Nghiên cứu sự phát sinh hình thái in vitro của cây nho (vitis vinifera l ) không hạt

Nghiên cứu ảnh hưởng đơn chất của chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro của cây nho không hạt .... Ảnh hưởng đơn chất của chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI IN VITRO CỦA CÂY NHO (VITIS VINIFERA L.) KHÔNG HẠT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, bảng biểu,hình ảnh và kết quả trong trong báo cáo này là hoàn toàn trung thực, chưa từng được sửdụng và công bố trong các báo cáo, luận văn, luận án hay bất kỳ công trình khoa họcnào trước đây

Tôi cũng xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn được sử dụng trong báo cáonày đều đã ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo quy định

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Minh Nguyệt

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôicòn nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ và động viên từ gia đình, quý thầy cô, cáctập thể và các cá nhân

Với lòng biết ơn sâu sắc, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị trongViện Sinh học nông nghiệp, thầy cô khoa Công nghệ Sinh học - Trường Học Viện Nôngnghiệp Việt Nam Với tri thức và tâm huyết của mình, các thầy cô, các anh chị đã tạomọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn KS Nguyễn Thị Hân - cán bộ của Viện sinh Học Nông nghiệp,người đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo, tạo điều kiện thuận lợi nhất về mọi mặt chotôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Đặc biệt, với lòng biết ơn sâu sắc nhất tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới côgiáo hướng dẫn TS Nguyễn Thị Lâm Hải, PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh, ngườihướng dẫn đề tài giúp tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong quá trình làm và hoànthành luận văn đúng định hướng ban đầu

Cuối cùng, tôi muốn nói lời cảm ơn tới bố, mẹ, gia đình đã ủng hộ, chăm sóc,động viên tôi và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văntốt nghiệp này

Báo cáo này không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những ýkiến dóng góp quý báu của Quý Thầy Cô để báo cáo được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Minh Nguyệt

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn

ii Mục lục

iii Danh mục viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis Abstract xi Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề

1 1.2 Mục đích

1 1.3 Yêu cầu

2 Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Giới thiệu về cây nho 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

3 2.1.2 Đặc điểm thực vật học

3 2.1.3 Đặc điểm sinh thái 4

2.1.4 Giá trị dinh dưỡng và công dụng

4 2.1.5 Tình hình sản xuất nho trên thế giới và nước ta 4

2.2 Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật 5

2.2.1 Khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật 5

2.2.2 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật

5 2.2.3 Các giai đoạn nhân giống vô tính

7 2.2.4 Một số nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật

2.3 Một số kết quả nghiên cứu về nhân giống cây nho không hạt 15

2.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước 15

2.3.2 Các nghiên cứu trong nước 17

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18

3.1 Địa điểm nghiên cứu 18

3.2 Thời gian nghiên cứu 18

3.3 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 18

3.4 Nội dung nghiên cứu 18

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung dịch HgCl2 và dung dịch Troclosene Sodium (NaDCC) đến quá trình khử trùng mẫu 18

3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng đơn chất của chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro của cây nho không hạt 19

3.4.3 Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của nguồn callus mô lá nho không hạt 21

3.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BA, Ki và α-NAA đến sự phát sinh hình thái của callus nho không hạt 21

3.4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây nho không hạt 22

3.5 Phương pháp nghiên cứu 23

3.5.1 Khử trùng mẫu cấy và tạo nguồn mẫu ban đầu từ đoạn thân mang mắt ngủ 23

3.5.2 Bố trí thí nghiệm 24

3.5.3 Các chỉ tiêu theo dõi 24

3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu 25

Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 26

4.1 Kết quả 26

4.1.1 Ảnh hưởng của dung dịch HgCl2 và dung dịch Troclosene Sodium (NaDCC) đến quá trình khử trùng mẫu 26

4.1.2 Ảnh hưởng đơn chất của chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro của cây nho không hạt 27

4.1.3 Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của nguồn callus mô lá nho không hạt 35

4.1.4 Ảnh hưởng phối hợp của BA, Ki và α-NAA đến sự phát sinh hình thái của callus nho không hạt 38

4.1.5 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây nho không hạt 40

4.1.6 Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ của chồi nho không hạt 45

4.2 Thảo luận 46

4.2.1 Khử trùng mẫu tạo vật liệu sạch ban đầu 46

4.2.2 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng tới khả năng phát sinh hình thái 46

4.2.3 Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của nguồn callus mô lá 47

4.2.4 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi và ra rễ 47

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

Tài liệu tham khảo 49

Phụ lục 51

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

α-NAA alpha-Naphthyl acetic acid

LSD0,05 Độ sai khác nhỏ nhất đáng tin cậy ở mức 95%

MS Môi trường Murahige & Skoog

NXB Nhà xuất bản

TB Trung bình

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của dung dịch HgCl2 và dung dịch Troclosene Sodium

(NaDCC) đến quá trình khử trùng đoạn thân có chứa mắt ngủ 26

Bảng 4.2a Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến sự phát sinh hình thái của đoạn thân không mang mắt ngủ và mô lá 28

Bảng 4.2b Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến sự phát sinh hình thái của đoạn thân mang mắt ngủ 29

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng Ki đến sự phát sinh hình thái 31

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng 2,4D đến sự phát sinh hình thái 33

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng α-NAA đến sự phát sinh hình thái 34

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nguồn mẫu callus mô lá trên môi trường 2,4D đến sự phát sinh hình thái 36

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nguồn mẫu callus mô lá trên môi trường α-NAA đến sự phát sinh hình thái 37

Bảng 4.8 Ảnh hưởng phối hợp của BA và α-NAA đến sự phát sinh hình thái của callus 38

Bảng 4.9 Ảnh hưởng phối hợp của Ki và α-NAA đến sự phát sinh hình thái của callus 39

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi 41

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của tổ hợp BA + Ki đến khả năng nhân nhanh chồi 42

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi 44

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ của chồi nho 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Đặc điểm hình thái cây nho không hạt giống Prime 3

Hình 4.1 Mẫu nho sạch sống trong môi trường sau 4 tuần theo dõi 27

Hình 4.2a Sự tái sinh tạo callus của đoạn thân không mang mắt ngủ, mô lá trên môi trường bổ sung BA 29

Hình 4.2b Sự tái sinh chồi của đoạn thân mang mắt ngủ trên môi trường bổ sung BA 30

Hình 4.3 Sự tái sinh chồi, callus ở CT2 của 3 loại mô nuôi cấy 31

Hình 4.4 Callus được tái sinh trên môi trường bổ sung 2,4D 33

Hình 4.5 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng α-NAA đến sự phát sinh hình thái ở CT3 35

Hình 4.6 Callus từ nguồn mẫu mô lá trong môi trường 1,5 mg/l BA 36

Hình 4.7 Callus tái sinh trên môi trường BA 1,5 mg/l 37

Hình 4.8 Ảnh hưởng phối hợp của BA và α-NAA đến sự phát sinh hình thái của callus 39

Hình 4.9 Ảnh hưởng phối hợp của Ki và α-NAA đến sự phát sinh hình thái của callus 40

Hình 4.10 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi 41

Hình 4.11 Ảnh hưởng của tổ hợp BA + Ki đến khả năng nhân nhanh chồi 43

Hình 4.12 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi nho không hạt

44 Hình 4.13 Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ của chồi nho 45

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên học viên: Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Tên luận văn: Nghiên cứu sự phát sinh hình thái in vitro của cây nho (Vitis vinifera L.)không hạt

Phương pháp nghiên cứu

Đoạn thân chứa mắt ngủ, thu từ cây nho không hạt được trồng tại Viện Sinh họcNông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phương pháp nghiên cứu sự phát sinhhình thái của cây nho không hạt gồm 4 giai đoạn cơ bản: (1) khử trùng tạo vật liệu sạchban đầu, (2) xác định được chất điều hòa sinh trưởng phù hợp đến sự phát sinh hìnhthái, (3) xác định được chất điều hòa sinh trưởng phù hợp trong giai đoạn nhân nhanhchồi, (4) xác định được chất điều hòa sinh trưởng phù hợp trong giai đoạn ra rễ

Kết quả nghiên cứu chính và kết luận

Đối với mẫu cấy là đoạn thân mang mắt ngủ, chế độ khử trùng kép thích hợp là 5phút HgCl2 0,1% + 10 phút NaDCC 0,5% (Troclosene Sodium) và nuôi cấy trên môitrường cơ bản MS + 20 g/l đường saccarose + 5,0 g/l agar trong 4 tuần với tỷ lệ mẫusạch là 53,33% và tỷ lệ mẫu sạch sống là 46,67% Các chất điều tiết sinh trưởng BA, Ki,2,4D, α-NAA có cảm ứng kích thích mẫu nuôi cấy theo hướng tạo callus, tạo chồi, tạo

rễ tùy thuộc vào mẫu nuôi cấy là mô lá, mô thân hay đoạn thân mang mắt ngủ Sự phát

sinh hình thái của callus khi cấy chuyển sang môi trường có bổ sung 1,5 mg/l BA phụthuộc vào nguồn gốc callus Môi trường cho hệ số nhân chồi cao nhất là: MS + 20g/lsaccaroza + 5,0g/l agar + 1,0 mg/l BA + 15% nước dừa cho hệ số nhân đạt 3,17 (chồi/mẫu) Môi trường thích hợp nhất cho sự ra rễ của chồi nho không hạt là: MS + 20g/lsaccaroza + 5,0g/l agar + 0,25 mg/l α-NAA.

THESIS ABSTRACT

Author: Nguyen Thi Minh Nguyet

Thesis title: Study of the in vitro morphogenesis of grapevine (Vitis vinifera L.)seedless

Industry: Biotechnology Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Purposes:

Grapevine (Vitis vinifera L.) is one of the seedless fruits have high nutritionalvalue include: sugar, protein, minerals, amino acids and vitamins In particular, marketsand processing industry in Vietnam fruit there is now great potential However, to date,grape in general, in particular seedless grape varieties are mainly propagated by cuttingsmethod, low propagation coefficient, heterogeneous and can infect Therefore, weproceed to implement the project in order to study the effects of growth regulators onthe morphogenesis and initially assess the in vitro propagation of seedless grapes, as abasis for further studies on the construction process of breeding and breeding research.Research Methodology:

The body contains sleeping eyes, obtained from seedless grapes are grown at theInstitute of Biology of Agriculture - Agricultural Institute of Vietnam Male Methods ofstudying the morphogenesis of seedless grapes 4 basic stages: (1) Clean sterilized createoriginal material, (2) identify growth regulators suited to the generation morphology, (3)identify the substances suitable growth regulators in the bud multiplication stage, (4)identify the substances suitable growth regulators in the rooting stage

The findings and conclusions main:

For the culture is the body carrying sleeping eyes, dual mode appropriatedisinfection is 5 minutes 10 minutes HgCl2 0.1% + 0.5% NaDCC (Troclosene Sodium)and cultured on MS basic medium + 20 g/l sugar saccarose + 5.0 g/l agar for 4 weekswith a clean sample rate is 53.33% and the sample rate is 46.67% pure life The growthregulators BA, Ki, 2.4 D, α-NAA has induced stimulus towards creating cultures ofcallus, bud creation, root formation depends on the leaf tissue cultures, tissue or bodytrunk sections bring sleeping eyes The morphogenesis of callus when transferred toenvironmental transplants additional 1.5 mg/l BA depends on the origin ofcallus Environment for the highest multiplier bud is: MS + 20g/l saccarose + 5.0g/lagar + 1.0 mg/l BA + 15% coconut water to reach 3.17 multiplier (bud/form) The mostappropriate environment for the roots of grape seedless buds is: MS + 20g/l saccarose +5.0g/l agar + 0.25 mg/l α-NAA

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây nho (Vitis vinifera L.) thuộc họ nho (Vitaceae) gốc ở các miền ôn đớikhô Âu Á (Acmêni - Iran), là một trong những loại cây ăn quả có giá trị dinhdưỡng cao Trong quả nho hàm lượng đường tổng số chiếm 15 - 25%, protein0,03 - 0,17%, các chất khoáng hoà tan 0,03 - 0,6%, tanin 0,01 - 0,1%… và cònchứa nhiều axit amin, axit tartaric, axit malic, axit xitric và các vitaminShanmugavelu (2003) Thịt quả nho ăn dễ tiêu, giải khát, thông tiểu và lợi mật.Trong quả nho có chứa polyphenol có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ các tế bào

và các nguyên sinh chất trong cơ thể, chống lại sự hình thành các gốc tự do Vìvậy ăn nho giúp con người trẻ lâu, làm giảm nếp nhăn, tăng sức đề kháng, chốnglại sự xâm nhập của các loại virus Ngoài ra trong quả nho còn chứa nhiều đườnggluco và fructose dễ hấp thụ, các vitamin và khoáng chất có tác dụng tăng sức đềkháng cho cơ thể

Đặc biệt, thị trường tiêu thụ và ngành công nghiệp chế biến trái cây tạiViệt Nam hiện nay còn có tiềm năng rất lớn Sản phẩm nho được sử dụng ở nhiềudạng như: ăn tươi, sấy khô, sản xuất rượu, bánh kẹo và nhiều sản phẩm khác

Theo Aubert nho là một trong những cây lâu năm có tính thích ứng caonhất Từ năm 1975 các chuyên gia Philippines đã viết "Nghề trồng nho khôngcòn là một độc quyền của các nước ôn đới nữa" Ở nước ta hiện nay, nho khônghạt là một đặc điểm được đánh giá cao khi đem dùng ở dạng quả tươi và cácgiống không hạt hiện nay đã chiếm một tỷ lệ áp đảo trong số các giống nho trồng

để ăn quả tươi, việc nhân giống cây nho chủ yếu là giâm cành, hệ số nhân giốngthấp, không đồng nhất và có thể lây nhiễm bệnh Vì vậy, một hướng nghiên cứumới đã và đang được quan tâm là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo ranguồn giống đồng nhất, số lượng và chất lượng cao Xuất phát từ những vấn đềtrên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu sự phát sinh hình thái

in vitro của cây nho (Vitis vinifera L.) không hạt” làm cơ sở cho các nghiêncứu tiếp theo về xây dựng quy trình nhân giống và nghiên cứu chọn tạo giống.1.2 MỤC ĐÍCH

Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hìnhthái và bước đầu đánh giá khả năng nhân giống in vitro của cây nho không hạt

1.3 YÊU CẦU

Tạo được nguồn vật liệu ban đầu (tạo mẫu in vitro sạch vi sinh vật)

Xác định được chất điều tiết sinh trưởng phù hợp đến sự phát sinh hìnhthái (callus, rễ, chồi)

Xác định được chất điều tiết sinh trưởng phù hợp trong giai đoạn nhânnhanh chồi

Xác định được chất điều tiết sinh trưởng phù hợp trong giai đoạn ra rễ.1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC, THỰC TIỄN

Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về sự phát sinh hình thái in vitrocây nho không hạt Nghiên cứu này sẽ cung cấp những kết quả nghiên cứu bổsung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy Bên cạnh đó, làm cơ

sở cho các nghiên cứu tiếp theo về xây dựng quy trình nhân giống và nghiên cứuchọn tạo giống

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY NHO

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây nho có nguồn gốc ở miền khí hậu khô Âu - Á Cây nho được du nhậpvào Việt Nam năm 1960 và được trồng tại Trung tâm Nha Hố

Về phân loại thực vật theo Miq,1851 cho biết cây nho thuộc:

Giới (kingdom): Plantae

(không phân hạng) Angiospermae

(không phân hạng) Eudicots

Bộ (ordo): Vitales

Họ (familia): Vitaceae

Chi (genus): Vitis

Loài (species): Vinifera.L

2.1.2 Đặc điểm thực vật học

Thân cây nho thuộc loại thân gỗ, dạng cây leo Từ thân và cành mọc racác tua cuốn ở vị trí đối diện với lá Tua cuốn có thể phân nhánh để bám vào giànleo giữ cho cây được vững chắc

Lá đơn, hình tim, xung quanh có nhiều khía nhỏ như răng cưa Rễ thuộcloại rễ chùm phần lớn ở độ sâu 30 - 60 cm và trải rộng quanh vùng tán cây

Hoa lưỡng tính mọc thành chùm trên các đốt cành, kích thước nhỏ, màuxanh nhạt, thời gian nảy chồi đến khi hình thành hoa trung bình từ 30 - 40 ngày

Hình 2.1 Đặc điểm hình thái cây nho không hạt giống Prime

Quả có kích thước nhỏ, hình tròn đường kính trung bình 1,5 - 2,0 cm, vỏmỏng hơi dính vào thịt quả, khi chín có màu xanh nhạt, không có hạt Thời gianđậu quả đến khi quả chín hoàn toàn trung bình 50 - 60 ngày.

2.1.3 Đặc điểm sinh thái

Cây nho thích hợp với khí hậu khô, ít mưa, nhiều nắng, nhiệt độ khôngquá cao Vì vậy những sa mạc và nửa sa mạc trồng nho rất tốt Cây phù hợp vớinhiều loại đất trồng Tuy nhiên loại đất tơi xốp, độ thoát nước tốt cho năng suất

và chất lượng cao hơn

2.1.4 Giá trị dinh dưỡng và công dụng

Từ lâu nho đã được chứng minh là một loại quả chứa nhiều chất bổ cólợi cho sức khỏe như: Tăng cường sức đề kháng, chống lão hóa, tốt cho timmạch, có tác dụng thải độc tố Trái nho chứa khoảng 65 - 85% nước, 10 - 33%đường (glucose và fructose), phlobaphene, axit galic, axit silicic, quercetine,glucosides, mono delphinidin và delphinidin, axit hoa quả, axit phosphoric,salicilic, axit chanh, axit formic, axit oxalic, pectin, hợp chất tanin, muối kali,magiê, canxi, mangan, coban, sắt và vitamin B1, B2, B6, B12, A, C, P, K, axitfolic và các enzime

Thịt quả nho ăn dễ tiêu, giải khát, thông tiểu và lợi mật Trong quả nho cóchứa polyphenol có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ các tế bào và các nguyênsinh chất trong cơ thể, chống lại sự hình thành các gốc tự do

Vì vậy ăn nho giúp con người trẻ lâu, làm giảm nếp nhăn, tăng sức đềkháng, chống lại sự xâm nhập của các loại virus Ngoài ra trong quả nho cònchứa nhiều đường glucose và fructose dễ hấp thụ, các vitamin và khoáng chất cótác dụng tăng sức đề kháng cho cơ thể

Vỏ nho chứa nhiều resveratrol hơn trong thịt quả nho Chất này có khảnăng chống oxy hóa mạnh gấp 7 lần vitamin E

2.1.5 Tình hình sản xuất nho trên thế giới và nước ta

2.1.5.1 Trên thế giới

Theo số liệu của FAO, diện tích trồng nho của toàn thế giới là 8,4 triệu ha

và có xu hướng gia tăng 2% mỗi năm, sản lượng hàng năm đạt 60,4 triệu tấn,chiếm 17,5% tổng sản lượng trái cây trên toàn thế giới Cùng vói đó, theo số liệucủa FAO (1989) trung bình các năm 86 – 88, sản xuất nho trên thế giới đạt 65triệu tấn/năm Trong đó 2/3 là nho dùng để sản xuất rượu vang, nho ăn tươi cònkhoảng 20 triệu tấn, chiếm vị trí thứ ba sau cam và chuối (Vũ Công Hậu, 2001)

2.1.5.2 Ở Việt Nam

Cây nho có đặc điểm phát triển tốt ở khu vực không bị ngập úng, ít mưa

Do vậy ở nước ta, Ninh Thuận là nơi có điều kiện đất đai và khí hậu phù hợp chocây phát triển với năng suất cao Tính đến thời điểm năm 2014, tổng diện tíchtrồng nho của Ninh Thuận khoảng gần 800 ha, tập trung chủ yếu ở các huyện:Ninh Phước, Ninh Hải và thành phố Phan Rang, năng suất nho thu hoạch đạt16,87 tấn/ha (tăng 1,66 tấn/ha so với năm 2013), sản lượng đạt 11.000 tấn (tăng10,9% so với cùng kỳ)

2.2 CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ, TẾ BÀO THỰC VẬT

2.2.1 Khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả cácloại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên các môitrường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng, bao gồm:

Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành

Nuôi cấy cơ quan (rễ, thân, lá, hoa, quả, noãn chưa thụ tinh)

Nuôi cấy phôi (phôi non và phôi trưởng thành)

Nuôi cấy mô sẹo (callus)

Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

Nuôi cấy tế bào đơn (Nguyễn Quang Thạch và cs.,2005)

2.2.2 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết

về tính toàn năng của tế bào Theo Gottlide Haberlandt (1902), mỗi tế bào củabất kì cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ thống di truyền cần thiết và đầy đủ thôngtin của sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triểnthành cơ thể hoàn chỉnh Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơthể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ Hàng trăm loại cây trồng đã đượcnhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhântạo vô trùng và tái sinh thành cây hoàn chỉnh với số lượng vô cùng lớn(Murashige, 1980)

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất làkết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa Tất cả các tế bào trong các

cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôisinh Sau đó từ các tế bào phôi sinh này tiếp tục được biến đổi thành các tế bào

chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau gọi là sự phânhóa tế bào.Ví dụ: mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ,

mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dinh dưỡng

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên,chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cầnthiết,ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôi sinh và phát triểnmạnh

mẽ Đó là quá trình phản phân hóa, ngược lại với sự phân hóa tế bào như sơ đồsau:

Quá trình biệt hóa TB

TB phôi sinh TB giãn TB phân hóa

chức năng

Quá trình phản biệt hóa TB

Ví dụ: khi nuôi cấy mô thuốc lá, các tế bào phân hóa của lá gặp điều kiệnthích hợp sẽ phản phân hóa và liên tục phân chia liên tục tạo thành mô sẹo Các

mô sẹo không còn là các tế bào có chức năng như tế bào lá nữa, khi cấy chuyểntrên môi trường thuận lợi thì chúng sẽ tạo thành cây hoàn chỉnh

Về bản chất, đó là các quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Trong quá trìnhphát triển của cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất địnhđược hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị ngừng hoạt động.Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tửADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vậtluôn được hài hòa Mặt khác, khi nằm trong một khối mô bình thường, tế bàoluôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh Khi tế bào được tách riêng rẽ, tácdụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa

và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một chương trình đã được thiết lập

Như vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật xét cho cùng là kỹ thuậtđiều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trongđiều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa củacác tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật (Nguyễn Quang Thạch vàcs., 2005; Nguyễn Như Khanh, 2006)

2.2.3 Các giai đoạn nhân giống vô tính

Theo Nguyễn Quang Thạch và cs (2005) sự thành công của việc nhângiống in vitro chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn:

Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống invitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưavào nuôi cấy in vitro

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên.Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vàilần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả

Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các

mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợpchất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bêncạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mônon, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành Người

ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của câycho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ sốnhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoàsinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin,…) các chất bổ sung khác nhờ nướcdừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp

Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằngkích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sựphát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi

vô tính

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ởgiai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này

sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổsung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng cóchức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra ngoài điều kiện tự nhiên

là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khảnăng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất

Để đưa cây từ ống nghiêm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinhtrưởng tốt càn đảm bảo một số yêu cầu:

+ Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số

lá, số rễ, chiều cao cây );

+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp,thoát nước;

+ Có thể chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu ánh sáng của vườnươm cũng như chế độ dinh dưỡng thích hợp (Lê Văn Hoàng, 2007)

2.2.4 Một số nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật2.2.4.1 Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy

Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định đến sự thành bại của quá trìnhnuôi cấy in vitro Do môi trường nuôi cấy rất giàu dinh dưỡng nên nó sẽ là môitrường phát triển hết sức thuận lợi cho nấm và các vi sinh vật khác Nếu điềukiện vô trùng không được đảm bảo thì mẫu cấy sẽ bị tạp nhiễm và chết dẫn đếncác giai đoạn sau bị ngừng lại Vì vậy, trong quá trình nuôi cấy phải đảm bảođiều kiện vô trùng tuyệt đối hay là phải có phương pháp khử trùng mẫu thíchhợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng cấy, bàn cấy vô trùng, đặc biệt cácthao tác nuôi cấy phải hết sức cẩn thận

Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ, thời gian

xử lý là mức độ xâm nhập của chất khử trùng vào các kẽ và những phần gồ ghềtrên bề mặt của mô cấy Đối với các mẫu quá bẩn, việc rửa kỹ bằng xà phòng và

để dưới vòi nước chảy từ 20 – 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể vi khuẩn

có trong mẫu cấy (Bhojwani,1980)

2.2.4.2 Ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy

- Mẫu nuôi cấy: Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựamẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôicấy mô Các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổisinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu

- Kiểu gen: ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy Với loài thuốc láđược sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng and Smith (1973) ghi nhận sự khác nhaugiữa các genome qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi Hơn nữa, Jaramillo andSummers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính

mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cà chua Lycopersycon esculentum

- Chọn cơ quan:

Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khảnăng sử dụng nuôi cấy in vitro Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loàikhác nhau có thể dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung and Miller (1976)cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt Nuôicấy thân mầm cây để tạo protoplast có khả năng phát sinh phôi Nuôi cấy lát cắtmỏng ở mô lá cây thuốc lá có thể tái sinh các cơ quan khác nhau như hoa chồi và

rễ phụ thuộc vào lớp mỏng tế bào ở bộ phận nào của cây được nuôi cấy và cáchocmon Có thể thu nhận những cây cúc có kiểu hoa và màu hoa khác với cây mẹkhi nuôi cấy những phần của mẫu hoa

- Tuổi và sinh lý:

Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôicấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào và tuổi sinh lý Có nhiềunghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik(1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già Thànhphần cơ quan có cấu tạo thấp không thể nuôi cấy in vitro do không thể sửdụng thành phần khoáng trong môi trường

- Mẫu in vitro:

Trong những năm gần đây, nhiều kết quả cho thấy mẫu in vitro có khảnăng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươmnhư ở cây Azalea (Economou and Read, 1986) Tuy nhiên, Lu et al (1991) ghinhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên câyđồng ruộng

- Sức sống của mẫu:

Mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro Morel(1952 - 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất ra cây sạch bệnh.Những cây bị nhiễm virus cũng có thể tạo ra cây sạch bệnh nhờ nuôi cấy đỉnhsinh trưởng

- Duy trì mẫu:

Xử lý và vận dụng quản lý mẫu nuôi cấy cho phép nhà vi nhân giống luôn

có nguồn nguyên liệu để sử dụng trong nhân giống Nguyên liệu của nuôi cấy cầnphải sạch bệnh Có nhiều nhân tố kiểm tra và cải thiện những điều kiện sinh lý vàvật lý mẫu cây mẹ như dinh dưỡng, nhiệt độ, cường độ ánh sáng mà mẫu cây mẹsinh trưởng và những xử lý vật lý và hóa học trực tiếp trên mẫu cây mẹ

- Dinh dưỡng:

Sử dụng vật liệu nuôi cấy khỏe và dinh dưỡng cây mẹ cho thấy rất quantrọng để có mẫu nuôi cấy khỏe

2.2.4.3 Ảnh hưởng của các thành phần môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy bao gồm hai loại: Môi trường hoá học và môi trườngvật lý, chúng quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in vitro

Do vậy, khi tiến hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi trường thích hợpcho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy vàvới từng đối tượng nuôi cấy cụ thể:

Môi trường nuôi cấy MT

Hóa học

MT Vật lí

Cá

Cá

N

h Án

sinh

phần

* Môi trường hoá học: Cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho

sự sinh trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro Thànhphần của môi trường hoá học thay đổi theo loài cây, bộ phận cây, mục đích nuôicấy, nhưng thường có các nhóm chất sau:

- Nhóm các nguyên tố đa lượng

Nguyên tố đa lượng là những nguyên tố muối khoáng như: N, P, K, S, Mg

và Ca, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm Các nguyên tố này có chức năngtham gia vào quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường vàxây dựng nên thành tế bào Môi trường nhiều Nitơ thích hợp cho việc hình thànhchồi, với môi trường nhiều Kali sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh

mẽ (Nguyễn Văn Uyển, 2000)

- Nhóm các nguyên tố vi lượng

Nguyên tố vi lượng là những nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độdưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co, Mn, Bo… Tuy chỉ cần một lượng nhỏtrong môi trường nuôi cấy, nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sựsinh trưởng và phát triển của mô Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bịrối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất táisinh thấp Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụthuộc vào từng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy

có chứa 30 g/l saccarose hoặc phối hợp giữa saccarose (15 g/l) và glucose (15g/l) là thích hợp nhất cho sinh trưởng tế bào (Gunter and Ovodo, 2003) Khốilượng khô của tế bào tỷ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ saccarose từ 20 – 40 g/l,nhưng khi nồng độ saccarose lên đến 60 g/l thì ức chế sinh trưởng của tế bào(Sheper, 2001)

- Các vitamin

Theo Czocowoki (1952) thì mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitrovẫn có khả năng tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng

đủ nhu cầu của chúng Vì vậy, phải bổ sung các vitamin cần thiết vào môi trườngnuôi cấy để góp phần tạo các cô enzyme xúc tác các phản ứng sinh hoá trong tế

1mg/l Myo – inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trongsinh tổng hợp thành tế bào thực vật

- Các chất phụ gia hữu cơ

Các chất phụ gia được đưa và môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sựsinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như: nước dừa, khoai tây, chuối, dịchchiết nấm men Trong thành phần của nước dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ,đường, Myo - inositol và các chất có hoạt tính Auxin, các gluoxit của Cytokinin.Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng, vì trong thành phần củachúng có chứa một số vitamin và các kích thích tố có tác dụng tích cực đến sựsinh trưởng, phát triển của mẫu cấy

- Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều tiết sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quảnuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy Nóảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản biệt hoá và sự sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là

sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ Nhu cầu về chất điều hòa sinh trưởng đốivới từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau Vì vậy, để nuôi cấy invitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng độ cũngnhư tỷ lệ các chất điều tiết sinh trưởng phù hợp Trong nuôi cấy mô - tế bàothường sử dụng 3 nhóm chất chính là: Auxin, cytokinin và gibberellin

Nhóm các auxin

Auxin được chia làm hai nhóm do có nguồn gốc khác nhau Trong đó,auxin tự nhiên quan trọng nhất là 1H-indole-3-acetic acid (IAA) nhưng nó chỉđược dùng trong một số môi trường nuôi cấy vì IAA không ổn định với nhiệt độ

và ánh sáng Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơntrong các môi trường nuôi cấy như: 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyricacid (IBA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), picloram (Vũ Văn Vụ, 1999)

Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormonethuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính

hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn Nói chung, cácauxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng.

Auxin là nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật được sử dụng thườngxuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thànhphần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo,huyền phù tế bào và kích thích sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó đượcphối hợp sử dụng với các cytokinin Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tếbào Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormonethuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, tính hướng,tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn Vai trò của các chất thuộc nhómauxin được khái quát dưới đây:

- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên Ưuthế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫnđến sự phát chồi nách Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh bằng một lớp chất keo

có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng Cơ chế ức chế của chồiđỉnh liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác là ethylene Auxin (IAA)kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh

- IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn;

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo;

- Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp);

- 1H- indole-3-acetic acid (IAA);

- Tạo phôi soma 2,4-D (Hoàng Tấn Minh, 2006)

Nhóm các cytokinin

Trong nuôi cấy mô thực vật, cytokinin được dùng để kích thích sự phátsinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào Nồng độcytokinin cao kìm hãm sự hinh thành và phát triển rễ (Vũ Quang Sáng, 2005)

Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

- Kích thích phân chia tế bào;

- Tạo và nhân callus;

- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô;

- Kích thích phát sinh chồi nách và loại bỏ ưu thế ngọn (Hoàng Minh Tấn

và cs., 2004)

Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chất điều tiết sinh trưởng có ảnh hưởng lớnđến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các chất cuẩ mô thực vật trongnuôi cấy in vitro cũng như trong cây hoàn chỉnh (Võ Châu Tuấn, 2014).

2.2.4.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

- Ánh sáng:

Ảnh hưởng của ánh sáng có thể được chia ra trong sự tác động của cường

độ ánh sáng (bức xạ hoạt động quang hợp), thời gian chiếu sáng (quang chu kỳ)

và chất lượng ánh sáng đến sinh trưởng, phát triển của thực vật

Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của

mô nuôi cấy Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8 - 12 h/ngày

Cường độ ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đếnkhả năng nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố, mức cường độ ánh sáng

kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi(Ammirato, 1986) Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là

từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974)

Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sángcũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Ánh sáng cóbước sóng quang trọng nhất cho quang hợp và sự phát sinh quang hình thái là từ

400 - 800 nm Chất lượng ánh sáng cũng làm thay đổi phản ứng sinh trưởng củachồi in vitro Chất lượng ánh sáng cũng có thể tác động gián tiếp lên sự phát triểnchồi, là nguyên nhân làm các yếu tố môi trường phát triển trong nuôi cấy thay đổi(Hartmann, 1997) Nhìn chung ánh sáng kiềm hãm sự phát triển của rễ và có vàichỉ dẫn rằng ngăn không cho ánh sáng từ vùng rễ thì có lợi cho việc hình thành rễ(Hartmann, 1997)

- Agar (thạch):là thành phần quyết định trạng thái vật lý của môi trườngnuôi cấy Độ cứng của agar phụ thuộc vào nồng độ agar sử dụng và PH môitrường nuôi cấy Nồng độ agar thường sử dụng là 5 - 10%, nồng độ này cho phép

ổn định trong môi trường nuôi cấy

- pH của môi trường:

pH của môi trường là yếu tố rất quan trọng, sự ổn định pH của môi trường

là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào Giá trị của pH trong môi trường thíchhợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thức vật biến đổi từ 5,5 - 6,0

Theo Nguyễn Như Khanh (1990) khi pH thấp (môi trường axit) sẽ hoạt hóa cácenzyme hydrolaza dẫn đến kìm hãm sự sinh trưởng, đồng thời kích thích sự lãohóa tế bào trong mô cấy Ngoài ra, sự bền vững và hấp thu một loạt các chất phụthuộc vào pH môi trường: Gibberelin và các vitamin rất mẫn cảm với pH Sự hấpthu sắt cũng phụ thuộc vào pH môi trường.

Độ pH ảnh hưởng tới khả năng hòa tan của ion, độ đông tụ của agar, khảnăng hấp thụ dinh dưỡng của mẫu cấy, sự tăng trưởng của tế bào Để điều chỉnh

pH, ta sử dụng axit HCl, NaOH

- Nhiệt độ:

Là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào vàcác quá trình trao đổi chất trong mô cấy, đồng thời nó ảnh hưởng tới sự hoạtđộng của auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây mô

2.3 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG CÂY NHOKHÔNG HẠT

2.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Phòng thí nghiệm cây trồng, Khoa Nông nghiệp, Trường đại họcMaragheh, Iran đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởngđến việc nuôi cấy in vitro cây nho Meristem ở đỉnh chồi được sử dụng để táisinh 2 giống nho -”Soltanin” và “Sahebi” Meristem được lấy từ đoạn chồi dài

10 cm Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nghiên cứu này là MS(Murshige & Skoog, 1962) và bổ sung chất điều tiết sinh trưởng bao gồm: A (1,0mgL-1 BA), B (1,5 mgL-1 BA), C (1,0 mgL-1 IBA+ 1,5 mgL-1 BA) và D (1mgL-1 TDZ) Kết quả cho thấy công thức B và C sản sinh được số lượng chồitrung bình cao nhất trên một đỉnh đã nuôi cấy (3,8 – 5,4) Vì vậy, chồi đã đượcnuôi tăng trưởng lần thứ 2 trên môi trường bổ sung 1 mg/L TDZ+1,5 mg/L GA.Chồi in vitro được tiến xử lý với 1 mg/l IBA, sau đó được cấy trực tiếp, tạo ra sựtăng cường số lượng rễ trên chồi Sự mọc rễ khỏe đạt được trong điều kiện invitro dẫn đến việc giảm thời gian cho sự thích nghi cây so với rễ in vitro, do đóthời gian cần cho sự tái sinh cây con được ngắn lại (Aazami, 2010)

Phòng nhân giống cây trồng, Khoa Nông nghiệp, Trường đại họcAlexandria, Ai Cập đã nhân giống in vitro cây nho để bảo tồn khỏi nguy cơtuyệt chủng Quy trình tái sản xuất vi nhân giống cây con (Vitis vinifera L.) từ

đỉnh chồi và đoạn gióng, được phát triển sau khi khử trùng bề mặt của mẫu cấythí nghiệm (đỉnh chồi và đoạn lóng ) sử dụng sodium hypochloride (NaOCl) ở0,52 và 0,78% tương ứng trong 15 và 20 phút Mẫu cấy được nuôi cấy trên môitrường MS (Murshige & Skoog, 1962) bổ sung 0,5; 1,0; 2,0 mg/l BAP và 0,1mg/l NAA Trong giai đoạn nhân chồi, bổ sung 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 mg/l BAP và0,1; 0,2; 0,3 mg/l NAA hoặc sự kết hợp giữa chúng được thử nghiệm Số lượngchồi tăng lớn nhất đạt được trên môi trường MS bổ sung 3,0 mg/l BAP + 0,2mg/l NAA Trong giai đoạn tạo rễ bổ sung 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l Indol-3-butyric acid (IBA) và kết hợp với 0; 0,5 hoặc 1,0 mg/l NAA được thử nghiệm.Chồi tạo rễ trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l IBA + 0,5 mg/l NAA cho tỷ lệcao nhất, số lượng rễ/chồi và chiều dài rễ lần lượt là 87%, 3, 4 và 4,5 cm Câycon được nuôi trồng thành công khi chuyển vào chậu chứa than bùn rêu và cát

tỷ lệ 1: 1 (Abido et al., 2013)

Phòng thí nghiệm sinh học thực vật, cục công nghệ đồ uống, Viện Athens

đã nhân giống nho qua nhân nhanh chồi bên Môi trường được sử dụng nuôi cấy

vi nhân giống nho (Vitis vinifera L.) là môi trường MS bổ sung hàm lượng rấtthấp BA nồng độ 2,5 µM Khi tăng nồng độ BA thì số lượng chồi và hệ số nhânchồi được tăng lên Ở nồng độ thấp khi bổ sung IBA vào nuôi cấy cũng ảnhhưởng đến sự ra rễ và số lượng rễ của chồi (Banilas, 2010)

Khoa trồng trọt, Đại học Nông nghiệp Pakistan đã nghiên cứu ảnh hưởngcủa chất điều tiết sinh trưởng đến việc nhân giống in vitro cây nho Môi trường

cơ bản được sử dụng là MS, bổ sung BA với dải nồng độ (0, 5 và 10 µM) chonhân nhanh chồi Tạo mô sẹo bổ sung NAA với các nồng độ (0, 1, 5 và 10 µM).Thí nghiệm tạo mẫu sạch cao hơn sử dụng chất khử trùng chlorox 10% trong thờigian 10 hoặc 15 phút Kết quả, chồi sinh trưởng và hệ số nhân khi bổ sung 5 µM

BA Tỷ lệ mẫu tạo chồi là 80% so với công thức bổ sung 10 µM Tỷ lệ mẫu tạo

mô sẹo là 80% bổ sung 10 µM IBA (Jakani et al., 2008)

Đại học Nebraska – Lincoln đã nghiên cứu nghiên cứu nhân giống và sựthích nghi môi trường ban đầu của giống nho ‘Norton’ Nghiên cứ sử dụng môitrường cơ bản là MS được bổ sung 4 µM BA và thiamin (0.5 mgL-1 ), agar 7,5 g.Mục tiêu nghiên cứu là xác định phương pháp tối ưu, để sản xuất cây con ốngnghiệm và ex vitro Thí nghiệm được thiết kế với 4 nồng độ BA (0, 2, 4 & 8 µM),NAA được bổ sung với 2 nồng độ (0 & 0,5µM) Kết quả cho thấy khi bổ sung

chất điều tiết sinh trưởng vào, cây con ở môi trường ex vitro không có sự ra rễ.Cây con chỉ ra rễ tại môi trường ex vitro mà không cần bổ sung auxin Vì vậy,auxin không ảnh hưởng đến khả năng nhân giống hay kích thích ra rễ Cho thấy

sự thích nghi môi trường ban đầu cho hiệu quả cao hơn (Brant, 2010)

2.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Để nhân nhanh giống nho mới bằng biện pháp giâm cành cần phải bổ sungchất kích thích sự hình thành mô sẹo và tạo rễ nhằm rút ngắn thời gian nhângiống và nâng cao hệ số nhân giống Thí nghiệm xác định nồng độ và thời gian

xử lý Atonik trong giâm cành nho được thực hiện từ tháng 5 đến tháng 6 năm

2013 tại Nha Hố, Nhơn Sơn, Ninh Sơn, Ninh Thuận Kết quả cho thấy xử lý cànhnho giâm bằng Atonik 1,8 DD ở nồng độ 50 ppm trong thời gian 30 phút có tácdụng kích thích sự nảy chồi và ra rễ Ở giai đoạn 45 ngày sau khi giâm, Atonik1,8 DD làm tăng tỷ lệ chồi 12 %, tăng chiều dài chồi 1,14 cm và đường kính chồi0,11cm so với đối chứng, tăng tỷ lệ ra rễ 6,66 %, số rễ trung bình 14,44 %, tỷ lệbầu xuất vườn 8,66 % và lợi nhuận cũng tăng 19,64 % so với đối chứng (TháiThị Phương Hạnh và cs., 2015)

Ở Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có báo cáo nào về việc nhân giốngthành công cây nho nói chung và cây nho không hạt nói riêng bằng phương phápnuôi cấy in vitro

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học thực vật –Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 11 năm 2016.3.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên cây nho không hạt Israel, giống Prime Giống Prime là giống nho không hạt được phát triển bởi Viện The

Volcani,

Israel Quả mọng và có kích thước trung bình

 Vật liệu nghiên cứu

Đoạn thân có chứa mắt ngủ, thu từ cây nho không hạt được trồng tại ViệnSinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962).Các chất hữu cơ (đường saccarose)

Các chất điều tiết sinh trưởng: BA, 2,4D, Kinetin, α-NAA

Trang thiết bị phục vụ: Máy đo pH, bếp ga, cân kỹ thuật, box cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, tủ sấy

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Sodium (NaDCC) đến quá trình khử trùng mẫu

Môi trường nền: MS + 20g/l saccarose + 5,0g/l agar pH = 5,8-6,0

Công thức thí nghiệm:

Công thức HgCl2 0,1% (phút)CT1

NaDCC 0,5%

(phút)5CT2 5 10CT3 15

 Cách tiến hành:

Đoạn thân có chứa mắt ngủ, sau khi cắt tỉa bỏ hết lá được rửa dưới vòinước chảy Sau đó được rửa sạch bằng nước xà phòng, lắc đều 2 - 3 lần trong 10phút và rửa sạch dưới vòi nước

Trong buồng cấy vô trùng, tráng lại mẫu bằng nước cất vô trùng sau đó

cất vô trùng 3 lần Tiếp theo khử trùng mẫu trong 0,5% Troclosene sodium(NaDCC) ở các ngưỡng thời gian 5, 10, 15 phút Rửa sạch lại mẫu bằng nước cất

vô trùng 3 lần

Sau khi tráng sạch mẫu ta dùng panh kéo cắt bỏ hết phần bị thâm dập,tổn thương

Cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy khởi đầu Cắt đoạn chồi kích thước

từ 2- 3 cm rồi cấy vào bình môi trường nuôi cấy khởi đầu Ở mỗi ngưỡng thờigian bố trí 30 mẫu, theo dõi thường xuyên ngay sau khi nuôi cấy và kết thúcsau 4 tuần

3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng đơn chất của chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro của cây nho không hạt

3.4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng 6-Benzyladenine(BA) đến sự phát sinh hình thái

Nhằm xác định nồng độ BA thích hợp nhất đến sự phát sinh hình thái mẫunho, công thức thí nghiệm như sau:

ĐC 0

T

0,5C

ĐC 0

T

0,5C

T

1,0C

T

1,5C

3.4.3 Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của nguồn callus mô lá nho không hạt

Để tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus, đề tàitiếp tục cấy chuyển callus mô lá sang các môi trường nuôi cấy có bổ sung 1,5mg/l BA và theo dõi sự phát sinh hình thái callus mô lá nho không hạt

3.4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu callus mô lá trên môi trường2,4D đến sự phát sinh hình thái

Công thức thí nghiệm:

Thành phần môi trườngCông thức Nguồn mẫu callus trên môi

trường 2,4 D(mg/l)

trường α-NAA(mg/l)

Công thức Thành phần môi trường

3.4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Ki và α-NAA đến sự phát sinh hình thái của callus

Công thức thí nghiệm:

Công thức Thành phần môi trường

3.4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây nho không hạt

3.4.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi

Nhằm xác định nồng độ BA thích hợp nhất cho sự tạo chồi, mẫu cấy là đoạn chồi nho không hạt đã được tiến hành vào mẫu in vitro

Công thức thí nghiệm như sau:

Thành phần môi trườngC

3.4.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp của BA + Ki đến khả năng nhân nhanh chồi

CT1 nhất ở thí nghiệm nhanh chồi) 0,5

CT2 MS 0,5

CT3 1,0

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Khử trùng mẫu cấy và tạo nguồn mẫu ban đầu từ đoạn thân mang mắt ngủ

Đây là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn nàycần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinhtốt Các bước tiến hành: