Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây đu đủ đực (carica papaya l )

Đã có những nghiên cứu như lai tạo đểchọn ra giống mới chống chịu bệnh đốm vòng Siar và cộng sự, 2005; Chan2005; chuyển gen kháng bệnh đốm vòng vào cây đu đủ Drew và cộng sự,2005 hoặc sử

 -NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC

(CARICA PAPAYA L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN – 2019

 -NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC

(CARICA PAPAYA L.)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Lan

Cơ quan: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới

sự hướng dẫn của cô giáo TS.Vũ Thị Lan Mọi trích dẫn trong luận văn đều

ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực

và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những gì đã cam đoan ở trên

Thái Nguyên, ngày 21 tháng 5 năm 2019

Tác giả

Nguyễn Thị Hương Giang

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân

thành và sâu sắc tới TS Vũ Thị Lan Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học

-Trường Đại học Khoa học, cô đã định hướng nghiên cứu, tận tình giúp đỡ, chỉdẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, bộ phận Sau Đại học, TrườngĐại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệsinh học và các thầy cô giáo, cán bộ trong Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp

đỡ của các anh chị kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh họctrong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên cạnh ủng

hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những thiếu sót, tôi rấtmong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ vô cùng quý báu đó!

Thái Nguyên, ngày 21 tháng 5 năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Hương Giang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây đu đủ 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây đu đủ 4

1.1.4 Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây đu đủ đực 9

1.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 15

1.3 Tình hình nghiên cứu cây đu đủ bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam 20

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu nghiên cứu 24

2.1.1 Vật liệu thực vật 24

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 24

2.2 Địa điểm và thời gian 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy 25

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo 25

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 26

2.3.4 Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh 27

2.4 Điều kiện thí nghiệm 27

2.5 Phương pháp xử lí số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ khử trùng mẫu cấy 28

3.1.1 Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu 28

3.1.2 Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu đến hiệu quả khử trùng 31

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (IAA, NAA, BAP và NAA) đến khả năng hình thành mô sẹo 34

3.2.1 Ảnh hưởng của loại vật liệu nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo 34

3.2.2 Ảnh hưởng của của các chất kích thích sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo 35

3.3 Nghiên cứu tái sinh chồi từ mô sẹo 39

3.4 Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi đu đủ đực 42

3.5 Nghiên cứu khả năng tạo rễ cho chồi đu đủ đực 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng đối

với ngọn đu đủ 27Bảng 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi mẫu đến hiệu quả khử trùng

sau 2-4 tuần nuôi cấy 30Bảng 3.3 Ảnh hưởng của loại vật liệu đến khả năng tạo mô sẹo 32Bảng 3.4 Ảnh hưởng của của các chất kích thích sinh trưởng đến sự hình

thành mô sẹo (sau 4 tuần nuôi cấy) 34Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi

của callus đu đủ (Sau 4 tuần nuôi cấy) 38Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh

chồi đu đủ (Sau 4 tuần nuôi cấy) 40Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ IBA, α-NAA đến khả năng tạo rễ của

chồi đu đủ đực 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Các loại cây đu đủ 5

Hình 1.2 Các loại hoa đu đủ 6

Hình 1.3 Cụm hoa lưỡng tính 7

Hình 1.4 Cụm hoa đơn tính cái 7

Hình 1.5 Cụm hoa đực 7

Hình 2.1 Cây đu đực dùng trong nghiên cứu 23

Hình 3.1 Mẫu trước và sau khử trùng 30

Hình 3.2 Khử trùng mẫu với các độ tuổi khác nhau 33

Hình 3.3 Nuôi mô sẹo 37

Hình 3.4 Chồi tái sinh từ mô sẹo 40

Hình 3.5 Nhân chồi 42

Hình 3.6 Tạo cây hoàn chỉnh 45

Hình 3.7 Rễ cây đu đủ đực in vitro 46

Hình 3.8 Quy trình nhân giống cây đu đủ đực 45

IBA Indole butyric acid

MS Murashige & Skoog (1962)NAA  - Naphthalene axetic acid

NC Môi trường nhân chồi

MS Môi trường tạo mô sẹo

TC Môi trường tái sinh chồi

1 Đặt vấn đề

MỞ ĐẦU

Đu đủ (Carica papaya L.) thuộc họ Caricaceae là loài cây ăn trái phổ

biến ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Đu đủ phân bố ở hầu hết các nước trênthế giới thuộc Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ Latin và Châu Úc Đu đủ có nhiều

ưu điểm thích nghi với nhiều loại đất đai và khí hậu khác nhau, cây sớm chotrái và mang trái quanh năm, hàm lượng chất dinh dưỡng cao đặc biệt làvitamin A (cao gấp mười lần so với chuối, dứa và gần gấp đôi xoài) Cây đu

đủ là loài đa tính, có đu đủ đực, đu đủ cái và cây đu đủ lưỡng tính Ở ViệtNam cây đu đủ được trồng phổ biến, nhưng hiện nay ở nước ta cũng như trênthế giới đều chú trọng trong việc phát triển cây đu đủ theo hướng cây chonhiều trái, trồng cây đu đủ cái và đu đủ lưỡng tính mà chưa quan tâm đến cây

đu đủ đực

Đu đủ đực có nhiều ứng dụng về mặt dược liệu trong các bài thuốcđông y cổ truyền Các bộ phận của cây đu đủ đực có nhiều giá trị về mặt yhọc Hoa đu đủ đực là thành phần không thể thiếu trong các bài thuốc đông ychữa các bệnh như ho, viêm họng, mất tiếng, viêm cuống phổi, ho gà, chữatiểu dắt, tiểu buốt, đau niệu đạo, nước tiểu ít và đỏ Lá của cây đu đủ đựcdùng rửa vết thương, tẩy vết máu trên quần áo, vải Rễ của cây đu đủ đựcchữa rắn cắn, cá đuối cắn Đu đủ rất giàu enzyme tự nhiên, dễ dàng thấmsâu vào làn da giúp đẹp da, mau lành các tổn thương trên da Đu đủ cũng cótác dụng tẩy tế bào da chết, hồi phục sự tươi trẻ cho làn da Chính vì vậy, cây

đu đủ rất có giá trị về mặt kinh tế cũng như giá trị y học, giúp cải thiện đờisống người nghèo vùng nông thôn

Hiện nay, các giống đu đủ của Việt Nam cũng như trên thế giới đều rất

dễ bị nhiễm các bệnh virus Malaysia đã phải đối mặt với tình trạng cây đu đủchết do bị nhiễm nhiều loại bệnh như: khảm đu đủ, bệnh phấn trắng, thối rễ

do nấm , có đến 800 ha cây đu đủ bị chết đã khiến cho nền kinh tế nước này

bệnh đốm vòng, virus gây bệnh quắt ngọn làm cho cây tàn lụi nhanh, giảmnăng suất, sản lượng nghiêm trọng ở hầu hết các nước trên thế giới Mặt khácgiá thành hạt giống đu đủ nhập nội cao Trong khi đó việc lai hữu tính vànhân giống bằng hạt đã làm phân ly các đời sau, mất dần các đặc tính tốt củacây bố mẹ dẫn đến thoái hóa giống Đã có những nghiên cứu như lai tạo đểchọn ra giống mới chống chịu bệnh đốm vòng (Siar và cộng sự, 2005; Chan2005); chuyển gen kháng bệnh đốm vòng vào cây đu đủ (Drew và cộng sự,

2005) hoặc sử dụng phương pháp nuôi cấy mô in vitro để sản xuất cây đu đủ

sạch bệnh [31], [34], [53], tuy nhiên, hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu vềnhân giống cây đu đủ đực để phục vụ cho nhu cầu sản xuất dược liệu

Với sự phát triển của công nghệ tế bào thực vật, trong đó phương phápnuôi cấy mô tế bào thực vật đã cho thấy rõ những ưu điểm của nó là tạo ranguồn cây giống sạch bệnh, sinh trưởng, phát triển khỏe, độ đồng đều và hệ

số nhân giống cao Đây là giải pháp lựa chọn phù hợp để tạo ra nguồn câygiống đu đủ đực sạch bệnh cung cấp cho nhu cầu cây giống trong sản xuấtdược liệu ngày càng tăng hiện nay

Chính vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây đu đủ đực (Carica Papaya L.)”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nhân giống thành công cây đu đủ đực bằng phương pháp nuôi cấy mô

tế bào nhằm cung cấp nguồn cây giống cho nhu cầu sản xuất dược liệu

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu chế độ khử trùng mẫu cấy

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng đến khảnăng tạo mô sẹo

- Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh

1.1 Giới thiệu chung về cây đu đủ

1.1.1 Nguồn gốc

Cây đu đủ có tên khoa học là: Carica papaya, cây có nguồn gốc ở

vùng đất thấp từ miền nam Mexico qua miền đông Trung Mỹ và bắc Nam Mỹ.Được người Tây Ban Nha đưa tới Philipin vào khoảng năm 1550 Từ đây câyđược đưa vào khu vực nhiệt đới châu Á, châu Phi Hiện nay cây đu đủ phân bố

ở hầu hết các nước trên thế giới thuộc Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ Latin vàChâu Úc.Ở Việt Nam, đu đủ được trồng rộng rãi trong phạm vi cả nước

Cây đủ đủ là cây rất quen thuộc được trồng ở khắp mọi nơi, từ một vàicây quanh nhà, bờ đê đến xen canh cây lâu năm Cây đu đủ còn có tên gọikhác là phan qua thụ, phiên mộc, mác rẩu (dân tộc Tày) [14] Xét về mặt giớitính, đu đủ có ba loại giới tính là:cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Cây đu

đủ đực có nhiều ứng dụng về mặt dược liệu trong các bài thuốc đông y cổtruyền, tuy nhiên hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về loại cây đu đủ đựcnày Các giống được trồng hiện nay chủ yếu là giống địa phương đã bị lai tạpnhiều nên không còn giữ đúng đặc tính ban đầu của giống

1.1.2 Phân loại

Cây đu đủ được phân loại theo quyển Medicinal- Plants (1887) củaKoehler như sau:

Danh pháp hai phần Carica papaya L.

chọn giống như: C candamarcencis Hook (đu đủ núi); C cundinamarcensis Linden; C quercifolia Benth and Hook (đu đủ lá cây giẽ); C chryso pétala Heilb; C pentagona Heilb (đu đủ năm góc, còn có tên là Babacao, tái dài, không hột, ruột vàng, mùi vị giống như dưa gang tây (melon); C microcarpa Jacq (đu đủ nhỏ trái); C cauliflora Jacq; gracilis Sohms; C perythrocarpa Linden and André [17].

1.1.3 Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây đu đủ

a) Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây đu đủ

Đu đủ (Carica papaya L.) Loài cây ăn quả thuộc họ đu đủ (Caricaeae) Cây thân cột mềm, mang nhiều sẹo lá to; lá lớn, tập trung ở đỉnh,

cuống dài rỗng, phiến lá xẻ thùy chân vịt; toàn cây có nhựa mủ trắng đục Hoatạp tính: trên cùng một cây có hoa đực và hoa lưỡng tính hoặc hoa cái và hoalưỡng tính [9]

Đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, câylưỡng tính và cây cái Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiếtgây ra ví dụ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ Nhiệt độ càng cao thì khuynhhướng sản xuất hoa đực càng lớn Đu đủ đực chỉ mang toàn hoa đực trên pháthoa Phát hoa có cuống dài và phân nhánh Hoa đực không cuống, nhỏ, đườngkính 0,4 - 0,5 cm, dài 4-5 cm, không bầu noãn, có 10 nhị đực với 2 túi phấntrên mỗi nhị [10]

Hoa của đu đủ: hoa trắng nhạt hay xanh nhạt, khác gốc Hoa đực mọc ở

kẽ lá thành chùy có cuống hoa rất dài Hoa cái có tràng dài hơn tràng của hoađực, mọc thành chùy ở kẽ lá Theo khung phân loại của Storey (1941), hoa đu

đủ được chia ra thành 6 kiểu cơ bản:

Hoa đơn tính cái: có bầu nhụy và không có nhị đực

Hoa lưỡng tính 5 nhị (pentandria) có 5 chỉ nhị, bầu nhụy có 5 rãnh.

Hoa lưỡng tính dị hình (carpelloid) có từ 6 đến 9 nhị, bầu nhụy có rãnh dị

Cây đu đủ cái Cây đu đủ lưỡng tính

Hình 1.1 Các loại cây đu đủ

Theo phân loại của Oschae và cộng sự (1975), trích trong tài liệu củaSingh (1990), cụm hoa đu đủ được phân thành 3 nhóm: Cụm hoa đơn tính cái(cụm hoa ngắn, chỉ mang hoa đơn tính cái), cụm hoa lưỡng tính (cụm hoangắn, có thể mang hoa lưỡng tính 5 nhị, hoa lưỡng tính thon dài, hoa lưỡng

tính bất dục và hoa lưỡng tính dị hình), Cụm hoa đực (cụm hoa có cuống dài,mang chủ yếu là hoa đực, có thể mang một vài hoa lưỡng tính thon dài ở đầungọn cành hoặc nhánh của cụm hoa).

Hoa đơn tính cái Hoa lưỡng tính năm nhị

Hoa lưỡng tính dị hình Hoa lưỡng tính thon dài

Hoa lưỡng tính bất dục Hoa đực

Hình 1.2 Các loại hoa đu đủ [7]

Hình 1.3 Cụm hoa lưỡng tính ( B1 – B4) [7].

Hình 1.4 Cụm hoa đơn tính cái ( A1, A2) [7].

Hình 1.5 Cụm hoa đực (C1, C2) [7].

Quả đu đủ: Quả thịt, hình trứng to, dài 20-30 cm, đường kính 15-20

cm Thịt quả dày, lúc đầu có màu xanh lục, sau ngả màu vàng cam Trongruột quả có rất nhiều hạt đen to bằng hạt tiêu, xung quanh có lớp nhầy [13].Thân, rễ: đu đủ thuộc loại thân mềm, bản mộc, thân già có màu xám xanh,nâu xám hay nâu đỏ Thân mang nhiều sẹo lá, sẹo phát hoa và dễ bị bọng ruột

Độ bọng ruột càng lớn khi cây càng già, do đó dù thân có đường kính khá lớn(đôi khi đường kính đạt 15-20cm) nhưng khá giòn và mọng nước nên cây dễ

bị gió mạnh làm gãy cây Hầu hết rễ đu đủ đâm nhánh ngang mạnh khi gặpđiều kiện thuận lợi, nhưng mọc xuống sâu kém, rễ mềm và rất sợ đọng hoặcúng nước

b) Đặc điểm sinh thái của cây đu đủ:

Cây đu đủ phát triển tốt trong điều kiện khí hậu ấm và ẩm, lượng mưa100mm/tháng, không bị che bóng mát Đu đủ rất nhạy cảm với nhiệt độ và ẩm

độ, khi nhiệt độ cao 30-35oC hoặc ẩm độ cao, lượng mưa nhiều 300mm/tháng, cây sẽ sinh trưởng kém Nhiệt độ dưới 0oC làm cây chết, hưhại nặng nề Nếu tưới quá nhiều nước thì rễ, lá bị hư hại nhiều, cây phát triểnchậm, yếu Cây đu đủ không chịu đựng được gió to Đu đủ dễ tính có thểtrồng trên đất có độ chua thích hợp pH từ 5,5- 6,5 Đất trồng đu đủ phải giàuchất hữu cơ, tơi xốp, đất không hoặc ít phèn, thuận tiện cho việc tưới nước vàthoát nước tốt khi có mưa lớn Vùng đồng bằng phải lên luống thật cao vàđường mương thoát nước phải sâu để dễ thoát nước Chuẩn bị đất: Đất trướckhi trồng nên đánh luống rộng 2-2,5m Giữa các luống có rãnh sâu 30cm đểthoát nước.

250-Thời vụ: Đu đủ có khả năng trổ hoa và đậu trái quanh năm, tuy nhiênhạn chế sâu bệnh có thể bố trí trồng đu đủ vào đầu mùa mưa (tháng 4-5).Những vùng chủ động tưới tiêu trồng vào cuối mùa mưa (tháng 10- 11) [5]

1.1.4 Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây đu đủ đực

Thành phần hóa học của đu đủ: Trong các thành phần của cây như thân,

rễ, lá đều chứa một chất nhựa mủ (latex) Trong nhựa mủ có enzyme papain,các axit amin: leuxin, tyrosin, chất béo, axit malic và enzyme thủy phân,enzyme papain có tác dụng phân giải các chất đạm, protein để giải phóng cácaxit amin như alanin, arginin, tryptophan Tác dụng phân huỷ các chất đạmcủa enzyme papain tiến hành ở môi trường axit, trung tính hoặc hơi kiềm, tốtnhất ở pH 6,4-6,5 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme khá cao, cóthể tới 80-85oC, nhưng cao hơn 90oC sẽ mất hoạt tính Ở nhiệt độ thường, khicho enzyme papain tiếp xúc với lòng trắng trứng thì lòng trắng trứng mất tínhsánh sền sệt Trong lá, hạt (chủ yếu ở lá) có một chất ancaloit đắng gọi làcacpain và glucoxit gọi là cacpozit Cacpain kết tinh dưới dạng khối lăng trụđơn (prisme monoclinique) nóng chảy ở 121oC, không tan trong nước, tantrong các dung môi hữu cơ Tác dụng của cacpain gần như digitalin là thuốc

trợ tim Trong hạt và các bộ phận khác, người ta còn thấy các tế bào chứamyrozin và các tế bào khác chứa kali myronat Khi giã hạt với nước, myrozin

và kali myronat tiếp xúc với nhau sẽ cho tinh dầu có mùi diêm sinh, hắc giốngchất isothioxynat alyl Trong rễ, người ta thấy có nhiều kali myronat, trong lánhiều myrozin, trong vỏ hạt nhiều myrozin và không có kali myronat TheoHooper hạt đu đủ có: 26,3% dầu; 24,3% chất anbuminoit; 17% sợi; 15,5%hydrat cacbon; 8,8% tro và 8,2% nước [13]

Hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của

đu đủ như: Khảo sát tinh sạch Enzyme Chymopapain trong mủ trái đu đủ ViệtNam [18]; Nghiên cứu hoạt tính sinh học của flavonoid từ lá đu đủ cho thấyhàm lượng flavonoid chiếm khoảng 0,78 % trọng lượng lá khô Ngoài tácdụng kháng khuẩn các flavonoid còn có tác dụng kìm hãm sự phát triển vàtiêu diệt tế bào ung thư biểu mô người mà không gây tác hại xấu đối với tếbào lympho bình thường [11] Hồ Thị Hà và cộng sự đã phân lập và xác địnhcấu trúc hóa học, đồng thời đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, kháng khuẩn

và chống oxy hóa của hợp chất alkaloid mới được đặt tên làCarpainone (1) từ lá cây Đu đủ [5]

Từ xa xưa, ông cha ta đã biết dùng các thành phần của cây đu đủ đực đểchữa bệnh Vị của lá và hoa đu đủ đực rất đắng nhưng vẫn hoàn toàn có thểdùng nấu canh ăn hoặc làm rau trộn gỏi

Tác dụng dược lý của các thành phần của cây đu đủ như sau: Enzymepapain có tác dụng như enzyme pepsin của dạ dày và nhất là giống enzymetrypsin của tụy tạng trong sự tiêu hóa đạm Enzyme papain làm cho một số vikhuẩn Gram dương và Gram âm ngừng phát triển Những vi khuẩn như

Staphylococci, vi khuẩn Salmonella rất nhạy cảm đối với tác dụng của papain.

Papain còn có tác dụng làm đông sữa và tác dụng giảm độc đối với toxin

và toxanbumin Chất cacpain làm chậm nhịp tim, có người đã dùng thay thế

thuốc chữa tim Gần đây, người ta đã phát hiện thấy hạt đu đủ có chất khángsinh mạnh [13].

Hoa đu đủ đực trị ho cho trẻ sơ sinh và người lớn là cách chữa trị hođược lan truyền rộng dãi trong dân gian và được rất nhiều người tin dùng.Hoa đu đủ đực trị ho hiệu suất cao và bảo đảm an toàn đặc biệt là cho trẻ sơsinh Hoa đu đủ đực trị ho có phản ứng rất nhanh, với nguyên vật liệu dễ tìmkiếm và hoàn toàn có thể phối kết hợp với nhiều loại thảo dược khác để tạonên một hỗn hợp trị ho hiệu quả

Theo tài liệu Rau ngon thuốc quý của nhà xuất bản Dân trí (năm 2015)[14], bác sỹ Đoàn Lư đã sưu tầm được bốn bài thuốc đông y có thành phầnchính là hoa đu đủ đực chữa ho như sau:

Bài thuốc 1: Hoa đu đủ đực 30g nấu lấy nửa chén nước, hòa tan vớiđường cho trẻ em uống ngày 2 lần

Bài thuốc thứ 2: Hoa đu đủ đực 20g, tẩm mật sao, bách bộ 12g, phèn phi12g Tất cả tán nhỏ, rây bột mịn Trẻ em 1-5 tuổi ngày uống 3 lần, mỗi lần 1-4g Trẻ 6-10 tuổi mỗi lần 5-8g

Bài thuốc thứ 3: Hoa đu đủ đực 15g, trần bì 20g tẩm nước gừng, sao, lálốt 40g, nghệ vàng 15g, chua me đất hoa vàng 30g, cam thảo đất 20g, lá chanhnon 30g, rau má 40g, vỏ rễ dâu 30g tẩm mật sao vàng, vỏ cây khế chua 30gsao vàng Sắc với 400ml nước còn 100ml, chia 2 lần uống trong ngày.Dùng 5-7 ngày

Bài thuốc thứ 4: Hoa đu đủ đực 50g, dây tơ hồng 50g, rau má 35g, láxương sông 20g, lá hẹ 15g Tất cả sắc với 1500ml lít nước còn 500ml Lọc,thêm 75g đường trắng Ngày uống 2 lần, mỗi lần 100ml

Ho gà là đường hô hấp bị nhiễm trùng bởi một loại vi khuẩn có tên là

Bordetella, căn bệnh này nguy hiểm và nó xảy ra ở mọi lứa tuổi, chính vì như

vậy chúng ta rất cần được điều trị thật sớm, cũng như cần điều trị dứt điểm.Trị ho bằng hoa đu đủ đực phối kết hợp một số ít loại thảo dược, sẽ đem đến

lợi ích lớn trong công việc điều trị dứt điểm bệnh ho gà Theo tài liệu Đông ytrị bách bệnh của nhà xuất bản Văn hóa- thông tin năm 2009 [19], NgọcPhương và Hồng Hà đã sưu tầm được bài thuốc làm cao ho gà chữa trẻ emmắc bệnh ho gà mà thành thần cao có chứa hoa đu đủ đực sấy khô Bài thuốcnhư sau: Tang bạch bì 100g, lá chanh tươi 100g, lá táo tươi 100g, cỏ sữa nhỏ

lá tươi 100g, hoa đu đủ đực khô 50g, gừng tươi 50g, củ sả tươi 50g, đườngkính 800g Các vị thái nhỏ sao vàng hạ thổ Cho nước đường, nấu lấy 1000mlcao lỏng Trẻ em dưới 5 tuổi mỗi lần uống 5ml cao Ngày uống 2 lần, khiuống hòa với ít nước chín

Hoa đu đủ đực trị ho mất tiếng hiệu quả khi kết hợp với hạt chanh và lá

hẹ Với việc phối kết hợp giữa hoa đu đủ đực trị ho, lá hẹ, hạt chanh và đườngphèn, hỗn hợp này không những hỗ trợ cho trẻ em và người lớn trị được ho,

mà còn hỗ trợ chữa cuống phổi bị viêm, giải quyết và khắc phục tình trạngmất tiếng, khản giọng rất hiệu quả Bài thuốc chữa viêm thanh quản gồm: Hoa

đu đủ đực 15g lá hẹ 15g, hạt chanh 10g, nước đun sôi để nguội 20ml Cácdược liệu được nghiền nát với nước Thêm ít mật ong hoặc đường kính, uốnglàm 3 lần trong ngày Dùng vài ngày Bài thuốc chữa viêm họng: Hoa đu đủđực 15g, xạ can 10g, củ mạch môn 10g, lá húng chanh 10g Tất cả cho vàomột bát nhỏ, thêm ít muối, hấp chín rồi nghiền nát [14] Chữa ho khản tiếng:Hoa đu đủ đực tươi 12g, đường phèn 50g Hoa đu đủ đực tươi sao vàng thơm,đem đun cách thủy với đường phèn Chia uống dần trong ngày [3]

Hoa đu đủ đực ngoài được sử dụng để chữa các bệnh về đường hô hấpcòn được sử dụng làm thành phần chữa bệnh viêm đau niệu đạo: Hoa đu đủđực 40g phối hợp với lá bạc thau 60g, đậu đen 40g, phác tiêu 4g Sắc lấy nướcđặc uống làm ba lần vào lúc đói [14]

Theo như tài liệu Chữa bệnh bằng cây, củ, quả của nhà xuất bản Y họcnăm 2005 đã đưa ra bài thuốc sử dụng hạt đu đủ để chữa bệnh gai cột sống.Bài thuốc như sau: Hạt đu đủ đem xát cho sạch phần nhớt bao quanh, giã nát

trong túi vải rồi đắp lên vùng đau Mỗi lần chỉ đắp tối đa 30 phút và theo dõi

để tránh bị bỏng Ngày làm một lần, liên tục trong 20-30 ngày [6]

Hạt đu đủ có chứa chất phytochemical nephroprotective và có hữu íchtrong việc ngăn ngừa tổn thương thận gây ra bởi paracetamol (Thử nghiệmtrên chuột) [38] Hạt đu đủ có tác dụng trong tránh thai (Thử nghiệm trênchuột) [22]

Cây đu đủ đực không chỉ cho hoa đực và hạt làm thuốc mà rễ của cây đu

đủ đực cũng được sử dụng để chữa bệnh rắn cắn Bài thuốc như sau: Rễ đu đủđực 20g, lá xuyên tiêu 10g, hồng bì 5 hạt Tất cả giã nhỏ, thêm nước, gạnuống, bã đắp [14] Rễ đu đủ sắc uống làm thuốc cầm máu trong bệnh bănghuyết, bệnh sỏi thận [13] Bên cạnh đó rễ của cây đu đủ còn được dùng đểchữa cá đuối cắn Bài thuốc như sau: Rễ đu đủ tươi 30g, muối ăn 4g Hai thứgiã nhỏ Vắt lấy nước uống, bã đắp lên chỗ sưng đau Sau chừng nửa giờ thấygiảm đau vài ngày sau khỏi hẳn (kinh nghiệm nhân dân miền Nam) [14]

Lá của đu đủ dùng gói những thịt gà cứng để khi nấu chóng mềm, dừ.Nước sắc lá đu đủ dùng giặt những vết máu trên vải và quần áo, hoặc để rửavết thương, vết lở loét Thái lá đu đủ cho nhỏ rồi trộn với thóc cho ngựa, bò

ăn để chữa bệnh biếng ăn ở bò ngựa [13] Nước ép lá của đu đủ còn được sửdụng cho điều trị bệnh sốt xuất huyết Nghiên cứu của Varisha cho thấy nước

ép lá đu đủ có thể làm trung gian giải phóng tiểu cầu để điều trị và phòngngừa sốt xuất huyết [22], [50]

Dịch chiết xuất từ lá đu đủ làm giảm quá trình tan máu hồng cầu dohydro peroxide gây ra [43] Dịch chiết xuất từ lá đu đủ còn được chứng minh

có tác dụng chống lại các tổn thương oxy hóa gây ra bởi chì acetate trong tủyxương và có hiệu quả tốt đối với bệnh tan máu hồng cầu [56] Hoạt tínhchống co thắt được quan sát thấy trong chiết xuất thô ethyl acetate từ lá đu đủ

[32] Ngoài ra dịch chiết xuất từ lá đu đủ còn có tác dụng bảo vệ chức năngcủa thận [27], tiềm năng chống lại bệnh sốt xuất huyết [21]

Nghiên cứu này cho thấy rằng dịch chiết của đu đủ có tác dụng hạđường huyết và chống oxy hóa; nó cũng cải thiện hàm lượng lipid ở chuột bịtiểu đường Ngoài ra, chiết xuất lá ảnh hưởng tích cực đến tính toàn vẹn vàchức năng của cả gan và tuyến tụy Chiết xuất nước của Carica đu đủ (0,75g

và 1,5g/100 mL) làm giảm đáng kể lượng đường trong máu (p <0,05) ở chuộtmắc bệnh tiểu đường Nó cũng làm giảm nồng độ cholesterol, triacylglycerol

và amino-transferase trong máu Nồng độ insulin huyết tương thấp khôngthay đổi sau khi điều trị ở chuột bị tiểu đường, nhưng chúng tăng đáng kể ởđộng vật không mắc bệnh tiểu đường Các tế bào đảo tụy là bình thường ởđộng vật được điều trị không mắc bệnh tiểu đường, trong khi ở chuột đượcđiều trị tiểu đường, C đu đủ có thể giúp tái sinh đảo nhỏ biểu hiện như bảotồn kích thước tế bào Trong gan của chuột được điều trị tiểu đường, C đu đủ

đã ngăn chặn sự phá vỡ tế bào gan, cũng như tích lũy glycogen và lipid Cuốicùng, tác dụng chống oxy hóa của C đu đủ chiết xuất cũng được phát hiện ởchuột mắc bệnh tiểu đường [28]

Chiết xuất từ đu đủ có thể làm thay đổi sự phát triển của một số loại tếbào ung thư [39], chống các khối u và điều hòa miễn dịch cơ thể [44] Kết quảxét nghiệm cho thấy so với thuốc sắc, nước ép lá không chỉ thể hiện tác dụnggây độc tế bào mạnh hơn đối với tế bào ung thư SCC25, mà còn tạo ra hiệuquả chọn lọc ung thư đáng kể như các xét nghiệm trên các tế bào keratinocytekhông gây ung thư ở người Hơn nữa, bằng chứng từ việc thử nghiệm nước ép

lá ủ trên hai dòng tế bào này cho thấy rõ tác dụng chọn lọc của lá đu đủ đốivới tế bào ung thư SCC25 [40] Chiết xuất từ lá đu đủ có tác dụng chống tăngsinh các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới [46], chống ung thư

thông qua cơ chế chống tăng sinh và cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư vú

ở người MCF-7 [41] Dịch chiết đu đủ và chất phytochemical liên quan đến

đu đủ có đặc tính chống viêm và điều hòa miễn dịch [33], [45], phần pectinhòa tan chelate từ bột đu đủ tương tác với galectin-3 và ức chế sự tăng sinh tếbào ung thư đại tràng [49] Dịch chiết metanlo từ hạt đu đủ có hiệu quả tránhthai tốt ở chuột [23] Chế phẩm chiết xuất từ rễ cây đu đủ có tiềm năng điềutrị như là một chất bổ sung có thể được áp dụng trong ngộ độc thạch tín [42].Nhựa của cây đu đủ dùng để chữa chai chân và mụn cơm: Bài thuốc nhưsau: Rửa sạch chai chân hay mụn cơm, dùng kim sạch khêu nhẹ vết chai chânhay mụn cơm, sau đó lấy nhựa đu đủ bôi lên băng lại Nhựa đu đủ sẽ ăn mònvết chai chân hoặc mụn cơm [3] Nhựa, mủ đu đủ có hiệu quả trong việc điềutrị sốt xuất huyết, giun kim [24] Protein cysteine của đu đủ có tác dụng chốnggiun sán (Nghiên cứu ở lợn) [29], papain trong mủ đu đủ có tác dụng giúpkiểm soát các bệnh ký sinh trùng [35] Các sản phẩm thu được từ đu đủ lênmen có tác dụng chống độc và miễn dịch (Đã thử nghiệm trên người) [37]

1.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng

để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vôtrùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xácđịnh [1]

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Tính toàn năng của tế bào (Totipotency): Mỗi tế bào của bất kỳ cơ

thể sinh vật nào đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể đó có khảnăng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi; Tính toànnăng của tế bào thực vật: Là khả năng của tế bào đã biệt hóa có khả năng thể

hiện toàn bộ thông tin di truyền và có thể phát triển thành cây hoàn chỉnhtrong điều kiện thuận lợi giống như chu trình phát triển của phôi.

Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra giả thiết về tính toàn năng của tếbào thực vật Ông cho rằng tất cả tế bào đều có tính toàn năng(totipotency), nghĩa là mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin ditruyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnhkhi gặp điều kiện thuận lợi [8] Nhưng phải đến năm 1922 tính toàn năngcủa tế bào mới được chứng minh bằng thực nghiệm nhờ thí nghiệm nuôicấy thành công đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo của Kotte

và Robbins Và sau đó 43 năm (1965) Vasil và Haberlandt đã nuôi từng tếbào riêng biệt của cây thuốc lá và tạo được cây thuốc lá hoàn chỉnh trongống nghiệm Kết quả này đã chứng minh toàn diện tính toàn năng của tếbào [2]

Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào:

Sự phân hóa: là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bàocủa các mô chuyên hóa đảm nhiệm các chức năng khác nhau nhưng chúngđều có từ nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã trải qua giai đoạn phân hóa tếbào để hình thành các mô riêng biệt; Phản phân hóa: Khi các tế bào đãphân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay vềtrạng thái chức năng phôi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi

Về bản chất sự phân hóa và phản phân hóa tế bào là quá trình hoạthóa của gen, tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể thìmột số gen được hoạt hóa và một số gen khác bị ức chế Điều này đươc xảy

ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA Khinằm trong một cơ thể hoàn chỉnh gế bào giữa các tế bào có sự ức chế lẫnnhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì cácgen được hoạt hóa dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen

để hình thành các thể mới Đây chính là cơ sở khoa học là nền tảng cho kỹthuật nuôi cấy mô tế bào.

Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phânsinh, các tế bào của cơ quan sinh sản rất dễ xảy ra quá trình biệt hóa Vì vậy,theo Galson và Murashige thì khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các

tế bào thực vật lại giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc [1], [2], [8]

1.2.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết địnhcho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

1.2.2.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

a) Điều kiện vô trùng:

Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tácvới mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng

- Vô trùng thiết bị và dụng cụ: Dụng cụ được hấp ướt ở 121oC trong

30 phút; sấy khô ở nhiệt độ 90oC trong 2 giờ; sấy tiệt trùng 180oC trong 1 giờ Thiết bị sử dụng: Nồi hấp, tủ sấy, box cấy vô trùng

- Vô trùng mẫu: Sử dụng hóa chất cồn tuyệt đối, thủy ngân HgCl2 0,1%

b) Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH

Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hìnhthái của mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổánh sáng Cường độ ánh sáng được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại

mô là từ 1000-2500 lux Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởngcủa chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ (Murashege, 1977)

Sự thu nhận ánh sáng của chồi in vitro phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng

và chất lượng bình nuôi cấy [8]

Nhiệt độ thích hợp: Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển

ở các loài là không như nhau Tuy nhiên trong thực tế phòng thí nghiệmnhiệt độ thường được duy trì trong khoảng từ 25-28oC

Độ pH của môi trường: Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnhhưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trườngvào tế bào Độ pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5,5 – 6,0 trướckhi khử trùng Nhìn chung nếu độ pH cao hơn 6,0 sẽ làm môi trường bịcứng và nếu thấp hơn 5,0 thì agar khó đông [2], [8].

1.2.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, pháttriển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môitrường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳtheo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy Mặc dù có sự đadạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trườngnuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau:

Thành phần khoáng: Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trườngdinh dưỡng nuôi cấy mô - tế bào thực vật được chia thành hai nhóm theohàm lượng sử dụng: nhóm đa lượng và nhóm vi lượng Nhóm đa lượng:gồm các nguyên tố như Nitơ, lưu huỳnh, photpho, magiê, canxi Chúng đặcbiệt cần thiết đối với quá trình sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào.Nhóm vi lượng gồm các nguyên tố như sắt, mangan, bo, molypden… lànhóm nguyên tố được sử dụng với nồng độ rất nhỏ nhưng lại không thểthiếu đối với sự phát triển của mô – tế bào [8]

Nguồn cacbon: Phần lớn mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sốngtheo phương thức dị dưỡng vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồncacbon hữu cơ là điều bắt buộc Nguồn cacbon thông dụng hiện nay làsucrose Nồng độ thích hợp là 2-3% song cũng còn phụ thuộc vào mục đíchnuôi cấy mà thay đổi Ngoài ra còn có thể sử dụng một số nguồn cacbonkhác như glucose, maltose, fructose…Các loại rượu như glycerin cũngđược tế bào sử dụng Manitol hoặc sorbitol còn có thể được sử dụng trong

nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast với chức năng là chất ổn định áp suất thẩm thấu [2], [8].

Vitamin: Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả năng tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thườngkhông đủ về lương, do đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt làcác vitamin thuộc nhóm B như: B1, B3, B5, B6, meso-inosit… rất cần thiếtcho các phản ứng sinh hóa [8]

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Trong môi trường nuôi cấy mô– tế bào thực vật thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quảnuôi cấy là các chất điều khiển sinh trưởng, thuộc các nhóm sau:

+ Auxin: Có 4 loại auxin thường được sử dụng là: Indole acetic acid(IAA), Naphthylacetic acid (NAA), 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D),Indol butyric acid (IBA) Chúng chủ yếu có tác dụng kích thích sinh trưởngcủa tế bào nhưng cũng làm phân bào

+ Cytokinin: Là nhóm các phytohormone dẫn xuất của adenin.Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hóa của các cơquan, làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ môsẹo nuôi cấy Các loại cytokinin thường dùng trong môi trường nuôi cấy làkinetin, 6-Benzylaminopurin (BAP) Ngoài ra còn có Zeatin nhưng nó ítđược sử dụng trong nuôi cấy vì giá thành quá đắt

+ Gibberellic acid: Tới nay đã phát hiện được trên 60 loại thuộcnhóm gibberellic acid Loại thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3.Trong cơ thể thực vật, gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiềuquá trình sinh lý như: Sinh lí ngủ nghỉ của hạt và chồi, phát triển của hoa,làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật

+ Abscisic acid: Abscisic acid (ABA) thuộc nhóm các chất ức chếsinh trưởng ABA có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bàothực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vàomôi trường tái sinh cây và mang lại hiệu quả nhất định [2], [8], [12].

Các hỗn hợp chất tự nhiên: Sự bổ sung thêm một số các hỗn hợpdinh dưỡng tự nhiên như: nước dừa, dịch chiết mầm lúa mì, dịch chiết nấmmen, dịch thủy phân casein…vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sựsinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy [8]

Chất độn- thạch (Agar): Agar là thành phần quyết định trạng thái vật

lí của môi trường Hàm lượng agar dùng trong nuôi cấy dao động 0,6 – 1,0

% theo khối lượng Tuy nhiên còn tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1994 M o n d a l v à các cộng sự đã nghiên cứu cải tiến kỹ thuật nhângiống in vitro cây đu đủ bằng phương pháp nuôi cấy tái sinh mô sẹo từ cuống

lá, thân và rễ của cây đu đủ con Môi trường nuôi cấy được bổ sung IBA 2,0mg/l và BAP 0,5 mg/l Cây con được sử dụng là những cây sạch bệnh đượcnuôi cấy trong phòng thí nghiệm Số lượng chồi nhiều nhất thu được từ môsẹo có nguồn gốc phát sinh từ rễ trong môi trường MS bổ sung IBA 0,5 mg/l

và Kinetin từ 1 mg/l đến 2 mg/l Sự hình thành rễ được tạo ra trong môi

trường MS 1/2 bổ sung IBA 2 mg/l Cây con invitro đã được thuần dưỡng và

đưa ra trồng ở môi trường tự nhiên [34]

Năm 2003, McCubbin và cộng sự đã nghiên cứu cải tiến kỹ thuật nhângiống cây đu đủ trong ống nghiệm Khi bổ sung than hoạt tính với hàm lượng

3g/l ở bước trung gian trước khi ra rễ làm giảm hiệu ứng độc của cytokinin doviệc sử dụng lâu dài [31].

Năm 2012, Roy Và cộng sự đã nghiên cứu về sự di truyền của cây đu đủ

thông qua nuôi cấy in vitro Kết quả nghiên cứu đã cho thấy một số lượng lớn

chồi được tái sinh từ nụ bên và lá non của đu đủ trên môi trường MS được bổsung zeatin 1,0 mg/l và NAA 0,2 mg/l Bổ sung casein hydrolylate (CH) 200mg/l và than hoạt tính 2,0 g/l vào môi trường nuôi cấy sẽ tạo được môi trườngphù hợp cho lá phát triển Trong khi đó, khi bổ sung ure 100 mg/l và than hoạttính 2,0 g/l vào môi trường nuôi cấy sẽ tạo được môi trường phù hợp cho sựkéo dài chồi Môi trường tốt nhất cho sự ra rễ là môi trường có bổ sung IBA4,0 mg/l Sau bốn tuần theo dõi 90% số chồi ra rễ, đạt được 12 – 14 rễ/ chồi.Khi đưa ra môi trường ngoài có 84% cây con phát triển tốt [52]

Năm 2013, Mumo và cộng sự đã nghiên cứu quy trình tái sinh cây đu đủKenya trong ống nghiệm bằng cách sự dụng vật liệu là chồi cây đu đủ Kếtquả nghiên cứu đã cho thấy: Môi trường nhân chồi tốt nhất là MS có bổ sungBAP 0,5 mg/l và NAA 0,1 mg/l.; Môi trường có hàm lượng IBA 2,5 mg/l có

tỷ lệ cảm ứng ra rễ tốt nhất với số lượng rễ và chiều dài rễ cao nhất [36]

Năm 2015, Setargie và các cộng sự đã nghiên cứu quy trình nhân giống

in vitro cây đu đủ Nghiên cứu này đươc tiến hành để cải tiến cho quy trình nhân giống in vitro cây đu đủ lưỡng tính (Carica papaya L.) từ chồi non trước

đó Trong nghiên cứu này, môi trường MS có bổ sung các nồng độ auxin vàcytokinin khác nhau, từ đó đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ auxin vàcytokinin đến việc tạo môi trường phù hợp cho việc tái sinh chồi trong điều

kiện in vitro Môi trường phù hợp nhất cho mô sẹo tái sinh chồi là môi trường

MS có bổ sung BAP 1mg/l và NAA 0,5 mg/l Tại môi trường MS có bổ sungBAP 1,0 mg/l và NAA 0,5 mg/l có số lượng chồi đạt mức trung bình là 16chồi, chồi cao nhất là 1,7 cm, số chồi có lá là 21 chồi Lượng BAP và NAAtối thiểu bổ sung vào môi trường để nẩy chồi là BAP 0,5 mg/l và NAA 0,5

g/l Lượng BAP và NAA tối đa bổ sung vào môi trường để nẩy chồi là BAP2,0 mg/l và NAA 0,5 g/l Số lượng chồi, số lá và chiều dài lá được ghi nhậntrong khoảng từ BAP 0,5 mg/l đến BAP 2,0 mg/l Môi trường ra rễ cho chồitốt nhất là môi trường MS có bổ sung IBA 1,5 mg/l Số lượng rễ thu đượclà

16,25 rễ; chiều dài gốc đo được là 3,92 cm Tại môi trường MS có bổ sungIBA

3mg/l cho độ dài gốc tối thiểu Khả năng cây con sống sót khi làm quen vớikhí hậu đạt 40% trên hỗn hợp đất vườn, cát và phân bò theo tỷ lệ 2: 1: 1 [55]

Năm 2016, Gatambia đã sử dụng phương pháp in vitro để tái sinh đu đủ

trên môi trường lỏng và môi trường bán lỏng có bổ sung các chất điều hòasinh trưởng với các nồng độ khác nhau Số lượng chồi cao nhất thu được trênmôi trường có bổ sung IBA 0,5 mg/l và NAA 1,0 mg/l Môi trường cảm ứng

ra rễ tốt nhất là môi trường có bổ sung IBA 2,5 mg/l [26]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Đỗ Văn Nam và các cộng sự (2013) đã nghiên cứu nhân giống vô tính

in vitro cây đu đủ dòng bố của giống VNĐĐ9 từ đoạn thân mang chồi nách.Kết quả đã xác định được chế độ khử trùng thích hợp là khử trùng kép bằngHgCl2 0,1 % lần 1 trong thời gian 10 phút và lần 2 trong thời gian 5 phút Chế

độ khử trùng này cho 86,9% mẫu sạch Môi trường thích hợp nhất để tạocallus từ lát cắt đoạn thân là MS bổ sung α-NAA 1 mg/l và BA 0,5 mg/l, tỷ lệhình thành callus đạt 90,74 % sau 4 tuần nuôi cấy Tỷ lệ callus tái sinh chồicao nhất (44,44 %) trên môi trường MS có BA 1 mg/l và α- NAA 0,1 mg/l

Hệ số nhân chồi đạt cao nhất (3,17 lần) trên môi trường MS bổ sung BA 1mg/l và α-NAA 0,25 mg/l sau 4 tuần nuôi cấy Môi trường thích hợp để cảmứng tạo rễ cho chồi in vitro là MS ½ bổ sung 1mg/l than hoạt tính và IBA 1,5mg/l cho tỷ lệ chồi tạo rễ cao nhất đạt 50% sau 4 tuần nuôi cấy [15]

là lá trên chồi thân từ cây trưởng thành, trong môi trường MS ½ có bổ sungsucrose 30 g/l với glutamine 400 mg/l và agar 8 g/l, BAP 0,02 mg/l và 2,4-D

1 mg/l cho kết quả tốt nhất trong tạo mô sẹo Môi trường để nuôi cấy kíchthích hình thành phôi soma là MS bổ sung sucrose 30 g/l, agar 8 g/l, BAP 0,5mg/l, NAA 0,1 mg/l cho kết quả tốt nhất trong kích thích mô sẹo hình thànhphôi Môi trường để nuôi cấy kích thích phôi nảy mầm là MS bổ sung sucrose

30 g/l, không cần bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng.Trạng thái lỏng lắccho kết quả tốt nhất trong kích thích phôi nảy mầm Môi trường để nuôi cấykích thích phôi đã nảy mầm phát triển thành cây hoàn chỉnh là MS bổ sungsucrose 30 g/l Không cần bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng Trạng tháiđặc cho kết quả tốt nhất trong kích thích phôi đã nảy mầm phát triển thànhcây hoàn chỉnh [20]

Nguyễn Thị Nhẫn và cs (2004) đã nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro cây đu đủ Phương thức khử trùng tốt nhất với cây đu đủ là kết hợp

Ca(OCl)2 0,15% với HgCl2 0,1% sau đó đưa vào nuôi cấy trên môi trường

MS có BA 1ppm hoặc BA 0,5 ppm và kinetin 0,5 ppm Sử dụng môi trường

MS bổ sung NAA 0,2 ppm và BA 0,5 ppm với nước dừa (5%) đạt được hệ sốnhân chồi từ 4,4 đến 4,6 lần Tỷ lệ chồi ra rễ trên môi trường NAA 0,025ppm là 95% sau 4 tuần nuôi cấy [16]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Chất điều hòa sinh trưởng: 2,4 D, NAA, IBA (Sigma, Đức)

- Hợp chất hữu cơ: cao nấm men, peptone (Phytech, USA), nước dừa

- Hóa chất khác: đường sucrose, agar (Hạ Long, Việt Nam)

- Than hoạt tính

- Hóa chất khử trùng (cồn 70%, thủy ngân HgCl2 0,1%, hypoclrit canxiCa(OCl)2)

b) Thiết bị

2.2 Địa điểm và thời gian

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật, khoa Côngnghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu: các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8/2017 tháng 4/2019

-2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy.

- Vật liệu thí nghiệm: đoạn ngọn chứa chồi nách của cây đu đực với các độtuổi khác nhau từ cây non đến cây trưởng thành (chưa ra hoa hoặc đang có hoa)

- Phương pháp tiến hành: mẫu thu về rửa sạch dưới vòi nước chảy,ngâm trong xà phòng loãng khoảng 15 phút, tiếp theo rửa sạch xà phòng sau đótráng bằng nước cất, mang vào box cấy để khử trùng Ở trong box cấy vôtrùng; khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 1-2 phút, tráng sạch bằng nướccất khử trùng

3-4 lần sau đó khử trùng bằng thủy ngân clorua HgCl2 với các nồng độ 0,1%,0,15% và trong các khoảng thời gian khác nhau 13 phút, 15 phút hoặc 10 phút(lần 1) và 5 phút (lần 2)

- Chỉ tiêu nghiên cứu: xác định tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệmẫu sống, tỷ lệ mẫu chết

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo