởng dịch chiết Cà chua lên phát sinh hình thái mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.26 Ảnh hưởng dịch chiết Cà chua lên phát sinh hình thái mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Trọng lượng Trọng lượng Số PLB Số chồi Tỷ lệ tạo mô Tỷ lệ sống tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) (PLB/mẫu) (chồi/mẫu) sẹo (%) sót (%) Q0 1348,2c 309,3c 70,72c 2,27c – 97,80c Q1 697,1d 078,3d 25,28d – – 63,41d Q2 1642,2b 620,2a 86,48b 3,59b – 100a Q3 2398,1a 374,0b 153,65a 5,14a – 100a Q4 801,3c 61,2e 25,86d – 35.43a 98,00b e f e Q5 219,2 34,0 2,86 – – 4,00e Q6 123,4f 39,3f – – – – *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 (-): Không có số liệu mẫu bị chết NT Khi bổ sung dịch chiết hữu có nguồn gốc tự nhiên dịch chiết Cà chua vào nuôi cấy mô sẹo lan Hồ điệp nhằm mục đích kích thích tăng trưởng mẫu cấy tạo PLB nên bổ sung 30 ml/l (nghiệm thức Q3) 3.3.3.2 Thí nghiệm 7.2 Ảnh hưởng Chuối nghiền lên phát sinh hình thái mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.27 Ảnh hưởng Chuối nghiền lên phát sinh hình thái mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy NT Trọng lượng Trọng lượng tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) Số PLB (PLB/mẫu) Số chồi (chồi/mẫu) Tỷ lệ sống sót (%) 18 R0 1412,4d 139,0f 70,69d 2,21a 97,61c R1 897,0f 178,0e 23,28e – 64,50e R2 1742,2c 611,1c 78,38c – 99,00ab R3 2196,2b 741,2b 92,41b 1,34b 99,00ab R4 3183,3a 961,1a 175,86a 2,17a 100a R5 1229,2e 333,1d 3,87f – 76,92d R6 123,0g 9,0g – – 5,90f *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 (-): Không có số liệu mẫu bị chết Thí nghiệm cho thấy hiệu kích thích Chuối nghiền mẫu cấy mô sẹo lan Hồ điệp tốt nồng độ 40 g/l (nghiệm thức R4) 3.3.3.3 Thí nghiệm 7.3 Ảnh hưởng Khoai tây nghiền lên phát sinh hình thái mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.28 Ảnh hưởng Khoai tây nghiền lên phát sinh hình thái mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Trọng lượng Trọng lượng Số PLB Số chồi Tỷ lệ sống tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) (PLB/mẫu) (chồi/mẫu) sót (%) S0 1351,0d 312,3e 71,6413a 2,24c 97,61b e d e S1 1183,4 338,2 15,862 – 67,41c S2 1223,0e 304,3e 23,3103d 3,28b 62,90d S3 2371,3c 674,4c 27,6207c 2,41c 97,66b S4 3873,4b 708,1b 50,138b 0,86d 100a S5 4411,1a 848,3a 51,862b 8,72a 100a S6 414,0f 51,4f 7,31033f 0,31ef 50,00e *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 (-): Không có số liệu mẫu bị chết NT Từ kết ghi nhận cho thấy nghiệm thức bổ sung 50 g/l Khoai tây (nghiệm thức S5) thích hợp cho phát sinh hình thái mô sẹo lan Hồ điệp 3.4 NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CHUẨN HÓA CÂY CON IN VITRO 3.4.1 Thí nghiệm 8.1 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng hàm lượng nước dừa lên khả sinh trưởng có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.29 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng đa lượng hàm lượng nước dừa lên khả sinh trưởng có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Trọng lượng Số lượng Số lượng Chiều cao Chiều dài Đường kính tươi (mg/cây) (lá/cây) rễ (rễ/cây) (cm) rễ (cm) (cm) X0 1552,4c 3,21e 6,93d 3,031e 3,65cd 1,39d a cd a a a X1 2939,2 3,69 9,63 6,30 4,93 1,94a X2 1776,1b 3,53de 8,17c 3,87d 4,02b 1,52bc X3 1591,2c 4,24a 9,21b 4,29c 2,82f 1,41cd X4 1798,9b 4,31a 9,00b 4,49b 3,16de 1,62b X5 1475,2c 3,83bc 8,14c 4,19c 3,03e 1,39d *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Nhìn chung, thí nghiệm sinh trưởng môi trường ½MS tốt môi trường MS Ở môi trường ½MS môi trường MS bổ sung 15% nước dừa cho khả sinh trưởng tốt hơn, nghiệm thức X1 (½MS, bổ sung 15% nước dừa) tốt Hơn nữa, môi trường ½MS lại cho hiệu kinh tế cao 19 3.4.2 Thí nghiệm 8.2 Ảnh hưởng mật độ cấy chuyền lên khả sinh trưởng có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.30 Ảnh hưởng mật độ cấy chuyền lên khả sinh trưởng có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy Trọng lượng Số Số rễ Chiều cao Chiều dài Đường kính tươi (mg/cây) (lá/cây) (rễ/cây) (cm) rễ (cm) (cm) a a a a MD1 5933,4 4,60 12,20 8,76 6,90a 2,20a b b b b c MD2 3545,1 3,50 9,70 6,19 4,37 2,17a MD3 2939,3b 3,69b 9,63b 6,29b 4,93b 1,94b MD4 1832,1d 3,65b 7,73d 4,50c 4,36c 1,71b MD5 1766,9d 3,33b 8,67c 4,07c 3,61d 1,05c *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Từ kết thí nghiệm cho thấy lan Hồ điệp, với bình nuôi cấy 250 ml, 40 ml môi trường, cấy bình tốt 3.4.3 Thí nghiệm 8.3 Ảnh hưởng chiều cao có nguồn gốc từ tế bào đơn cấy chuyền lên sinh trưởng chúng sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.31 Ảnh hưởng chiều cao có nguồn gốc từ tế bào đơn cấy chuyền lên sinh trưởng chúng sau 12 tuần nuôi cấy Đường kính (cm) KT1 1245,1d 3,8723a 6,41c 2,99d 2,96c 1,46c c a c c c KT2 1654,1 3,4723 6,33 4,38 3,45 1,73b a a a a b KT3 2939,3 3,6897 9,63 6,30 4,93 1,95a KT4 2204,1b 3,6707a 8,60b 4,95b 5,61a 1,62c *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Trọng lượng tươi (mg/cây) Số (lá/cây) Số rễ (rễ/cây) Chiều cao (cm) Chiều dài rễ (cm) Kết thí nghiệm cho thấy nghiệm thức cho khả sinh trưởng tốt KT3 (chiều cao cấy chuyền cm), nghiệm thức này, sau cấy chuyền 12 tuần chiều cao tăng gấp 2,1 lần so với ban đầu 3.4.4 Thí nghiệm 8.4 Ảnh hưởng tuổi cấy chuyền lên sinh trưởng chúng điều kiện in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.32 Ảnh hưởng tuổi có nguồn gốc từ tế bào đơn cấy chuyền lên sinh trưởng chúng sau 12 tuần nuôi cấy Trọng lượng Số Số rễ Chiều cao Chiều dài Đường kính tươi (mg/cây) (lá/cây) (rễ/cây) (cm) rễ (cm) (cm) TC3 2939,3a 3,69a 9,63a 6,29a 4,93a 1,94a TC4 2209,2b 3,33a 9,07a 4,50b 5,27a 1,61b TC5 2138,4b 3,33a 7,60b 4,01b 5,53a 1,41c *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Qua thí nghiệm này, cho thấy việc xác định độ tuổi cấy chuyền quan trọng, cấy chuyền khoảng tháng tuổi cho khả sinh trưởng tốt Có thể độ tuổi có sức sống tốt, khả sinh trưởng nhanh, Kết luận chung mối quan hệ mật độ, chiều cao tuổi cấy chuyền với khả sinh trưởng chúng: mật độ, chiều cao tuổi cấy chuyền có ảnh hưởng nhiều đến khả sinh 20 trưởng Trong đó, mật độ bình, chiều cao cm, tháng tuổi cho khả sinh trưởng tối ưu hiệu kinh tế cao 3.5 KẾT QUẢ QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẪU CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI, PLB VÀ RỄ Phôi thu nhận từ thí nghiệm khác hình thái Chủ yếu phôi hình cầu dạng chuyển tiếp Tuy nhiên, có khác tần số xuất dạng phôi nghiệm thức Phôi soma lan Hồ điệp trải qua giai đoạn phát triển sau: - Về hình thái giải phẫu phôi lan nghiên cứu cho thấy phôi lan Hồ điệp có kích thước nhỏ chưa phân hóa, gồm dạng sau: dạng cầu → dạng chuyển tiếp → dạng protocorm like body-PLB (phôi soma) Phôi thực vật họ lan gọi cấu trúc giả phôi, không trải qua đầy đủ giai đoạn phát triển phôi đa số thực vật hai mầm (như Cà rốt) Chính vậy, quan sát hình thái giải phẫu phôi soma P amabilis, thấy số giai đoạn phát triển định 3.6 NỘI DUNG 5: CHUYỂN CÂY NUÔI CẤY MÔ RA VƯỜN ƯƠM, TRỒNG THỬ NGHIỆM, THEO DÕI SỰ SINH TRƯỞNG 3.6.1 Thí nghiệm 9.1 Ảnh hưởng chế độ tưới nước đến khả sinh trưởng có nguồn gốc từ tế bào đơn sau tuần vườn ươm Bảng 3.33 Tỷ lệ sống sót lan Hồ Điệp giai đoạn vườn ươm sau tuần trồng chăm sóc Thời gian sinh trưởng, phát triển (tuần) Tỷ lệ sống sót (%) tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần TN1 95,00b 95,00b 93,61b 92,31b 90,13b 85,62b 85,62b 85,62b TN2 98,00a 98,00a 97,93a 97,93a 97,93a 97,93a 97,93a 97,93a TN3 90,00c 89,71c 89,21c 89,00c 88,21c 88,21c 87,52b 87,52b *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 NT Bảng 3.34 Các tiêu sinh trưởng, phát triển lan Hồ điệp giai đoạn vườn ươm sau tuần trồng chăm sóc NT Chiều cao (cm) Số (lá/cây) c Chiều dài (cm) c Đường kính (cm) c TN1 3,7517 2,5167 3,00 0,93c TN2 6,7103a 3,6723a 5,26a 1,72b TN3 4,7233b 3,1723b 3,98b 1,83a *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Kết thí nghiệm cho thấy chế độ tưới lần/ngày (TN2) thích hợp lan Hồ điệp cho tỷ lệ sống sót cao 97,93%, sinh trưởng phát triển tốt nhất, cao (6,71 cm), dài (5,26 cm) nhiều (3,67 lá/cây) 3.6.2 Thí nghiệm 9.2 Ảnh hưởng chiều cao có nguồn gốc từ tế bào đơn lên khả sinh trưởng chúng sau 20 tuần vườn ươm Bảng 3.35 Các tiêu ban đầu trước chuyển vườn ươm để theo dõi khả sinh trưởng Loại I II Trọng lượng tươi (mg/cây) 4302,3a 3076,5b Số lượng (lá/cây) 3,50a 2,78b Chiều cao (cm) 7,23a 5,47b Đường Số lượng kính cm) rễ (rễ/cây) 2,09a 8,56a 1,72b 7,67b Chiều dài rễ (cm) 3,06b 4,37a 21 III 2105,5b 2,99b 4,17c 1,63b 6,28c 4,31a IV 836,0d 2,72bc 2,74d 1,17c 5,00d 2,82c V 462,2e 2,28cd 1,95e 0,82d 3,83e 2,02d VI 134,0f 1,89d 1,01f 0,52e 2,67f 1,89d *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Cây có kích thước lớn I; có kích thước vừa II; có kích thước trung bình III; có kích thước nhỏ vừa IV; có kích thước nhỏ trung bình V; có kích thước nhỏ VI Bảng 3.36 Các tiêu theo dõi sinh trưởng lan Hồ điệp điều kiện vườn uơm sau 10 tuần trồng chăm sóc Loại Số lượng Chiều cao Đường kính Tỷ lệ sống (lá/cây) (cm) (cm) sót (%) a a a I 3,26 7,35 2,44 98,00a b b b II 2,89 5,53 2,02 97,50a b c c III 2,92 4,26 1,81 97,96a IV 2,16c 2,90d 0,98d 32,57b V 2,09c 2,07e 0,89de 20,28c VI 1,64d 1,40f 0,75f 14,74d *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Bảng 3.37 Các tiêu theo dõi sinh trưởng lan Hồ điệp điều kiện vườn uơm sau 20 tuần trồng chăm sóc Loại Số lượng Chiều cao Đường kính Tỷ lệ sống (cm) sót (%) (lá/cây) (cm) I 3,00a 9,98a 2,85a 98,00a II 2,97a 7,93b 2,38b 97,35a III 2,90a 6,86c 2,10c 97,90a IV 1,41c 2,99d 0,98d 21,75b V 1,83b 1,95e 0,98d 17,39c VI 1,34c 1,80e 0,97d 11,54d *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, c,… khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, c,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Nhìn chung, có kích thước lớn thường chiều cao lớn, tỷ lệ sống sót khả sinh trưởng tốt, gia tăng chiều cao cây, đường kính nhanh Việc chuyển có chiều cao khoảng cm trở lên trồng vườn ươm cho hiệu tốt Từ kết nghiên cứu, sơ đồ qui trình nhân giống lan Hồ điệp thông qua nuôi cấy tế bào đơn sau: 22 Hình 3.1 Sơ đồ qui trình nhân giống lan Hồ điệp thông qua nuôi cấy tế bào đơn CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết thu được, tác giả đến kết luận sau đây: Nội dung 1: Tạo nguồn mẫu ban đầu cho nuôi cấy tế bào đơn - Môi trường nuôi cấy tăng sinh PLB hình thành từ mẫu cấy có nguồn gốc từ phát hoa: ½ MS bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính (C1) - Môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo từ mẫu cấy lát mỏng tế bào cắt dọc (lTCLPLB) hình thành từ mẫu cấy có nguồn gốc từ phát hoa: MS bổ sung 0,1 mg/l BA, 0,01 mg/l 2,4-D, 1,0 g/l cao nấm men, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính sử dụng mannitol bổ sung 10 g/l (D1), sử dụng adenine bổ sung 3,0 mg/l (E3) Nội dung 2: Nuôi cấy huyền phù tế bào thu nhận tế bào đơn - Điều kiện nuôi cấy lỏng lắc thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào cho mục đích thu nhận tế bào đơn - Chu kỳ tăng trưởng tế bào khoảng 15 đến 16 ngày cần cấy chuyền qua môi trường Môi trường nuôi cấy: MS lỏng lắc bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 40 g/l sucrose; 10 g/l sorbitol; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa (H6) Nội dung 3: Nghiên cứu tái sinh tế bào đơn - Môi trường phát sinh phôi từ tế bào đơn: MS bổ sung 0,01 mg/l 2,4-D; 2,0 mg/l BA; 40 g/l sucrose; 10 g/l sorbitol; 20% nước dừa; 1,0 g/l than hoạt, giá thể gòn (I0) 23 - Môi trường phát sinh phôi từ mô sẹo hình thành từ tế bào đơn: MS bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính bổ sung 40 g/l sucrose (J9) - Môi trường tạo phôi từ mô sẹo: MS bổ sung 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính kết hợp với 10 g/l D-glucose (M0), sử dụng đường đôi bổ sung 20 g/l sucrose TN (O1) 20 g/l sucrose CN (P1) - Trong nghiên cứu này, giai đoạn tạo mô sẹo, cường độ hô hấp mẫu cấy tăng cao, hoạt tính zeatin, GA3 tăng cao, hoạt tính ABA giảm thấp Ở giai đoạn phát sinh hình thái từ tế bào đơn, hoạt tính IAA tăng Trong giai đoạn hình thành phôi, cường độ hô hấp cao, hoạt tính chất kích thích sinh trưởng (IAA, zeatin, GA3) tăng cao hoạt tính ABA thấp - Về hình thái giải phẫu phôi lan nghiên cứu cho thấy phôi lan Hồ điệp có kích thước nhỏ chưa phân hóa, gồm dạng sau: dạng cầu → dạng chuyển tiếp → dạng protocorm like body-PLB (phôi vô tính) - Môi trường tạo PLB từ mô sẹo: MS kết hợp 1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 5% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính bổ sung 30 ml/l Cà chua (Q3) 40 g/l Chuối nghiền (R4) 50 g/l Khoai tây (S5) Nội dung 4: Nghiên cứu chuẩn hóa in vitro - Môi trường cấy chuyền tăng trưởng con: ½ MS bổ sung 15% nước dừa kết hợp với 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, g/l agar, g/l than hoạt tính (X1) - Việc cấy chuyền có kích thước cm, tháng tuổi vào bình tích 250 ml vào môi trường ½MS bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 20% nước dừa (v/v), 30 g/l sucrose, 1,0 g/l than hoạt tính, 9,0 g/l agar thích hợp cho tăng trưởng tối ưu hiệu kinh tế cao Nội dung 5: Chuyển nuôi cấy mô vườn ươm, trồng thử nghiệm, theo dõi sinh trưởng - Chế độ tưới chuyển vườn ươm: lần/ ngày (TN2) - Kích thước chuyển từ in vitro vườn ươm: khoảng cm trở lên 4.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu tạo dòng tế bào làm nguồn nguyên liệu cho thu nhận tế bào trần - Nghiên cứu tạo nhiều dòng tế bào đơn từ nhiều loài lan Hồ điệp khác làm nguồn nguyên liệu cho tạo tế bào trần dung hợp tế bào tạo loài lai mới, rút ngắn thời gian lai tạo giống 24 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Trịnh Thị Lan Anh, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Trịnh Thị Hương, Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Võ Thị Bạch Mai, Dương Tấn Nhựt (2013), Ảnh hưởng loại đường khác lên trình phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 11(3), pp 529-537 Trịnh Thị Lan Anh, Hồ Thanh Tâm, Lê Kim Cương, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Võ Thị Bạch Mai, Dương Tấn Nhựt (2013), Chuẩn hóa lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) có nguồn gốc từ tế bào đơn phục vụ công tác nhân giống, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 11(4), pp 705-716 Trịnh Thị Lan Anh, Nguyễn Quốc Hiệu, Đặng Hòa Thuận, Lê kim Cương, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương, Võ Thị Bạch Mai, Dương Tấn Nhựt (2014), Xác định đường cong tăng trưởng tối ưu tế bào đơn lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) nuôi cấy huyền phù tế bào, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12(1), pp 85-93 Trịnh Thị Lan Anh, Nguyễn Quốc Hiệu, Nguyễn Thị Kim Loan, Nguyễn Thanh Sang, Hoàng Thanh Tùng, Võ Thị Bạch Mai, Dương Tấn Nhựt (2014), Cảm ứng tạo mô sẹo có khả sinh phôi làm nguồn mẫu cho phát sinh phôi vô tính nuôi cấy huyền phù tế bào lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12(3), pp 531-541 ... lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy 3.2.2.2 Thí nghiệm 4.2 Ảnh hưởng sucrose lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng... luận án: Nghiên cứu hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) ứng dụng nhân giống CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NUÔI CẤY MÔ SẸO Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo đám tế bào không... 3.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào tạo dòng tế bào có khả hình thành tế bào đơn 3.2.2.1 Thí nghiệm 4.1 Ảnh hưởng BA lên khả hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày