Sàng lọc tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của một số loài thuộc chi ficus l

6 Bảng 3.1 : Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu tía Ocimum sanctum L.. Xuất phát từ thực tế cây Hương nhu tía ở Việt Nam chưa được nghiên cứu nhiều về thành

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến Tiến sỹ Nguyễn Văn Tài và Tiến sỹ Đỗ Quyên, dù bận rất nhiều công việc nhưng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dìu dắt em trong quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh khóa luận Mặc dù bản thân đã rất cố gắng trong lần đầu tiên nghiên cứu khoa học nhưng

chắc chắn khóa luận không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được

những ý kiến đóng góp quý giá của các thầy cô

Hà Nội, tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Nguy ễn Ngọc Hiếu

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật chi Ocimum L 2

1.2 Thành phần hóa học của Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) 5

1.3 Tổng quan về acid ursolic 6

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15

3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học 15

3.2 Định tính acid ursolic trong cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng SKLM 22

3.3 Phân lập acid ursolic từ cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng sắc ký cột 23

3.4 Xây dựng quy trình chiết tách acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) 29

BÀN LUẬN 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 43

Rf hệ số lưu SKLM sắc ký lớp mỏng

tt thể tích

TT thuốc thử

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 : Hàm lượng acid ursolic trong lá của các loài thuộc chi Ocimum L 6

Bảng 3.1 : Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu

tía (Ocimum sanctum L.) bằng phản ứng hóa học 21

Bảng 3.2 : Phổ 1

H, 13 C-NMR của D1 và acid ursolic 27 Bảng 3.3 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết bằng các dung môi khác nhau 32 Bảng 3.4 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết ở các nhiệt độ khác nhau 34 Bảng 3.5 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết với tỷ lệ dung môi/dược liệu khác nhau 34 Bảng 3.6 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) với số lần chiết khác nhau 35

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 : CTCT của acid ursolic 7 Hình 1.2 : CTCT của acid corosolic 9 Hình 1.3 : Sơ đồ bán tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic 9 Hình 1.4 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros kaki) 10

Hình 1.5 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica) 11

Hình 3.1 : Sắc ký đồ của cắn MeOH toàn phần với acid ursolic đối chứng trên các hệ dung môi khai triển 22 Hình 3.2 : Tóm tắt quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cành, lá Hương nhu

tía (Ocimum sanctum L.) 24

Hình 3.3 : Sắc ký đồ các cắn phân đoạn với acid ursolic đối chứng 25 Hình 3.4 : Sắc ký đồ acid ursolic thô và sau khi kết tinh với chất đối chứng 31 Hình 3.5 : Sắc ký đồ acid ursolic thô của các mẻ chiết bằng các dung môi khác nhau 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hương nhu tía từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền làm thuốc điều trị cảm nắng, cảm hàn, sốt nóng sợ rét, nhức đầu, đau bụng Dược điển

Việt Nam IV có chuyên luận về Hương nhu, xem hai loài Hương nhu trắng

(Ocimum gratissimum L.) và Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) được sử dụng

như nhau trong điều trị Thực tế, cây Hương nhu trắng là nguồn nguyên liệu chiết

xuất tinh dầu Hương nhu và điều chế eugenol, còn cây Hương nhu tía chủ yếu dùng trong Y học cổ truyền

Trên thế giới, Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) được dùng như một nguồn

nguyên liệu giàu acid ursolic, do có chứa hàm lượng acid ursolic cao [19, 22] Acid ursolic là một saponin thuộc nhóm ursan đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như chống viêm, bảo vệ gan, hạ lipid máu, chống khối u [10, 15] Đặc biệt acid ursolic còn là một chất trung gian quan trọng để bán tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như acid corosolic (một chất ức chế glycogen phosphorylase được nghiên cứu nhiều trong điều trị đái tháo đường) [20, 24]

Xuất phát từ thực tế cây Hương nhu tía ở Việt Nam chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần acid ursolic, chúng tôi đã thực hiện đề tài : "Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)"

với các nội dung chính như sau :

- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)

- Chiết xuất, phân lập acid ursolic từ cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)

- Xây dựng quy trình chiết xuất acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng acid ursolic chiết từ dược liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật chi Ocimum L

1.1.1 Vị trí phân loại chi Ocimum L

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 1987, chi Ocimum L thuộc :

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Ocimum L

Chi Ocimum L thu ộc họ Bạc hà (Lamiaceae), tên gọi có thể bắt nguồn từ ozo,

ozein nghĩa là toát mùi thơm, liên quan đến mùi thơm phảng phất của các cây thuộc chi này; hoặc do chữ okimon, okys nghĩa là nhanh, cấp tốc vì các cây này mọc rất

nhanh Tên khác của chi : Hương nhu, Húng, É

Cỏ hay cây bụi nhỏ, sống hằng năm hay sống nhiều năm Thân thường vuông,

nhẵn hay có lông Lá mọc đối, mép nguyên hay xẻ răng cưa, có lông hay nhẵn, thường có các điểm tuyến tròn trên phiến Cụm hoa dạng chùy hay hình tháp, gồm các xim bó tạo thành các vòng giả, mỗi vòng thường có 6 hoa Lá bắc tồn tại hay

sớm rụng Đài hình chuông, thường có lông và điểm tuyến ở phía ngoài, 2 môi; môi trên có một thùy lớn ít nhiều men xuống ống; môi dưới 4 thùy, với 2 thùy bên nhọn

ngắn, 2 thùy dưới nhọn, dài Tràng có ống thò khỏi đài, nhẵn hay có lông, 2 môi : môi trên 4 thùy ngắn; môi dưới một thùy dài và lớn hơn môi trên, hơi cong và lõm hình thuyền Nhị 4, hướng xuống môi dưới, chỉ nhị ít nhiều thò khỏi ống tràng, bao

phấn hình trứng hay hình thận, 1 ô Bầu nhẵn, vòi nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh Đĩa mật

có thùy trước lớn Quả hình trứng hay gần hình cầu, nhẵn, nằm trong đài đồng trưởng

Có khoảng 150 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi và Nam Mỹ

Ở Việt Nam có 4 loài [5]

1.1.3 Chi Ocimum L ở Việt Nam

Ở Việt Nam, chi Ocimum L có 4 loài :

• Ocimum americanum L - É hoang, É châu Mỹ Ở nước ta có gặp tại Hà Nội

và vùng Cam Ranh tỉnh Khánh Hòa

• Ocimum basilicum L - Húng quế, Húng giổi, Húng chó, É tía, É quế Ở nước ta, có gặp từ Hà Giang, Hà Nội, Thừa Thiên Huế, Ninh Thuận, thành

phố Hồ Chí Minh và Long An Cũng được trồng ở nhiều nơi

Ocimum basilicum L var pilosum (Willd.) Benth - Húng trắng, É trắng, Trà tiên Ở nước ta, thứ này có gặp từ Hà Giang, Hòa Bình, Hà Nội vào Quảng Nam, Kon Tum, Đắc Lắc, Khánh Hòa, thành phố Hồ Chí Minh và Long An Cũng được trồng ở nhiều nơi

• Ocimum gratissimum L - Hương nhu trắng, É lá lớn Ở nước ta, có gặp từ

Hà Giang, Sơn La, Lạng Sơn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Nội vào tới thành phố

Hồ Chí Minh

• Ocimum sanctum L (tên khác O tenuiflorum L.) - Hương nhu tía, É tía, É

đỏ, É rừng Ở nước ta, có gặp từ Hòa Bình, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình vào Khánh Hòa, Ninh Thuận, thành phố Hồ Chí Minh cho đến An Giang Cũng được trồng ở nhiều nơi [5]

1.1.4 Đặc điểm thực vật loài Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)

1.1.4.1 Tên gọi

• Tên khoa học : Ocimum sanctum L (tên khác : O tenuiflorum) - họ Bạc hà (Lamiaceae)

• Tên khác : É đỏ, é tía

• Tên nước ngoài : Monk's basil, sacred basil, holy basil, rough basil, tulsi, mosquito plant of South Africa (Anh), basilic saint, basilic sacré (Pháp) [7]

1.1.4.2 Đặc điểm thực vật

Cây nhỏ, sống hằng năm hay sống dai, cao đến gần 1m Thân, cành màu đỏ tía, có lông mịn Lá mọc đối, có cuống dài, hình mác hoặc thuôn, dài 2 - 5 cm, rộng

1 - 3 cm, mép khía răng, hai mặt màu tím tía, có lông mềm

Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm xim phân nhánh; lá bắc nhỏ; hoa màu

trắng hoặc tím tía, xếp thành từng vòng 5 - 6 cái trên cụm hoa; đài hoa dài 3 - 5 mm, thùy trên hình mắt chim, thùy dưới hình giùi dài hơn, những thùy bên rất ngắn; tràng hoa có cánh hơi lượn sóng ở mép; nhị 4, vượt ra ngoài tràng

Quả bế tư, gần hình cầu, hơi dẹt, màu nâu nhạt hoặc đỏ có đốm đen nhỏ, nằm trong đài tồn tại

Mùa hoa quả : tháng 5 - 7 [7]

1.1.4.3 Phân bố, sinh thái

Hương nhu tía vốn là cây cổ nhiệt đới châu Á, được trồng rải rác ở Trung Quốc, Lào, Thái Lan để làm thuốc và làm rau gia vị Ở Việt Nam, Hương nhu tía

mới được trồng hạn chế trong vườn các gia đình hoặc các cơ sở chữa bệnh theo y

học cổ truyền Cây ưa khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm; nhiệt độ trung bình năm khoảng 25 - 300C; lượng mưa 1800 - 2600 mm/năm Ở các vùng núi cao có khí hậu

cận nhiệt đới và hơi lạnh, không thấy trồng

Hương nhu tía mọc từ hạt vào khoảng cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong mùa hè, đến cuối mùa thu hay đầu mùa đông thì tàn lụi Cây ra hoa quả nhiều Quả chín tự mở, hạt rơi xuống đất và nảy mầm sau 5 - 6 tháng Cây trồng dễ dàng bằng hạt [7]

1.2 Thành phần hóa học của Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)

Tinh dầu : đây là thành phần đáng chú ý và có giá trị cao trong cây Hương nhu

tía, theo Dược điện Việt Nam IV, dược liệu phải chứa ít nhất 0,5% tinh dầu (tính theo dược liệu khô tuyệt đối) [3]

Về thành phần hóa học,tinh dầu hương nhu tía Việt Nam chứa các thành phần chính là eugenol (trên 70%), methyleugenol (trên 12%) và β-caryophylen [7]

Thành phần hóa học khác trong cây :

- Hương nhu tía chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid như apigenin, luteolin, apigenin-7-glucuronid, luteolin-7-glucuronid, orientin và nhóm polyphenol như : acid galic, acid galic methylester, acid galic ethylester, acid protocatechic, acid rosmarinic [7]

- Acid ursolic là một thành phần quan trọng và có hàm lượng cao trong Hương nhu tía

+ Năm 2008, Silva MG và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng acid ursolic trong lá của 8 loài thuộc chi Ocimum L., đó là : O americanum, O

basilicum, O basilicum var purpurascens, O basilicum var minimum, O gratissimum, O micranthum, O selloi và O tenuiflorum bằng phương pháp phân tích HPLC Nghiên cứu đã chỉ ra Ocimum tenuiflorum là loài có hàm lượng acid

ursolic trong lá cao nhất (lên đến 2,02%) trong các loài thuộc chi Ocimum L Kết

quả của nghiên cứu được trình bày ở bảng 1.1 [19]

+ Năm 2013, Mangesh D và cộng sự đã khảo sát các yếu tố trong quá trình chiết xuất acid ursolic từ lá Ocimum sanctum L bằng sóng siêu âm Nghiên cứu đã

xác định điều kiện chiết xuất tối ưu trên một mẻ 2 g dược liệu là sử dụng dung môi MeOH, tỷ lệ dung môi/dược liệu là 1/30, nhiệt độ 45 0C, tần số sóng siêu âm 25 kHz và trong thời gian 12 phút, lượng acid ursolic được chiết ra ở điều kiện này là

1,647% (sử dụng phương pháp định lượng HPLC) [22]

Bảng 1.1 : Hàm lượng acid ursolic trong lá của các loài thuộc chi Ocimum L

1.3 Tổng quan về acid ursolic

1.3.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa của acid ursolic

Công thức phân tử : C30H48O3

Khối lượng phân tử : 456,7 (g/mol)

Công th ức cấu tạo (hình 1.1) Tên khoa học : 3β-hydroxyurs-12-en-28-oic acid

Hình dạng tinh thể : Kết tinh dạng tinh thể lăng trụ to từ cồn tuyệt đối, dạng kim từ

cồn loãng

Nhiệt độ nóng chảy : 2840

C

Độ tan : 1/88 (MeOH, kl/tt), 1/178 (EtOH, kl/tt), 1/35 (EtOH sôi, kl/tt), 1/140

(ether, kl/tt), 1/388 (chloroform, kl/tt), 1/1675 (CS2, kl/tt), tương đối tan trong aceton Tan trong acid acetic băng nóng và dung dịch 2% NaOH trong EtOH Không tan trong ether dầu hỏa Độ tan trong nước : 1,02.10-4

mg/L ở 250

C (dự đoán) [26]

Hình 1.1 : CTCT của acid ursolic

1.3.2 Tác d ụng dược lý của acid ursolic

Acid ursolic phân lập từ Plantago major thể hiện tác dụng chống viêm trong

thử nghiệm in vitro sinh tổng hợp prostaglandin (có sự xúc tác của COX-2) Acid

ursolic thể hiện tác dụng chống viêm đáng kể trên 2 với tỷ lệ chọn lọc 2/COX-1 là 0,6 [13] Trong thử nghiệm in vivo, tác dụng chống viêm của acid ursolic lớn hơn acid oleanolic và indomethacin, cụ thể là giá trị ID50 của acid ursolic, acid oleanolic và indomethacin lần lượt là 0,14/0,36/0,26 μmol/cm2, điều này cho thấy acid ursolic có tác dụng chống viêm mạnh hơn gần 2 lần so với indomethacin và gần 3 lần so với acid oleanolic [8]

COX-1.3.2.2 Tác dụng bảo vệ gan

Acid ursolic có tác dụng bảo vệ gan trong các tổn thương gan do hóa chất, cũng như bệnh xơ hóa gan cấp tính, xơ gan, acid ursolic được sử dụng đơn độc hoặc

phối hợp với các tác nhân bảo vệ gan khác Tác dụng bảo vệ gan của acid ursolic có

thể do tác dụng chống oxy hóa và chống viêm của nó mang lại Một trong những cơ

chế bảo vệ gan của acid ursolic là làm tăng lượng metallothionein - một protein giàu cystein có chức năng giống glutathion trong việc bảo vệ gan khỏi các độc tố, loại bỏ các kim loại nặng Tuy nhiên đó không phải là cơ chế bảo vệ gan duy nhất của acid ursolic [16]

Bên cạnh tác dụng bảo vệ gan trong các thử nghiệm gây tổn thương gan bởi CCl4 hoặc D-galactosamin, acid ursolic còn có tác dụng ngăn ngừa tắc nghẽn đường

mật trong thử nghiệm gây tắc nghẽn đường mật bởi acetaminophen [18]

1.3.2.3 Tác dụng chống khối u

Acid ursolic từ Eriobotrya japonica thể hiện tác dụng ức chế sự đột biến trong

thử nghiệm sử dụng aflatoxin B1 trên Salmonella typhimurium [25]

Acid ursolic tách từ Rosmarinus officinalis có hiệu quả trong ức chế sự hình

thành liên kết cộng hóa trị của B[a]P với DNA của da và ức chế sự hình thành khối

1.3.3 Acid ursolic là nguyên liệu ban đầu để bán tổng hợp một số hợp chất có tác d ụng sinh học quan trọng

Từ acid ursolic có thể bán tổng hợp nên các hợp chất có tiềm năng ức chế enzym glycogen phosphorylase để điều trị đái tháo đường type 2 [23], đặc biệt là acid corosolic (chỉ khác acid ursolic là có thêm 1 nhóm OH ở vị trí số 2-alpha)

Hình 1.2 : CTCT của acid corosolic

X.Wen et al (2007) đã tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic theo sơ đồ [24]

Hình 1.3 : Sơ đồ bán tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic

1.3.4 M ột số phương pháp phân lập acid ursolic

1.3.4.1 Phân lập acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros kaki L.f.)

Nguyễn Thị Ngọc Lan (2012) đã chiết tách acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros

kaki L.f.) làm chất đối chiếu phục vụ Công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu Từ 2 kg dược liệu, tác giả đã chiết tách được 125 mg acid ursolic Phương pháp chiết tách được trình bày ở hình 1.4 [6]

Lá Hồng (2kg) Dịch chiết MeOH

MeOH (7L x 3 lần)

Cao MeOH (170g)

- MeOH

+ 1,5L nước Dịch nước

SK cột pha đảo MeOH-H2O

SK cột pha đảo MeOH-H2O (4:1)

5/1

1.3.4.2 Phân lập acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica)

Rosa T.S Frighetto (2007) đã chiết tách và tinh chế acid ursolic từ vỏ táo

(Malus domestica) bằng phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao

(HSCCC - high speed counter-current chromatography) [9]

Vỏ táo + n-hexan loại bỏ nhớt

Sắc ký cột silicagel pha thuận

Hình 1.5 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica).

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2 1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất

Nguyên liệu : cành, lá Hương nhu tía được thu hái tại huyện Ba Vì, Hà Nội

Mẫu tươi được giám định tên khoa học ở bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà

Nội với mã số tiêu bản là HNIP/18039/13, tiêu bản được lưu tại Phòng tiêu bản cây thuốc (HNIP) - trường Đại học Dược Hà Nội (phụ lục 1)

Hóa chất : Dung môi dùng trong chiết xuất là dung môi công nghiệp đã cất lại

Các hóa chất, dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế là dung môi tinh khiết của Trung

Quốc Acid ursolic đối chứng được cung cấp bởi Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu, được sử dụng làm chất đối chứng cho các thí nghiệm sau này

2.1.2 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

- Các dụng cụ cần thiết trong quá trình thực nghiệm như bình nón, cốc có mỏ, ống nghiệm, pipet,

- Thu hồi dung môi bằng máy cất quay Rotavapor R-200 của hãng BUCHI - Viện Dược liệu

- Xác định độ ẩm trên máy PRECISA HA60 - Viện Dược liệu

- Cân phân tích PRECISA - Viện Dược liệu

- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn pha thuận - Viện Dược liệu

- Phổ hồng ngoại đo trên máy quang phổ hồng ngoại IMPACT 410 NICOLET - Viện Hóa học

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H, 13C đo trên máy BRUKER AVANCE AM500 NMR - Viện Hóa học

FT Phổ khối đo trên máy sắc kí lỏng- khối phổ SHIMADZU LC-MS 2010EV - Viện Hóa học

2.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong cây Hương nhu tía (Ocimum

sanctum L.)

Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu theo phương pháp hóa học ghi trong sách Thực tập Dược liệu và Bài giảng Dược liệu tập 1 của trường Đại học Dược Hà Nội [1, 2]

2.2.2 Định tính acid ursolic trong cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng SKLM

- Bản mỏng Silicagel GF254 pha thuận (Merck) được hoạt hóa trong vòng 1 giờ ở nhiệt độ 1100

C

- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký của mẫu thử và mẫu đối chứng :

+ Mẫu đối chứng : lấy khoảng 1 mg acid ursolic đối chứng hòa tan vào 1 mL MeOH

+ Mẫu thử : lấy khoảng 5 mg cắn MeOH hòa tan vào 1 mL MeOH (cắn được chuẩn bị như mục 2.2.3)

- Các hệ dung môi khai triển :

Hệ 1 : CHCl3 : MeOH = 9 : 1 (tt/tt)

Hệ 2 : ether dầu hỏa : EtOAc = 4 : 6 (tt/tt)

Dung môi khai triển được bão hòa trong cốc sắc ký, đặt bản mỏng đã chấm

dịch chiết vào cốc, chạy theo chiều từ dưới lên trên Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra, để khô tự nhiên

- Phương pháp phát hiện : Quan sát các vết dưới ánh sáng tử ngoại (UV) ở 2 bước sóng

254 nm và 365 nm, phun dung dịch H2SO410% trong EtOH, hơ nóng trên bếp điện

2.2.3 Phân l ập bằng sắc ký cột

- Chi ết xuất : Chiết hồi lưu cành lá Hương nhu tía (phơi sấy khô, xay nhỏ) với

MeOH Sau đó, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn

nước nóng, sau đó chiết lần lượt với các dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực

là n-hexan, DCM, EtOAc Thu các phần dịch chiết, rồi đem cất thu hồi dung môi

dưới áp suất giảm tới cắn

- Phân lập bằng sắc ký cột :

+ Lựa chọn phân đoạn DCM để tiến hành sắc ký

+ Ch ất hấp phụ : Silicagel 60 (cỡ hạt 0,04 - 0,063 mm) được hoạt hóa ở 110 0

C trong 1 giờ Để nguội ở bình hút ẩm

+ C ột sắc ký : kích thước 5x25 cm

+ H ệ dung môi rửa giải : Sử dụng hệ dung môi DCM và MeOH tăng dần độ phân

cực (gradient lượng MeOH từ 0% đến 10%)

- Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, đo điểm chảy Sau đó sử dụng các phương pháp phân tích phổ (phổ hồng ngoại IR, khối phổ ESI-

MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H/13C-NMR), tham khảo cơ sở dữ liệu phổ của các tài liệu đã công bố để biện giải cấu trúc chất phân lập được

2.2.4 Phương pháp chiết xuất acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)

Chiết cành, lá Hương nhu tía bằng phương pháp hồi lưu với hệ dung môi EtOH và EtOAc, dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn Phân tán cắn vào một lượng tối thiểu nước nóng, chiết nhiều lần với DCM, gộp các

phần dịch chiết DCM Cất thu hồi bớt dung môi, sau đó đun hồi lưu lớp DCM với than hoạt để than hoạt hấp phụ acid ursolic, rửa giải acid ursolic ra khỏi than hoạt

bằng dung môi aceton, cất thu hồi dung môi thu được acid ursolic thô

Kết tinh acid ursolic : sử dụng phương pháp kết tinh bằng nhiệt độ, dựa trên sự chênh lệch độ tan của acid ursolic trong EtOH ở nhiệt độ sôi (1/35, kl/tt) và trong EtOH ở nhiệt độ thường (1/178, kl/tt) [26]

2.2.5 Khảo sát một số thông số của quá trình chiết xuất

Tiến hành khảo sát một số thông số ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất :

A : hàm lượng phần trăm (%) của acid ursolic thô

m : khối lượng acid ursolic thô thu được

b : hàm ẩm dược liệu

M : khối lượng dược liệu

CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ

3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học

Định tính các nhóm chất trong cành, lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)

bằng phản ứng hóa học

m

M (1-b)

- Chuẩn bị dịch chiết cồn : Cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 mL, thêm

50 mL EtOH 900, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc làm các phản ứng

- Chuẩn bị dịch chiết ether dầu hỏa : Cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 50

mL, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm, lọc Dịch lọc dùng để làm các phản ứng

3.1.1 Định tính alcaloid

Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 mL, thêm dung dịch H2SO4

2% cho ngập dược liệu, đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn,

kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH kiềm Chiết alcaloid bằng cloroform (CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5 mL Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc

với H2SO4 2% Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1

mL rồi thêm vào :

- Ống 1 : 2-3 giọt TT Dragendorff, dung dịch trong suốt, không có tủa vàng cam

- Ống 2 : 2-3 giọt TT Mayer, dung dịch trong suốt, không có tủa vàng nhạt

- Ống 3 : 2-3 giọt TT Bouchardat, dung dịch trong suốt, không có tủa nâu

Kết luận : dược liệu không có alcaloid

3.1.2 Định tính anthranoid

- Phản ứng Borntraeger: cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 mL, thêm 10

mL dung dịch H2SO4 25% cho ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 mL ether Lấy 1 mL dịch ether cho vào ống nghiệm, thêm 1mL KOH 10%, lắc kỹ, quan sát thấy lớp KOH không có màu

K ết luận : dược liệu không có anthranoid

3.1.3 Định tính flavonoid

bột Mg kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc Đun nóng trên bếp cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ

- Ph ản ứng với dung dịch FeCl 3 5% : cho 2 mL dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy dung dịch chuyển màu xanh sẫm

- Ph ản ứng với kiềm : Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi

đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng hiện rõ, khi soi dưới đèn tử ngoại thấy có màu vàng sáng

Kết luận : dược liệu có chứa flavonoid

3.1.4 Định tính saponin

HCl 0,1 N và ống thứ 2 là 5 mL NaOH 0,1 N Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dịch chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây Để yên, thấy cột bọt

ở 2 ống bền vững và bằng nhau

H2SO4 loãng Đun sôi cách thủy vài phút Để nguội, chiết với cloroform Lấy khoảng 2 mL dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm Thêm từ từ 1 mL H2SO4đặc theo thành ống nghiệm, quan sát thấy giữa hai lớp xuất hiện vòng màu xanh lá

1 ống nghiệm rồi cô tới cắn Cho vào cắn 0,5 mL anhydrid acetic, lắc đều, đặt nghiêng ống 450

rồi thêm 0,5 mL acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống chia thành 2 lớp, quan sát thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng trong ống nghiệm có màu đỏ

Kết luận : dược liệu có chứa saponin, sơ bộ là nhóm triterpenoid

3.1.5 Định tính tanin

- Ph ản ứng với dung dịch gelatin 1% : lấy 1g dược liệu cho vào bình nón dung tích

50 mL Thêm nước ngập dược liệu rồi đun sôi vài phút Lọc nóng, lấy 1 mL dịch

lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, không quan sát thấy tủa bông

K ết luận : dược liệu không có tanin

- Ph ản ứng với thuốc thử diazo : cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết cồn, thêm

vào đó 2 mL dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch

K ết luận : dược liệu có coumarin

3.1.7 Định tính acid amin

giọt thuốc thử Ninhydrin 0,5%, đun sôi 2 phút, không quan sát thấy dung dịch chuyển màu tím

K ết luận : dược liệu không có acid amin

3.1.8 Định tính acid hữu cơ

- Phản ứng với Na 2 CO 3 : cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết cồn và cô tới cắn Hòa cắn trong 1 mL nước và thêm vài tinh thể Na2CO3 thấy có bọt khí nổi lên

K ết luận : dược liệu có acid hữu cơ

3.1.9 Định tính đường khử

- Phản ứng với TT Fehling : lấy 1 mL dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm, thêm 3

giọt TT Fehling A và 3 giọt TT Fehling B, đun cách thủy trong 10 phút, không quan sát thấy tủa màu đỏ

Kết luận : dược liệu không có đường khử

3.1.10 Định tính chất béo

Nhỏ vài giọt dịch chiết ether dầu hỏa trên giấy lọc, hơ khô, không quan sát

thấy vết mờ trên giấy

Kết luận : dược liệu không có chất béo

3.1.11 Định tính carotenoid

- Phản ứng với H 2 SO 4 đặc : cô 5 mL dịch chiết ether dầu hỏa tới cắn, thêm 1-2 giọt

acid sulfuric đặc, không thấy xuất hiện màu xanh ve

K ết luận : dược liệu không có carotenoid

3.1.12 Định tính phytosterol

dung môi đến khô, cho vào ống nghiệm 1 mL anhydrid acetic, lắc kỹ, thêm 1 mL

H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Kết quả cho thấy giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện

một vòng tím đỏ

Kết luận : dược liệu có phytosterol

3.1.13 Định tính tinh dầu

Nhỏ vài giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, thấy có mùi thơm

K ết luận : dược liệu có tinh dầu

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong Hương nhu tía bằng phản ứng hóa học được tóm tắt trong bảng 3.1

Bảng 3.1 : Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu

tía (Ocimum sanctum L.) bằng phản ứng hóa học

4 Saponin

Saponin triterpenoid

Phản ứng với thuốc thử diazo +

7 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 0,5% - Không

11 Carotenoid Phản ứng với H2SO4 đặc - Không

Ghi chú : (-) âm tính, (+) dương tính, (++) dương tính rõ

Nhận xét : Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy cành, lá Hương

nhu tía có chứa saponin triterpenoid, flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, phytosterol,

tinh dầu và bằng phương pháp này không thấy sự có mặt của alcaloid, tanin, anthranoid, acid amin, đường khử, chất béo và carotenoid

Như vậy, theo kết quả định tính ở trên, trong thành phần hóa học của Hương nhu tía có nhóm saponin triterpenoid Tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành định tính acid ursolic trong Hương nhu tía bằng SKLM

L.) bằng SKLM

Tiến hành chạy sắc ký cắn MeOH so sánh với acid ursolic đối chứng trên 2 hệ dung môi

Sắc ký đồ của 2 hệ dung môi ở hình 3.1

Hình 3.1 : Sắc ký đồ của cắn MeOH toàn phần với acid ursolic đối chứng trên

các hệ dung môi khai triển

(a) Hệ 1 : CHCl3 : MeOH = 9 : 1 (tt/tt)

(b) Hệ 2 : ether dầu hỏa : EtOAc = 4 : 6 (tt/tt)

Phương pháp phát hiện : soi UV ở bước sóng 254 nm, 365 nm và thuốc thử H2SO410%/EtOH, hơ nóng trên bếp điện

(1) acid ursolic đối chứng ; (2) cắn MeOH toàn phần ; (1+2) chấm chồng acid ursolic và cắn MeOH toàn phần