Nghiên cứu sự hình thành tế bào đơn cây lan hồ điệp (phalaenopsis amabilis) và ứng dụng trong nhân giống (tóm tắt)

Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong huyền phù tế bào .... Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng phát sinh hì

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRỊNH THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH TẾ BÀO ĐƠN CÂY

LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS AMABILIS)

VÀ ỨNG DỤNG TRONG NHÂN GIỐNG

Công trình được hoàn thành tại:

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Dương Tấn Nhựt

2 PGS TS Võ Thị Bạch Mai

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Quỳnh

Phản biện 2: TS Bùi Minh Trí

Phản biện 3: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

Phản biện độc lập 1: PGS.TS Đặng Văn Đông

Phản biện độc lập 2: TS Đoàn Thị Phương Thùy

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại vào lúc giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

- Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

i

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 NUÔI CẤY MÔ SẸO 1

1.2 NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 1

1.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN 2

1.4 NUÔI CẤY PHÔI 2

1.5 SỰ BIỂU HIỆN GENE TRONG QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI SOMA 3

1.6 QUÁ TRÌNH TÁI SINH 4

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI 2.1.1 Địa điểm tiến hành đề tài 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 4

2.2.1 Vật liệu dùng trong nuôi cấy 4

2.2.2 Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm 5

2.3 MÔI TRƯỜNG, ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN KẾT QUẢ 5

2.3.1 Môi trường thí nghiệm tạo mô sẹo, phôi, PLB, tế bào đơn, ra cây 5

2.3.2 Thiết kế thí nghiệm nuôi cấy lỏng lắc 5

2.3.3 Điều kiện nuôi cấy 5

2.3.3.1 Điều kiện nuôi cấy in vitro 5

2.3.3.2 Điều kiện ở vườn ươm 5

2.3.4 Phương pháp xác định số lượng tế bào, sinh khối (trọng lượng mô sẹo, sinh khối huyền phù, phôi, PLB và cây con) 5

2.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 6

2.4.1 Nội dung 1: Tạo nguồn mẫu ban đầu cho nuôi cấy tế bào đơn 6

2.4.1.1 Qui trình tạo mẫu in vitro 6

2.4.1.2 Nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB ban đầu 6

2.4.1.3 Khảo sát các môi trường nhân nhanh PLB 6

2.4.1.4 Khảo sát các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào 6

2.4.2 Nội dung 2: Nuôi cấy huyền phù tế bào thu nhận tế bào đơn 6

2.4.2.1 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong huyền phù tế bào 6

2.4.2.2 Xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy tế bào đơn lan Hồ điệp 6

ii

2.4.2.3 Thí nghiệm 4.4 Xác định đường cong tăng trưởng của huyền

phù tế bào lan Hồ điệp 7

2.4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu tái sinh tế bào đơn 7

2.4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của giá thể, môi trường khoáng và sucrose lên sự tái sinh 7

2.4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường (đường đơn, đường đôi) lên sự phát sinh phôi 8

2.4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các loại dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên lên sự phát sinh hình thái lan Hồ điệp 8

2.4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu chuẩn hóa cây con in vitro 9

2.4.5 Nội dung 5: Chuyển cây nuôi cấy mô ra vườn ươm, trồng thử nghiệm, theo dõi sự sinh trưởng 9

2.4.6 Hình thái giải phẫu 10

2.4.7 Đo cường độ hô hấp 10

2.4.8 Đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh 10

2.4.9 Thống kê và xử lý số liệu 10

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10

3.1 NỘI DUNG 1: TẠO NGUỒN MẪU BAN ĐẦU CHO NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN 10

3.1.1 Kết quả nuôi cấy phát hoa và nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB ban đầu 10

3.1.2 Xác định các môi trường nhân nhanh PLB có nguồn gốc từ mẫu cấy lá hình thành từ nuôi cấy phát hoa lan Hồ điệp 10

3.1.2.1 Thí nghiệm 1.1 Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy 10

3.2.2.2 Thí nghiệm 1.2 Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy 11

3.1.2.3 Thí nghiệm 1.3 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy 11

3.1.3 Xác định các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào 12

3.1.3.1 Thí nghiệm 2.1 Ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 12

3.1.3.2 Thí nghiệm 2.2 Ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi từ lTCL-PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 12

3.2 NỘI DUNG 2: NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO THU NHẬN TẾ BÀO ĐƠN 13

iii

3.2.1 Thí nghiệm 3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong nuôi cấy huyền phù tế bào mô sẹo có khả năng sinh phôi sau 14 tuần nuôi cấy 13 3.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào tạo dòng tế bào có khả năng hình thành

tế bào đơn 14 3.2.2.1 Thí nghiệm 4.1 Ảnh hưởng của BA lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy

3.2.2.2 Thí nghiệm 4.2 Ảnh hưởng của sucrose lên khả năng hình thành

tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy 14 3.2.2.3 Thí nghiệm 4.3 Ảnh hưởng của sucrose kết hợp với sorbitol lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy 15 3.2.2.4 Thí nghiệm 4.4 Xác định đường cong tăng trưởng của tế bào đơn trong nuôi cấy huyền phù tế bào lan Hồ điệp 15 3.3 NỘI DUNG 3: NGHIÊN CỨU TÁI SINH TẾ BÀO ĐƠN 15 3.3.1 Ảnh hưởng của giá thể, môi trường khoáng và sucrose lên sự tái sinh 15 3.3.1.1 Thí nghiệm 5.1 Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tạo mô sẹo

và phát sinh phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 15 3.3.1.2 Thí nghiệm 5.2 Ảnh hưởng của khoáng và sucrose lên quá trình phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 8 tuần nuôi cấy 16 3.3.2 Ảnh hưởng của các loại đường (đường đơn, đường đôi) lên sự phát sinh phôi lan Hồ điệp 17 3.3.2.1 Thí nghiệm 6.1 Ảnh hưởng của D-glucose lên sự phát sinh phôi

từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy 17 3.3.2.2 Thí nghiệm 6.2 Ảnh hưởng của D-fructose lên sự phát sinh phôi

từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy 17 3.2.2.3 Thí nghiệm 6.3 Ảnh hưởng của sucrose thí nghiệm (TN) lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy 17 3.2.2.4 Thí nghiệm 6.4 Ảnh hưởng của sucrose công nghiệp (CN) lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy 18 3.3.3 Ảnh hưởng của các loại dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên lên sự phát sinh hình thái lan Hồ điệp 18

iv

3.3.3.1 Thí nghiệm 7.1 Ảnh hưởng của dịch chiết Cà chua lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần

nuôi cấy 18

3.3.3.2 Thí nghiệm 7.2 Ảnh hưởng của Chuối nghiền lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 18

3.3.3.3 Thí nghiệm 7.3 Ảnh hưởng của Khoai tây nghiền lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 19

3.4 NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CHUẨN HÓA CÂY CON IN VITRO 19

3.4.1 Thí nghiệm 8.1 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng và hàm lượng nước dừa lên khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 19

3.4.2 Thí nghiệm 8.2 Ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy 20

3.4.3 Thí nghiệm 8.3 Ảnh hưởng của chiều cao cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng sau 12 tuần nuôi cấy 20

3.4.4 Thí nghiệm 8.4 Ảnh hưởng của tuổi cây con khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng trong điều kiện in vitro sau 12 tuần nuôi cấy 20

3.5 KẾT QUẢ QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẪU CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI, PLB VÀ RỄ 21

3.6 CHUYỂN CÂY NUÔI CẤY MÔ RA VƯỜN ƯƠM, TRỒNG THỬ NGHIỆM, THEO DÕI SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN 21

3.6.1 Thí nghiệm 9.1 Ảnh hưởng của chế độ tưới nước đến khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 8 tuần ở vườn ươm 21

3.6.2 Thí nghiệm 9.2 Ảnh hưởng của chiều cao cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn lên khả năng sinh trưởng của chúng sau 20 tuần ở vườn ươm 21

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 23

4.1 KẾT LUẬN 23

4.2 ĐỀ NGHỊ 24

MỞ ĐẦU

Mặc dù thị trường xuất khẩu phong lan trên thế giới có nhiều triển vọng song để có thể đáp ứng nhu cầu nội địa, tiến vào thị trường thế giới, ngành công nghiệp hoa lan của Việt Nam còn phải quan tâm rất nhiều đến vấn đề tạo giống, công nghệ sản xuất, canh tác, công nghệ sau thu hoạch, đóng gói, kiểm dịch và đầu tư mở rộng cơ sở hạ tầng Hàng năm Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan từ các nước láng giềng cho nhu cầu nội địa

Hiện nay, đối với việc nhân giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis) đã

có nhiều triển vọng Tuy nhiên, hầu hết các giống lan rất dễ xảy ra biến dị

vì vậy việc nuôi cấy hạt không thể tạo được cây con đồng nhất (Arditti, 1992) Do vậy, để tạo cây con đồng nhất cần phải áp dụng phương pháp nhân giống vô tính Khó khăn lớn nhất trong nhân giống vô tính lan Hồ điệp là nguồn mẫu rất hạn chế do chúng là lan đơn thân, sử dụng chồi đỉnh

để nuôi cấy như nhiều loài lan khác sẽ làm tổn thương cây mẹ (Intuwong và Sagawa, 1974) Hơn nữa, lan Hồ điệp thường tiết nhiều hợp chất phenol từ

bề mặt vết cắt ra môi trường nuôi cấy, gây độc cho mẫu (Fast, 1979) Đối với lan Hồ điệp các quy trình tái sinh có tần số cao chưa xác định được (Takuhara và Mii, 2001)

Trong các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật thì nuôi cấy tế bào đơn có nhiều ưu điểm vượt trội Để tạo được dòng tế bào đơn thì trong nuôi cấy huyền phù tế bào, việc loại bỏ các cụm tế bào lớn, sau đó ly tâm sẽ giúp thu được huyền phù tế bào lý tưởng chỉ chứa các tế bào đơn Tế bào đơn là một đối tượng nghiên cứu sinh hóa, bệnh lý tế bào, đồng thời thông qua đó

có thể thu nhận tế bào trần Do tế bào có tính toàn năng nên từ một tế bào sinh dưỡng thực vật có thể tái sinh thành một cây hoàn chỉnh, sau khi đã tạo khối tế bào dạng mô sẹo Về mặt lý thuyết thì nuôi cấy tế bào đơn thành công cho hệ số nhân giống cao vượt trội hơn hẳn so với các kỹ thuật khác, chất lượng cây con đồng nhất Nuôi cấy tế bào đơn còn mở ra những ứng dụng mới trong việc tạo các dòng tế bào đột biến, các dòng siêu sản xuất một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến di truyền ở thực vật bậc cao, giúp rút ngắn thời gian lai tạo giống

Xuất phát từ những vấn đề trên, tác giả tiến hành luận án: “Nghiên

cứu sự hình thành tế bào đơn cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) và

ứng dụng trong nhân giống”

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NUÔI CẤY MÔ SẸO

Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc

tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo

cơ quan Do đó, các phần non của cơ thể thực vật (mô phân sinh ngọn, thân,

rễ,…) dễ tạo mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một

auxin mạnh (như 2,4-D) được sử dụng riêng rẽ hay kết hợp với auxin khác hay với cytokinin Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo (Taiz và Zeiger,

2006; George et al., 2008) Sự tạo mô sẹo in vitro thuộc một trong ba quá trình:

sự phản phân hóa của tế bào nhu mô (xung quanh mộc hay libe, trong vỏ hay lõi), sự phân chia của tế bào tượng tầng hay sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi để tạo mô sẹo, cần chú ý đến tuổi của mô cấy, sử dụng auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất của loại auxin và nồng độ auxin (Hopkin,

1995; Bùi Trang Việt, 2000; George et al., 2008; Suárez và Bozhkov, 2008; Grafi et al., 2011)

Quá trình hình thành mô sẹo chia ra ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: giai đoạn phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào

chuẩn bị phân chia, giai đoạn này phụ thuộc vào loại mô mẫu, tình trạng sinh lý của mẫu và điều kiện nuôi cấy

Giai đoạn 2: phân chia tế bào, sau khi hình thành, các tế bào mô sẹo phân chia

nhanh tạo ra nhiều tế bào mới

Giai đoạn 3: biệt hóa, các tế bào mô sẹo đi vào giai đoạn biệt hóa, xuất hiện

các con đường trao đổi chất dẫn đến sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học

1.2 NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

Nuôi cấy huyền phù tế bào được khởi đầu bằng cách chuyển các khối

mô sẹo vào môi trường B5, MS lỏng khuấy và bổ sung thêm các dịch chiết có nguồn gốc tự nhiên như nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết malt,… Các

tế bào được tách ra khỏi khối mô sẹo và phân tán vào trong môi trường lỏng, nơi chúng sẽ phân chia để tạo thành các cụm tế bào nhỏ Nuôi cấy được duy trì qua một loạt cấy chuyền dưới những điều kiện về dinh dưỡng và thoáng khí thích hợp Việc bổ sung thêm các dịch chiết có nguồn gốc tự nhiên như nước dừa, dịch chiết nấm men, các auxin và cytokinin ở nồng độ tối ưu sẽ thúc đẩy sự

phân bào cũng như tăng tốc độ tăng trưởng (Earle và Torrey, 1965; King et al.,

1973) Sự phân bố của các tế bào và các cụm tế bào phụ thuộc vào thành phần của môi trường dinh dưỡng và sự thông khí của môi trường Theo King (1980) nuôi cấy huyền phù tế bào gần với nuôi cấy tế bào đơn Huyền phù tế bào lý tưởng có sự phân chia tế bào tích cực, sự cân bằng tốt giữa hai quá trình tạo nhóm và tách rời tế bào, có tính đồng nhất cao về hình thái và sinh hóa Huyền phù tế bào lý tưởng là một dịch mịn, hầu như chỉ bao gồm các tế bào có khả năng sinh phôi, cô lập hay hợp lại thành từng nhóm nhỏ chứa từ vài đến vài chục tế bào có khả năng duy trì tính toàn năng và tiến hóa thành phôi soma trên môi trường tái sinh trong một điều kiện thích hợp (Bùi Trang Việt, 2000; Assani

et al., 2002; George et al., 2008) Nhu cầu về ánh sáng trong quá trình tạo huyền

phù tế bào thường tương tự như quá trình hình thành mô sẹo trước đó Sự hình

2

thành và tăng trưởng của huyền phù tế bào có thể xảy ra trong điều kiện tối hoàn

toàn như ở Solanum tuberosum L (De Vries và Bokelmann, 1986); hay Daucus carota (Fujimura và Komamine, 1979)]; và cũng có thể xảy ra trong điều kiện chiếu sáng ở cây Pyrus communis [(Mehra và Jaidka, 1985), Brassica nigra (Klimaszewska và Keller, 1986) hay ở Solanum melongena (Gleddie et al.,

1983)

1.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN

Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng tất cả những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó nó sinh ra Cho nên mỗi tế bào có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể mới nhờ tính toàn thế Nuôi cấy tế bào đơn là phương pháp nuôi cấy tế bào được phân lập vô trùng trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện có kiểm soát (King, 1980)

Các nguyên tắc cơ bản của nuôi cấy tế bào đơn là cô lập số lượng lớn các tế bào còn sống nguyên vẹn và nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự tăng trưởng và phát triển Tế bào đơn có thể được thu nhận từ một loạt các mô và cơ quan của thực vật cũng như từ mô sẹo và huyền phù tế bào Theo phương pháp truyền thống các tế bào đơn cũng được thu nhận từ nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào trên hệ thống máy lắc Các tế bào đơn được cô lập một cách cẩn thận từ huyền phù tế bào bằng kim tiêm Nhờ sự rung lắc của máy lắc làm cho các cụm mô sẹo tạo ra các tế bào đơn và các cụm nhỏ tế bào trong môi trường Kết quả tạo thành huyền phù tế bào Huyền phù tế bào được lọc để loại bỏ những khối tế bào và dịch lọc sau đó được ly tâm để thu nhận các

tế bào đơn Các mô sẹo rời thường được chọn để nuôi cấy tế bào đơn Tế bào đơn là một đối tượng nghiên cứu sinh hóa, bệnh lý tế bào, đồng thời thông qua

đó có thể thu nhận tế bào trần Do tế bào có tính toàn năng nên từ một tế bào sinh dưỡng thực vật có thể tái sinh thành một cây hoàn chỉnh, sau khi đã tạo khối tế bào dạng mô sẹo Nuôi cấy tế bào đơn mở ra những ứng dụng mới trong việc tạo các dòng tế bào đột biến, các dòng siêu sản xuất một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến di truyền ở thực vật bậc cao Mô sẹo cũng có thể được sử dụng cho nuôi cấy tế bào đơn

1.4 NUÔI CẤY PHÔI

Phôi soma (phôi vô tính, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ) là phôi hình thành theo con đường vô tính từ các tế bào soma (tế bào sinh dưỡng 2n), theo

con đường sinh phôi soma Phôi soma phổ biến khi nuôi cấy in vitro của các mô

tách rời trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh Trong quá trình sinh phôi soma, tế bào soma đóng vai trò sinh phôi như hợp tử và sự phát triển phôi cũng trải qua các giai đoạn như trong quá trình sinh phôi hợp tử Sự hiện diện của phôi soma là điểm kết thúc của một chuỗi các bước bao gồm sự thu nhận các tế bào có khả năng phát sinh phôi và biệt hóa tế bào (Suárez và Bozhkov, 2008) Để tạo thành phôi soma, các tế bào thực vật đã biệt hóa cần phản biệt hóa (trừ các tế bào mô phân sinh) tạo thành tế bào gốc, phát triển thông qua giai đoạn phôi đặc trưng để tạo ra tất cả các loại tế bào của cây mới Do đó, các tế bào tiền thân của một phôi soma là một tế bào gốc có tính toàn năng Các đặc điểm chính để phân biệt một phôi soma với một chồi bất định là khi giải phẫu hình thái cho thấy phôi có cấu tạo rời rạc, độc lập không có liên kết mạch với các mô của mô mẹ (Haccius, 1978; Rafael, 2009) Tuy nhiên, ngay cả sau khi công bố nhiều bài báo về phôi soma, các nhà nghiên

3

cứu vẫn không hiểu được làm thế nào mà một tế bào được lập trình lại để có

thẩm quyền tạo thành một phôi soma (Michael et al., 2010)

Quá trình phát sinh phôi soma thường được xem là con đường trung tâm của quá trình vi nhân giống thực vật và có vai trò đặc biệt quan trọng trong các nghiên cứu về phát sinh hình thái thực vật Quá trình thu nhận phôi soma thường bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn tạo các tế bào sinh phôi (mô sẹo và dịch huyền phù tế bào) và giai đoạn tiến hóa phôi soma từ các tế bào sinh phôi Dưới các điều kiện xác định, các tế bào mô sẹo hay huyền phù tế bào có thể cho các sơ khởi cơ quan (sinh cơ quan) hay phôi (sinh phôi soma) dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật (Ahloowalia, 1991; Bùi Trang Việt, 2005)

Sự sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng phải trải qua hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: mô nuôi cấy trong môi trường có auxin sẽ tăng sinh nhanh, các tế bào trong môi trường này sẽ phản phân hóa và mất tính hữu cực

Giai đoạn 2: mô sẹo từ giai đoạn 1 sẽ được chuyển sang môi trường có ít hoặc không có auxin, trong môi trường này tính hữu cực và sự sinh phôi được cảm ứng với trạng thái phôi từ hình cầu đến trạng thái hình tim và trạng thái hình cá đuối

Các phân tích về quá trình phát triển phôi cho thấy sự hình thành phôi của thực vật gồm hai giai đoạn chính: sự phân đoạn và sự sinh cơ quan phôi

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi: các chất điều hòa sinh

trưởng, nguồn carbohydrate, nguồn nitrogen, các thành phần khoáng trong môi trường nuôi cấy, tính chất đồng bộ của tế bào

Hiện nay, những nghiên cứu về đặc tính sinh lý, sinh hóa của quá trình sinh phôi trong huyền phù tế bào còn rất ít do sự tạo phôi xảy ra không đồng bộ

và tần số không cao Gần đây, người ta đã thành công trong việc tạo phôi đồng

bộ từ những cụm tế bào kích thước nhỏ với tần số cao hơn trước đây Nuôi cấy phôi soma hiện nay được xem như một kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả hơn trong nhân giống cây trồng mà nhân giống vô tính theo phương pháp cổ điển có nhiều hạn chế

1.5 SỰ BIỂU HIỆN GENE TRONG QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI SOMA

Mỗi giai đoạn của sự phát triển phôi soma liên quan đến việc kích hoạt

và khử hoạt tính của các gene Quá trình phát triển một số cây trồng là kết quả của một loạt các tương tác gene, đòi hỏi sự biểu hiện của gene khởi động

(Torres-Ruiz et al.,1996) Sự cô lập các gene cụ thể quyết định sự sinh phôi, các

đặc tính và vai trò của chúng trong quá trình phát triển của phôi là nền tảng cho

sự hiểu biết tổng quát về quá trình điều khiển sự sinh phôi ở cấp độ phân tử

(Magioli et al., 2001) Các giai đoạn và cơ chế tham gia vào quá trình biến đổi

của các tế bào mô sẹo thành các tế bào phôi chưa được biết rõ Giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo và chuyển hóa thành phôi được gọi chung là giai đoạn tạo phôi

soma sớm (Kairong et al., 1999; Sato et al., 1995; Momiyama et al., 1995) Các

nghiên cứu gần đây đã cố gắng xác định những khác biệt trong sự biểu hiện gene giữa mô sẹo và mô phôi Duncan và cộng sự (2003) đã nhận thấy rằng các

mô với hàm lượng cao protein globulin-1 (Glb1) được mã hóa bởi các chuỗi polypeptid là các mô có thẩm quyền tạo phôi Trong mô không phải là phôi, nồng độ Glb1 rất thấp Các protein Glb1 được tổng hợp trong phôi hợp tử ngay sau khi hoa được thụ phấn Sự biểu hiện của gene SERK đã được phát hiện

4

trong nhóm các tế bào đang trong quá trình kéo dài và không bào hóa trong suốt giai đoạn phát triển trước khi tạo phôi hình cầu Somleva và cộng sự (2000) cũng đã xác định được gene SERK trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi của các tế

bào đơn ở loài Dactylis glomerata Gene HBK2, một gene mới thuộc lớp I của

họ gene KNOTTED1 (tương tự như gene KNOX) gene được biểu hiện ở cây

Vân sam Na Uy (Picea abies L Karst.) từ giai đoạn tăng sinh của tiền phôi cho đến giai đoạn phát triển phôi muộn (Hjortswang et al., 2002) Các gene

homeobox kiểm soát chi tiết tế bào và hình thành mô hình trong thời gian phát triển của cây Gene HBK2 chỉ biểu hiện trong các dòng tế bào có khả năng sinh phôi mà kết quả là tạo phôi soma và không được biểu hiện trong các dòng tế bào không sinh phôi Các nghiên cứu khác liên quan đến gene KNOX cũng cho thấy

sự biểu hiện của gene này thể hiện cả trong phôi hợp tử cũng như trong phôi

soma ở cây Ngô (Zea mays L.) (Zhang et al., 2002)

Thực tế là sự phát triển của phôi soma dễ dàng được chia thành các giai đoạn khác biệt dựa trên đặc điểm hình thái học (phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình thủy lôi và phôi lá mầm) điều này dễ tiếp cận hơn so với giai đoạn phát triển phôi soma sớm Mặc dù có sự khác biệt cả về mặt phân tử và hình thái học giữa các mô không sinh phôi và mô sinh phôi, nhưng quá trình biến đổi từ giai đoạn này đến giai đoạn tiếp theo vẫn còn ít được biết đến Rất khó để xác định sự khác biệt trong biểu hiện gene giữa các giai đoạn khi chính các giai đoạn đó không được xác định rõ (Tammy và Zhongmin, 2004)

1.6 QUÁ TRÌNH TÁI SINH

Tái sinh là quá trình các mô đã biệt hóa phản biệt hóa và chuyển thành

mô non trẻ, có khả năng phân chia tế bào và bước vào chu trình tế bào mới, hình

thành cơ quan (Klerk et al., 1997) Quá trình này gồm ba giai đoạn chính, chịu

sự điều hòa của nhiều yếu tố khác nhau

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI

2.1.1 Địa điểm tiến hành đề tài

Các thí nghiệm trong nghiên cứu của luận án được tiến hành tại: Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa Học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam – 116 Xô Viết Nghệ Tĩnh - Đà Lạt - Lâm Đồng và Bộ môn Sinh lý Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM – 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Tp HCM

2.1.2 Thời gian tiến hành đề tài

Các thí nghiệm trong nghiên cứu của luận án được tiến hành từ năm 2010 đến

2015

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Vật liệu dùng trong nuôi cấy

Vật liệu dùng trong nghiên cứu là phát hoa của các cây lan Hồ điệp

(Phalaenopsis amabilis) trưởng thành, khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh,

cho hoa đẹp trồng trong nhà kính Chọn những phát hoa có nụ hoa chưa nở Chọn các phần trên phát hoa có mang mầm ngủ, ở khoảng vị trí thứ ba từ dưới lên, hai vị trí mầm ngủ ở phần gốc thường không tạo được chồi nên loại bỏ đi, phần phía trên mang hoa cũng không sử dụng Phần phát hoa sử dụng làm

5

nguồn mẫu cấy ban đầu thường chỉ mang từ 4 – 6 vị trí mầm ngủ (Tanaka và Sakanishi, 1978)

2.2.2 Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm

Mẫu cấy ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau (phát sinh mô sẹo từ PLB,

mô sẹo tái sinh từ tế bào đơn, phôi được dùng để trích ly các chất điều hòa sinh trưởng thực vật dùng trong sinh trắc nghiệm

2.3 MÔI TRƯỜNG, ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN KẾT QUẢ

2.3.1 Môi trường thí nghiệm tạo mô sẹo, phôi, PLB, tế bào đơn, ra cây

Môi trường căn bản được sử dụng là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) Ngoài ra, bổ sung thêm: 30 g/l sucrose (đường Biên Hòa), 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính, riêng đối với nuôi cấy huyền phù tế bào sử dụng môi trường lỏng không bổ sung agar Tùy từng thí nghiệm mà các chất điều hòa sinh trưởng như BA (6-benzyl adenin), NAA (α-naphthalene acetic acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid),… được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với nhau ở các nồng độ khác nhau Tùy từng thí nghiệm mà dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc

tự nhiên được bổ sung thêm hay không bổ sung vào môi trường nuôi cấy

2.3.2 Thiết kế thí nghiệm nuôi cấy lỏng lắc

Dung dịch huyền phù tế bào được hình thành trên hệ thống máy lắc, các bình thủy tinh có thể tích 250 ml có chứa 40 ml môi trường lỏng cấy 1,3 g mô sẹo và các bình thủy tinh có thể tích 100 ml có chứa 30 ml môi trường lỏng cấy

1 g mô sẹo được đặt lên máy lắc Orbital Shaker S01 (Stuart Scientific, Anh Quốc) ở tốc độ 100 vòng/phút Hệ thống này được đặt dưới đèn huỳnh quang (Rạng Đông, Việt Nam), với cường độ sáng từ 2.500 – 3.000 lux)

2.3.3 Điều kiện nuôi cấy

2.3.3.1 Điều kiện nuôi cấy in vitro

- Thời gian chiếu sáng : 10 giờ/ngày

- Cường độ ánh sáng : 2.500 – 3.000 lux

- Nhiệt độ : 25 ± 2oC

- Độ ẩm trung bình : 75 – 80%

2.3.3.2 Điều kiện ở vườn ươm

- Thời gian chiếu sáng: ánh sáng tự nhiên

6

2.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

2.4.1 Nội dung 1: Tạo nguồn mẫu ban đầu cho nuôi cấy tế bào đơn

2.4.1.1 Qui trình tạo mẫu in vitro

Nuôi cấy phát hoa để tạo chồi

2.4.1.2 Nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB ban đầu

Từ các chồi thu được tiến hành nuôi cấy lá để thu nhận PLB

2.4.1.3 Khảo sát các môi trường nhân nhanh PLB

a) Thí nghiệm 1.1 Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa

Các mẫu cấy PLB có nguồn gốc từ mẫu lá hình thành từ nuôi cấy phát hoa được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 20% (v/v) nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính

b) Thí nghiệm 1.2 Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa

Các mẫu cấy PLB có nguồn gốc từ mẫu lá hình thành từ nuôi cấy phát hoa được cấy vào môi trường MS có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau kết hợp với 2,0 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% (v/) nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt

c) Thí nghiệm 1.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa

Các mẫu cấy PLB được cấy vào môi trường ½MS và môi trường MS có

bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 20% (v/v) nước dừa, 30 g/l sucrose, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính

2.4.1.4 Khảo sát các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào

a) Thí nghiệm 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp

Các lớp mỏng tế bào cắt dọc (lTCL) PLB có kích thước 0,5 x 1,5 mm được cấy vào môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BA, 0,01 mg/l 2,4-D, 1,0 g/l cao nấm men, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2009) kết hợp với mannitol ở nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40 mg/l)

b) Thí nghiệm 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo từ

lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp

Các lTCL-PLB có kích thước 0,5 x 1,5 mm được cấy vào môi trường

MS có bổ sung 0,1 mg/l BA, 0,01 mg/l 2,4-D, 1,0 g/l cao nấm men, 20% nước dừa, 30 g/l sucrose, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính kết hợp với adenine ở nồng độ khác nhau (0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 mg/l)

2.4.2 Nội dung 2: Nuôi cấy huyền phù tế bào thu nhận tế bào đơn

2.4.2.1 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong huyền phù tế bào

Các cụm mô sẹo được cấy vào môi trường MS lỏng có bổ sung 0,1 mg/l

BA, 0,01 mg/l 2,4-D, 1,0 g/l cao nấm men, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2009)

2.4.2.2 Xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy tế bào đơn lan Hồ điệp

7

a) Thí nghiệm 4.1 Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc

Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g)

được cấy vào môi trường MS bổ sung BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l) kết hợp

với 0,01 mg/l 2,4-D; 1,0 g/l cao nấm men; kết hợp thêm với môi trường nuôi cấy protoplast gồm có 27,3 g/l mannitol; 27,3 g/l sorbitol; 18 g/l glucose (Lê Văn Hoàng, 2008

b) Thí nghiệm 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của sucrose lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc

Song song với thí nghiệm 4.1 chúng tôi cũng tiến hành cải tiến môi trường nuôi cấy tế bào đơn bằng cách cấy các cụm mô sẹo có khả năng sinh

phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g) vào môi trường MS lỏng có bổ sung sucrose

(30; 40; 50; 60; 70 g/l) kết hợp với 0,01 mg/l 2,4-D; 2,0 mg/l BA; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa

c) Thí nghiệm 4.3 Khảo sát ảnh hưởng của sucrose kết hợp với sorbitol lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc

Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g)

được cấy vào môi trường MS lỏng bổ sung sucrose (30; 40 g/l) kết hợp sorbitol

(0; 10; 20; 30; 40 g/l) và bổ sung thêm 0,01 mg/l 2,4-D; 2,0 mg/l BA; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa

2.4.2.3 Thí nghiệm 4.4 Xác định đường cong tăng trưởng của huyền phù tế bào lan Hồ điệp

Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g) được cấy vào ba môi trường tốt nhất cho sự tăng trưởng của tế bào đơn trong huyền phù tế bào thu được từ ba thí nghiệm nuôi cấy huyền phù tế bào ở trên là: MS lỏng có bổ sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 27,3 g/l mannitol; 27,3 g/l sorbitol; 18 g/l glucose; 1,0 g/l cao nấm men (Nghiệm thức F3); MS lỏng có bổ sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 40 g/l sucrose; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa (Nghiệm thức G1); MS lỏng có bổ sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 40 g/l sucrose; 10 g/l sorbitol; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa (Nghiệm thức H6) Thí nghiệm này nhằm để khảo sát chu kỳ tăng trưởng của huyền phù

tế bào, từ đó xác định pha log của quá trình tăng trưởng của tế bào đơn lan Hồ điệp nhằm xác định thời điểm thích hợp để cấy chuyền tế bào đơn và nghiên cứu tái sinh

2.4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu tái sinh tế bào đơn

2.4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của giá thể, môi trường khoáng và sucrose lên

sự tái sinh

a) Thí nghiệm 5.1 Khảo sát ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tạo mô sẹo

và phát sinh phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn

Huyền phù tế bào được thu nhận ở ngày nuôi cấy thứ 16 (pha log kết quả ở thí nghiệm 4.4) sau khi loại bỏ các cụm tế bào lớn chỉ chứa các cụm nhỏ

tế bào (chứa vài tế bào có nguồn gốc từ tế bào đơn) được cấy với thể tích là 1 ml/bình sử dụng pipette thủy tinh vô trùng vào môi trường MS bổ sung 0,01 mg/l 2,4-D; 2 mg/l BA; 40 g/l sucrose; 10 g/l sorbitol; 20% nước dừa; 1,0 g/l

MS giảm đi một nửa), MS] có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính và sucrose ở nồng độ khác nhau (30; 40; 50; 60 g/l)

2.4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường (đường đơn, đường đôi) lên

sự phát sinh phôi

a) Thí nghiệm 6.1 Khảo sát ảnh hưởng của D-glucose lên sự phát sinh phôi

từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn

Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS bổ sung D-glucose (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính

b) Thí nghiệm 6.2 Khảo sát ảnh hưởng của D-fructose lên sự phát sinh

phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn

Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS bổ sung D-fructose (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính

c) Thí nghiệm 6.3 Khảo sát ảnh hưởng của sucrose thí nghiệm (TN) lên sự

phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn

Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi

trường MS bổ sung sucrose TN (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l

NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính

d) Thí nghiệm 6.4 Khảo sát ảnh hưởng của sucrose công nghiệp (CN) lên

sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn

Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi

trường MS có bổ sung sucrose CN (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l

NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính

2.4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các loại dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên lên sự phát sinh hình thái lan Hồ điệp

a) Thí nghiệm 7.1 Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết Cà chua lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn

Các cụm mô sẹo hình thành từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS

bổ sung 1,0 mg/l BA; 1,0 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 5% nước dừa; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007) còn dịch chiết Cà chua được bổ sung với các nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 ml/l)

b) Thí nghiệm 7.2 Khảo sát ảnh hưởng của Chuối nghiền lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn

Các cụm mô sẹo hình thành từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS

bổ sung 1,0 mg/l BA; 1,0 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 5% nước dừa; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007) còn Chuối nghiền được bổ sung với các nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 ml/l)

9

c) Thí nghiệm 7.3 Khảo sát ảnh hưởng của Khoai tây lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn

Các cụm mô sẹo hình thành từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS

bổ sung 1,0 mg/l BA; 1,0 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 5% nước dừa; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007), còn Khoai tây được

bổ sung với các nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 ml/l)

2.4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu chuẩn hóa cây con in vitro

a) Thí nghiệm 8.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng và hàm lượng nước dừa lên khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn

Các cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi trường khoáng (MS và ½MS) bổ sung nước dừa (10; 15; 20%) kết hợp với 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính

b) Thí nghiệm 8.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên

khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn

Các cây con 3 tháng tuổi có nguồn gốc từ tế bào đơn, chiều cao cây 3

cm được cấy vào các bình có thể tích 250 ml trên môi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 15% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than

hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3 với các mật độ khác nhau (1, 2, 3, 4, 5 cây/bình)

c) Thí nghiệm 8.3 Khảo sát ảnh hưởng của chiều cao cây con có nguồn gốc

từ tế bào đơn khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng

Các cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn 3 tháng tuổi với các chiều cao khác nhau (1, 2, 3, 4 cm/cây) được cấy chuyền sang môi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 15% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3

d) Thí nghiệm 8.4 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi cây con có nguồn gốc từ tế

bào đơn khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng

Các cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn có độ tuổi khác nhau (2, 3, 4 tháng tuổi) được cấy vào các bình có thể tích 250 ml (kích thước cây 3 cm, cấy

3 cây trong một bình) trên môi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 15% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than hoạt tính; 9,0 g/l agar;

pH = 5,3

2.4.5 Nội dung 5: Chuyển cây nuôi cấy mô ra vườn ươm, trồng thử nghiệm, theo dõi sự sinh trưởng

a) Thí nghiệm 9.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ tưới nước đến khả năng

sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn ở vườn ươm

Chọn các cây con sau 3 tháng nuôi cấy in vitro có kích thước 4 – 5 cm,

có 2 – 3 lá và 5 – 6 rễ chuyển ra trồng ex vitro Tiến hành 3 chế độ tưới nước:

tưới 1 lần/ngày (9h sáng), tưới 2 lần/ngày (9h sáng, 15h chiều), tưới 3 lần/ngày (9h sáng, 12h trưa, 15h chiều)

b)Thí nghiệm 9.2 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn lên khả năng sinh trưởng ở giai đoạn vườn ươm

Cây con sau 3 tháng nuôi cấy in vitro với các chiều cao cây khác nhau được chuyển ra trồng ex vitro trong điều kiện vườn ươm Tiến hành theo dõi sáu kích thước (dựa vào chiều cao cây) sau của cây in vitro ở điều kiện vườn ươm:

kích thước lớn: 7,23 ± 0,81 cm; cây có kích thước vừa: 5,47 ± 0,60 cm; kích