Trong những năm qua, chăn nuôi lợn ở nước ta có sự phát triển mạnh mẽ theo hướng chăn nuôi công nghiệp tập trung, đóng góp lớn cho sự phát triển kinh tế xã hội ở các địa phương. Tuy nhiên xu hướng lại không theo tính quy hoạchdẫn đếntình trạng giá heo giảm do đầu ra không đảm bảo.Theo Bộ NNPTNT sau nhiều tháng chạm đáy, giá lợn hơi những tháng cuối năm đang có dấu hiệu tăng trở lại nhưng vẫn không đủ để người chăn nuôi có lãi. Tình trạng giá thấp kéo dài, khó khăn trong khâu tiêu thụ khiến người chăn nuôi lợn giảm đàn, bỏ đàn, treo chuồng. Theo kết quả điều tra chăn nuôi kỳ 01102017, đàn lợn cả nước có 27,4 triệu con; giảm 5,7%; sản lượng thịt lợn hơi xuất chuồng đạt 3,7 triệu tấn; tăng 1,9%.Không những gặp nhiều rủi ro về giá cả, thị trường, chăn nuôi lợn còn gặp vấn đề khó khăn và nan giải đó là các loại dịch bệnh luôn tiềm ẩn, ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả sản xuất. Trong các bệnh thường gặp và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn hiện nay ngoài các bệnh truyền nhiễm thường gặp thì bệnh viêm phổi đóng một vai trò quan trọng trong việc gây tổn thất lớn cho chăn nuôi lợn ở nước ta. Bệnh viêm phổi do vi khuẩn là một trong những nguyên nhân chính gây chết nhiều lợn tại các địa phương hiện nay, với nhiều căn nguyên gây bệnh và bệnh lại rất đa dạng, triệu chứng bệnh khác nhau. Đặc biệt là bệnh viêm phổi viêm phổi màng phổi, do Actinobaccilus pleuropneumonie gây tổn thất nghiêm trọng cho người chăn nuôi. Vi khuẩn A.pleuropneumoniae gây ra dưới thể viêm phổi đã gây chết rất nhiều lợn ở các lứa tuổi, đặc biệt quan trọng là lợn mắc bệnh viêm phổi màng phổi bị chết. Ngoài vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 2 và 5 thường gặp gây ra chiếm tỷ lệ cao thì có thể còn do các serovar khác như 1, 7, 9... gây ra. Do đó rất cần được quan tâm nghiên cứu để có biện pháp làm giảm thiệt hại do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra. Nếu không có biện pháp ngăn ngừa thì khả năng lây lan rất cao gây thiệt hại lớn cho đàn lợn nuôi. Vì vậy, việc nghiên cứu phân lập và xác định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn là rất cần thiết từ đó biết được vai trò gây ra một số đặc điểm triệu chứng lâm sàng của lợn mắc bệnh viêm phổi viêm phổi màng phổi. Kết quả này có thể sử dụng để tiếp tục những nghiên cứu sâu hơn nhằm chẩn đoán nhanh bệnh, biện pháp phòng và trị do vi khuẩn A.pleuropneumoniae gây ra. Để có cơ sở xây dựng biện pháp phòng bệnh đạt hiệu quả cao, góp phần xác định đúng pháp đồ điều trị, giảm thời gian điều trị và nâng cao hiệu quả điều trị, thúc đẩy chăn nuôi gia súc nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng phát triển bền vững, tạo ra sản phẩm an toàn vệ sinh thực phẩm, có sức cạnh tranh cao trên thị trường, chúng tôi tiến hành đề tài: Ngiên cứu phân lập và giám định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Actinobaccilus pleuropneumoniae gây viêm phổi lợn tại Thái Nguyên”
1 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU A pleuropneumoniae: Actinobacillus pleuropneumoniae AGID: Agargel Immuno Diffuse AGPT: Agar Gel Precipitin Test bronchiseptica: Bordetella bronchiseptica BHI: Brain Heart Infusion CAMP: Christie - Atkinson - Munch - Peterson Es: Công D.S.A: Dextrose Starch Agar DNA: Deoxyribo Nucleic Acid ELISA: Enzyme - Linked Immuno Sorbant Assay Fg : Greenish Fluorescent F0: parasuis: Orange Fluorescent Haemophilus parasuis pleuropneumoniae : Haemophilus pleuropneumoniae M hyopneumoniae: Mycoplasma hyopneumoniae MR: Methyl red MT: Môi trường NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide PBS: Phosphat buffer solution Nf: Not Fluorescent P multocida: Pasteurella multocida PCR: Polymerase Chain Reaction PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome TSA: Tryptic Soy Agar VK: Vi khuẩn VP: Voges - Proskauer VPDS: YPC: Viêm phổi dính sườn Yaest extract pepton, L.cystine DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH Chương MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Trong năm qua, chăn ni lợn nước ta có phát triển mạnh mẽ theo hướng chăn nuôi công nghiệp tập trung, đóng góp lớn cho phát triển kinh tế xã hội địa phương Tuy nhiên xu hướng lại khơng theo tính quy hoạchdẫn đếntình trạng giá heo giảm đầu không đảm bảo.Theo Bộ NN&PTNT sau nhiều tháng chạm đáy, giá lợn tháng cuối năm có dấu hiệu tăng trở lại khơng đủ để người chăn ni có lãi Tình trạng giá thấp kéo dài, khó khăn khâu tiêu thụ khiến người chăn nuôi lợn giảm đàn, bỏ đàn, treo chuồng Theo kết điều tra chăn nuôi kỳ 01/10/2017, đàn lợn nước có 27,4 triệu con; giảm 5,7%; sản lượng thịt lợn xuất chuồng đạt 3,7 triệu tấn; tăng 1,9%.Không gặp nhiều rủi ro giá cả, thị trường, chăn ni lợn gặp vấn đề khó khăn nan giải loại dịch bệnh tiềm ẩn, ảnh hưởng nhiều tới hiệu sản xuất Trong bệnh thường gặp gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn ngồi bệnh truyền nhiễm thường gặp bệnh viêm phổi đóng vai trò quan trọng việc gây tổn thất lớn cho chăn nuôi lợn nước ta Bệnh viêm phổi vi khuẩn nguyên nhân gây chết nhiều lợn địa phương nay, với nhiều nguyên gây bệnh bệnh lại đa dạng, triệu chứng bệnh khác Đặc biệt bệnh viêm phổi- viêm phổi màng phổi, Actinobaccilus pleuropneumonie gây tổn thất nghiêm trọng cho người chăn nuôi Vi khuẩn A.pleuropneumoniae gây thể viêm phổi gây chết nhiều lợn lứa tuổi, đặc biệt quan trọng lợn mắc bệnh viêm phổi màng phổi bị chết Ngoài vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serovar thường gặp gây chiếm tỷ lệ cao serovar khác 1, 7, gây Do cần quan tâm nghiên cứu để có biện pháp làm giảm thiệt hại vi khuẩn A pleuropneumoniae gây Nếu khơng có biện pháp ngăn ngừa khả lây lan cao gây thiệt hại lớn cho đàn lợn ni Vì vậy, việc nghiên cứu phân lập xác định số đặc điểm sinh hóa vi khuẩn cần thiết từ biết vai trò gây số đặc điểm triệu chứng lâm sàng lợn mắc bệnh viêm phổi- viêm phổi màng phổi Kết sử dụng để tiếp tục nghiên cứu sâu nhằm chẩn đốn nhanh bệnh, biện pháp phòng trị vi khuẩn A.pleuropneumoniae gây Để có sở xây dựng biện pháp phòng bệnh đạt hiệu cao, góp phần xác định pháp đồ điều trị, giảm thời gian điều trị nâng cao hiệu điều trị, thúc đẩy chăn ni gia súc nói chung chăn ni lợn nói riêng phát triển bền vững, tạo sản phẩm an tồn vệ sinh thực phẩm, có sức cạnh tranh cao thị trường, tiến hành đề tài: "Ngiên cứu phân lập giám định số đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Actinobaccilus pleuropneumoniae gây viêm phổi lợn Thái Nguyên” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu: - Phânlập, xác địnhđặc điểm nuôi cấy, đặc tính sinh hóa A.pleuropneumoniaegây bệnh viêm phổi lợn Thái Nguyên - Xác định triệu chứng, bệnh tích lợn bị bệnh viêm phổi dính sườn vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây - Xác định độ mẫn cảm vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae với kháng sinh - Đưa phác đồ điều trị nhanh đạt hiệu bệnh viêm phổi dính sườn 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu * Đối tượngnghiên cứu: - Lợn lứa tuổi nghi mắc bệnh viêm phổi vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây địa bàn tỉnh Thái Nguyên - Vi khuẩn gây viêm phổi lợn: Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae * Phạm vi nghiên cứu: - Một số địa điểm địa bàn tỉnh Thái Ngun phòng thí nghiệm cơng ty Marphavet 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn * Ý nghĩa khoa học - Phân lập,xác định vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniaegây bệnh viêm phổi lợn Thái Nguyên - Kết nghiên cứu đề tài sở khoa học phục vụ cho nghiên cứu bệnh viêm phổi- màng phổi lợn * Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài đánh giá vai trò vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae hội chứng PRRS Điều phục vụ cho cơng tác phòng điều trị bệnh viêm phổi- màng phổi lợn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm vi khuẩn A.pleuropneumonia 2.1.1 Hình thái, kích thước đặc tính ni cấy Vi khuẩnActinobacillus pleuropneumoniaethuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trước có tên Haemophilus parahaemolyticushay Haemophilus pleuropneumoniae xác định nguyên nhân gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm lợn A pleuropneumoniae vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, bắt màu gram âm, kích thước khoảng0,3-0,5 x 0,6-1,4 µm Vi khuẩn khơng di động, khơng sinh nha bào, có khả hình thành giáp mơ, nhiên số chủng khơng có giáp mơ quan sát thấy Dưới kính hiển vi điện tử phát vi khuẩn có nhung mao với kích thước 0,5-2 x 60-450 nm Loại có vỏ (capsule) polysaccharide tìm thấy hầu hết serotype vi khuẩn A pleuropneumoniae,còn loại khơng có vỏ tìm thấy A.pleuropneumoniae loại vi khuẩn khó phân lập môi trường thông thường thường phụ thuộc vào yếu tố V (hay NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide) Dovậy, nuôi cấy A.pleuropneumoniae cần môi trường giàu dinh dưỡng Trên môi trường thạch máu vi khuẩn không phát triển môi trường thạch máu thông thường mà mọc thạch máu bổ sung NAD có cấy kèm vi khuẩn S aureus Sau 24 nuôi cấy, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc mọc xung quanh đường cấy S aureusvới kích thước 0,5-1 mm hình thành vùng dung huyết β Vùng dung huyết thường quan sát rõ mơi trường thạch có bổ sung 5-7% máu cừu Ngồi ra, vi khuẩn A pleuropneumoniae gây vùng dung huyết tăng cường vùng dung huyết bán phần, xung quanh đường cấy S aureuscó độc tố dung huyết β gọi tượng CAMP (Kilian, 1976) [26] Hiện tượng CAMP liên quan tới có mặt loại độc tố A pleuropneumoniae bao gồm ApxI, ApxII ApxIII Trên môi trường TSA: Trong thành phần môi trường bổ sung Yeast Extract (YE) huyết ngựa Sau 24 - 48 nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng trong, ánh sáng đèn điện có màu xám xanh Trên môi trường thạch chocolate: Sau 24 nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhầy, màu trắng xám Vi khuẩn A pleuropneumoniae thuộc biotype phân biệt với H parasuis khả gây dung huyết thạch máu có S aureus cấy kèm (Kilian M., 1976) [26] 2.1.2 Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn A.pleuropneumoniae lên men đường glucose, xylose, mannitol, mannose không lên men đường arabinose, lactose, raffinose, sorbitol Dương tính với phản ứng urease, oxidase, CAMP, O.N.P.G, âm tính với phản ứng sinh Indol khơng mọc thạch MacConkey (Trịnh Quang Hiệp cs, 2004 [5]; Cù Hữu Phú cs, 2005 [6]; Đặng Xuân Bình cs, 2007 [2]; Nguyễn Thị Thu Hằng, 2010 [4]) 2.1.3.Cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn A pleuropneumoniae từ lâu nhiều nghiên cứu xác định nguyên nhân gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi lợn chia thành biotype dựa nhu cầu cần sử dụng NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) hay gọi yếu tố V cho q trình sinh trưởng vi khuẩn Biotype cần có NAD, biotype khơng đòi hỏi NAD q trình ni cấy, song cần có pyridine nucleotid đặc hiệu chất tiền thân pyridine nucleotid cho q trình tổng hợp NAD Biotype có độc lực cao biotype Biotype có 12 serotype khác dựa khác capsule polysaccharide (CPS) lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào Ở biotype có serotype 2, 4, có chung nhóm định kháng nguyên biotype Trong năm gần đây, serotype 13 14 thuộc biotype phát mơ tả 10 có kháng ngun khác với biotype (Nielsen cs, 1997) [34] Blackall cs (2002) [9] phát serotype 15 thuộc biotype chủng vi khuẩn phân lập Australia 2.1.4 Các yếu tố độc lực Nhiều nghiên cứu cho thấy độc lực serotype khác vi khuẩn A pleuropneumoniae phần lớn định ngoại độc tố mà chúng sản sinh (Devenishvà cs, 1990 [13]; (Freyvà Bosse, 1993) [18]) Polysaccharide vỏ, lipopolysaccharide, protein màng, protein thu nhận sắt, yếu tố bám dính, ngoại độc tố vài loại enzym có liên quan đóng vai trò quan trọng độc lực vi khuẩn A pleuropneumoniae Hiểu biết thành phần cấu trúc kháng nguyên chủ yếu liên quan đến độc tính, độc lực vi khuẩn cung cấp thông tin quan trọng, sở khoa học cho việc phát triển kỹ thuật chẩn đoán huyết đặc hiệu chế tạo vaccine phòng bệnh - Vai trò ngoại độc tố (Exotoxin): Nhiều nghiên cứu cho thấy mức độ độc lực khác serotype vi khuẩn A pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn đóng vai trò trình gây bệnh cho lợn (Devenish cs, 1990 [13] Các nhà khoa học xác định độc lực vi khuẩn A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố Các độc tố xếp vào nhóm RTX-toxin đặt tên độc tố Apx, bao gồm ApxI,ApxII, ApxIII (Frey Bosse, 1993) [18]; Cho Chae, 2001 [11]) Tính độc loại độc tố thay đổi phụ thuộc vào serotype khác vi khuẩn A Pleuropneumoniae + ApxII độc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào mức độ trung bình có trọng lượng phân tử khoảng 103 -105 kDa (Frey Nicolet, 1988) [16] Trước ApxII gọi HlyII, ClyII hay CytII (Frey Nicolet, 1990) [17] Tất serotype A pleuropneumoniae tiết ApxII, ngoại trừ serotype 10 14 46 4.5 Kết xác định triệu chứng, bệnh tích điển hình lợn mắc bệnh viêm phổi dovi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây Thái Nguyên - Sau tiến hành phân lập, xác định đặc tính sinh hóa, chạy phản ứng PCR vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ 30 mẫu lợn thu thập kết có mẫu khuẩn lạc dương tính với vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae Chúng quay trở lại điều tra triệu chứng bệnh tích mẫu lợn bị viêm phổi Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra.Kết thể bảng 4.5 4.6 Bảng 4.5: Kết quan sát thu thập triệu chứng lợn nghi mắc bệnh vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumonie Tổng số Biểu mẫu (con) Sốt, sốt nhẹ Lợn mệt mỏi, bỏ ăn, nôn, tiêu chảy, giảm trọng lượng, gầy Ho tự phát, ho ngắn từ đến cái, ho Triệu chứng giật giật thể bụng, vật tỏ đau đớn ho Thở khó, thở kiểu chó ngồi, nhịp tim tăng nhanh Có nhiều dịch bọt mũi miệng, mũi Số có biểu Tỉ lệ (%) 100 3 100 3 100 3 100 33,33 chân tai tím dần Từ bảng 4.5 thấy 100 % lợn sốt sốt nhẹ, lợn có biểu ho tự phát, ho ngắn từ đến cái, ho giật giật thể bụng, vật tỏ đau đớn ho Lợn có biểu mệt mỏi, bỏ ăn, nôn, tiêu chảy, giảm trọng lượng, gầy chiếm tỉ lệ 100% Lợn có tượng thở khó, thở kiểu chó ngồi, nhịp tim tăng nhanh chiếm Đối với 47 số trường hợp lợn bị cấp thấy có nhiều bọt mũi miệng, chân, tai mũi tím dần chiếm 33,33% Bảng 4.6: Kết quan sát bệnh tích lợn nghi mắc bệnh vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumonie Tổng số Biểu mẫu (con) Khí quản chứa đầy chất nhầy, bọt đơi có lẫn máu Phổi sẫm màu khơng đồng đều, phổi bị Bệnh tích viêm Có nhiều tơ huyết gắn phổi Số có biểu Tỉ lệ (%) 33,33 3 100 3 100 thành ngực, hoành tim Bề mặt phổi có tơ huyết fibrin 66,67 Từ bảng 4.6: thu kết 100 % phổi sẫm màu khơng đồng đều, có tượng gan hóa đối xứng không đối xứng, phổi bị viêm Hiện tượng có nhiều tơ huyết gắn phổi thành ngực, hoành tim chiếm tỉ lệ 100 % Lợn mổ khám thấy khí quản chứa đầy chất nhầy, bọt đơi có lẫn máu chiếm tỉ lệ 33,33% trường hợp bệnh tích lợn chết cấp tính Trên bề mặt phổi có tơ huyết fibrin chiếm tỉ lệ 66,67% Từ kết xác định bệnh tích từ lợn mắc viêm phổi dính sườn vi khuẩn A Pleuropneumoniae thấy lợn bị mắc viêm phổi dính sườn có triệu chứng sốt sốt nhẹ, lợn bỏ ăn mệt mỏi, lợn ho tự phát, ho ngắn từ đến cái, lợn thở khó thở kiểu chó ngồi, trường hợp cấp tính tai mõm vùng da mỏng tím dần thiếu oxy, có bọt mũi, miệng Bệnh tích phổi bị gan hóa phần tồn phần, phổi bị viêm, bề mặt phổi có tơ huyết fibrin có nhiều tơ huyết gắn phổi 48 thành ngực, tim, hồnh Kết chúng tơi trùng khớp với kết nghiên cứu trước (Nicolet, 1992) [33] (Fenwick Henry, 1994) [15] Kết xác định đốn lợn bị mắc viêm phổi dính sườn để có biện pháp phòng trị có hiệu 4.6 Kết xác định mức độ mẫn cảm với số kháng sinh vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập Hiện nay, sử dụng kháng sinh không hướng dẫn chăn nuôi thú y nên xuất ngày nhiều loại vi khuẩn kháng thuốc, có vi khuẩn A pleuropneumoniae Để góp phần vào việc khống chế điều trị bệnh vi khuẩn A pleuropneumoniae gây lợn, tiến hành kiểm tra mức độ mẫn cảm với số kháng sinh chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập được, giúp cho việc lựa chọn kháng sinh điều trị xác có hiệu Kết trình bày bảng 4.7 Bảng 4.7: Kết xác định mức độ mẫn cảm với số kháng sinh chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập Đánh giá mức độ mẫn cảm Mạnh Trung bình Kháng thuốc Kháng chủng d d d sinh VK (+) (%) (+) (%) (mm (+) (%) (mm) (mm) thử ) Ceftiofur 23.5 100 0 0 Amoxicillin 21.3 100 0 0 Florfenicol 23 66,67 21.2 33,33 0 Ampicillin 0 20.7 100 0 Tetracyclin 0 26.4 66,67 22.1 33,33 Colistin 16.6 33,33 13.5 66,67 0 Kết so sánh vớiBảng đánh giá mức độ mẫn cảm vi khuẩn với Số TT số loại kháng sinh (NCCLS - 2002) [39] 49 Qua bảng 4.7 cho thấy: chủng vi khuẩnA pleuropneumoniae phân lập mẫn cảm với ceftiofur amoxicillin, chiếm tỷ lệ 100%; florfenicol 66,67% Một số kháng sinh sử dụng nhiều có tỷ lệ mẫn cảm mức trung bình ampicilin 100%, Colistin, tetracyclin 66,67% tỉ lệ kháng thuốc tetracyclin 33,33% Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tượng kháng kháng sinh vi khuẩn A pleuropneumoniae ngày gia tăng việc dùng kháng sinh điều trị kéo dài, kháng sinh bổ xung vào thức ăn tượng di truyền tính kháng thuốc gen nằm plasmid vi khuẩn A pleuropneumoniae Từ kết làm tiền đề để đưa phác đồ thử nghiệm thực tiễn để có phác đồ xác hiệu nhanh cho người chăn nuôi nhằm giảm thiểu thiệt hại kinh tế 4.7 Kết thử nghiệm số phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi dính sườn A pleuropneumoniae Căn vào kết kháng sinh đồ chọn loại kháng sinh có độ mẫn cảm mạnh với vi khuẩn A Pleuropneumoniaephân lập ceftiofur, amoxicillin,florfenicol xây dựng phác đồ điều trị thử nghiệm lợn mắc bệnh tỉnh Thái Nguyên Các phác đồ điều trị thử nghiệm lợn mắc bệnh sau: + Phác đồ 1: Điều trị nguyên nhân lợn mắc viêm phổi dùng loại thuốc CEFANEW-LA công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần ceftiofur: 10g/100 ml), tiêm bắp với liều lượng: ml/25 kg thể trọng/ngày, tương ứng mg ceftiofur/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 72 - 96 Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức: GLUCO-K-C-NAMIN, tiêm bắp với liều: ml/10 kg thể trọng/ngày 50 +Phác đồ 2: Dùng loại thuốc MARPHAMOX-LA công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần amoxicillin:15g/100 ml), tiêm bắp với liều lượng ml/10 kg thể trọng/ngày; tương ứng 15 mg amoxicillin/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 48 Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức: GLUCO-K-C-NAMIN, tiêm bắp với liều: ml/10 kg thể trọng/ngày +Phác đồ 3: Dùng loại thuốc MARFLO-45% công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần florfenicol: 45g/100 ml), tiêm bắp với liều lượng ml/30 kg thể trọng/ngày, tương ứng 15 mg florfenicol/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 72 - 96 Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức: GLUCO-K-C-NAMIN, tiêm bắp với liều: ml/10 kg thể trọng/ngày Và vào triệu chứng lợn mắc bệnh viêm phổi dính sườn vi khuẩn A pneuropneumoniae gây chọn lợn bị bệnh để tiến hành thử nghiệm phác đồ điều trị Kết điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc PRRS mắc viêm phổi trình bày bảng 4.8 Bảng 4.8: Kết điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc lợn mắc viêm phổi dính sườn Phác đồ I Loại thuốc CEFANEW- Liều lượng cách dùng 1ml/25kg TT/ngày LA (ceftiofur: (4mg ceftiofur/kgTT); 10g/100ml) tiêm bắp; thuốc tác Số Số ngày điều trị điều trị (con) 10 Số khỏi bệnh (con) Tỷ lệ (%) 90,00 51 Gluco-K-CNa MarphamoxLA II (amoxicillin: 15g/100ml) Gluco-K-CNa MARFLO45% III (florfenicol: 45g/100ml) Gluco-K-C- dụng 72-96 1ml/10kg TT/ngày; tiêm bắp: 1lần/ngày 1ml/10kg TT/ngày (15mg amoxicillin/kgTT); tiêm bắp; thuốc tác dụng 48 15 13 86,67 13 10 76,92 38 32 84,21 1ml/10kg TT/ngày; tiêm bắp: 1lần/ngày 1ml/30kgTT/ngày (15mg florfenicol/kgTT); tiêm bắp; thuốc tác dụng 72 - 96 1ml/10kg TT/ngày; Namin tiêm bắp: 1lần/ngày Tổng hợp Ghi chú: TT - Thể trọng - Qua bảng 4.8 cho thấy điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc viêm phổi với loại kháng sinh ceftiofur, amoxicillin, florfenicol Ngoài sử dụng loại kháng sinh điều trị chúng tơi bổ sung tiêm thêm Gluco.K.C.Namin để trợ sức trợ lực, giảm sốt, giảm ho, tiêu viêm tăng cường sức đề kháng cho lợn bệnh - Ở phác đồ sử dụng ceftiofur với liều lượng mg/kg thể trọng, điều trị 10 lợn mắc viêm phổi có khỏi, đạt tỷ lệ 90,00% - Ở phác đồ sử dụng amoxicillin với liều lượng 15 mg/kg thể trọng; tiến hành điều trị 15 lợn mắc viêm phổi, khỏi 13 con, đạt tỷ lệ 86,67% 52 - Ở phác đồ sử dụng florfenicol với liều lượng 15 mg/kg thể trọng; điều trị tổng số 13 lợn mắc viêm phổi, khỏi 10 con, đạt tỷ lệ 76,92% - Tổng cộng với phác đồ điều trị thử nghiệm 38 lợn mắc viêm phổi có 32 khỏi, đạt tỷ lệ trung bình 84,21% Trong đó, phác đồ có tỷ lệ khỏi cao (90,00%), tiếp đến phác đồ (86,67%) thấp phác đồ (76,92%) - Như vậy, phác đồ điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc viêm phổi tỉnh Thái Nguyên có kết tốt, tỷ lệ lợn khỏi bệnh cao Từ kết thu qua điều trị thử nhiệm, khuyến cáo người chăn nuôi chủ động sử dụng ba phác đồ để điều trị lợn nghi mắc viêm phổi, đặc biệt phác đồ (sử dụng kháng sinh ceftiofur) - Xây dựng thành công phác đồ tạo điều kiện cho người chăn nuôi, cán thú y sở chủ động phòng điều trị bệnh viêm phổi lợn, giảm thiểu thiệt hại, tăng giá trị sản phẩm chăn ni Từ ổn định nguồn cung cấp thực phẩm tiêu dùng hàng ngày làm cho giá ổn định đồng thời giúp ngành chăn nuôi lợn tỉnh phát triển bền vững 53 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Các mẫu A Pleuropneumoniae phân lập mang hình thái, đặc tính ni cấy, hóa học tương đồng với tài liệu ngồi nước cơng bố - A pleuropneumoniaephân lập vi khuẩn bắt màu Gram âm, dạng cầu trực khuẩn, kích thước khoảng 0,3-0,5 x 0,6-1,4 pm.Dưới kính hiển vi điện tử phát vi khuẩn có nhung mao với kích thước 0,5-2 x 60-450 nm - 100% Vi khuẩnA pleuropneumoniae lên men đường glucose, xylose, mannitol, mannose không lên men đường arabinose, lactose, raffinose, sorbitol Dương tính với phản ứng urease, oxidase, CAMP, O.N.P.G; âm tính với phản ứng sinh Indol không mọc thạch MacConkey - Lợn bị mắc viêm phổi dính sườn vi khuẩn Actinobaccillus pneuropneumoniae có triệu chứng sốt sốt nhẹ, lơn bỏ ăn mệt mỏi, lợn ho tự phát, ho ngắn từ đến cái, lợn thở khó, thở kiểu chó ngồi, trường hợp cấp tính tai mõm vùng da mỏng tím dần thiếu oxy, có bọt mũi, miệng Bệnh tích phổi bị gan hóa phần tồn phần, phổi bị viêm, bề mặt phổi có tơ huyết fibrin có nhiều tơ huyết gắn phổi thành ngực, tim, hoành - Vi khuẩnA pleuropneumoniae phân lập mẫn cảm với ceftiofur amoxicillin - Sử dụng kháng sinh Ceftiofur, amoxilin, fofenicol thuốc trợ sức trợ lực điều trị bệnh viêm phổi dính sườn đạt hiệu cao 5.2 Đề nghị - Tiếp tục tiến hành phản ứng PCR xác định gen độc tố chọn chủng vi khuẩnA pleuropneumoniae mang tính đại diện, điển hình, phù hợp với thực địa để dùng làm giống sản xuất vaccine phòng bệnh viêm phổi cho lợn 54 - Áp dụng phác đồ thử nghiệmđiều trị lợn nghimắc viêm phổi vi khuẩn A Pleuropneumoniaegây địa phương TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Tiêu Quang An, Nguyễn Hữu Nam (2011), “Xác định số vi khuẩn kế phát gây chết lợn vùng dịch lợn Tai xanh huyện Văn Lâm tỉnh Hưng Yên năm 2010”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(3), tr 56- 64 Đặng Xuân Bình, Nguyễn Thị Ngân, Phan Hồng Phúc (2007), “Tình hình nhiễm Actinobacillus pleuropneumoniaevà bệnh viêm phổi màng phổi lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 14(2), tr 36-39 Lê Văn Dương (2013), “Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcussuis gây viêm phổi Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Bắc Giang, biện pháp phòng trị” Luận án tiến sỹ thú y, Đại học Thái Nguyên,tr 82- 116 Nguyễn Thị Thu Hằng (2010), Nghiên cứu số đặc tính sinh học tính sinh miễn dịch Actinobacillus pleuropneumoniae phân lập từ lợn làm sở cho việc chế tạo vaccine.Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia, Hà Nội, tr 115116 Trịnh Quang Hiệp, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thu Hằng, Âu Xuân Tuấn (2004), “Xác định đặc tính sinh vật hoá học, độc lực vi khuẩn Actinobacillus, Pasteurella Streptocococcus gây bệnh viêm phổi lợn”, Tạp chí khoa học-cơng nghệ Bộ Nơng nghiệp PTNT (4), tr 476-477 Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Nguyễn Thu Hằng, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn Bích Thuỷ, Vũ Ngọc Quý, Phạm Bảo Ngọc (2005), “Xác định nguyên nhân gây bệnh đường hô hấp lợn nuôi số tỉnh phía Bắc”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú 55 y, 12(4), tr 23-32 Tiếng Anh Archambault M., Rioux S., Jacques M (1999), Evaluation of the hemoglobine binding activity of Actinobacillus pleuropneumoniae using fluorescein labeled pig hemoglobin and flow cytometry FEMS Microbiol Lett;173:17-25 Bertram T A (1986), Intravascular macrophages in lungs of pigs infected with Haemophilus pleuropneumoniae Vet Pathol 23: 681-691 Blackall P J., Klaasen H B L M., van den Bosch H., Kuhnert P., Frey J (2002), Proposal of a new serovar of Actinobacillus pleuropneumoniae: serovar 15, Vet Microbiol (84) 47-52 10 Chang Y F., Shi J R., Ma D P., Shin S J., Lein D H (1993), Molercular analysis of the Actinobacillus pleuropneumoniae RTX Toxin-III gene cluster DNA Cell Biol 12: 351-362 11 Cho W S., Chae C (2001), Expression of the apx IV Gene in Pigs Naturally Infected with Actinobacillus pleupneumoniae, J Comp Path 125, p 34 - 40 12 Chung J W., Ng- Thow- Hing C., Budman L I., Gibbs B F., Nash J H., Jacques M., Coulton J W (2007), Outer membrane proteome of Actinobacillus pleuropneumoniae: LC-MS/MS analyses validate in silico predictions Proteomics Jun; 7(11): 1854-1865 139, pp 1-5 13 Devenish J., Rosendal S., Bosse J T., Wilkie B N., Johnson R (1990), Prevalence of seroreactors to the 104-kilodalton hemolysin of Actinobacillus pleuropneumoniae in swine herds, J Clin Microbiol 28:789-791 14 Fedorka-Cray P J., Hoffman L., Cray W C., Gray J T., Breish S A., Anderson G A (1993), Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae Part I History, epidemiology, serotyping, and treatment Compend Contin Ed Practic Vet 15:1447-1455 56 15 Fenwick B., Henry S (1994), Porcine pleuropneumonia.J Am Vet Med Assoc 204:1334-1340 16 Frey J., Nicolet J (1988), Purification and partial characterization of a hemolysin produced by Actinobacillus pleuropneumoniae type strain 4074 FEMS Microbiol Lett 55:41-46 17 Frey J., Nicolet J (1990), Hemolysin patterns of Actinobacillus pleuropneumoniae J.Clin Microbiol 28:232-236 18 Frey J., Bosse J T (1993), Actinobacillus pleupneumoniae RTX toxins: Uniform designation of haemolysins, cytolysins pleurotocin and their genes, J Gen Microbiol 139, p 1723 - 1728 19 Frey J., Kuhn R., Nicolet J (1994), Association of the CAMP phenomenon in Actinobacillus pleuropneumoniae with the RTX toxins ApxI, ApxII and ApxIII FEMS Microbiol Lett124 245-251 20 Gerlach G F., Klashinsky S., Anderson C., Potter A A., Willson P J (1992), Characterization of two genes encoding distinct transferring binding proteins in different Actinobacillus pleuropneumoniae isolates Infect Immun;60: 3253-3261 21 Gonzalez G C., Yu R H., Rosteck P R J R., Schryvers A B (1995), Sequence, genetic analysis and expression of transferrin receptor genes Microbiology (Reading) 141: 2405-2416 22 Jacobsen M J., Nielsen J P., Nielsen R (1996), Comparison of virulence of different A pleuropneumoniae serotypes and biotypes using an aerosol infection model.Veterinary Microbiology 49: 159-168 23 Jacques M (2004), Surface polysaccharides and iron-uptake systems of Actinobacillus pleuropneumoniae The Canadian Journal of Veterinary Research 68:81-85 57 24 Jensen A E., Bertram T A (1986), Morphological and biochemical comparison of virulent and avirulent isolates of Haemophilus pleuropneumoniae serotype Infect Immun 51:419-424 25 Kamp E M., Vermeulen T M., Smits M A., Haagsma J (1994), Production of Apx toxins by field strains of A pleuropneumoniae and Actinobacillus suis Infect Immun 62: 4063-4065 26 Kilian M (1976), A taxonomic study of the genus Haemophilus, with the proposal of a new species J Gen Microbiol 9-62 27 Langford P R., Loynds B M., Kroll J S (1996), Cloning and molecular characterisation of copper-zinc superoxidase dismutase from Actinobacillus pleuropneumoniae Inf and Imm 64: 5035-5041 28 Leman A D (1992), The decision to repopulate In Proceedings Am Assoc Swine Pract pp 9-12 29 Macdonald J., Rycroft A N (1992), Molecular cloning and expression of ptxA, the gene encoding the 120-kilodalton cytotoxin of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype Infection and Immunity 60: 2726- 2732 30 Macdonald J., Rycroft A N (1993), Actinobacillus pleuropneumoniae haemolysin II is secreted from Escherichia coli by Actinobacillus pleuropneumoniae pleurotoxin secretion gene products FEMS Microbiol Lett 109, 317-322 31 MacInnes J I., Rosendal S (1988), Prevention and control of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae infection in swine: A review Can Vet J 572-573 32 Nicolet J., Schifferli D (1982), In vitro susceptibility of HaemophilusPleuropneumoniae to antimirobial substances Porc Int Congr Pig Vet Soc 7:71 33 Nicolet J (1992),Actinobacillus pleuropneumoniae: In Leman AD, Straw B, Mengeling WL, D’Allaire S, Taylor DJ (ed.): Diseases of swine Iowa State University Press, Ames, pp 401-408 58 34 Nielsen R., Adresen L O., Plambeck T., Nielsen J P., Krarup L T., Jorsal S V (1997), Serological characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype strains isolated from pigs in two Danish herds Vet Microbiol 54, 35 - 46 35 Prescott J F., Baggot J D (1993), Antimicrobial Therapy in Medicine Ames: Iowa State Univ Press 36 Rayamajhi N., Shin S J., Kang S G., Lee D Y., Ahn J M., Yoo H S (2005), Development and use of a multiplex polymerase chain reaction assay based on Apx toxin genes for genotypeing of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates J Vet Diagn Invest Jul;17(4): 359-62 37 Rycroft A N., Williams D., Cullen J M., MacDonald J (1991a), The cytotoxin of Actinobacillus pleuropneumoniae (pleurotoxin) is distinct from the hemolysin and is associated with a 120 kDa polypeptide J Gen Microbiol 137: 561- 568 38 Ward C K., Inzana T J (1997), Identification and characterization of a DNA region involved in the export of capsular polysaccharide by A pleuropneumoniae serotype 5a Infect and Immun 65: 2491-2496 39 Negrete-Abascal E., Tenorio V R., Serrano J J., Garcia C., de la Garza M (1994), Secreted proteases from Actinobacillus pleuropneumoniae serotype degrade porcine gelatin, hemoglobin and immunoglobulin A Can J Vet Res 58:83-86 PHỤ LỤC Một số hình ảnh trình nghiên cứu Hình 1: lợn bị VPDS Hình 3: mẫu phẩm phổi bệnh Hình 2: mổ khám lợn VPDS Hình 4: ni cấy VK ... Actinobaccilus pleuropneumoniae gây vi m phổi lợn Thái Nguyên 1.2 Mục tiêu nghiên cứu: - Phânlập, xác định ặc điểm ni cấy, đặc tính sinh hóa A.pleuropneumoniaegây bệnh vi m phổi lợn Thái Nguyên - Xác định. .. cho đàn lợn ni Vì vậy, vi c nghiên cứu phân lập xác định số đặc điểm sinh hóa vi khuẩn cần thiết từ biết vai trò gây số đặc điểm triệu chứng lâm sàng lợn mắc bệnh vi m phổi- vi m phổi màng phổi. .. học - Phân lập, xác định vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniaegây bệnh vi m phổi lợn Thái Nguyên - Kết nghiên cứu đề tài sở khoa học phục vụ cho nghiên cứu bệnh vi m phổi- màng phổi lợn * Ý