Nghiên cứu tái sinh invitro rong sụn kappaphycus alvarezii từ mô sẹo

Khả năng cảm ứng mô sẹo của mẫu rong nuôi cấy trên môi trường PES bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau .... Chính vì vậy, chúng tôi đãtiến hành thực hiện đề tài nhằm cảm ứng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiêncứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Phạm Thị Mát

LỜI CẢM ƠNTrong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh, TS Nguyễn Văn Nguyên, ThS Đào Duy Thu

đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốtquá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Công nghệ Sinh học thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nôngnghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoànthành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng Nghiên cứuCông nghệ Sinh học Biển, Viện Nghiên cứu Hải sản đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôitrong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điềukiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luậnvăn./

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Phạm Thị Mát

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn

ii Mục lục

iii Danh mục chữ viết tắt v Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu nghiên cứu

3 1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học, thực tiễn 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 5

2.1 Tổng quan về rong sụn Kappaphycus alvarezii 5

2.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô rong biển

9 Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 20

3.1 Địa điểm nghiên cứu 20

3.2 Thời gian nghiên cứu

20 3.3 Vật liệu nghiên cứu 20

3.4 Nội dung nghiên cứu 20

3.5 Phương pháp nghiên cứu 20

Phần 4 Kết quả và thảo luận 28

4.1 Kết quả nghiên cứu

28 4.1.3 Kết quả nghiên cứu phương pháp tái sinh chồi thích hợp 39

4.1.3 Kết quả nghiên cứu so sánh hiệu quả tái sinh của các dạng mô sẹo khác nhau 42

4.1.4 Kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng của rong tái sinh 44

4.1.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự sinh trưởng của rong in vitro 48

4.2 Thảo luận 52

4.2.1 Khử trùng tạo vật liệu sạch 52

4.2.2 Cảm ứng tạo mô sẹo 544.2.3 Phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo 58

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 62

5.1 Kết luận 62

5.2 Kiến nghị 62

Danh mục các công trình đã công bố 63

Tài liệu tham khảo 64

Phụ lục 70

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

BA 6 - benzylaminopurine IAA indole-3-acetic acid NAA 1-naphtalene acetic axit

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô từ mô sẹo ở rong biển 11

Bảng 2.2 Môi trường, chất điều hòa sinh trưởng được thử nghiệm nuôi cấy từ mô sẹo trên một số đối tượng rong biển 15

Bảng 4.1 Hiệu quả tái sinh của phương pháp phát sinh phôi 39

Bảng 4.2 Các dạng mô sẹo được hình thành trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi 42

Bảng 4.3 Hiệu quả tái sinh chồi của các dạng mô sẹo 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Những khu vực trồng nhiều rong sụn 5

Hình 2.2 Các loài rong sụn thương mại Kappaphycus alvarezii 6

Hình 2.3 Vòng đời của rong sụn Kappaphycus alvarezii 8

Hình 2.4 Quá trình tái sinh mô sẹo thành cây con 13

Hình 4.1 Hiệu quả của các chế độ khử trùng khác nhau 29

Hình 4.2 Mẫu cấy của một số công thức thí nghiệm 30

Hình 4.3 Mô sẹo phát sinh trong nuôi cấy mô rong sụn 31

Hình 4.4 Các loại mô sẹo được hình thành (sau 60 ngày nuôi cấy) 32

Hình 4.5 Tỷ lệ sống và tỷ lệ cảm ứng mô sẹo ở các cường độ ánh sáng khác nhau

32 Hình 4.6 Tỷ lệ các loại mô sẹo ở cường độ ánh sáng khác nhau 33

Hình 4.7 Mẫu cấy ở cường độ ánh sáng khác nhau 33

Hình 4.8 Tỷ lệ sống và tỷ lệ cảm ứng mô sẹo của mẫu cấy ở các nồng độ agar 34

Hình 4.9 Tỷ lệ các loại mô sẹo của mẫu cấy ở nồng độ agar khác nhau 35

Hình 4.10 Mẫu cấy ở các nồng độ agar khác nhau 36

Hình 4.11 Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo của mẫu cấy trên môi trường bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau 53

Hình 4.12 Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo của mẫu cấy trên môi trường bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau 37

Hình 4.13 Khả năng cảm ứng mô sẹo của mẫu rong nuôi cấy trên môi trường PES bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau 38

Hình 4.14 Mô sẹo tái sinh bằng phương pháp nuôi lỏng trực tiếp và phương pháp phát sinh phôi 39

Hình 4.15 Mô sẹo sau khi nuôi cấy tăng trưởng 40

Hình 4.16 Sự tái sinh chồi của mô sẹo 41

Hình 4.17 Các dạng mô sẹo hình thành trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi trên thạch 42

Hình 4.18 Kết quả tái sinh của các dạng mô sẹo 44

Hình 4.19 Tốc độ sinh trưởng của mẫu rong trong các môi trường khác nhau 45

Hình 4.20 Số lượng chồi tăng lên của mẫu rong trong các môi trường khác nhau 62

Hình 4.21 Sự tăng chiều dài của mẫu rong trong các môi trường khác nhau 46

Hình 4.22 Động thái sinh trưởng của rong trong các môi trường khác nhau trong 30 ngày 47

Hình 4.23 Rong nuôi trong các môi trường khác nhau 48Hình 4.24 Tốc độ sinh trưởng của mẫu rong ở các cường độ ánh sáng khác nhau 49Hình 4.25 Số lượng chồi tăng lên của mẫu rong ở các cường độ ánh sáng khác nhau 49

Hình 4.26 Sự tăng chiều dài của mẫu rong ở các cường độ ánh sáng khác nhau

50

Hình 4.27 Động thái sinh trưởng của rong ở các điều kiện ánh sáng khác nhau 51Hình 4.28 Rong nuôi ở các cường độ ánh sáng khác nhau 51

mô tế bào thực vật Mặc dù trên thế giới đã có những thành công nhất định, tuy nhiên,nuôi cấy mô rong sụn ở Việt Nam còn là lĩnh vực mới mẻ Chính vì vậy, chúng tôi đãtiến hành thực hiện đề tài nhằm cảm ứng và tái sinh thành công mô sẹo rong sụnK.alvarezii tạo ra cây con trong phòng thí nghiệm làm cơ sở xây dựng quy trình nhângiống rong sụn in vitro để phục vụ nhu cầu rong giống thiết yếu hiện nay.

Phương pháp nghiên cứu

Mẫu rong sụn K alvarezii được thu thập từ vịnh Cam Ranh, Khánh Hòa vàchuyển về phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Biển - Viện Nghiên cứu Hải sản Sau

đó, rong được nuôi thích nghi trong điều kiện nhà kính 4 tuần và trong phòng thínghiệm 1 tuần Phương pháp nuôi cấy mô rong sụn có 4 bước cơ bản gồm (1) khử trùngtạo vật liệu sạch, (2) cảm ứng tạo mô sẹo, (3) tái sinh mô sẹo thành chồi và (4) nuôi tạotản rong Việc nghiên cứu lựa chọn phương pháp tạo vật liệu sạch trên cơ sở bố trí thínghiệm so sánh hiệu quả của ba phương pháp khử trùng bằng kháng sinh nguyên chấthãng Sigma, kháng sinh có nguồn gốc dược phẩm và dung dịch Javen ở các nồng độ,thời gian khác nhau Để tối ưu cho việc cảm ứng mô sẹo, ảnh hưởng của một số yếu tốmôi trường đã được tiến hành nghiên cứu như nồng độ agar (0,4; 0,8; 1,5 và 2%), cường

độ ánh sáng (5, 35, 70 µmol photon.m-2.s-1) và chất điều tiết sinh trưởng (IAA, NAA,BA) Sau đó, mô sẹo được nghiên cứu tái sinh bằng hai phương pháp là phương phápnuôi trực tiếp trong môi trường lỏng và phương pháp cảm ứng phát sinh phôi trên môi

trường thạch Hiệu quả của năm dạng mô sẹo tạo ra sau giai đoạn cảm ứng tạo phôiđược đánh giá so sánh trên các chỉ tiêu gồm tỷ lệ và thời gian tái sinh, số lượng chồi tạo

ra Sau đó, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng (PES, f/2,

NH4Cl - K2HPO4) và cường độ ánh sáng (10, 35, 70 µmol photon m-2.s-1) để tối ưu cho

sự sinh trưởng của rong nuôi cấy mô tạo ra trong điều kiện phòng thí nghiệm

Kết quả chính và kết luận

Phương pháp khử trùng tốt nhất là sử dụng dung dịch Javen 0,25% trong thờigian 5 giây cho tỷ lệ mẫu sạch 86,67% và tỷ lệ mô sẹo đạt 96,67% Môi trường PES bổ

quả tốt nhất cho sự cảm ứng mô sẹo với tỷ lệ sống đạt 100%, tỷ lệ mô sẹo cao (đạt96,67%, thậm chí có thể đạt tối đa 100%), trong đó chủ yếu là loại mô sẹo chất lượngtốt Tái sinh thông qua sự phát sinh phôi trên môi trường thạch của mô sẹo là phươngpháp thích hợp để tạo chồi rong sụn K alvarezii với tỷ lệ đạt 29,23% với số lượng chồidao động lớn từ 1 đến 238 Toàn bộ mô sẹo tái sinh theo phương pháp nuôi lỏng trựctiếp đều không có khả năng hình thành chồi và chết Đối với phương pháp tái sinh quamôi trường thạch, mô sẹo chất lượng kém thường không có khả năng tái sinh và chết

Mô sẹo loại tốt có tỷ lệ sống tới 90,44% và hình thành 5 dạng phát triển (dạng sợi cóphôi, dạng khối có phôi, dạng có chồi, dạng sợi và dạng khối không chồi) Trong đó,dạng sợi có phôi cho hiệu quả tái sinh cao nhất, đạt tỷ lệ 100%, số lượng chồi trung bình

là 168 Cường độ ánh sáng 35µmol photon.m-2.s-1, môi trường PES và môi trường

NH4Cl - KH2PO4 thích hợp cho sự sinh trưởng của rong in vitro với tốc độ cao nhất (đạt5%/ngày)

THESIS ABSTRACTMaster candidate: Pham Thi Mat

Thesis title: Research of regeneration of cottonii seaweed Kappaphycusalvarezii from callus

Major: Biotechnology Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

Kappaphycus alvareziiis a major commercial source of k-carrageenan and is animportant economic species in aquaculture in the central part of Vietnam However,seaweed seedling is mainly produced by traditional vegetative reproduction method.This is one of the main causes to the degradation of genetic resources, genetic variationreduction, the low rate of growth and content of carrageenan and it also increases thedisease susceptibility level of plant leading to the decline in productivity Thesedisadvantages are overcome by tissue culture technology Though the world has madecertain achievements in recent years, however, seaweed tissue culture in Vietnam is still

a new subject Therefore, the objective of this study was to obtain the optimal mediumfor callus induction from thallus explants of K alvareziiand to regenerate thallus frominduced callus as a basis for formulating the process of in vitro propagation to producemore seaweed seedling

Materials and Methods

K alvarezii, cottonii seaweeds collected from the Cam Ranh Bay (Khanh Hoaprovince) were acclimatized in greenhouse and in semisterile culture in the laboratory.The procedure includes four steps: preparation of axenic material, callus induction,micropropagules culture, and thallus formation The paper presents how to select anappropriate method in producing “clean materials” for tissue culture of the contoniseaweed, Kappaphycus alvarezii based on a test of some disinfectiton methods usingsodium hypochlorite (Javen), Sigma antibiotics and pharmaceutical antibiotics Toobtain optimal and consistent callus induction rates and growth in explants, some of theculture media supplements such as agar, growth regulators, and photon flux densitieswere standardized All culture conditions and media used for this purpose were the same

as adopted for explant culture To investigate the optimal photon flux densities, explants

were cultured at 5, 35, and 70 µmol photon m-2.s-1, for agar at 0,4%, 0,8%, 1.5%, and2,0 %, and for growth regulators (naphthaleneacetic acid [NAA] and 6-benzylaminopurine [BAP] and indole-3-acetic acid [IAA]) at different concentrationeach or in combination The concentrations of BA were 0, 0.5, 1 mg/l, theconcentrations of IAA were 0, 2.5, 5 mg/l, whereas the concentration of NAA were 0,0.5, 1 mg/l Two documented methods were applied including: direct regeneration ofcallus in liquid medium and regeneration through somatic embryogenesis Finally,micropropagules were transferred into aerated flasks with seawater and added PESmedium, or f/2 medium or NH4Cl 1 mg.L-1 and K2HPO4 1 mg.L-1 to research optimalmedium To investigate the optimal photon flux densities, micropropagules werecultured at 10, 35, and 70 µmol photon m-2.s-1

Main findings and conclusions

The main results showed using Javen 0.25% in 5 seconds to prevent bacterialcontamination in K alvarezii tissue culture is the best selection The rate of cleansamples in the treatment with Javen was 86.67% and the callus induction rate for thatwas highest (96.67%) The optimal medium for callus induction was 1.5% (w/v) bacto-agar-solidified PES medium supplemented with BA 1 mg/l The optimal photon fluxdensities was 5 µmol photon m-2.s-1 The results showed that a effective method wasregeneration through somatic embryogenesis with high micropropagule production rate(29.23%) After two months of explants culture, callus was excised from the explantsand subcutured separately on fresh medium The excised callus developed into darkreddish brown-pigmented microcolonies of globular or oval-shaped somatic embryos.The embryos were then transferred into liquid PES medium and sharked at 100 rpm forabout 10 - 15 days to form micropropagules In other method, the callus directlyregenerated in liquid medium were bleached and die after 10-12 days Finally,micropropagules were transferred into aerated flasks with seawater The seawatermedium added 1 mg.L-1 NH4Cl and 1mg.L-1 K2HPO4 or PES medium at 35 µmolphoton.m-2.s-1 gave the highest growth rate in vivo (5%)

1970 lên 20.000 tấn năm 1995 Hơn nữa, kappa carageenan chiết xuất từ K.alvarezii có sức đông mạnh hơn iota carageenan từ E denticulatum (Hayashi etal., 2010) nên được thị trường ưa chuộng hơn, tiềm năng kinh tế từ loài rong sụnnày là rất lớn Chiết xuất từ K alvarezii cũng rất giàu dinh dưỡng, cung cấpnhiều khoáng chất (iod, magie, kẽm, sắt, phospho, kali, …), giàu vitamin B, C, E,

K, β – carotene và các chất điều tiết sinh trưởng thực vật như IAA, kinetin,zeatine, gibberellins (Zodape et al., 2009)

Tuy nhiên, từ trước đến nay, giống rong biển nói chung, giống rong sụnnói riêng chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp sinh sản sinh dưỡng truyềnthống Đây chính là nguyên nhân dẫn đến suy thoái nguồn gen, giảm biến dị ditruyền, đồng thời làm giảm tốc độ sinh trưởng, hàm lượng carrageenan và làmtăng mức độ cảm nhiễm bệnh tật của rong kéo theo sự suy giảm về năng suất thuhoạch (Dawes et al., 1991; Hayashi et al., 2008) Sự suy giảm chất lượng ronggiống đã khiến cả hai nước có bề dày lịch sử trồng rong hơn 40 năm là Indonesia

và Philippines đều phải đối mặt với tình trạng suy giảm nghiêm trọng về sảnlượng rong trong nhiều năm qua Chất lượng rong giống Việt Nam cũng đangsuy thoái rất nhanh sau gần hai thập kỷ du nhập và nhân sinh dưỡng liên tục Tốc

độ sinh trưởng của rong suy giảm đến mức đáng lo ngại Vào những năm 1994 –

1996, tốc độ sinh trưởng đạt được trung bình 7-9%/ngày hoặc có thể đạt tối đa11%/ngày (Ohno et al., 1996), nhưng hiện nay chỉ còn 3-6%/ngày, thậm chí cònthấp hơn 1% (Trần Mai Đức và cs., 2007; Đào Duy Thu và cs., 2014) Một trongnhững nguyên nhân dẫn đến nghề trồng rong sụn kém phát triển là do không chủ

động được nguồn giống Nguồn giống chủ yếu do người dân tự lưu giữ, một năm

có khoảng 6 tháng để sản xuất rong thương phẩm nhưng họ phải mất 3 tháng đểnhân giống.Việc lưu giữ này có chi phí lớn, hiệu quả không ổn định bởi ảnhhưởng của mưa, nước ngọt từ vùng cửa sông và bị bệnh Ice-ice, bệnh sởn lôngcũng như các loài rong tạp bám (chủ yếu là rong lục Enteromorpha spp.) (ĐàoDuy Thu và cs., 2014)

Những nhược điểm này sẽ được khắc phục bởi công nghệ nuôi cấy mô tếbào thực vật Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nuôi cấy mô là phương pháp hiệuquả trong việc lưu giữ những nguồn gen quý, tăng cường chất lượng giống, tạogiống sạch bệnh,…làm cơ sở để nhân giống sinh dưỡng phục vụ thương phẩm(Hayashi et al., 2010; Reddy et al., 2010; Bindu et al., 2011) Chất lượng ronggiống tạo ra cũng đồng đều cả về kích thước và về tuổi Một ưu điểm khác củaphương pháp này là cùng một lúc có thể tạo ra một lượng lớn giống phục vụ sảnxuất, việc sản xuất và lưu giữ giống không phụ thuộc vào thời tiết, mùa vụ Việcnhân giống cũng không cần diện tích quá lớn và quá trình vận chuyển dễ dànghơn Chính vì vậy, việc áp dụng phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô có

ưu thế vượt trội, là hướng đi tất yếu, sớm hay muộn ở Việt Nam, nếu khôngmuốn ngành sản xuất rong sụn dần suy thoái và mất ổn định

Đối với việc nuôi cấy mô rong sụn, đã có nhiều tác giả tiến hành nghiêncứu và đạt được nhiều kết quả quan trọng (Dawes et al., 1991, 1993; Reddy etal., 2003; Salvador and Serrano, 2005; Hayashi et al., 2008; Hurtado et al.,2009) Một số nghiên cứu không những đã sản xuất thành công giống rong sụn từnuôi cấy mô mà còn khẳng định tính ưu việt của phương pháp này trong sàng lọc

và chọn giống Hai nghiên cứu của Dawes et al (1991,1993) đã thử nghiệmthành công sản xuất mô sẹo rong sụn và nuôi cấy thành rong, đạt tỷ lệ 100%.Rong giống sau đó đem trồng thử nghiệm cho tốc độ sinh trưởng đạt 5-5,5 %trong suốt chu kỳ 85 ngày Reddy et al (2003) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô

từ mô sẹo tạo ra phôi tế bào soma và nuôi cấy phôi đó thành rong giống Kết quảkhảo nghiệm tốc độ tăng trưởng cho thấy tốc độ tăng trưởng của rong nuôi cấy

mô luôn lớn hơn rong tự nhiên từ 1,5 – 1,8 lần trong cả 7 thế hệ thử nghiệm.Hàm lượng carageenan trong rong sụn nuôi cấy mô (67%) cũng cao hơn so vớirong giống thường (51%) (Yong et al., 2014) Mặc dù trên thế giới đã có nhữngthành công nhất định, tuy nhiên, nuôi cấy mô rong sụn ở Việt Nam còn là lĩnhvực mới mẻ Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

tái sinh in vitro rong sụn Kappaphycusalvarezii từ mô sẹo” nhằm tạo ra rong giống nuôi cấy mô phục vụ nhu cầu thiết yếu hiện nay

1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU NGHIÊN CỨU

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Cảm ứng và tái sinh thành công mô sẹo rong sụn K.alvarezii tạo ra câycon trong phòng thí nghiệm làm cơ sở xây dựng quy trình nhân giống rong sụn invitro

1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu

- Xác định được chế độ khử trùng tối ưu cho việc tạo vật liệu sạch

- Xác định được nồng độ agar, nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng vàcường độ ánh sáng thích hợp cho sự cảm ứng tạo mô sẹo

- Xác định được phương pháp tái sinh rong sụn thích hợp trong phòng thínghiệm từ mô sẹo

- Xác định được hiệu quả tái sinh của các dạng mô sẹo khác nhau

- Xác định được môi trường và cường độ ánh sáng thích hợp để nuôi tảnrong tái sinh trong phòng thí nghiệm

1.3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC, THỰC TIỄN

1.3.1 Những đóng góp mới

Nuôi cấy mô rong sụn ở Việt Nam còn là lĩnh vực mới mẻ.Nghiên cứunày nằm trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu nhân giống rong sụnKappaphycusalvarezii bằng công nghệ nuôi cấy mô” thuộc “Đề án phát triển vàứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản đến năm 2020” được BộNông nghiệp và Phát triển Nông thôn phê chuẩn năm 2013 và giao cho ViệnNghiên cứu Hải sản chủ trì thực hiện Sau ba năm nghiên cứu, đề tài đã tạo rađược bước đầu thành công và lần đầu tiên ở Việt Nam sản xuất được rong sụnbằng phương pháp nuôi cấy mô

1.3.2 Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống rong sụn K.alvarezii- loài rong biển đầu tiên được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy

mô ở Việt Nam

- Các kết quả đạt được sẽ giúp bổ sung thêm nguồn tài liệu khoa họcphục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về kỹ thuật nhân giốngrong biển bằng phương pháp nuôi cấy mô sẹo

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII

2.1.1 Hệ thống phân loại

Theo cơ sở dữ liệu Algaebase (Guiry et al., 2016), rong sụn Kappaphycusalvarezii (hoặc Eucheuma alvarezii) thuộc vào ngành rong đỏ Hệ thống phânloại của K alvarezii như sau:

Ngành: Rhodophyta

Lớp: Florideophyceae

Phân lớp: RhodymeniophycidaeBộ: Gigartinales

Họ: SolieriaceaeChi: KappaphycusLoài: Kappaphy alvarezii2.1.2 Khu vực phân bố

K alvarezii là loài rong nhiệt đới phân bố rộng theo chiều ngang từ cácquần đảo ở Thái Bình Dương đến các nước châu Phi, châu Á và châu Mỹ (Binduand Levine, 2011) Trong tự nhiên, rong sụn có thể bắt gặp ở các vùng nước venbiển có độ sâu không quá 20m Chúng thường bám lỏng lẻo trên bề mặt rạn san

hô hoặc đá ngầm (Huỳnh Quang Năng, 2007) Do có giá trị kinh tế, loài rong này

đã được di nhập sang các vùng biển khác từ những năm 1960 để trồng thươngphẩm (Bindu and Levine, 2011) Chúng đã xuất hiện ở trên 20 vùng nhiệt đới

-Malaysia - Philippine được coi là trung tâm phân bố của rong sụn, chiếm khoảng60% diện tích trên toàn cầu (Bindu and Levine, 2011)

Hình 2.1.Những khu vực trồng nhiều rong sụn (Hayashi et al., 2010)

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Rong sụn có thân hình trụ đặc, cứng, dai và nhớt do chất keo (Trono andFortes, 1998) Rong thường có chiều dài tản 20-60 cm nhưng cũng có thể dài đến2m, với trọng lượng tối đa đạt 56 kg Tản rong thô, nặng, thân phân nhiều nhánh,trên bề mặt các nhánh có các mấu hoặc u lồi nhỏ (Silva et al., 1996; HuỳnhQuang Năng, 2007) Rong sụn có 2 dạng hình thái chính là dạng thân bò (phânnhánh mạnh, dạng bụi lớn, nhiều nhánh nhỏ) và dạng thân thẳng (ít phân nhánh,nhánh thẳng và mập) Màu sắc rong sụn rất đa dạng biến đổi từ xanh ngọc bíchđến vàng cam (Hayashi et al., 2008) Người ta đã tìm được ít nhất 10 loại rongsụn khác nhau trên thế giới Chúng không chỉ khác nhau về hình thái, màu sắc

mà còn khác nhau về tốc độ tăng trưởng, hàm lượng dinh dưỡng và carrageenan(Dawes and Koch, 1991; Munoz et al., 2006)

Hình 2.2 Các loài rong sụn thương mạiKappaphycus alvarezii

Nguồn: Hurtado et al (2008)

2.1.4 Đặc điểm sinh thái

Các điều kiện sinh thái ảnh hưởng khác nhau đến sinh trưởng và phát triểncủa rong sụn Ở vùng nước thường xuyên trao đổi và luân chuyển do dòng chảy,dòng triều hay sóng bề mặt, rong phát triển rất tốt vì được tiếp xúc với ánh sáng

và chất dinh dưỡng liên tục cũng như hạn chế sự bám dính của chất bẩn K

lux), tốc độ tăng trưởng của rong sụn giảm mạnh (Nguyễn Xuân Lý và Phạm ThịNhàn, 2000) Theo Võ Duy Tiết và Cao Thị Trúc Duyên (2004), nhiệt độ thích

và có thể chết Rong sụn sinh trưởng ở độ mặn cao, thường từ 28-34‰ (HuỳnhQuang Năng, 2007) Độ mặn nước dưới 20‰, rong sụn bị đứt gãy và chết trongthời gian ngắn 7-10 ngày (Nguyễn Xuân Lý và Phạm Thị Nhàn, 2000; Võ DuyTiết và Cao Thị Trúc Duyên, 2004) Cường độ ánh sáng 30000-50000 lux phùhợp cho sự sinh trưởng của rong sụn (Huỳnh Quang Năng, 2007) Hàm lượngdinh dưỡng N, P phù hợp lần lượt là 1,1-1,4 mg/l và 0,08-0,1 mg/l (Nguyễn Xuân

Hình 2.3 Vòng đời của rong sụn Kappaphycus alvarezii

Nguồn: Nguyễn Xuân Lý (1995)

2.1.6 Vai trò của rong sụn

Nuôi trồng rong biển nói chung và K alvarezii nói riêng đã đóng gópđáng kể cho nền kinh tế của các nước, mang lại nguồn thu nhập và cải thiện tìnhhình kinh tế xã hội của người dân vùng ven biển (Hayashi et al., 2010) K.alvarezii là một trong những loài rong biển nhiệt đới trồng phổ biến nhất và pháttriển nhanh nhất của chi rong Kappaphycus, đồng thời cho hàm lượngcarrageenan chất lượng tốt nhất Vì vậy, nó được coi là nguồn chính sản xuấtkappa carrageenan, một dạng hydrocolloid đang được sử dụng trong nhiều ngànhcông nghiệp như công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp nhẹ (giấy, da,keo, sơn) và công nghệ sinh học (cố định enzyme và nấm men, nuôi cấy mô tếbào thực vật, vi sinh) (Hayashi et al., 2008; Hayashi et al., 2010) Ngoài ra, chiếtxuất từ K alvarezii cũng rất giàu dinh dưỡng, bao gồm cả những chất điều tiếtsinh trưởng thực vật như IAA, kinetin, zeatine, gibberellins (Zodape et al., 2009)

và lượng lớn các lectin có hoạt chất sinh học tốt (Kawakubo et al., 1997, 1999;Sugawara et al., 2001; Liao et al., 2003; Hori et al., 2007)

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ RONG BIỂN

2.2.1 Nghiên cứu nuôi cấy mô rong biển trên thế giới

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phạm trù khái niệm chung cho tất cảcác loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môitrường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng Nuôi cấy mô tế bào thựcvật bao gồm: nuôi cấy cây con và cây trưởng thành; nuôi cấy cơ quan (rễ, thân,

lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh); nuôi cấy phôi; nuôi cấy mô sẹo; nuôicấy tế bào trần

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào chính là học thuyết vềtính toàn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người Đức, Haberlandt (1902):Mọi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin ditruyền (DNA) cần thiết và đầy đủ của sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợpmỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Ngày nay, các nhàkhoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từmột tế bào riêng rẽ

Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấyphân hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng của tếbào thực vật Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy in vitro trảiqua ba giai đoạn sau: tế bào phản phân hóa với sự phát sinh tế bào khả biến; sựđịnh hướng phân hóa tế bào (hoặc tác dụng quyết định của tế bào); sự phát sinhhình thái và phát triển cơ quan để hình thành cở thể hoàn chỉnh

Dựa trên cơ sở khoa học nêu trên, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất khácnhau Trong đó, nhân giống cây trồng in vitro là một trong các lĩnh vực đượcphát triển sớm, phổ biến và thu được nhiều thành công nhất

Hiện nay, có hai phương pháp chính nuôi cấy mô rong biển là nuôi cấy

mô từ mô sẹo và nuôi cấy mô từ tế bào trần (Reddy et al., 2008a,b) Phươngpháp nuôi cấy từ tế bào trần đã được thực hiện trên 89 loài của 36 chi, thuộcngành rong đỏ (Phodophyta – có 41 loài thuộc 13 chi), rong lục (Chlorophyta

- có 24 loài thuộc 5 chi) và rong nâu (Phaeophyta - 24 loài thuộc 18 chi) Tuynhiên, phương pháp nuôi cấy mô bằng tế bào trần thường cho hiệu quả khôngcao bằng phương pháp sử dụng mô sẹo vì quá trình phân lập tế bào trần phụthuộc vào nhiều yếu tố (Reddy et al., 2010) Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, số

lượng tế bào trần thu được trong mỗi lần xử lý đối khi chỉ đạt một hoặc vài tếbào do chưa đúng trong việc áp dụng loại enzyme và nồng độ sử dụng, pH củamôi trường, điều kiện tinh sạch của môi trường cấy, nhiệt độ ủ phôi, vị trí thumẫu phôi,… (Reddy et al 2008a) Việc phân lập tế bào trần đã hoàn toàn cóthể thực hiện được với nhiều hình thức phối hợp enzyme khác nhau ở tất cảcác loài trên, nhưng nuôi tế bào trần thành cây con hoặc xa hơn là tạo câygiống chỉ thành công trên một số ít loài Cho đến nay, nuôi cấy mô rong biển

từ mô sẹo được thực hiện nhiều hơn và cho kết quả ổn định hơn, với hiệu quảtạo mô sẹo có thể lên tới 100% ở nhiều hình thức phối hợp môi trường nuôicấy với chất điều tiết sinh trưởng

Phương pháp nuôi cấy mô sẹo đã được tiến hành thử nghiệm trên 85 loàirong biển thuộc ba ngành rong đỏ, rong lục và rong nâu cho mức độ thànhcông ở các mức độ khác nhau (bảng 2.1) Tùy từng loài mà mức độ thànhcông khác nhau Ở một số loài rong mới chỉ thành công ở mức tạo ra mô sẹo,nhưng một số loài khác đã tạo được cây con trong phòng thí nghiệm, thậm chí

đã thuần dưỡng và chuyển ra trồng thử nghiệm ngoài môi trường tự nhiên, ví

dụ như Agardhiella subulata, Carpopeltis afinis, Gracilaria perplexa, G.tenuistipitata, Grateloupia acuminate, G doryphora, Kappaphycus alvarezii(Dawes and Koch, 1991; Kumar et al., 2004, 2007; Reddy et al., 2003, 2010).Riêng đối với rong sụn, đã có khá nhiều nghiên cứu được tiến hành và đạtnhiều kết quả quan trọng (Dawes et al., 1991, 1993; Reddy et al., 2003;Salvador and Serrano, 2005; Hayashi et al., 2008; Hurtado et al., 2009) Một

số nghiên cứu không những đã sản xuất thành công giống rong sụn từ nuôi cấy

mô mà còn khẳng định tính ưu việt của phương pháp này trong sàng lọc vàchọn giống Hai nghiên cứu của Dawes et al (1991,1993) đã thử nghiệmthành công sản xuất mô sẹo rong sụn và nuôi cấy thành rong, đạt tỷ lệ 100%.Rong giống sau đó đem trồng thử nghiệm cho tốc độ sinh trưởng đạt 5-5,5 %trong suốt chu kỳ 85 ngày Reddy et al (2003) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy

mô từ mô sẹo tạo ra phôi tế bào soma và nuôi cấy phôi đó thành rong giống.Kết quả khảo nghiệm tốc độ tăng trưởng cho thấy tốc độ tăng trưởng của rongnuôi cấy mô luôn lớn hơn rong tự nhiên từ 1,5 – 1,8 lần trong cả 7 thế hệ thửnghiệm Trong một nghiên cứu của Hayashi et al (2008) đã tiến hành sản xuấtrong giống bằng công nghệ nuôi cấy mô sử dụng colchisin (0,01%) nhằm tạorong giống đa bội thể Kết quả nghiên cứu cho thấy hơn 80% phôi cấy được

tiền xử lý bằng cochisin (0.01%) phát triển thành mô sẹo trong môi trườngProvasoni (PES) Mô sẹo sau đó phát triển nhanh chóng thành cây giống khinuôi trong môi trường Stosch có bổ sung glycerol 90 mM và rong giống khinuôi thương phẩm cũng cho tốc độ lớn nhanh hơn nhân giống tự nhiên từ 1,5– 1,8 lần

Bảng 2.1 Kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô từ mô sẹo ở rong biển

Kết quả Kết quảđ

Ghi chú: BF – nảy chồi chưa hoàn toàn, CI – tạo ra mô sẹo, PR – tạo cây con, SE – tạo phôi hoàn chỉnh,

AE – tạo phôi chưa hoàn chỉnh, SD – nảy chồi hoàn toàn.

Quy trình nuôi cấy mô rong biển về cơ bản cũng giống như quy trình nuôicấy mô ở thực vật bậc cao Tuy nhiên, do sự khác biệt về cấu trúc vỏ tế bào nênphương pháp nuôi cấy mô (cả nuôi cấy bằng mô sẹo hay tế bào trần) đều cần có

sự chỉnh lý thích hợp với từng nhóm rong biển (Reddy et al., 2008b) Nhiều tácgiả trên thế giới đã thử nghiệm các phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo để tạocây con hoàn chỉnh Sự thành công của việc tái sinh chồi từ mô sẹo trên môitrường rắn đã được báo cáo trên một vài loài rong đỏ (Liu and Gordon, 1987;PolneFuller and Gibor, 1987; Huang and Fujita, 1997; Reddy et al., 2003).Reddy et al (2003) đã tái sinh K alvarezii bằng cách cắt những mô sẹo phát triểnmạnh sau 2 tháng nuôi cấy cảm ứng và cấy trên môi trường PES nồng độ agar1,5% Điều kiện nuôi tương tự như điều kiện cảm ứng mô sẹo, ngoại trừ ánh sáng

nhỏ và cấy trong môi trường PES, 0,4% bactoagar hoặc 0,6% agarose, bổ sung0,1–1,0 mg/l NAA hoặc hỗn hợp NAA và BAP 0,1 mg/l Mẫu được cấy chuyểnsang môi trường mới sau 40-45 ngày Phôi tạo thành được nuôi lắc một tháng

trong môi trường PES lỏng Kết quả thu được cây con có tốc độ sinh trưởng8,1%/ngày, cao gấp 1,5 -1,8 lần so với rong nhân giống bằng phương pháp thông thường.

Hình 2.4 Quá trình tái sinh mô sẹo thành cây con (Reddy et al., 2010)Rorrer and Cheney (2004) đã tạo được cây rong nuôi cấy mô gồm hai giaiđoạn chính là cảm ứng tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo hình thành vi câycon Khối mô sẹo dạng sợi, đường kính 2 đến 8 mm, bao gồm các tế bào tròn,màu đỏ ở vùng lõi trung tâm và dãy sợi dày đặc có màu sáng có khả năng tái sinhtạo chồi bất định trên môi trường 1,5% agar Sau đó, những chồi này đượcchuyển vào môi trường lỏng để tạo cây con hoàn chỉnh Sulistiani et al (2012)cũng đã tái sinh mô sẹo bằng cách cấy tất cả những mô sẹo được hình thành trênmôi trường PES rắn (1,5% agar) bổ sung BAP 1 mg/l và IAA 2,5 mg/l để tăngcường sự phát triển của chúng Sau 2 tháng, những mô sẹo này được cắt ra và cấytrong môi trường PES rắn bổ sung BAP 1 mg/l và IAA 2,5 mg/l Kết quả là môsẹo sẽ tái sinh thành cây con sau 2 tháng

Tuy nhiên, một số tác giả đã báo cáo rằng việc nuôi cấy tăng cường sinhtrưởng mô sẹo không thích hợp trên môi trường rắn và việc nuôi cấy tăng trưởng

mô sẹo được ưu tiên trong môi trường lỏng bởi vì nó không chỉ hỗ trợ sự sinhtrưởng mà còn thúc đẩy sự phát sinh hình thái của mô sẹo (Robaina et al., 1992).Kumar et al (2004) đã tiến hành cảm ứng mô sẹo ở loài rong đỏ Gelidiellaacerosa trong 30 ngày trên môi trường PES, nồng độ agar 1,5% Sau đó mô sẹođược cắt khỏi mẫu cấy và chuyển sang môi trường lỏng hoặc bán lỏng (0,2%agar) để tái sinh Cây con đa chồi được tạo ra sau 30 ngày nuôi lỏng lắc (100rpm) Liu and Bernard(1992) đã tái sinh thành công Laminaria digitata bằngcách nuôi cấy mô sẹo trên môi trường La lỏng Theo Yokoya et al.(2004), trạngthái vật lý của môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến quá trình tái sinh từ môsẹo tùy thuộc vào loài Các tác giả quan sát thấy rằng mô sẹo của Gracilariatenuistipitata (Chang & Xia) tái sinh chồi khi được nuôi cấy trong môi trườngrắn, trong khi sự tái sinh của G perplexa chỉ xảy ra khi chuyển từ môi trườngagar sang môi trường lỏng Ở Solieria filiformis, môi trường rắn cảm ứng sự sinhtrưởng của mô sẹo sợi, trong khi cây con được tái sinh trong môi trường lỏng(Yokoya and Handro, 2002) Tuy nhiên, Polne-Fuller and Gibor (1987) lại báocáo rằng sự tái sinh từ mô sẹo và mẫu cấy ở Eucheuma và Kappaphycus nuôi cấytrên môi trường agar tốt như môi trường lỏng.

Bên cạnh đó, chất điều hòa sinh trưởng được coi là một yếu tố cơ bản ảnhhưởng đến sự tái sinh cây từmô sẹo(Yokoya et al., 1999) Những ảnh hưởng củaauxin có liên quan đến sự gia tăng tổng hợp protein, biến đổi biểu hiện gen(Yokoya et al., 2004) còn hiệu quả của cytokinin được gắn liền với việc tăngcường phân chia tế bào và các hoạt động trao đổi chất (Evans, 1984) Auxin vàcytokinin có vai trò kích thích việc hình thành mô sẹo, tái sinh và tăng trưởngchồi (Bradley, 1991; Yokoya and Handro, 1996; Yokoya et al 2004) Yokoyaand Handro (1996) đã tiến hành tái sinh cây từ mô sẹo ở G dichotoma bằng cáchnuôi cấy callus trong môi trường lỏng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Sự táisinh được thúc đẩy bằng việc xử lý với BA hoặc IAA:BA ở nồng độ 1:5 mg/l.Nồng độ cytokinin cao có thể kích thích sự phân chia tế bào bằng cách tăng tổnghợp protein và hoạt động trao đổi chất, ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa của tếbào Tuy nhiên, Bradley and Cheney (1990) lại cho rằng nồng độ cao cytokinin(10 mg/l) có thể ức chế sự tái sinh cây con trên rong đỏ Agardhiella subulata.Hurtado and Biter (2007) đã tái sinh thành công cây non 3 loài rong sụnKappaphycus alvarezii var adik-adik khác nhau (màu nâu, xanh lá cây và màuđỏ) bằng phương pháp nuôi cấy mô sẹo Từng đoạn rong vô trùng 3 cm được nuôicấy

trên môi trường ESS/2 bổ sung chất kích thích sinh trưởng (1mg/l PAA + zeatin),

Sự hình thành mô sẹođược quan sát sau 25-30 ngày và có nguồn gốc từ lớp lõi.Sau đó, mô sẹo được cắt thành những mảnh nhỏ và nuôi trong bình T25 chứa môitrường ESS/2 lỏng bổ sung chất kích thích sinh trưởng ở điều kiện 20°C, L:D

thành chồi mầm.Gracilariopsis tenuifrons và G perplexacũng đã được tái sinhthành công bằng cách cắt nhỏ callus và nuôi cấy trong môi trường lỏng có bổsung chất điều hòa sinh trưởng như IAA, 2,4-D, kinetin (Yokoya et al., 2004).Kết quả nghiên cứu của tác giả còn cho thấy khả năng tái sinh cây khác nhau giữacác loại mô sẹo và có mối liên hệ giữa nguồn gốc tế bào mô sẹo, vị trí của nó trênmẫu cấy Tỷ lệ tái sinh từ mô sẹo đỉnh cao hơn so với mô sẹo gốc và mô sẹotrung đoạn IAA (0,1 µmol), 2,4-D (10,0 µmol) và K (1,0-10,0 µmol) cho tỷ lệtái sinh cao nhất từ mô sẹo đỉnh, trong khi IAA hoặc K (0,1 µmol) hoặc 2,4-

D (1,0-10,0

µmol) kích thích sự tái sinh cao nhất ở mô sẹo trung đoạn

Bảng 2.2 Môi trường, chất điều hòa sinh trưởng được thử nghiệm nuôi cấy

từ mô sẹo trên một số đối tượng rong biển (Reddy et al., 2010)

Hình

sinh trưởng

MôitrườngmASP12-

thành

mô sẹo(%)

Kết quảcuốicùng

Tác giả

Agardhiella

subulata

NAAPAA, NAA,

Bradley and Cheney

Ahnfeltiopsis

BAP, K,2,4,5 T,IAA

f/5 NR PRASP12-

(1990), Huang et al.(1998)

flabelliformis

Carpopeltis

affinis

IAA, BAPIAA, BAP

NTA ASP12-NTA ASP12-

38 PR Huang and Fujita (1997)

96 CI & PR Huang and Fujita (1997)

C prolifera IAA, BAP

Loài Chất điều hòa

sinh trưởng

Môi trường

Hình thành

mô sẹo(%)

Kết quảcuốicùng

Tác giảtenellus NTA

NR PES 10 PRNAA, BAP,

Polne-Fuller and Gibor (1987), Dawes and Koch(1991), Dawes et al (1993)

Kappaphycus

alvarezii

IAA, KNAA, BAP, K, Spm

2-4D, BAP,IAA,

ESS 90 SE Reddy et al (2003)PES 100 CI Munoz et al (2006)

VS 50,F/2 50,

ASP12-NTA

100 CI & PR Hayashi et al (2008)

Hurtado and BiterEucheuma

PAA, Zea ESS/2 NR CI & PRPAA, IBA,

(2007)

K, 2ipBAP, Zea and Dawes et al (1993)

Hurtado and Cheney

E denticulatum PAA, Zea ESS/2 NR PR

E uncinatum NR PES 3 PR

Furcellaria

(2003)Polne-Fuller and Gibor(1987)

chilensis IAA, K PES NR CI Collantes et al (2004)

G corticata NAA, BAP, PES 60 CI & PR Rajakrishna Kumar et al

Loài Chất điều hòa

sinh trưởng

Môi trường

Hình thành

mô sẹo(%)

Kết quảcuốicùng

Tác giả

IAA, K (2007)

ASP12-NTAASP12-

NR MS 4 CI& PR Gusev et al (1987)

Kaczyna and Megnet

NR ASP6-F2 30 CI & PRGracilariopsis

tenuifrons

Grateloupia

acuminata

IAA, 2-4D,BAPIAA, BAP

NTA ASP12-NTA

ASP12-(1993)

NR PR Yokoya (2000)

92 CI Huang and Fujita (1997)

G doryphora NR mPES 100 BF Robaina et al (1990)

G dichotoma NR

G filiformis NR

G filicina IAA, BAP

G turuturu IAA, BAP

G imbricata IAA, BAP

NTA Von stosch ASP12-NTA ASP12-NTA ASP12-NTA

ASP12-Yokoya and HandroCI

(1996)

NR CI&PR Yokoya et al (1993)

CI Huang and Fujita (1997)

36 CI Huang and Fujita (1997)

57 CI Huang and Fujita (1997)Hypnea

NR PES 40 SR Robaina et al (1992)

Loài Chất điều hòa

sinh trưởng

K, BAP, NAA,

Môi trường

Hình thành

mô sẹo(%)

Kết quảcuốicùng

Ochtodes

NTA ASP12-NTAASP12-

CI Huang and Fujita (1997)

Malaikal et al (2001),

(2004)Phyllophora

nervosa NR MS 18 CI&PR Gusev et al (1987)

Polne-Fuller and Gibor

P lenceolata NR ASP6-F2 84 PR

ASP12-(1987)Polne-Fuller and Gibor

crispata

Pterocladia

capillacea

Rhodymenia

NAA, K mPES 12 CI Liu and Gordon (1987)

K, BAP, NAA,pertusa

Ghi chú: NR không có báo cáo, BF hình thành chồi, CI hình thành mô sẹo, PR thành cây con, SE

-thành phôi từ tế bào soma, BS - nghiên cứu sinh hóa, SD - biệt hóa -thành chồi.

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật trên cạn rất đadạng, tuy nhiên những nghiên cứu đối với các loài thực vật thủy sinh bậc thấpnhư rong biển còn khá hạn chế, sơ khai Cũng giống như các quốc gia khác, nhângiống rong sụn ở Việt Nam chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp sinh sản

sinh dưỡng Về nhu cầu và sản lượng rong giống hàng năm chưa được thống kê

rõ ràng và chủ yếu do người dân trồng rong chủ động chuẩn bị Hiện tại ở ViệtNam có rất ít nghiên cứu chính thức đi sâu vào việc nghiên cứu và sản xuất cácgiống rong biển ở quy mô lớn bằng việc ứng dụng kỹ thuật vi nhân giống, đặcbiệt là nhóm rong biển có giá trị kinh tế như rong sụn, rong câu, rong nho… Chođến nay, mới chỉ có ba nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy mô rong biển gồmNguyễn Xuân Lý (1995), Đặng Diễm Hồng (2002) và Đào Duy Thu và cs.(2015) Năm 2002, trong nghiên cứu sinh học và kỹ thuật nuôi trồng một số loàitảo biển ở vùng quần đảo Trường Sa, Đặng Diễm Hồng tiến hành nhân giốngrong sụn bằng phương pháp sinh sản vô tính sử dụng những đoạn rong sụn dài 3-

5 cm sau khi khử trùng cho nuôi trong môi trường dinh dưỡng PES, ESS vàASPC-1 Kết quả nghiên cứu cho thấy rong sụn sống và phát triển tốt trên môitrường PES và ESS Bổ sung vitamine và 2NAA+Kinetine là chất điều hòa sinhtrưởng tốt nhất để nuôi mô rong sụn trên nền môi trường ESS (Đặng Diễm Hồng,2002) Trước đó, Nguyễn Xuân Lý (1995) đã thử nghiệm nuôi cấy các lát mỏng1-2 mm rong câu Gracilaria trong 4 môi trường khác nhau là Erd-Schreiber,PES, ESS và PES có bổ sung 2,4D cho thấy, các chồi rong câu phát triển tốt trênPES với tỷ lệ sống đạt 70% còn trong các môi trường khác, rong phát triển chậmhơn rất nhiều Hiện nay, đề tài “Nghiên cứu nhân giống rong sụn Kappaphycusalvarezii bằng phương pháp nuôi cấy mô” thuộc “Đề án phát triển và ứng dụngcông nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản đến năm 2020” do Th.S Đào DuyThu chủ nhiệm và Viện Nghiên cứu Hải sản là cơ quan chủ trì đã được triển khai

và đang trong giai đoạn hoàn thiện

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Biển – Viện Nghiên cứu Hải sản.3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Từ tháng 12/2015 –08/2016

3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Mẫu rong sụn Kappaphycus alvarezii được thu thập từ vịnh Cam Ranh,Khánh Hòa và chuyển về phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Biển - ViệnNghiên cứu Hải sản Việc lưu giữ rong được dựa trên nghiên cứu của Sulistiani

et al (2012) Rong sau khi rửa sạch được nuôi trong bể với hệ thống nước tuần

và sục khí liên tục Độ mặn nước biển nuôi rong duy trì 30±1‰ Hàng tuần thay

rong Sau một tháng lưu giữ ở nhà kính, lựa chọn những tản rong sạch, khỏechuyển sang nuôi thích nghi trong phòng thí nghiệm dưới ánh sáng đèn huỳnh

sục khí liên tục

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu hiệu quả tái sinh của các dạng mô sẹo khác nhau

- Nghiên cứu môi trường và cường độ ánh sáng thích hợp để nuôi tản rongtái sinh trong phòng thí nghiệm

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Nghiên cứu phương pháp khử trùng thích hợp để tạo vật liệu sạch

Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạovật liệu sạch

Sau một tuần thích nghi phòng thí nghiệm, mẫu rong được cắt thành cácđoạn 5 cm, rửa với chất tẩy rửa (Lô Hội - Hàn Quốc) ở nồng độ 0,5% trong 10phút và ngâm trong dung dịch provine iodine (HD PHARMA) 2% (0,5% w/v) 3phút Để đánh giá hiệu quả khử trùng, mẫu rong được xử lý tiếp theo với các loạichất gồm hỗn hợp kháng sinh nguyên chất hãng Sigma, hỗn hợp kháng sinh dượcphẩm và dung dịch Javen ở các nồng độ và thời gian khác nhau

Quy trình khử trùng bằng hỗn hợp kháng sinh nguyên chất hãng Sigmađược thực hiện theo phương pháp của Reddy et al (2003) Các đoạn rong 5cmtrên được rửa lại bằng nước biển vô trùng 3 lần rồi đem ngâm trong môi trườngPES có bổ sung 1,5%; 3% và 4,5% hỗn hợp gồm Penicillin 1g, Streptomycinsulphate 2g, Kanamycin 1g, Nystatin 25mg, Neomycin 200mg ở ba khoảng thời

Kháng sinh tổng hợp dạng dược phẩm gồm 4 loại thuốc phổ biến trên thịtrường do Việt Nam sản xuất (Neo-megyna, Binystar, Mystrep,Benzylpenicillin) Hàm lượng các chất Neomycin, Nystatin, Streptomycin vàPenicillin được pha giống với hỗn hợp kháng sinh Sigma Việc xử lý mẫu rongvới hỗn hợp kháng sinh này cũng được tiến hành tương tự như kháng sinhnguyên chất Sigma

Đối với công thức khử trùng bằng Javen, mẫu rong sau khi khử trùngtrongpovidone iodine như mô tả ở trên được xử lý với dung dịch Javen nồng độ0,25%; 0,5%; 0,75% với các khoảng thời gian 5, 10 và 15 giây

Sau giai đoạn khử trùng, mẫu rong được rửa lại bằng nước biển vô trùng3-4 lần sau đó lau khô bằng giấy lọc ASTME832-81 vô trùng rồi cắt thành đoạn4-5mm Mỗi đoạn mẫu này được lau sạch chất nhày ở vết cắt và cấy trên môitrường PES, 1,5% agar Mỗi đĩa được cấy 10 mẫu, nuôi trong điều kiện nhiệt độ

12:12.Thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.Tiến hànhtheo dõi thí nghiệm trong 30 ngày với các chỉ tiêu gồm tỷ lệ sống, tỷ lệ mẫu sạch

và tỷ lệ hình thành mô sẹo

3.5.2 Nghiên cứu điều kiện môi trường thích hợp để cảm ứng tạo mô sẹo

Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến khả năng cảm ứngtạo mô sẹo

Mẫu rong được nuôi cấy trên môi trường PES, bactoagar 1,5% và nuôi

được cấy chuyển sang môi trường mới một cách đều đặn sau 30 ngày nuôi Thínghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Định kỳ quan sát mẫu

và theo dõi tỷ lệ, chất lượng mô sẹo hình thành

Côn

Cườ

Thí nghiệm 3 Ảnh hưởng của nồng độ agar đến khả năng cảm ứng tạo

mô sẹo

Mẫu rong được nuôi cấy trên môi trường PES với các nồng độ bactoagar

sang môi trường mới một cách đều đặn sau 30 ngày nuôi Thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Định kỳ quan sát mẫu và theo dõi tỷ lệ,chất lượng mô sẹo hình thành

chu kỳ sáng tối L:D= 12:12 Mẫu rong được cấy chuyển sang môi trường mới

một cách đều đặn sau 30 ngày nuôi Thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.Định kỳ quan sát mẫu và theo dõi tỷ lệ, chất lượng mô sẹo hìnhthành

C

3.5.3 Nghiên cứu phương pháp tái sinh chồi rong sụn

Thí nghiệm 5 Nghiên cứu phương pháp tái sinh chồi thích hợp

Tiến hành thử nghiệm phương pháp tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo trongmôi trường lỏng và phương pháp tái sinh chồi thông qua sự phát sinh phôi của

mô sẹo trên môi trường thạch

Phương pháp tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo trong môi trường lỏng đượctiến hành dựa trên nghiên cứu của Kumar et al (2004) Sau giai đoạn cảm ứng,

mô sẹo được cắt ra khỏi mẫu rong và cấy trên môi trường PES bổ sung BA 1mg/l

độ lắc là 100rpm

Phương pháp tái sinh chồi thông qua sự phát sinh phôi của mô sẹo đượctiến hành dựa trên nghiên cứu của Reddy et al (2003) Mô sẹo được cấy trên môitrường PES nồng độ agar 1,5% bổ sung BA 1mg/l để tăng cường sự phát triển

trưởng, mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường PES bổ sung 1mg/l BA, 0,8%bactoagar để cảm ứng tạo phôi Điều kiện nuôi giống với điều kiện nuôi cấy tăng

môi trường PES lỏng bổ sung BA 1 mg/l và IAA 2,5 mg/l, nuôi lắc với tốc độ100rpm trong thời gian 1 tháng để tạo chồi.Hàng ngày tiến hành quan sát biếnđổi của mô sẹo dưới kính hiển vi soi nổi (BMS 74956 và Nikon SMZ1500).Kiểm tra các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng đảm bảo đúng ngưỡng thí nghiệm thiết kế.3.5.4 Nghiên cứu hiệu quả tái sinh của các loại mô sẹo khác nhau

Thí nghiệm 6 Nghiên cứu hiệu quả tái sinh của các loại mô sẹo khác

nhau

Sau quá trình cảm ứng tạo phôi, các dạng mô sẹo khác nhau được hìnhthành Để đánh giá hiệu quả tái sinh, những dạng mô sẹo này được được cấychuyển vào các bình tam giác chứa 50 ml môi trường PES lỏng bổ sung BAP 1

100rpm Hàng ngày tiến hành quan sát biến đổi của mô sẹo dưới kính hiển vi soinổi (BMS 74956 và Nikon SMZ1500) Kiểm tra các yếu tố nhiệt độ, ánh sángđảm bảo đúng ngưỡng thí nghiệm thiết kế

Chỉ tiêu theo dõi:

Rong được nuôi thử nghiệm ở ba loại môi trường khác nhau là môi trường

là bình tam giác 500ml Mỗi bình được nuôi 5 tản rong Mỗi lô thí nghiệm có ba

khí liên tục Hàng tuần thay môi trường mới Đối với môi trường vô cơ thì bổsung muối dinh dưỡng hàng ngày với lượng 1mg/l nước biển cho mỗi chất Thínghiệm được tiến hành theo dõi trong 30 ngày.Các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệsống, số lượng chồi phát sinh, tốc độ sinh trưởng và chiều cao của mẫu rong.Định kì cân khối lượng rong 5 ngày 1 lần bằng cân phân tích SHIMADZUAUY220

Thí nghiệm 8 Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng của chồi

Rong tái sinh được nuôi thử ghiệm ở ba cường độ chiếu sáng khác nhau là

bình được thả nuôi 5 tản rong Môi trường nuôi rong có độ mặn 30±1‰, nước

1mg/l cho mỗi chất Chiếu sáng bằng đèn Neol 40W sản xuất bởi công ty RạngĐông Hàng ngày bổ sung muối dinh dưỡng với lượng 1mg/l nước biển cho mỗichất Môi trường thay mới hoàn toàn định kỳ 1 tuần/lần Thí nghiệm được tiếnhành theo dõi trong 30 ngày Các chỉ tiêu theo dõi gồm: tỷ lệ sống, số lượng chồiphát sinh, tốc độ sinh trưởng và chiều cao của mẫu rong Định kì cân khối lượngrong 5 ngày 1 lần bằng cân phân tích SHIMADZU AUY220