Trong nhiều năm gần đây, cùng với sự phát triển của nền kinh tế, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng của nước ta đã có những bước phát triển mạnh mẽ, trở thành ngành sản xuất quan trọng, chiếm tỷ trọng đáng kể trong xuất khẩu các sản phẩm chăn nuôi và góp phần xóa đói giảm nghèo. Theo Quyết định số 102008QĐTTg ngày 16012008 của Thủ tướng Chính phủ8 về Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 1, mục tiêu của định hướng là: Phát triển nhanh quy mô đàn lợn ngoại theo hướng trang trại, công nghiệp ở nơi có điều kiện về đất đai, kiểm soát dịch bệnh và môi trường; duy trì ở quy mô nhất định hình thức chăn nuôi lợn lai, lợn đặc sản phù hợp với điều kiện chăn nuôi của nông hộ và của một số vùng. Tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp đến năm 2020 đạt trên 42%, trong đó năm 2010 đạt khoảng 32% và năm 2015 đạt 38%; đảm bảo an toàn dịch bệnh và vệ sinh an toàn thực phẩm, khống chế có hiệu quả các bệnh nguy hiểm trong chăn nuôi; các cơ sở chăn nuôi, nhất là chăn nuôi theo phương thức trang trại, công nghiệp và cơ sở giết mổ, chế biến gia súc, gia cầm phải có hệ thống xử lý chất thải, bảo vệ và giảm ô nhiễm môi trường ... Tuy nhiên, song song với sự phát triển chăn nuôi thì ngành chăn nuôi lợn ở nước ta vẫn luôn phải đối mặt với những khó khăn, thách thức về chất lượng con giống, thức ăn, giá cả thị trường,… Đặc biệt là bệnh dịch vẫn thường xuyên xảy ra gây thiệt hại lớn về kinh tế. Trong đó có một số bệnh thường xuyên xảy ra không những ảnh hưởng đến mục tiêu phát triển chăn nuôi mà còn đe dọa ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli và bệnh do vi khuẩn Salmonella vẫn gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn trong toàn quốc. Bệnh do Salmonella gây ra thường ở dạng nhiễm trùng máu cấp tính hoặc viêm ruột non. Tuy nhiên, hai thể bệnh này thường ít khi xảy ra đồng thời với nhau. Vi khuẩn Salmonella và E. coli gây tiêu chảy cho lợn ở các lứa tuổi, đặc biệt ở lợn trước và sau cai sữa trong chăn nuôi trang trại quy mô lớn hay chăn nuôi nông hộ với quy mô nhỏ. Việc nghiên cứu vi khuẩn E. coli và Salmonella gây tiêu chảy ở lợn là việc làm cần thiết, để từ đó có cơ sở xây dựng biện pháp phòng bệnh đạt hiệu quả cao, góp phần thúc đẩy chăn nuôi lợn phát triển bền vững, tạo ra sản phẩm an toàn vệ sinh thực phẩm, có sức cạnh tranh cao trên thị trường. Xuất phát từ tình hình thực tiễn đáp ứng cơ sở khoa học cho việc phòng chống bệnh tiêu chảy ở lợn, chúng tối tiến hành nghiên cứu đề tài:“ Phân lập và giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Escherichia coli và Salmonella spp. tại phòng thí nghiệm của công ty CP thuốc thú y Marphavet.”
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU BHI : Brain Heart Infusion CP : Cổ phần CFU : Colony Forming Unit Cs : Cộng DHL : Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA : DeoxyriboNucleic Acid E coli : Escherichia coli EMB : Eosin Methylene Blue ETEC : EnteroToxigenic E coli LPS : LipoPolySaccharide PCR : Polymerase Chain Reaction RR : Relative Risk S choleraesuis : Salmonella choleraesuis S dublin : Salmonella dublin S enteritidis : Salmonella enteritidis S gallinarum : Salmonella gallinarum S pullorum : Salmonella pullorum S typhimurium : Salmonella typhimurium ST : Heat- stabile Toxin SS : Salmonella Shigella TSA : Tryptic Soya Agar MỤC LỤC TRANG BÌA PHỤ .i DANH MỤC BẢNG ST T Tên bảng Bảng 3.1 Kết phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm phân lợn tiêu chảy Bảng 3.2 Kết xác định số lượng vi khuẩn E coli Salmonella mẫu phân Bảng 3.3 Kết giám định số đặc tính sinh hóa mẫu E coli phân lập từ phân lợn bị tiêu chảy Bảng 3.4 Kết xác định đặc tính lên men đường chủng E coli phân lập Bảng 3.5 Kết giám định đặc tính sinh hóa mẫu Salmonella phân lập phân lợn tiêu chảy Bảng 3.6 Kết phản ứng sinh hóa với chất thị màu Andrade mồi Stn-F/R Bảng 3.9 Kết phản ứng PCR vi khuẩn Salmonella Bảng 3.10 Kết phản ứng PCR vi khuẩn E coli Trang 37 39 41 42 43 44 46 47 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong nhiều năm gần đây, với phát triển kinh tế, ngành chăn ni nói chung chăn ni lợn nói riêng nước ta có bước phát triển mạnh mẽ, trở thành ngành sản xuất quan trọng, chiếm tỷ trọng đáng kể xuất sản phẩm chăn ni góp phần xóa đói giảm nghèo Theo Quyết định số 10/2008/QĐ-TTg ngày 16/01/2008 Thủ tướng Chính phủ[8] Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 [1], mục tiêu định hướng là: Phát triển nhanh quy mô đàn lợn ngoại theo hướng trang trại, cơng nghiệp nơi có điều kiện đất đai, kiểm soát dịch bệnh mơi trường; trì quy mơ định hình thức chăn nuôi lợn lai, lợn đặc sản phù hợp với điều kiện chăn nuôi nông hộ số vùng Tỷ trọng chăn nuôi nông nghiệp đến năm 2020 đạt 42%, năm 2010 đạt khoảng 32% năm 2015 đạt 38%; đảm bảo an toàn dịch bệnh vệ sinh an toàn thực phẩm, khống chế có hiệu bệnh nguy hiểm chăn nuôi; sở chăn nuôi, chăn nuôi theo phương thức trang trại, công nghiệp sở giết mổ, chế biến gia súc, gia cầm phải có hệ thống xử lý chất thải, bảo vệ giảm ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, song song với phát triển chăn ni ngành chăn nuôi lợn nước ta phải đối mặt với khó khăn, thách thức chất lượng giống, thức ăn, giá thị trường,… Đặc biệt bệnh dịch thường xuyên xảy gây thiệt hại lớn kinh tế Trong có số bệnh thường xuyên xảy ảnh hưởng đến mục tiêu phát triển chăn ni mà đe dọa ảnh hưởng đến sức khỏe người Bệnh tiêu chảy vi khuẩn E coli bệnh vi khuẩn Salmonella gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn ni lợn tồn quốc Bệnh Salmonella gây thường dạng nhiễm trùng máu cấp tính viêm ruột non Tuy nhiên, hai thể bệnh thường xảy đồng thời với Vi khuẩn Salmonella E coli gây tiêu chảy cho lợn lứa tuổi, đặc biệt lợn trước sau cai sữa chăn nuôi trang trại quy mô lớn hay chăn nuôi nông hộ với quy mô nhỏ Việc nghiên cứu vi khuẩn E coli Salmonella gây tiêu chảy lợn việc làm cần thiết, để từ có sở xây dựng biện pháp phòng bệnh đạt hiệu cao, góp phần thúc đẩy chăn ni lợn phát triển bền vững, tạo sản phẩm an tồn vệ sinh thực phẩm, có sức cạnh tranh cao thị trường Xuất phát từ tình hình thực tiễn đáp ứng sở khoa học cho việc phòng chống bệnh tiêu chảy lợn, chúng tối tiến hành nghiên cứu đề tài:“ Phân lập giám định số đặc tính sinh hóa vi khuẩn Escherichia coli Salmonella spp phòng thí nghiệm cơng ty CP thuốc thú y Marphavet.” Mục tiêu nghiên cứu Phân lập giám định vi khuẩn E coli Salmonella spp từ mẫu bệnh phẩm phân lợn tiêu chảy Xác định đặc tính sinh học chủng vi khuẩn phân lập Xác định vai trò gây bệnh vi khuẩn E coli Salmonella spp hội chứng tiêu chảy lợn Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học Cơng trình chứng minh vai trò vi khuẩn E coli Salmonella spp hội chứng tiêu chảy Kết nghiên cứu đề tài sở khoa học phục vụ cho nghiên cứu hội chứng tiêu chảy lợn con, đồng thời đóng góp tư liệu tham khảo, nghiên cứu cho cán thú y người chăn nuôi 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chứng minh vai trò gây bệnh vi khuẩn E coli Salmonella spp hội chứng tiêu chảy lợn Điều phục vụ cho cơng tác phòng điều trị hội chứng tiêu chảy lợn CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Một số hiểu biết vi khuẩn E coli Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, nhóm Escherichiae, giống Escherichiae, lồi Escherichiacoli Trước gọi Bacterium coli commune hay Bacillus coli communis, lần phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 đặt theo tên người bác sỹ nhi khoa Đức Theobald Escherich (1857 - 1911) ( Nguyễn Vĩnh Phước, 1974 [7] Nguyễn Như Thanh cs., 1997 [12]; Lê Văn Tạo, 1997[9] ) Đây vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thường trực ruột, chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí Hầu hết E coli không gây bệnh, số chủng E coli có khả gây bệnh cho gia súc có tiêu chảy Trong điều kiện bình thường, E coli khu trú thường xuyên phần sau ruột, có dày hay đoạn đầu ruột non động vật Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh số lượng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đường tiêu hoá trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Bá Hiên, 2012) [4] 1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn E coli 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn E coli trực khuẩn hình gậy ngắn, có kích thước - 3àm ì 0,3 0,6àm; mụi trng nuụi cy, canh khuẩn già, xuất trực khuẩn dài – µm Trong thể người động vật, vi khuẩn thường có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, xếp thành chuỗi ngắn Phần lớn vi khuẩn E coli có khả di động có lơng xung quanh thân, khơng sinh nha bào, có giáp mơ Vi khuẩn bắt màu gram âm, bắt màu sẫm hai đầu, khoảng nhạt Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy để nhuộm, thấy giáp mơ, soi tươi thường khơng nhìn thấy 1.1.1.2 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn E coli chia làm serotype khác dựa vào cấu trúc kháng nguyên thân O, giáp mô K, lông H kháng nguyên bám dính F Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn E coli gây bệnh gia súc đa dạng phức tạp với nhóm kháng ngun kháng ngun O (kháng nguyên thân), H (kháng nguyên lông), K (kháng nguyên giáp mơ), F (kháng ngun bám dính) (Gyles C.L., Fairbrother J.M., 2010) [22] Bằng phản ứng ngưng kết, nhà khoa học tìm 250 serotype O, 89 serotype K, 56 serotype H số serotype F Khi xác định serotype đầy đủ chủng vi khuẩn E coli phải xác định đủ loại kháng nguyên nói Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Ohne Hauch) coi yếu tố độc lực tìm thấy thành tế bào có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch Kháng nguyên O gặp kháng huyết tương ứng xảy phản ứng ngưng kết Ngưng kết kháng nguyên O tạo thành hạt nhỏ, khó tan Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch) thành phần lơng vi khuẩn, có chất protein, bền vững so với kháng nguyên O Kháng nguyên H yếu tố độc lực vi khuẩn, có khả tạo miễn dịch mạnh Phản ứng miễn dịch xảy nhanh so với kháng nguyên O Kháng nguyên H vi khuẩn E coli khơng có vai trò bám dính, khơng có tính độc khơng có ý nghĩa đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên quan tâm nghiên cứu,nhưng có ý nghĩa lớn xác định giống loài vi khuẩn (Orskov F 1978) [29] Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ bọc Capsular), gọi kháng nguyên bề mặt (OMP - Outer membrane protein) kháng nguyên vỏ bọc (Capsular) Vai trò kháng nguyên K chưa thống Có nhiều ý kiến cho rằng, khơng có ý nghĩa độc lực vi khuẩn, thấy độc lực chủng E coli có kháng nguyên K giống độc lực chủng khơng có kháng ngun K (Orskov F 1978)[29] Tuy nhiên, có ý kiến khác cho rằng, có ý nghĩa độc lực tham gia bảo vệ vi khuẩn trước yếu tố phòng vệ vật chủ Tuy vậy, phần lớn ý kiến thống kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau: hỗ trợ phản ứng ngưng kết kháng nguyên O, nên thường ghi liền công thức serotype vi khuẩn Ox: Ví dụ như: E coli O139: K88, O149: K88 Tạo hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh tượng thực bào, yếu tố phòng vệ vật chủ Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae- Kháng nguyên bám dính): Hầu hết chủng E coli gây bệnh sản sinh nhiều kháng nguyên bám dính Các chủng khơng gây bệnh khơng có kháng nguyênbám dính Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào thụ thể đặc hiệu bề mặt tế bào biểu mô ruột lớp màng nhày để xâm nhập gây bệnh, đồng thời chống lại khả đào thải vi khuẩn nhu động ruột Một số loại kháng nguyên bám dính vi khuẩn E coli thuộc nhóm ETEC (Enterotoxigenic E coli) gây bệnh chủ yếu cho lợn F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F18 F41 (Carter G.R cs., 1995) [15] 1.1.2 Đặc tính ni cấy,sinh hóa vi khuẩn E coli 1.1.2.1 Đặc tính ni cấy Theo Nguyễn Như Thanh cs., (19970 [12], Nguyễn Quang Tuyên (2008) [10] vi khuẩn E coli trực khuẩn hiếu khí yếm khí tùy tiện, sinh trưởng phổ nhiệt độ rộng (từ 5- 40 0C), nhiệt độ thích hợp 370C phổ pH rộng (pH từ 5,5 - 8,0), pH thích hợp từ 7,2-7,4 Khi nuôi cấy môi trường, để tủ ấm 37 0C sau 24 vi khuẩn phát triển sau: + Mơi trường thạch thường: Hình thành khuẩn lạc tròn, ướt, bóng láng khơng suốt, màu tro trắng nhạt, lồi, đường kính từ - 3mm Ni lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt mọc rộng ra, quan sát thấy khuẩn lạc dạng R (Rough) M (Mucous) + Môi trường nước thịt: Phát triển tốt, môi trường đục có lắng cặn màu tro nhạt đáy, đơi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối + Mơi trường MacConkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, lồi, khơng trầy, rìa gọn, khơng làm chuyển màu mơi trường + Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền khơng gọn, màu xám nhạt, số chủng có khả gây tượng tan máu + Môi trường Simmon citrat: Khuẩn lạc không màu xanh lục + Môi trường Endo: Khuẩn lạc màu đỏ + Mơi trường EMB: Khuẩn lạc màu tím đen + Mơi trường SS: Khuẩn lạc có màu đỏ 1.1.2.2 Đặc tính sinh hóa Theo Nguyễn Quang Tun (2008)[10] phản ứng lên men đường: Vi khuẩn E coli lên men sinh loại đường Lactose, Fructose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose, Manitol; lên men không chắn loại đường Duncitol, Saccarose Salixin Hầu hết chủng vi khuẩn E.coli lên men đường Lactose nhanh sinh hơi, đặc điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E.coli Salmonella Salmonella khơng lên men đường Lactose Một số phản ứng sinh hoá khác: Phản ứng Indol MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Citrat âm tính 1.1.3 Đặc tính gây bệnh vi khuẩn E coli 1.1.3.1 Cơ chế gây bệnh vi khuẩn E coli Theo Đào Trọng Đạt cs., (1996) [3] để gây bệnh, vi khuẩn E coli phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột yếu tố bám dính kháng nguyên F Sau đó, nhờ yếu tố xâm nhập (Invasion), vi khuẩn xâm nhập vào tế bào biểu mô thành ruột Ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên phá huỷ lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột, đồng thời sản sinh độc tố đường ruột Enterotoxin Độc tố đường ruột tác động vào trình trao đổi muối, nước, làm rối loạn chu trình Nước từ thể tập trung vào lòng ruột làm căng ruột, với khí lên men ruột gây nên tác dụng học, làm nhu động ruột tăng, đẩy nước chất chứa ngoài, gây nên tượng tiêu chảy Sau phát triển thành ruột, vi khuẩn vào hệ lâm ba, đến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu Trong máu, vi khuẩn chống lại tượng thực bào, gây dung huyết, làm cho thể thiếu máu Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn đến tổ chức quan Ở đây, vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá huỷ tế bào tổ chức, gây viêm sản sinh độc tố gồm Enterotoxin Verotoxin, phá huỷ tế bào tổ chức, gây tụ huyết xuất huyết 10 Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu số tác giả khác, Trương Quang (2005), kiểm tra số lượng vi khuẩn E coli/1g phân 314 mẫu phân lợn không bị tiêu chảy 312 mẫu lợn bị tiêu chảy Nguyễn Thị Oanh (2003), lợn nuôi Đắc Lắc nhiễm Salmonella với tỷ lệ 17,2%, tỷ lệ nhiễm Salmonella lợn khỏe 11,2% lợn bị tiêu chảy tỷ lệ nhiễm 23,68% Từ dẫn liệu khoa học trên, kết hợp với kết nghiên cứu này, cho thấy có khác số lượng vi khuẩn E coli Salmonella gam chất chứa Ở lợn khỏe mạnh, số lượng vi khuẩn đường ruột luôn cân động, lợn bị stress làm giảm sức đề kháng thể, số loại vi khuẩn có hội phát triển tăng nhanh số lượng làm tính cân động gây hội chứng tiêu chảy Trong thí nghiệm này, thấy vi khuẩn E coli có tăng đột biến lớn số lượng lợn mắc tiêu chảy, trình phát triển, vi khuẩn E coli sản sinh chất kháng khuẩn ColV ức chế phát triển loại vi khuẩn đường ruột khác, để chiếm vị trí độc tơn hệ vi khuẩn đường ruột Vấn đề phần lý giải cho tượng tỷ lệ phân lập loại vi khuẩn khác như: Salmonella, Clostridium số vi khuẩn đường ruột khác thấp mẫu kiểm tra 3.3 Kết giám định đặc tính sinh hóa vi khuẩn E coli Mỗi loại vi khuẩn có số đặc tính sinh học riêng như: tính chất mọc vi khuẩn mơi trường ni cấy thơng thường đặc hiệu, đặc tính chuyển hóa loại đường khả sinh sản hợp chất sinh học trung gian môi trường nuôi cấy Dựa ngun lý chúng tơi chọn khuẩn lạc điển hình nghi E coli để tiến hành giám định số đặc tính sinh hóa học Kết trình bày bảng 3.3: Bảng 3.3 Kết giám định số đặc tính sinh hóa mẫu E coli phân lập từ phân lợn bị tiêu chảy STT Loại phản Số chủng dương tính/tổng số 44 Tỷ lệ (%) ứng Indol MR VP Citrat H2S Kết bảng 3.3 cho thấy: chủng kiểm tra 28/28 28/28 0/28 0/28 0/28 100 100 0 100% chủng kiểm tra cho phản ứng sinh Indol MR dương tính Còn phản ứng VP, Citrat, H2S âm tính So sánh kết giám định đặc tính sinh hóa 28 chủng vi khuẩn E coli phân lập với bảng sinh hóa chuẩn vi khuẩn thấy chủng vi khuẩn phân lập từ phân lợn tiêu chảy có đặc điểm chung, điển hình vi khuẩn E coli tài liệu ngồi nước mơ tả 45 Bảng 3.4 Kết xác định đặc tính lên men đường chủng E coli phân lập STT Tên đường Sucrose Mantose Manitol Salicin Lactose Inulin Glucose VK sinh axit + ++ ++ ++ + + VK sinh + ++ ++ ++ + + Galactose + + Arabinose - - 10 Sorbitol ++ ++ 11 Xylose + + Ghi chú: ++ (mạnh), + (ít), - (không) Từ kết bảng 3.4 cho thấy: chủng vi khuẩn E coli lên men sinh sinh axit mạnh loại đường Mantose, Manitol,Sorbitol, Lactose loại đường Sucrose, Inulin, Glucose, Galactose Xylose Riêng với đường Salicin Arabinose chủng thử không lên men 3.5 Kết giám định đặc tính sinh hóa vi khuẩn Salmonella Trong mẫu kiểm tra có 20 mẫu dương tính với Salmonella Để giám định đặc tính sinh hóa mẫu phân lập này, tiến hành làm phản ứng sinh hóa, kết trình bày bảng 3.5 46 Bảng 3.5 Kết giám định đặc tính sinh hóa mẫu Salmonella phân lập phân lợn tiêu chảy ST Loại phản T ứng Indol MR VP Citrat H2S Từ kết bảng 3.5 cho thấy: Số chủng dương tính/tổng số chủng kiểm tra 0/20 20/20 0/20 20/20 20/20 Tỷ lệ (%) 100 100 100 100% mẫu Salmonella kiểm tra cho phản ứng dương tính MR, Citrat, H2S, phản ứng Indol VP cho kết âm tính So sánh kết giám định đặc tính sinh hóa 20 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập với bảng sinh hóa chuẩn vi khuẩn thấy chủng vi khuẩn phân lập từ phân lợn tiêu chảy có đặc điểm chung, điển hình vi khuẩn Salmonella tài liệu ngồi nước mơ tả 3.6 Kết phản ứng sinh hóa với chất thị màu Andrade Kết phản ứng sinh hóalàm từ khuẩn lạc nghi Salmonella thạch DHL nuôi cấy môi trường TPB Làm 11 loại đường 47 Bảng 3.6 Kết phản ứng sinh hóa với chất thị màu Andrade Thứ tự Tên loại đường VK sinh axit VK sinh Trehalose Mantol Cellobinose Rhamnose Sucrose Lactose Manitol Sobitol ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ Glucose ++ + 10 Arabinose + - 11 Salicin Ghi chú: ++ (mạnh), + (ít), - (khơng) Từ kết bảng 3.6 cho thấy: chủng vi khuẩn Salmonella lên men sinh axit loại đường Trehalose, Maltol, Malnitol, Sobitol nhiều so với Sucrose, Glucose Đối với Arabinose vi khuẩn Salmonella sinh axit ko sinh Riêng với đường Cellobinose, Lactose Salicin chủng thử không lên men 3.7 Kết phản ứng thử oxydaza Hình 1: Hình ảnh thử phản ứng oxydaza khuẩn lạc Salmonella 48 Nhìn vào hình ảnh thấy miếng giấy khơng bị khơng bị chuyển màu, ta kết luận phản ứng Oxydaza vi khuẩn nghi Salmonella cho kết âm tính 3.8 Kết phản ứng thử Catalaza Hình 2: Hình ảnh thử phản ứng Catalaza khuẩn lạc Salmonella Nhìn vào hình ảnh thấy phiến kính mẫu khuẩn lạc Salmonella có tượng sủi bọt nhỏ H2O2 vào Vậy ta kết luận phản ứng thử Catalaza khuẩn lạc Salmonella dương tính 3.9 Kết phản ứng PCR vi khuẩn Salmonella M N 300 bp Hình 3: Sản phẩm PCR Gene độc tố vi khuẩn Salmonella sử dụng cặp mồi Stn-F/R 49 Ghi chú: Giếng M: 100 bp DNA ladder (1 µl 6X loading dye-NEB +5 µl DNA ladder) Giếng 1: Sảnphẩm PCR từ DNA mẫu với cặp mồi Stn-F/R (1 µl 6X loading dye-NEB +5 µl mẫu) Giếng 2: Sảnphẩm PCR từ DNA mẫu với cặp mồi Stn-F/R (1 µl 6X loading dye-NEB +5 µl mẫu) Giếng N: Đối chứng âm cặp mồi Stn-F/R Bảng 3.9 Kết phản ứng PCR vi khuẩn Salmonella Tổng hợp kết PCR Mồi Kết Stn-F/R + Stn-F/R + Stn-F/R - Mẫu Đối chứng âm Từ kết bảng 3.9 ta kết luận: mẫu dương tính với gene đích sử dụng cặp mồi Stn-F/R Từ hình thấy: kích thước sản phẩm PCR mồi Stn-F/R tương ứng 259bp 3.10 Kết phản ứng PCR vi khuẩn E coli 1 2 M 10 M 10 Hình 4: 500bp Sản phẩm PCR từ DNA tách chiết khuẩn lạc vi khuẩn E coli sử dụng cặp mồi Fed A – 1/Fed A – Chú ý: 50 M 10 Giếng M: 100 bp DNA ladder (NEB) Giếng đến 5: Sản phẩm PCR từ DNA dịch chiết mẫu 1, 2, 3, 4, tương ứng Giếng đến 10: Sản phẩm PCR từ khuẩn lạccác mẫu 6,7,8,9,10 tương ứng Bảng 3.10 Kết phản ứng PCR vi khuẩn E coli Mẫu 10 Tổng hợp kết PCR Mồi Fed A – 1/2 Fed A – 1/2 Fed A – 1/2 Fed A – 1/2 Fed A – 1/2 Fed A – 1/2 Fed A – 1/2 Fed A – 1/2 Fed A – 1/2 Fed A – 1/2 Kết + + + + + + + + + + Từ kết bảng 3.10 ta kết luận 10 mẫu dương tính với gen tộc tố F18 vi khuẩn E coli Từ hình ta thấy kích thước sản phẩm PCR tương ứng 510bp CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu phân lập, xác định số lượng vi khuẩn E coli, Salmonella gây hội chứng tiêu chảy lợn nuôi khu chăn nuôi cty cổ phần thuốc thú y Marphavet, rút số kết luận sau: 51 Kết phân lập, xác định số lượng giám định số đặc tính sinh hóa vi khuẩn E coli phân lợn tiêu chảy: + Vi khuẩn E coli diện hầu hết mẫu (28/40) chiếm tỷ lệ trung bình 70% + Số lượng vi khuẩn E.coli 1g phân lợn mắc tiêu chảy tăng lên cao, cao gấp 20,59 lần so với lợn không mắc bệnh + Các chủng vi khuẩn E.coli đặc tính sinh hóa điển hình theo bảng sinh hóa chuẩn E coli + Kích thước sản phẩm PCR mồi Stn – F/R tương ứng 510bp Kết phân lập, xác định số lượng giám định số đặc tính sinh hóa vi khuẩn Salmonella phân lợn tiêu chảy: + Vi khuẩn Salmonella sp phân lập với tỷ lệ thấp nhiều, có 20/40 mẫu, chiếm tỷ lệ trung bình 50% + Vi khuẩn Salmonella sp gam chất chứa đường ruột lợn bị tiêu chảy cao 5,35 × 10 vi khuẩn lợn khỏe mạnh cao có 0,18 × 106 vi khuẩn (cao gấp 29,72 lần) + Các chủng vi khuẩn Salmonella đặc tính sinh hóa điển hình theo bảng sinh hóa chuẩn Salmonella + Kích thước sản phẩm PCR cặp mồi Fed A – 1/2 tương ứng 259bp 4.2 Đề nghị Tiếp tục tiến hành nghiên cứu đầy đủ yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn E coli Salmonella phân lập được, vai trò số vi khuẩn khác gây hội chứng tiêu chảy, nhằm lựa chọn chủng vi khuẩn phù hợp để chế tạo vaccine phòng bệnh Để chăn ni lợn có hiệu hạn chế dịch bệnh, xây dựng trại chăn nuôi đảm bảo yêu cầu kỹ thuật vệ sinh an toàn dịch bệnh 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt 1.Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2008 Trương Văn Dung, Yoshihara shinobu (2002), Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn bệnh gia súc Việt Nam, Viện Thú y Quốc gia Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ, Huỳnh Văn Kháng(1996) Bệnh lợn nái lợn con, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lăng, Đỗ Ngọc Thúy (2012) “Bệnh truyền nhiễm thú y”, NXB Đại học Nông nghiệp Hà nội Phạm Sỹ Lăng, Phan Địch Lân, Trương Văn Dung (1997), Bệnh phổ biến lợn biện pháp phòng trị, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Nguyễn Khả Ngự (2000), Xác định yếu tố gây bệnh vi khuẩn E coli bệnh phù đầu lợn đơng sơng Cửu Long, chế vacxin phòng bệnh, Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Thú y, Hà Nội Nguyễn Vĩnh Phước (1974), Vi sinh vật Thú y, tập NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Quyết định số 10/2008/QĐ – TTg ngày 16/01/2008 chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 Lê Văn Tạo (1997), Bệnh Escherichia coli gây Những thành tựu nghiên cứu phòng chống bệnh vật ni, tài liệu giảng dạy sau đại học cho bác sĩ thú y kỹ sư chăn nuôi, Viện thú y quốc gia, Hà Nội 10 Nguyễn Quang Tuyên (2008), Giáo trình vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp 11 Trịnh Quang Tuyên(2004), “Phân lập xác định yếu tố gây bệnh vi khuẩn E coli từ lợn bị tiêu chảy ni trại lợn Tam Điệp”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y (số 4) 12 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (1997), Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 53 13 Trung tâm Chẩn đoán cố vấn thú y Công ty cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam (2010), Bệnh heo cách điều trị, tập 2, NXB Khoa học kỹ thuật, Hồ Chí Minh II Tài liệu tiếng Anh 14 Bergey’s (1994), Manual of determinative Bacteriology, 9th Edition, by the Williams and Wilkings Company 15 Carter G.R., Chengapa M.M., Rober T.S (1995) Essentials of veterinary Microbiology.A warerly Company, 1995 16 Dean E.A., Whipp S.C & Moon H.W (1989).Age specific colonization of porcine intestinal epithelium by 987P-piliated enterotoxigenic Escherichia coli Infection and Immunity, pp 57 17 Dean Nystrom E.A & Samuel, J.E (1994) Age-related resistance to 987P fimbria-mediated colonization correlates with specific glycolipid receptors in intestinal mucus in swine Infection and Immunity, pp 62 18 Ewing Edward (1970), Indentification of Enterobacteriaceae.Edicion Revolucionnaria, Instituto Cubano del Libro, 19 No 1002, Vedado Habana 19 Fairbrother J.M (1992).Enteric colibacillosis Diseases of swine.IOWA State University Press/AMES, IOWA U.S.A 7th Edition, 1992 20 Giannella R.A (1976) Suckling mouse model for detection of heat-stable Escherichia coli enterotoxin: characteristics of the model.Infection and Immunity, pp.14 21 Guinee P.A & Jansen W H (1979) Behavior of Escherichia coli K antigens K88ab, K88ac, and K88ad in immunoelectrophoresis, double diffusion, and haemagglutination Infection and Immunity, pp.23 22 Gyles C.L., Fairbrother J.M (2010).Escherichia coli In: Pathogenesis of bacterial infections in animal (4th edition) Editor: Gyles, C.L., Prescott, J.F., Songer, J.G., and Thoen, C.O., Blackwell publishing, USA 23 Isaacson R.E., Nagy B & Moo, H.W (1977) Colonization of porcine small intestine by Escherichia coli: Colonization and adhesion factors of pig enteropathogens that lack K88 Journal of Infectious Diseases, pp.135 54 24 Jones J.W., Richardson A.L (1981), “The attachment to invasion of helacells by Salmonella typhimurium the contribution of manose sensitive and manose sensitive haemaglutinate activities” J Gen Microbiol, pp 127 25 Ketyle I Emodyl, Kentrohrt (1975), Mouse lang Oedema caused by a toxin substance of Escherichia coli strains Acta Microbiol, A cad-Sci Hung-25 26 Links I., Love R & Greenwood P (1985), Colibacillosis in newborn piglets associated with class enterotoxigenic Escherichia coli In Infectious diarrhoea of the young: strategies for control in humans and animals, pp 281-287 Edited by S Tzipori Geelong, Australia: Elsevier Science Publishers 27 Nagy B & Fekete P.Z (1999),Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals Veterinary Research, pp.30 28 Orskov I., Orskov F., Sojka W.J., Wittig W (1964) K antigens K88ab (L) and K88ac (L) in E coli A new O antigen: O147 and a new K antigen K89 (B) Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica sect, pp 62 29.Orskov F.(1978) Vilurence Factor of the bacterial cell surface.J.Infect 30 Quinn P.J., Carter M.E., Makey B., Carter G.R (2002), Clinical veterinary microbiology Wolfe Pulishing, London WC1 H9LB, England 31 Rippinger P., Bertschinger H.U., Imberechts H., Nagy B., Sorg I., Stamm M., Wild P & Wittig W (1995) Designations F18ab and F18ac for the related fimbrial types F107, 2134P and 8813 of Escherichia coli isolated from porcine postweaning diarrhoea and from oedema disease Veterinary Microbiology , pp.45 32 Smith H.W & Halls S (1967), Observations by the ligated segment and oral inoculation methods on Escherichia coli infections in pigs, calves, lambs and rabbits Journal of Pathology and Bacteriology, pp 93 33 Timoney J.F., Gillespie J.H., Baelough J.E., Hagan and Bruner ’s (1988), “Microbiology and infection disease of domentic animals”, Inthca and London Comstock Publising Associates, A Division of cornell University press 34 Wilcock B.P (1995), “Salmonellosis” Disease of Swine, Sixth Edition, Iowa state University Press, U.S.A 55 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA Hình 5: Lợn bị tiêu chảy Hình 6: Mổ khám bệnh tích Hình 7: Kiểm tra bệnh tích Hình 8: Kiểm tra bệnh tích Hình - 10: Ria cấy vi khuẩn mặt thạch Hình 11: Khuẩn lạc Salmonella cấy thạch MacConkey từ máu tim Hình 12: Khuẩn lạc Salmonellacấy thạch MacConkey từ lách Hình 13 – 14: Thử phản ứng sinh hóa Hình 15: Máy chạy PCR Hình 16: Máy chạy điện di ... bệnh tiêu ch y lợn, chúng tối tiến hành nghiên cứu đề tài:“ Phân lập giám định số đặc tính sinh hóa vi khuẩn Escherichia coli Salmonella spp phòng thí nghiệm cơng ty CP thuốc thú y Marphavet. ”... cứu Phân lập, xác định số lượng vi khuẩn E coli Salmonella spp từ phân lợn khỏe phân lợn tiêu ch y khu chăn nuôi công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet Kiểm tra số đặc tính ni c y vi khuẩn E coli. .. nghiên cứu Phân lập giám định vi khuẩn E coli Salmonella spp từ mẫu bệnh phẩm phân lợn tiêu ch y Xác định đặc tính sinh học chủng vi khuẩn phân lập Xác định vai trò g y bệnh vi khuẩn E coli Salmonella