Mục đích của luận án nhằm nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào; Xây dựng được quy trình vi nhân giống hiệu quả từ nuôi cấy phôi soma; Đánh giá mức độ ổn định di truyền ở cây cọc rào vi nhân giống tạo thành bởi phôi soma được cảm ứng từ mô sẹo nuôi cấy bằng kỹ thuật lớp mỏng tế bào lá, từ đó l m cơ sở cho việc sản xuất cây giống in vitro
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - ĐỖ ĐĂNG GIÁP NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.) VÀ ỨNG DỤNG TRONG VI NHÂN GIỐNG Chuyên ngành: Di truyền chọn giống trồng Mã số: 62.62.01.11 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Tp Hồ Chí Minh, 2016 Cơng trình hồn thành tại: VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP MIỀN NAM Người hướng dẫn khoa học: TS THÁI XUÂN DU TS NGUYỄN ĐÌNH LÂM Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam V o hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Thư viện Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Đối với nước ta, việc sản xuất ethanol có hạn chế định, l diện6 tích đất nơng nghiệp hạn hẹp nên khả mở rộng diện tích trồng nguyên liệu có nhiều khó khăn, nguyên liệu cho sản xuất ethanol sinh học lương thực chủ yếu, làm thức ăn chăn ni có liên quan đến an ninh lương thực cần phải xem xét cẩn trọng Hơn phát triển mạnh việc trồng sắn đất dốc gây xói mòn đất (bồi lấp cửa sơng, lòng hồ đập ).Cho nên việc định hướng phát triển diesel sinh học có nhiều thuận lợi Trong số lồi có khả sản xuất diesel sinh học cọc r o ý dễ trồng, biên độ sinh thái rộng, khả chống chịu tốt hàm lượng dầu hạt cao Chương trình phát triển nhiên liệu sinh học nói chung, nói riêng từ cọc r o nhận ủng hộ mạnh mẽ Nh nước Ngày 20 tháng 11 năm 2007, Thủ Tướng Chính Phủ định số 177/2007/QĐ ˗ TTg việc phê duyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” Ng y 19 tháng năm 2008, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn định số 1842/QĐ˗BNN˗LN việc phê duyệt Đề án “Nghiên cứu, phát triển sử dụng sản phẩm cọc rào (Jatropha curcas L.) Việt Nam giai đoạn 2008 ˗ 2015 tầm nhìn đến 2025” Hiện nay, giống cọc r o dùng để phát triển vùng nguyên liệu chủ yếu gieo từ hạt cành giâm.Mỗi phương thức sản xuất giống có ưu v nhược điểm định Cây giống gieo từ hạt giá thành giống thấp bị phân ly cọc rào thụ phấn chéo nên khó kiểm sốt suất Cây giống sản xuất từ cành giâm gieo từ hạt khơng đảm bảo tính đồng mặt di truyền Chính vậy, xu hướng gần nh khoa học nghiên cứu nhân giống theoquy trình kỹ thuật sau: (1) Nhân giống in vitro số đầu dòng tốt tuyển chọn Ngun liệu ni cấy ban đầu l đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi nách; (2) Trồng cấy mô đồng ruộng; (3) Chọn lọc lại nhân giống kỹ thuật nuôi cấy phôi soma từ nuôi cấy mơ nói để tăng hệ số nhân giống làm hạ giá thành giống Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào phương pháp mới, nghiên cứu khả biệt hóa tế bào Hệ thống tế bào lớp mỏng với đặc tính mỏng có nhiều ưu điểm quan trọng để tái thiết lập chương trình cho việc tạo phơi soma Sự thuận lợi phương pháp nghiên cứu lớp mỏng tế bào là: tần số phát sinh quan cao, đồng thời thời gian ngắn cho kết Nếu chọn môi trường dinh dưỡng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp 100% mẫu cấy có phản ứng Phương pháp ni cấy lớp mỏng tế b o l phương pháp mới, nghiên cứu khả biệt hóa tế bào Chỉ thị phân tử phát triển ứng dụng từ đầu thập niên 90 kỷ XX.Sự phát triển ứng dụng thị phân tử để xác định sử dụng biến đổi DNA bước phát triển quan trọng lĩnh vực di truyền chọn giống thực vật Cho đến n y có nhiều loại thị phân tử phát triển v đưa v o sử dụng Mỗi loại thị có nguyên lý, kỹ thuật, phạm vi ứng dụng khác phù hợp cho mục đích nghiên cứu khác Khơng có kỹ thuật thị phân tử n o đáp ứng đầy đủ yêu cầu nhà nghiên cứu.Trong số thị phân tử RAPD xem l tương đối đơn giản rẻ tiền để nghiên cứu tính ổn định di truyền giống ni cấy mô.Trên giới, kỹ thuật RAPD sử dụng nhiều nghiên cứu tính ổn định di truyền lai tạo giống công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong phạm vi nghiên cứu luận án này, tính chất lịch sử đề cương nghiên cứu giới hạn kinh phí nghiên cứu, kỹ thuật RAPD sử dụng để đánh giá kiểm tra tính ổn định di truyền cọc rào từ quy trình vi nhân giống Từ vấn đề nêu trên, việc thực luận án: “Nghiên cứu phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào cọc rào (Jatropha curcas L.) ứng dụng vi nhân giống” nhằm đưa phương pháp để vi nhân giống hiệu số lượng lớn cọc rào chất lượng cao, ổn định mặt di truyền so với đầu dòng Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào cọc rào; Xây dựng quy trình vi nhân giống hiệu từ nuôi cấy phôi soma; Đánh giá mức độ ổn định di truyền cọc rào vi nhân giống tạo thành phôi soma cảm ứng từ mô sẹo nuôi cấy kỹ thuật lớp mỏng tế bào lá, từ l m sở cho việc sản xuất giống in vitro Tính đề tài Luận án xây dựng quy trìnhvi nhân giống từ phơi soma cọc rào thông qua kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào Quy trình đảm bảo mục tiêu có hiệu suất nhân giống cao, ổn định di truyền, chất lượng tốt Đây l quy trình xây dựng Việt Nam có v i điểm cải tiến so với kết nghiên cứu giới Trong đề t i n y nghiên cứu thay chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh số acid amine polyamine số giai đoạn trình phát sinh phơi soma cọc r o Đây tính luận án so với kết nghiên cứu phát sinh phôi soma cọc rào nước giới Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học: Đây l hướng nghiên cứu nuôi cấy in vitro Việt Nam đối tượng cọc rào; Đề t i đóng góp số kết nghiên cứu phát sinh hình thái, di truyền chọn giống vi nhân giống thân gỗ Ý nghĩa thực tiễn:Từ quy trình vi nhân giống luận án sản xuất giống cọc rào ổn định mặt di truyền, có suất hàm lượng dầu cao đáp ứng cho nhu cầu cao xã hội; Các cá nhân, quan có nhu cầu nghiên cứu sử dụng tham khảo quy trình cơng nghệ vi nhân giống cọc rào từ kết đề tài này; Một số quan nghiên cứu, doanh nghiệp cần chuyển giao quy trình cơng nghệ vi nhân giống cọc rào từ kết đề tài Phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu đối tượng cọc rào giống Ấn Độ Giống n y nhập nội khảo nghiệm từ đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn giống công nghệ trồng dầu mè Jatropha curcasL để sản xuất diesel sinh học góp phần giảm thiểu nhiễm môi trường thành phố” thực Ban quản lý Khu Nông nghiệp Công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007 - 2010 Lá cọc r o trưởng th nh thu nhận sử dụng làm vật liệu nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu: Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật xây dựng quy trình vi nhân giống cọc rào từ phơi soma; Sử dụng công cụ đại đánh giá mức độ ổn định di truyền giống từ phôi soma; Sử dụng phương pháp giải phẫu mô tế bào thực vật quan sát hình thái nghiên cứu phát sinh hình thái Cấu trúc luận án Luận án gồm 132 trang, chia thành phần: Mở đầu (04 trang); Chương Tổng quan tài liệu (36 trang); Chương Nội dung phương pháp (17 trang); Chương Kết - thảo luận (54 trang); Kết luận kiến nghị (02 trang) Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (18 trang) với 223 tài liệu tham khảo có 17 tài liệu tiếng Việt 206 tài liệu tiếng Anh Luận án có 12 bảng số liệu, 26 hình Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cây cọc rào (Jatropha curcas L.) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có nguồn gốc từ châu Mỹ biết đến với nhiều giá trị sản xuất phân hữu cơ, thuốc trừ sâu, dược liệu, đặc biệt ứng dụng sản xuất dầu diesel sinh học (biodiesel) thân thiện với môi trường với h m lượng dầu hạt cao 35 - 40%, 50 - 60% nhân hạt (Sunder cộng sự, 2006) Để sản xuất biodiesel hiệu từ cọc rào điều quan trọng cần có giống tốt nhân đầu dòng để phát triển vùng nguyên liệu (Isabel cộng sự, 1993; Leroy cộng sự, 2000) Vi nhân giống J curcas nghiên cứu nhiều giới, tái sinh từ nuôi cấy phận khác như: chồi nách, chồi đỉnh, đốt thân, lá,…(Isabel cộng sự, 1993; Leela cộng sự, 2011; Leroy cộng 2000) Quá trình phát sinh phôi soma cọc rào trở thành phương pháp lý tưởng để nhân giống tạo số lượng lớn giống v phương pháp n y áp dụng thành công cọc rào (Bennici cộng sự, 2004; Fourré cộng sự, 1997; Ishii cộng sự, 1999; Nhut cộng sự, 2013) Tuy nhiên, tính khơng đồng di truyền tế bào soma tác động yếu tố trình ni cấy in vitro góp phần làm xuất biến dị soma, điều dẫn đến chọn lọc ổn định v l m tăng biến dị di truyền suốt giai đoạn đầu ni cấy Việc đánh giá tính ổn định di truyền giống cấy mô cần quan tâm để định hướng trình sản xuất giống hàng loạt Trong luận án này, sử dụng phương pháp RAPD để đánh giá ổn định di truyền cọc r o tái sinh thông qua phôi soma tác động yếu tố theo thời gian ni cấy q trình ni cấy in vitro góp phần làm xuất biến dị soma Để bổ sung cho tính xác cao phương pháp RAPD, luận án có nghiên cứu khả biến di kiểu hình sử dụng phương pháp dòng chảy tế bào đánh giá biến dị mức đa bội thể nhân giống từ phôi soma Kết nghiên cứu giúp định hướng thiết lập quy trình nhân giống, giúp sản xuất cọc rào với số lượng lớn thời gian ngắn kỹ thuật vi nhân giống Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP Địa điểm thí nghiệm: Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc Gia Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới 6 Thời gian thực hiện: Thời gian thực từ tháng 01/2011 đến tháng 03/2015 Đối tƣợng nghiên cứu: Đối tượng sử dụng giống cọc rào (Jatropha curcas L ) nhập từ Ấn Độ trồng vườn ươm Viện Sinh học nhiệt đới Giống Ấn Độ nhập nội khảo nghiệm từ đề t i “Nghiên cứu tuyển chọn giống công nghệ trồng dầu mè Jatropha curcas L để sản xuất diesel sinh học góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường thành phố” thực Ban quản lý Khu Nông nghiệp Công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007– 2010 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Nội dung 1: Nghiên cứu phát sinh quan phôi soma Nội dung 1.1 Khảo sát tạo nguồn mơ sẹo có khả sinh phôi từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ auxin ngoại sinh lên phát sinh hình thái lớp mỏng tế bào Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp 2,4-D kinetin lên khả sinh phôi soma Nội dung 1.2 Khảo sát khả tăng sinh, biệt hóa trưởng thành nguồn mơ sẹo có khả sinh phơi: ảnh hưởng số nồng độ acid amine spermidine Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ proline lên hình thành phơi soma Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutamine lên hình thành phơi soma Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ adenine sulphate lên hình thành phơi soma Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ spermidine lên hình thành phơi soma Nội dung 1.3 Khảo sát khả tái sinh, phát triển thành hồn chỉnh phơi soma Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng mơi trường khống lên hình thành rễ tái sinh từ phơi soma Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IBA, NAA lên phát triển rễ tái sinh từ phôi soma Thí nghiệm 9: Khảo sát khả ươm từ phôi soma vườn ươm, thử nghiệm số loại giá thể 2.1.2 Nội dung 2: Đánh giá mức độ ổn định di truyền giống từ phôi soma Nội dung 2.1 Khảo sát mức độ biến dị kiểu hình phát triển từ phơi soma Thí nghiệm 10: Khảo sát biến dị kiểu hình phát triển từ phơi soma Nội dung 2.2 Khảo sát mức độ bội thể giống từ phơi soma + Thí nghiệm 11: Sử dụng phương pháp dòng chảy tế b o đánh giá mức độ bội thể cọc rào nhân giống in vitro Nội dung 2.3 Khảo sát mức độ biến dị di truyền giống từ phôi soma + Thí nghiệm 12: Sử dụng kỹ thuật RAPD để so sánh mặt di truyền giống từ phơi soma với đầu dòng 2.1.3 Nội dụng 3: Xây dựng quy trình vi nhân giống cọc rào từ nuôi cấy phôi soma 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp giải phẫu quan sát hình thái phơi soma, mơ sẹo có khả sinh phơi mơ sẹo khơng có khả sinh phơi Hình thái phôi, mô sẹo theo dõi phương pháp giải phẫu, nhuộm hai màu (Nguyễn Tiến Bân cộng sự, 1979) 2.2.2 Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào thực vật Các cắt nhỏ theo kỹ thuật lớp mỏng tế bào (Tran Thanh Van, 1973) theo chiều ngang, mảnh nhỏ có kích thước 0,5 mm x 10 mm v dùng làm vật liệu ni cấy cho thí nghiệm cụ thể 8 2.2.3 Phân tích xử lý số liệu Các thí nghiệm bố trí theo kiểu thí nghiệm hồn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD) theo phương pháp Compton Mize, 1999, sử dụng để nghiên cứu thực vật phòng thí nghiệm nhà kính [37]; Số liệu ghi nhận xử lý phần mềm Statgraphics Centurion XV I theo phương pháp LSD - Least Significant Difference (Hayter, 1986) mức ý nghĩa 5% [82] 2.2.4 Điều kiện nuôi cấy - Điều kiện nuôi cấy mô: Thời gian chiếu sáng l 10h/ng y, cường độ chiếu sáng 2500 lux Nhiệt độ: 25 2C Độ ẩm trung bình: 60 5% - Điều kiện ngo i vườn ươm: Vườn ươm theo chuẩn che sáng Chƣơng KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 3.1 Kết 3.1.1 Ảnh hƣởng auxin ngoại sinh lên phát sinh hình thái lớp mỏng tế bào Ảnh hưởng auxin NAA, IBA lên phát sinh hình thái lớp mỏng tế bào cọc rào Sau 28 ngày nuôi cấy môi trường MS bổ sung IBA NAA riêng lẻ nồng độ khác cho thấy mẫu cấy lớp mỏng cọc rào khơng có hình thành mơ sẹo mà có dấu hiệu hóa nâu chết Từ kết thu kết luận IBA NAA loại auxin ngoại sinh khơng thích hợp để cảm ứng hình thành mơ sẹo TCL cọc rào Ảnh hưởng 2,4-D lên phát sinh hình thái lớp mỏng tế bào cọc rào Kết cho thấy 2,4-D cảm ứng hiệu tạo mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng cọc rào Nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D đạt kết tiêu khối lượng tươi 77,75 mg, khối lượng khô 4,11 mg, tỷ lệ tạo mô sẹo 98,40%, tỷ lệ sống 90,30% 9 Quan sát hình thái giải phẫu phương pháp nhuộm kép acetocarmine v Evan’s blue sử dụng để nhuộm tế bào Các tế bào có khả phát sinh phơi có nhân lớn tế bào chất đậm đặc nhuộm m u đỏ sáng mạnh với acetocarmine Kết cho thấy mơi trường có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D có hiệu để cảm ứng hình thành mơ sẹo có khả sinh phôi soma cọc rào Bảng 3.1.Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D lên phát sinh hình thái sau 28 ngày ni cấy Nghiệm Nồng độ 2,4-D Khối lƣợng Khối lƣợng Tỷ lệ tạo Tỷ lệ sống thức (mg/l) tƣơi (mg) khô (mg) mô sẹo (%) (%) D0 0,0 0,80dx 0,16e 0,00c 20,36d D1 0,1 8,01c 1,13d 10,52b 60,18c D2 0,5 77,75b 4,11c 98,40a 90,30b D3 1,0 80,44a 5,20a 97,95a 93,58a D4 1,5 81,62a 4,71b 98,79a 92,22ab y ANOVA * * * * 77,24 68,58 77,47 41,16 CV% x: Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD y *: khác biệt có mức ý nghĩa p ≤ 0,05 3.1.2 Ảnh hƣởng kết hợp 2,4-D kinetin lên khả phát sinh phôi soma Bảng 3.2 Ảnh hưởng 2,4-D kinetin lên phát sinh phôi từ mô sẹo Nghiệm 2,4-D Kinetin Khối lƣợng tƣơi Tỷ lệ hình thành phơi thức (mg/l) (mg/l) (mg) (%) A1 0,5 0,5 12,86dx 30,43f A2 0,5 1,0 62,95a 77,33a A3 0,5 1,5 50,52b 56,72b A4 0,5 2,0 33,19c 49,52c A5 0,5 14,52d 41,33e A6 1,0 60,33a 79,29a A7 1,5 27,14c 46,76d A8 2,0 28,38c 44,67d ANOVAy * * 52,08 30,89 CV% x: Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD y *: khác biệt có mức ý nghĩa p ≤ 0,05 Sau tuần ni cấy, kết thí nghiệm cho thấy có hình thành phơi từ mơ sẹo cọc r o mơi trường có bổ sung 2,4˗D v kinetin nồng độ khác (Bảng 3.2) Mơi trường khống MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D v 1,0 mg/l KINđược ghi nhận có hiệu tốt để cảm ứng hình thành phơi từ mơ sẹo có khả sinh phơi soma cọc rào với khối lượng tươi (62,95 g) v tỷ lệ hình thành phôi l (77,33%) đạt cao so với nghiệm thức khảo sát Mẫu cấy 10 môi trường bổ sung 1,0 mg/l KIN đạt tỷ lệ cao số mô sẹo phát sinh phôi (79,29%) phôi soma phát triển qua nhiều giai đoạn: dạng cầu, dạng tim, dạng thủy lôi dạng mầm 3.1.3 Ảnh hƣởng nồng độ proline lên hình thành phơi soma Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ proline lên hình thành phơi soma Proline Khối lƣợng tƣơi Tỷ lệ hình thành phơi/mẫu Số phơi/mẫu (mg/l) (mg) (%) 11,66cx 13,00c 23,33d 250 45,07b 50,07b 50,00c 500 47,87b 52,83b 60,00bc 750 72,33a 81,37a 86,67a 1000 50,70b 56,80b 66,67b ANOVAy * * * 45,42 45,42 38,71 CV% x: Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD y *: khác biệt có mức ý nghĩa p ≤ 0,05 Sau tuần nuôi cấy, kết thí nghiệm cho thấy có khác biệt đáng kể mặt thống kê nghiệm thức bổ sung proline nghiệm thức đối chứng Khi tiếp tục gia tăng h m lượng proline lên, tiêu theo dõi có gia tăng v đạt cao nghiệm thức có thành phần proline bổ sung 750 mg/l với tỷ lệ hình thành phơi 86,66%, số lượng phơi hình thành 72,33 phơi/mẫu khối lượng tươi 81,37 mg Nhìn chung, kết thí nghiệm cho thấy proline có tác động hiệu hình thành phơi soma từ mẫu cấy mơ sẹo có khả phát sinh phơi cọc rào Không giúp gia tăng tạo phôi, gia tăng khối lượng tươi mẫu tất nghiệm thức có bổ sung proline cho thấy proline có hiệu kích sinh tăng trưởng l gia tăng sinh sinh khối mẫu cấy 3.1.4 Ảnh hƣởng nồng độ glutamine lên hình thành phơi soma Trong thí nghiệm này, mơ sẹo có khả phát sinh phôi cấy v o môi trường MS cảm ứng phát sinh phơi, có bổ sung glutamine nồng độ từ 50 đến 200 mg/l Các mẫu cấy mơi trường có bổ sung glutamine nồng độ khác (từ 50 ˗ 150 mg/l) đạt tỷ lệ hình phơi cao từ 53,33% đến 83,33% Ở nghiệm thức có bổ sung 150 mg/l glutamine cho hiệu tạo phôi cao với tỷ lệ hình thành 11 phơi 83,33%, số lượng phơi hình thành 67,6 phơi khối lượng tươi mẫu cấy 104 mg Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ glutamine lên hình thành phơi soma Glutamine Khối lƣợng tƣơi Tỷ lệ hình thành phơi/mẫu Số phôi/mẫu (mg/l) (mg) (%) 11,66cx 13,10c 23,33d 50 33,13c 38,10b 53,33c 100 46,40b 52,87b 70,00b 150 67,60a 104,30a 83,33a 200 48,23b 54,00b 63,33bc y ANOVA * * * 46,72 68,39 36,93 CV% x: Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD y *: khác biệt có mức ý nghĩa p ≤ 0,05 3.1.5 Ảnh hƣởng nồng độ adenine sulphate lên hình thành phơi soma Sau tuần ni cấy, kết thí nghiệm cho thấy có khác biệt đáng kể mặt thống kê nghiệm thức bổ sung adenine sulphate nghiệm thức đối chứng Nghiệm thức bổ sung 150 mg/l adenine sulphate cho kết tốt nghiệm thức khảo sát thí nghiệm với số liệu cụ thể 76,67% tỷ lệ hình thành phơi với số phơi trung bình 52,43 phơi/mẫu khối lượng tươi mẫu 59 mg, khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức lại Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ adenine sulphate lên hình thành phơi soma Adenine Khối lƣợng tƣơi Tỷ lệ hình thành phơi/mẫu sulphate Số phơi/mẫu (mg) (%) (mg/l) x 11,66c 13,10c 23,33d 50 29,07c 33,50c 46,67c 100 41,40b 47,23b 63,33b 150 52,43a 59,23a 76,67a 200 39,27b 44,37b 53,33bc ANOVAy * * * 42,15 41,82 36,22 CV% x: Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD y *: khác biệt có mức ý nghĩa p ≤ 0,05 3.1.6 Ảnh hƣởng nồng độ spermidine lên hình thành phơi soma Kết cho thấy có khác biệt đáng kể mặt thống kê nghiệm thức Trên môi trường có bổ sung spermidine, tỷ lệ hình thành phơi mẫu cấy cao so với môi trường khơng bổ sung spermidine Trong đó, nghiệm thức bổ sung permidine nồng độ 0,03 12 mg/l cho hiệu cao với tỷ lệ phát sinh phôi đạt 100%, số lượng phơi hình thành 102,70 phơi khối lượng tươi trung bình l 1139 mg Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ spermidine lên hình thành phơi soma Spermidine Khối lƣợng tƣơi Tỷ lệ hình thành phơi/mẫu Số phôi/mẫu (mg/l) (mg) (%) 0,00 11,67d 13,40d 23,33e 0,01 63,37c 71,73c 76,67c 0,03 102,70a 113,90a 100,00a 0,05 81,27b 91,20b 90,00b 0,07 61,13c 67,47c 70,00d y ANOVA * * * 48,83 50,55 39,00 CV% x: Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD y *: khác biệt có mức ý nghĩa p ≤ 0,05 3.1.7 Ảnh hƣởng mơi trƣờng khống lên hình thành rễ tái sinh từ phơi soma Bảng 3.7 Ảnh hưởng mơi trường khống lên hình thành rễ tái sinh từ phơi soma Tỷ lệ hình MT Số lƣợng Chiều dài rễ Khối lƣợng rễ Chiều cao thành rễ khoáng rễ (cm) (mg) (cm) (%) 1/2MS 1,00dx 0,54e 2,83e 1,29d 79,95d MS 3,33b 1,57b 13,29b 2,13a 93,33b B5 4,07a 2,02a 17,53a 2,38a 100,00a WHITE 2,87c 1,28d 10,37d 2,11b 86,67c WPM 3,07c 1,44c 11,70c 1,93c 93,33b ANOVAy * * * * * 36,93 36,52 44,73 19,34 8,12 CV% x: Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD y *: khác biệt có mức ý nghĩa p ≤ 0,05 Trong thí nghiệm này, phơi hình thành mầm ni cấy mơi trường khống khác Tỷ lệ hình thành rễ từ phôi soma đạt tương đối cao từ 80% đến 100% tất môi trường khảo sát Trên mơi trường B5, tỷ lệ hình th nh rễ tiêu khác cao v khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại Cây có hình thành rễ đạt 100% phát triển tốt so với mơi trường khống khác với số lượng rễ trung bình (4,07 rễ), chiều dài rễ (2,02 cm), khối lượng rễ (17,53 mg) chiều cao (2,38 cm) đạt cao Môi trường MS v WPM cho thấy có hiệu việc thúc đẩy hình thành rễ phát triển con, nhiên rễ hình th nh mơi trường ngắn bị yếu so với rễ hình th nh môi trường B5 13 3.1.8 Ảnh hƣởng IBA, NAA lên phát triển rễ tái sinh từ phôi soma Kết tốt thí nghiệm ghi nhận nghiệm thức bổ sung 1,5 mg/l IBA với số lượng rễ (4,53 rễ), chiều dài rễ (3,02 cm), khối lượng rễ (27,07 mg), chiều cao (3,23 cm) đạt cao Cả IBA NAA cho thấy hiệu kích thích hình thành rễ tái sinh từ phôi soma Khi so sánh hiệu IBA NAA, nồng độ, nghiệm thức bổ sung IBA có ảnh hưởng tốt nghiệm thức bổ sung NAA lên hình thành rễ cọc rào thí nghiệm này, rễ hình thành mơi trường bổ sung IBA to khỏe, nhiều v d i rễ hình th nh mơi trường chứa NAA Bảng 3.8 Ảnh hưởng IBA, NAA lên hình thành rễ tái sinh từ phôi soma CĐHSTTV (mg/l) IBA Số lƣợng rễ Chiều dài rễ (cm) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 1,0 1,5 ANOVAy CV% 3,47dx 3,73cd 3,93bc 4,17b 4,10b 3,67cd 4,00bc 4,53a * 8,51 1,62h 1,83g 2,13e 2,58b 2,37d 1,99f 2,32d 3,02a * 18,02 NAA Khối lƣợng rễ (mg) Chiều cao (cm) Tỷ lệ tạo rễ (%) 14,07g 15,97f 19,13d 22,97b 21,03c 17,03e 21,37c 27,07a * 19,72 2,31f 2,36f 2,57d 3,03b 2,77c 2,45e 2,62d 3,23a * 11,52 86,67c 93,33b 100a 100a 100a 93,33b 100a 100a * 5,58 x: Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD y *: khác biệt có mức ý nghĩa p ≤ 0,05 3.1.9 Khảo sát khả ƣơm từ phôi soma vƣờn ƣơm, thử nghiệm số loại giá thể Tỷ lệ sống khả phục hồi (phát triển rễ, tăng trưởng chiều cao) mối quan tâm đưa in vitro ngo i vườn ươm Trên giá thể trồng khác khả sinh trưởng rễ khác nhau, điều ảnh hưởng đến tỷ lệ sống khả phục hồi sinh trưởng trồng sau chuyển từ môi trường in vitro môi trường ex vitro Yêu cầu giá thể vừa đảm bảo độ tơi xốp, có khả nước tốt, có tính giữ ẩm cao đồng thời phải hoàn toàn mầm bệnh Trên giá thể mụn dừa tỷ lệ sống 14 số rễ trung bình ngo i vườn ươm đạt cao nhất, tương ứng 97,78% 33,57 rễ Bảng 3.9 Ảnh hưởng giá thể lên khả sinh trưởng phát triển từ phôi soma vườn ươm Nghiệm thức Tỷ lệ sống (%) Số rễ trung bình (cái) 97,78ax 96,67a 97,78a 93,33ab 88,89b 86,67b * 5,92 19,60b 14,07c 33,57a 15,43c 15,30c 7,23d * 47,65 Đất Đất Mụn dừa Mụn dừa + đất (1:1) Mụn dừa + đất (1:1) Mụn dừa + đất + cát (1:1:1) ANOVAy CV% x: Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD y *: khác biệt có mức ý nghĩa p ≤ 0,05 3.1.10 Khảo sát biến dị kiểu hình phát triển từ phơi soma Theo quan sát phân loại kiểu hình từ 300 cọc rào in vitro thông qua tái sinh phôi soma thu kết Kết cho thấy số khơng nhận thấy biến dị kiểu hình 217 với tỷ lệ chiếm 72,30% Đặc điểm dễ nhận thấy n y có thân vươn thẳng cao từ 0,5 ˗ 1,0 cm, thân tròn, khỏe Có hình ovan hình trái tim, mép thẳng không bị xoắn lại; chia thùy mọc theo kiểu xen kẻ, xếp luân phiên dọc theo thân tập trung phần Bảng 3.10.Kết phân loại kiểu hình STT Kí hiệu Loại biến dị Số lƣợng (cây) Tỷ lệ (%) BT BD1 BD2 BD3 Cây không biến dị Cây biến dị Cây biến dị thân Cây biến dị thân 217 24 53 72,30 8,00 2,00 17,70 3.1.11 Sử dụng phƣơng pháp dòng chảy tế bào đánh giá mức độ bội thể cọc rào nhân giống in vitro Các nghiên cứu trước sử dụng phương pháp dòng chảy tế bào (flow cytometry-CMF) để khảo sát mức độ bội thể cọc rào nhân giống in vitro phương pháp khác nhau: nuôi cấy đỉnh sinh trưởng; nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá; nuôi cấy phôi soma Kết cho thấy 100% cọc rào vi nhân giống phương 15 pháp nêu mang nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n), khơng có dạng dị bội 3.1.12 Sử dụng kỹ thuật RAPD để so sánh mặt di truyền giống từ phơi soma với đầu dòng Sử dụng mẫu đầu dòng (BM1 BM2) thực phản ứng RAPD với 19 mồi để sàng lọc mồi hữu hiệu dùng cho khảo sát biến dị kiểu gen mẫu nghiên cứu Sau sàng lọc mồi với mẫu BM chọn mồi OPAL12, OPG02, OPAK14, OPC18, OPB01, OPAW07, OPM11, OPB07 cho kết với tổng số băng đủ lớn, băng phân biệt rõ, riêng biệt để thực đánh giá tính ổn định mẫu cọc rào sau nhân giống phôi soma phản ứng RAPD Phản ứng RAPD sử dụng mồi thu 47 băng, tổng số băng mồi khoảng ˗ v kích thước sản phẩm khuếch đại 370 ˗ 3000 bp Bảng 4.12 cho thấy đa số mồi cho kết đồng hình nhiên có xuất băng đa hình mồi (OPM11, OPG02) Khoảng cách di truyền mẫu với dầu dòng thể Các mẫu chia thành nhóm lớn kiểu di truyền Nhóm bao gồm BM1, BM2, L1 v L1 (97,44% tương đồng) Nhóm gồm L3.1, L3.2 v L6 (98,37% tương đồng) Nhóm mẫu L6.2, L9.1, L9.2 (100% tương đồng) Khoảng cách di truyền xa với BM1, BM2 L6.2, L9.1 v L9 (95,83% tương đồng), mẫu tương đồng gần với BM l L1 v L1 (tương đồng 100%) Điều cho thấy mẫu có độ tương đồng cao (0,985) đảm bảo từ phơi soma có tính ổn định di truyền cao so với bố mẹ Tuy nhiên khoảng cách di truyền tăng sau lần cấy truyền nhiều yếu tố tác động q trình nhân giống mơi trường ni cấy, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 3.1.13 Quy trình nhân giống in vitro cọc rào từ ni cấy phơi soma Theo quy trình vi nhân giống cọc rào nuôi cấy phôi soma, sau 49 tuần thời gian (khoảng năm) từ mẫu non từ bố mẹ thông qua chọn lọc tạo triệu giống phôi soma Cây giống n y đảm bảo tính năng: ổn định di truyền so 16 với bố mẹ, bệnh, có rễ cọc giống từ hạt Đồng thời với hệ số nhân giống lớn quy trình đáp ứng nhu cầu giống lớn quy mô canh tác cọc rào sau 3.2 Thảo luận 3.2.1 Thảo luận nội dung Hệ thống vi nhân giống cọc rào thông qua kỹ thuật nuôi cấy phôi soma giải nhược điểm phương pháp nhân giống cổ điển mắc phải đối gồm: - Khả chống chịu điều kiện ngoại cảnh giâm cành: cọc rào loại có khả chịu hạn cao, trồng vùng khô hạn Do vậy, phương pháp nhân giống giâm cành lo i n y có đời sống ngắn v khả chống hạn bệnh tật nhân giống hạt Bởi vì, từ cành giâm không tạo rễ cọc thật nên khả kháng hạn kém, thay v o chúng tạo rễ cọc giả cắm xuống đất khoảng 1/2 - 2/3 so với rễ cọc tạo từ gieo hạt Rễ giâm cành phát triển yếu, dễ bị gãy đổ Phôi soma cọc r o có cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi cực rễ, m điều kiện thích hợp phát triển thành thể có chức ho n chỉnh gần giống hạt hữu tính (Dương Tấn Nhựt, 2007) Do giống từ phơi soma có rễ cọc từ hạt hữu tính khả chống chịu khơ hạn bệnh tật hữu tính - Khả biến dị di truyền thụ phấn chéo gieo hạt: trồng cọc r o để khai thác dầu lâu năm phương pháp nhân giống gieo hạt sử dụng nhiều Hạt trước đem gieo lựa chọn hạt to, chắc, mẩy Hạt ngâm nước qua đêm để làm tăng tỷ lệ nảy mầm Hôm sau, hạt gieo vào bầu đất Hạt nảy mầm sau khoảng tuần đem trồng sau 45 ngày Rễ mọc từ hạt phát triển, thường có rễ rễ bên Cây trồng thực địa hoa sau khoảng - năm Tuy nhiên nhược điểm phương pháp nhân giống hạt chất lượng không đồng cọc rào thụ phấn chéo nên hạt 17 có khác mặt di truyền Như xét tính trạng h m lượng dầu hạt, tạo gieo hạt có h m lượng dầu hạt khơng ổn định, giao động từ đến 40 % Vì cọc rào nhân giống phương pháp ni cấy phơi soma ngun tắc tái sinh đường n y có vật chất di truyền giống hệt tế b o sinh dưỡng cha mẹ, tế b o n y chuyển gen tái sinh chuyển gen Do giống phơi soma đồng mặt di truyền so với đầu dòng qua chọn lọc - Hạn chế hệ số nhân giống không cao, không chủ động nhân giống, không ổn định di truyền so với bố mẹ nhân giống hạt: phơi soma giống phơi hữu tính hình thái sinh lý khơng có q trình tái tổ hợp di truyền phôi soma sản phẩm thụ tinh giao tử đực giao tử Về nguyên tắc, tất tái sinh đường có vật chất di truyền giống hệt tế b o sinh dưỡng cha mẹ, tế b o n y chuyển gen tái sinh chuyển gen Nhân giống vơ tính thực vật qua đường phát sinh phôi soma cho hệ số nhân cao, ổn định mặt di truyền so với bố mẹ chọn lọc 3.2.2 Thảo luận chung nội dung Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính nói chung kỹ thuật nhân giống thơng qua ni cấy phơi soma nói riêng sử dụng nhằm mục đích tạo quần thể trồng đồng với số lượng lớn phương pháp tạo quần thể biến dị tế bào soma Những biến dị nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống trồng biến dị có lợi báo cáo Đối với mức độ biến dị kiểu hình cọc rào ni cấy phơi soma: cho thấy có nhiều kiểu biến dị khác Tổng số có biểu biến dị kiểu hình chiếm tỷ lệ 27,7% Kết cho thấy tỷ lệ có biểu biến dị kiểu hình cao Các biến dị kiểu hình xuất tác động q trình ni cấy mơ, mơi trường ni cấy mơ sử dụng chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ 18 cao tác động vào trình biểu gen Một số ghi nhận đối tượng bơng vải, lúa nước (Oryza), lúa mì (Triticum) ho n chỉnh phát sinh thông qua giai đoạn callus tần số bị bạch tạng khơng phát triển bình thường chiếm cao (20 – 30 % cao nữa) Tuy nhiên, thay đổi kiểu hình tạm thời không di truyền cho hệ sau Cây cọc rào in vitro từ nuôi cấy phôi soma biến dị kiểu hình thường phát triển so với bình thường, không sống đưa ngo i vườn ươm Do đó, luận án này, cọc rào từ phơi soma có biến dị kiểu hình loại bỏ v không đưa ngo i vườn ươm Quá trình n y nhằm phần n o l m giảm khả cọc rào nhân giống thông qua nuôi cấy phôi soma triển khai ngo i vườn ươm có biến dị kiểu gen Như quy trình vi nhân giống cọc rào từ nuôi cấy phôi soma nhận kết với tỷ lệ khoảng 70% hình thành có khả ngo i vườn ươm Tỷ lệ chấp nhận với hai mục tiêu hệ số nhân lớn từ nuôi cấy phôi soma giảm khả biến dị triển khai trồng ngo i đồng ruộng Đối với mức độ biến dị thể bội cọc rào nuôi cấy phôi soma: kết phân tích mẫu nhóm so sánh phương pháp dòng chảy tế bào cho thấycác cọc rào từ phơi soma có mức độ bội thể 2n Kết n y có l loại bỏ có biến dị kiểu hình trước ngo i vườn ươm Những tượng tự đa bội hóa tế bào q trình ni cấy in vitro ghi nhận Lần Nitsch cộng (1969) ứng dụng để nhân thuốc nhị bội từ mô sẹo đơn bội [131] Woo Chen (1982) quan sát thấy mô sẹo lúa tái sinh từ hạt phấn in vitro tồn mức bội thể khác [201] Kết nghiên cứu lúa qua nhiều lần quan sát cho thấy mức bội thể mô sẹo xuất ng y sau: đơn bội 78,38%; nhị bội 11,74%, số lại mơ sẹo mức đa bội khác từ 3n đến 5n Cây lúa xuất từ mơ sẹo có mức đa bội thể khác nhau, số 168 nhận 19 từ hạt phấn có 62% nhị bội, 35% đơn bội, số lại tam bội Đối với mức độ biến dị di truyền cọc rào nuôi cấy phôi soma: đâychúng muốn tìm hiểu số lần cấy chuyền (số lần cấy chuyền cao tần số biến dị lớn) q trình nhân phơi soma có ảnh hưởng tới khả biến dị di truyền cọc rào Kết cho thấy có biến dị mức nhỏ từ lần cấy chuyền thứ trở lên.Khoảng cách di truyền xa với lần cấy truyền thứ so với bố mẹ l 95,83% tương đồng, mẫu tương đồng gần với bố mẹ lần cấy chuyền thứ tới thứ (tương đồng 100%) Điều cho thấy mẫu có độ tương đồng cao đảm bảo từ phơi soma có tính ổn định di truyền cao so với bố mẹ Như vậy, giống từ vi nhân giống cọc rào thông qua kỹ thuật nuôi cấy phôi soma loại bỏ bị biến dị kiểu hình khơng có biến dị kiểu gen mức đa bội thể, mức kiểu di truyền Trong quy trình vi nhân giống cọc rào,cần phải loại bỏ tỷ lệ biến dị kiểu hình cao gần 30%, hệ số nhân giống quy trình lại lớn bù đắp lại Mặt khác loại bỏ phôi soma bị biến dị giai đoạn tăng sinh mạnh quy trình vi nhân giống phí khơng đáng kể Vì qua trình sàng lọc quy trình vi nhân giống cọc rào từ phơi soma đảm bảo hiệu quả: hệ số nhân giống cao, ổn định mặt di truyền so với đầu dòng, chất lượng giống ổn định v đồng 20 Chƣơng KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Nghiên cứu phát sinh phôi: + Đã chứng minh phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào cọc rào - Nghiên cứu ổn định di truyền nhân giống từ nuôi cấy phôi soma: + Đối với mức độ biến dị kiểu hình cọc rào ni cấy phơi soma: cho thấy có nhiều kiểu biến dị khác Tổng số có biểu biến dị kiểu hình chiếm tỷ lệ 27,7% Trong trình nuôi cấy loại bỏ biến dị + Đối với mức độ biến dị thể bội cọc rào ni cấy phơi soma: kết phân tích mẫu nhóm so sánh phương pháp dòng chảy tế bào cho thấycác cọc rào từ phơi soma có mức độ bội thể 2n + Đối với mức độ biến dị di truyền cọc rào nuôi cấy phôi soma: Kết cho thấy có biến dị mức nhỏ từ lần cấy truyền thứ trở lên Khoảng cách di truyền xa với lần cấy truyền thứ so với bố mẹ l 95,83% tương đồng, mẫu tương đồng gần với bố mẹ lần cấy truyền thứ tới thứ (tương đồng 100%) Điều cho thấy mẫu có độ tương đồng cao đảm bảo từ phôi soma có tính ổn định di truyền cao so với đầu dòng - Quy trình nhân giống in vitro cọc rào từ nuôi cấy phôi soma Đã xây dựng quy trình nhân giống in vitro hiệu cọc rào từ nuôi cấy phôi soma Theo quy trình vi nhân giống cọc rào ni cấy phôi soma, sau 49 tuần thời gian (khoảng năm) từ mẫu non từ bố mẹ thơng qua chọn lọc tạo triệu giống phôi soma Cây giống n y đảm bảo tính năng: ổn định di truyền so với bố mẹ, bệnh, có rễ cọc giống từ hạt Đồng thời với hệ số nhân giống lớn quy trình đáp 21 ứng nhu cầu giống lớn quy mô canh tác cọc rào sau Hình1 Sơ đồ quy trình nhân giống cọc rào in vitro 4.2 Đề nghị - Từ quy trình nhân giống này, tiếp tục nghiên cứu khảo nghiệm giống cọc rào từ phôi soma ngo i đồng ruộng để đánh giá khả 22 tăng trưởng v suất trước phục vụ cho triển khai sản xuất tuyển chọn giống sau - Kết hợp phân nhóm di truyền dựa vào thực phản ứng RAPD với việc phân nhóm di truyền dựa v o phương pháp khác như: ISSR, AFLP, SCAR để có nhận định xác v độ tin cậy cao tuyển chọn lai tạo giống cọc rào từ ni cấy phơi soma Hình2 Một số hình ảnh vi nhân giống cọc tào từ phơi soma 23 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ Bài báo 1: Đánh giá mức độ biến dị cọc rào (Jatropha curcas L.) nhân giống in vitro thông qua tái sinh phôi Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Kim Loan, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Đình Lâm, Thái Xn Du, Dương Tấn Nhựt Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2015, 13(2A): 477-483 Bài báo 2: Ảnh hưởng số acid amine spemindin lên hình thành phơi vơ tính cọc rào (Jatropha curcas L.) Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Kim Loan, Trần Trọng Tuấn, Lê Thanh Tuấn, Huỳnh Lê Thiên Tứ, Thái Xuân Du, Nguyễn Đình Lâm, Dương Tấn Nhựt Tạp chí Sinh học, 2013, 35(3se):136-144 Bài báo 3: Sử dụng phương pháp dòng chảy tế b o đánh giá mức độ bội thể cọc rào (Jatopha curcas L.) nhân giống in vitro Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Kim Loan, Huỳnh Lê Thiên Tứ, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Đình Lâm, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt Tạp chí Khoa học Công nghệ, 2014, 52(4D): 42-50 ... giống Từ vấn đề nêu trên, vi c thực luận án: Nghiên cứu phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào cọc rào (Jatropha curcas L.) ứng dụng vi nhân giống nhằm đưa phương pháp để vi nhân giống. .. từ nuôi cấy phôi soma; Đánh giá mức độ ổn định di truyền cọc rào vi nhân giống tạo thành phôi soma cảm ứng từ mô sẹo nuôi cấy kỹ thuật lớp mỏng tế bào lá, từ l m sở cho vi c sản xuất giống in vitro... chất lượng giống ổn định v đồng 20 Chƣơng KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Nghiên cứu phát sinh phôi: + Đã chứng minh phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào cọc rào - Nghiên cứu ổn định