Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hợp chất steroid từ hợp chất methanol cây thạch vĩ họ dương xỉ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia Lingua (Thunb.)Farwell) HỌ DƯƠNG XỈ (Polypodiaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sư phạm Hóa học Phú Thọ, 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia Lingua (Thunb.) Farwell) HỌ DƯƠNG XỈ (Polypodiaece) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sư phạm Hóa học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: 1.ThS Nguyễn Thị Bình Yên Trường Đại học Hùng Vương 2.ThS Nguyễn Thị Nga Học viện phòng khơng – Khơng qn Phú Thọ, 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy hướng dẫn khoa học: ThS Nguyễn Thị Bình Yên - Trường Đại học Hùng Vương ThS.Nguyễn Thị Nga- Học viện Phòng khơng- Không quân hướng nghiên cứu tận tình hướng dẫn em suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp Ngồi ra, để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em nhận giúp đỡ nhiệt tình Thầy giáo, cán công nhân viên đặc biệt cô giáo chủ nhiệm Phạm Thị Thanh Huyền Em xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô, nhà khoa học Trường Đại học Hùng Vương giảng dạy, hướng dẫn tạo điều kiện tốt để em thực thực nghiệm hóa học Nhân dịp em xin bày tỏ cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo Trường Đại học Hùng Vương, Khoa Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học Hùng Vương tạo cho em môi trường học tập khoa học, nghiêm túc Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn sinh viên K11 ĐHSP Hóa học-Trường Đại học Hùng Vương hỗ trợ, động viên em suốt trình học tập thực Đề tài Phú Thọ, ngày 12 tháng năm 2017 Sinh viên Hoàng Thị Nhung -i- MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG v MỞ ĐẦU 1 Lý lựa chọn đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi Pyrrhosia 1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ 1.3 Các nghiên cứu hóa thực vật chi Pyrrhosia Việt Nam 1.4 Sơ lược lớp chất steroid CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Nguyên vật liệu thiết bị 2.2.1 Nguyên vật liệu 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 11 2.3.1 Phương pháp ngâm chiết 11 2.3.2 Phương pháp sắc ký 12 2.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại 15 2.3.4 Phương pháp phổ khối lượng 15 2.3.5 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR) 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết MeOH Thạch vĩ 19 3.2 Quá trình phân lập chất từ dịch chiết MeOH Thạch vĩ 20 3.2.1 Khảo sát thành phần định tính lựa chọn dung mơi 20 3.2.2 Quá trình phân lập chất 22 -ii- 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 Kết luận 35 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 -iii- DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ❖ Các phương pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography: Sắc ký cột ❖ Các phương pháp phổ H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 DEPT s: singlet Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT d: doublet t: triplet m: multiplet ❖ Tên hợp chất viết theo nguyên Tiếng Anh -iv- DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh Thạch vĩ Hình 1.2 Cấu tạo khung steroid Hình 2.1 Cây Thạch vĩ (tại Lâm Thao) Hình 2.2 Máy cất quay chân khơng Hình 2.3 Cột sắc ký với kích thước khác 10 Hình 2.4 Bộ chưng cất dung môi 10 Hình 2.5 Máy soi UV 11 Hình 2.6: Hộp thủy tinh chạy mỏng 11 Hình 2.7.Sơ đồ chung phương pháp ngâm chiết 12 Hình 2.8 Minh họa sắc ký lớp mỏng 13 Hình 2.9 Minh họa sắc ký cột 14 Hình 2.10 Độ chuyển dịch hóa học proton 17 Hình 2.11 Ví dụ minh họa tách vạch phổ 18 Hình 3.1 Hình cặn dịch chiết MeOH 19 Hình 3.2 Kết khảo sát TLC cặn chiết MeOH Thạch vĩ 21 Hình 3.3 TLC cặn MeOH Thạch vĩ với hệ dung môi (V) 21 Hình 3.4 Cột tổng đưa silica gel lên 22 Hình 3.5 Cột tổng silica gel cặn MeOH 23 Hình 3.6 Hình ảnh khảo sát TLC phân đoạn F1÷F9 23 Hình 3.7 Cột phân đoạn F8 24 Hình 3.8 Hình ảnh TLC lọ từ 30 – 46 phân đoạn F8.3 26 Hình 3.9 Sơ đồ phân lập dịch chiết MeOH câyThạch vĩ 27 Hình 3.10 Hình ảnh chất PLM3.2 sắc ký đồ TLC 27 -v- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Độ phân cực số dung môi thông dụng Bảng 3.1 Kết phân đoạn thu từ phân đoạn F8 25 -1- MỞ ĐẦU Lý lựa chọn đề tài Xã hội ngày phát triển nhu cầu sức khỏe người quan tâm hơn, phải kể đến nhà khoa học có bước tiến đáng kể việc tìm sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, không chữa khỏi bệnh mà giúp thể phòng bệnh Trinh nữ hoàng cung, Giác đế, Lược vàng, Thạch vĩ, Ngày nay, việc dùng lồi thuốc có nguồn gốc tự nhiên ngày ưa chuộng cơng trình nghiên cứu chúng ngày phát triển.Cùng với phát triển công nghệ tổng hợp hóa dược tạo biệt dược, nhà khoa học cố gắng tìm hiểu, khám phá hoạt tính sinh học khác hợp chất có nguồn gốc từ nhiều lồi thực vật khác Việt Nam nước nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa lớn, độ ẩm tương đối cao, nhiệt độ trung bình tháng 18 0C lượng mưa trung bình từ 1000-1500 mm Với diện tích tự nhiên lên đến 331.212 km2 đặc thù khí hậu thiên nhiên tạo nên đa dạng sinh học cao thành phần loài thực vật Trên sở tài liệu công bố nhà sinh vật Việt Nam, tổng hợp từ tài liệu đáng tin cậy, toàn lãnh thổ Việt Nam có tới 19.375 lồi thực vật có tới khoảng 13.000 lồi hạt kín Trong số 13.000 lồi hạt kín nói trên, theo thống kê Viện Dược liệu Việt Nam, biết có khoảng 4.000 loài sử dụng làm thuốc chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian đông y; điều kiện tốt để mở phát triển tiềm nghiên cứu hợp chất tự nhiên từ loài thực vật Việt Chi Pyrrhosia Việt Nam có 17 lồi ví dụ Pyrrhosia Lingua, Pyrrosia Sheareri, Pyrrosia Petiolosa, Pyrrosia Pekinesis, loài sử dụng y học cổ truyền [1] mở tiềm nghiên cứu hóa thực vật lồi -2- Theo Từ điển thực vật thông dụng tác giả Võ Văn Chi cho thấy Thạch vĩ có chứa triterpenoid diploptene, steroid β–sitosterol Gần đây, năm 2016 nhóm tác giả Bùi Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Sang bước đầu cơng bố thành phần hóa học Thạch vĩ Việt Nam Trong từ dịch chiết EtOAc, n-Hexane phân lập hỗn hợp β–sitosterol stigmasterol; hopane-22- ol Nhằm mục tiêu tìm kiếm hiểu biết hợp chất thiên nhiên từ Thạch Vĩ, lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hợp chất Steroid từ dịch chiết Methanol Thạch vĩ (Pyrrhosia Lingua (Thunb.) Farwell) họ Dương xỉ (Polypodiaceae) Mục tiêu đề tài - Điều chế cặn dịch chiết MeOH ( methanol) Thạch vĩ - Phân lập chất từ phân đoạn dịch chiết MeOH Thạch vĩ - Xác định cấu trúc chất phân lập phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Ý nghĩa khoa học: + Kết đề tài đóng góp thơng tin cho lĩnh vực nghiên cứu hóa học hữu cấu trúc hợp chất thiên nhiên có lồi Thạch vĩ + Cung cấp liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân số hợp chất thiên nhiên từ thực vật - Ý nghĩa thực tiễn: + Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc thành phần hóa học Thạch vĩ Từ tìm hiểu hoạt tính sinh học chất phân lập + Góp phần nâng cao kiến thức, kỹ kỹ thuật chiết tách, phân lập hợp chất thiên nhiên, phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho sinh viên + Đề tài tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành hóa học cán nghiên cứu hóa học hữu -23- Cho từ từ silica gel đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố vào cột (Hình 3.5) Hình 3.5 Cột tổng silica gel cặn MeOH Giai đoạn 3: Chạy cột tổng Tiến hành rửa giải hệ dung môi MeOH/CH2Cl2 (0% - 100%) Hứng dung dịch rửa giải khoảng 80-100 mL vào bình nón Dội cột dung mơi MeOH Kết thu phân đoạn có kí hiệu từ F1-F9 Các phân đoạn F1-F9 khảo sát lại TLC với hệ dung môi CH2Cl2/nHexane(75%) MeOH/CH2Cl2(10%) cho kết Hình 3.7 (II) Hình 3.6 Hình ảnh khảo sát TLC phân đoạn F1÷F9 -24- Giai đoạn 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ F8 (2,83g) Bước 1: Chuẩn bị cột Với mẫu chất có khối lượng m= 2,83g, chọn cột Ø2,5 có đường kính 2,5cm; chiều dài 50cm rửa sạch, tráng cột acetone, sấy khơ, lót đáy bơng Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt: Cân 70 gam silica gel, ngâm trương nở ngập CH2Cl2 30 phút, q trình rót dung mơi dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí, đậy cốc ngâm silica gel giấy bạc để tránh bay Rót từ từ hỗn hợp silica gel trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định thời gian 1h Bước : Đưa chất lên cột Đem 2,83 gam cặn chiết PLM F8 (kí hiệu F8) hòa tan với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, nhỏ từ từ vào khoảng 2,8g silica gel, làm bay hết dung môi đến thu hỗn hợp bột tơi màu nâu đen.Cho từ từ silica gel đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố vào cột cho khí Hình 3.7 Cột phân đoạn F8 Bước 3: Chạy cột Tiến hành rửa giải hệ dung môi MeOH/CH2Cl2 (0% - 100%) Hứng dung dịch rửa giải khoảng 10ml vào lọ có dung tích khoảng 15÷20ml -25- Kiểm tra sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp lọ có vết chất tương đương mỏng Dội cột dung mơi MeOH Kết thu 12 phân đoạn có kí hiệu từ F8.1 ÷ F8.12 (Bảng 3.1) Bảng 3.1 Kết phân đoạn thu từ phân đoạn F8 STT Bình gộp 1÷10 11÷24 25÷45 46÷57 58÷76 Dung mơi rửa giải 100 mL MeOH/CH2Cl2 0% 100 mL MeOH/CH2Cl2 0% 50 mL MeOH/CH2Cl2 1% 150 mL MeOH/CH2Cl2 1% 50 mL MeOH/CH2Cl2 2% 110 mL MeOH/CH2Cl2 2% 40 mL MeOH/CH2Cl2 2% 140 ml MeOH/CH2Cl2 3% Phân Khối lượng đoạn (mg) F8.1 26,3 F8.2 22,5 F8.3 17 F8.4 F4.5 127 F8.6 83,1 F8.7 97,3 F8.8 54 F8.9 134,2 F8.10 236 F8.11 285 F8.12 91 60 mL MeOH/CH2Cl2 3% 77÷135 200 mL MeOH/CH2Cl2 4% 200 mL MeOH/CH2Cl2 5% 120 mL MeOH/CH2Cl2 6% 136÷160 161÷169 170÷183 10 184÷204 80 mL MeOH/CH2Cl2 6% 160 mL MeOH/CH2Cl2 7% 40 mL MeOH/CH2Cl2 7% 40 mL MeOH/CH2Cl2 8% 130 mL MeOH/CH2Cl2 8% 30 mL MeOH/CH2Cl2 8% 170 mL MeOH/CH2Cl2 9% 30 mL MeOH/CH2Cl2 9% 11 205÷246 200 mL MeOH/CH2Cl2 10% 180 mL MeOH/CH2Cl2 11% 12 247÷hết 20 ml MeOH/CH2Cl2 11% -26- STT Bình gộp Dung mơi rửa giải Phân Khối lượng đoạn (mg) 200 mL MeOH/CH2Cl2 12% 100 mL MeOH/CH2Cl2 13% 100 mL MeOH 100% Ce(SO4) UV-254 UV-366 Hình 3.8 Hình ảnh TLC lọ từ 30 – 46 phân đoạn F8.3 -27- Hình 3.9 Sơ đồ phân lập dịch chiết MeOH câyThạch vĩ Hợp chất PLM 3.2 (PLM F8.3) không màu đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm, 366 nm màu xanh tím với thuốc thử Ce(SO 4)2 (Hình 3.10) Hình 3.10 Hình ảnh chất PLM3.2 sắc ký đồ TLC Trên sắc ký lớp mỏng PLEA2 xác định giá trị Rf = 0,65 (CH2Cl2 100%) -28- 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập Hình 3.11 Cấu trúc hợp chất PLMC2 Phổ hồng ngoại PLMC2 có đỉnh hấp thụ 3287 cm1 đặc trưng cho nhóm OH phân tử Tín hiệu dao động C-H sp3 quan sát vùng 2935, 2868 cm1 Đỉnh hấp thụ liên kết C=C quan sát thấy 1595 cm1 Các đỉnh hấp thụ 1379, 1059 đặc trưng cho liên kết C-OH (Hình 3.11) Phổ khối lượng PLMC2 cho pic ion phân tử dehydrate hóa proton hóa [M-H2O+H]+ = 397 phù hợp với CTPT C29H50O, M=414 (Hình 3.12) Trên phổ 1H-NMR PLMC2 có tín hiệu proton olefinic H 5,35 ppm (1H, m, H-6), proton nhóm CH liên kết với oxygen H 3,52 ppm (1H, m, H-3) Tín hiệu nhóm methyl quan sát thấy phổ 1H-NMR PLMC2 H 0,68 (3H, s, 18-CH3); 0,81 (3H, d, J=6.5 Hz, 26-CH3); 0,84 (3H, d, J=7.0 Hz, 27-CH3); 0,85 (3H, t, J=7.5 Hz, 29-CH3); 0,92 (3H, d, J=6.5 Hz, 21-CH3); 1,01 (3H, s, 19-CH3) (Hình 3.13, 3.14) -29- Hình 3.11 Phổ hồng ngoại PLMC2 -30- Hình 3.12 Phổ khối lượng PLMC2 -31- Hình 3.13 Phổ 1H-NMR PLMC2 -32- Hình 3.14 Phổ 1H-NMR giãn rộng PLMC2 -33- Hình 3.15 Phổ 13C-NMR, DEPT PLMC2 Phân tích phổ C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy phân tử 13 PLMC2 chứa 1CH liên kết với oxy C 71,8 (C-3), liên kết đôi C=C với [1C-sp2 bậc 140,8 (C-5), CH-sp2 121,7 (C-6)]; nhóm CH3-sp3 19,8 (C-26); 19,4 (C-19); 19,1 (C-21); 18,8 (C-27); 12,0 (C-29); 11,9 (C-18) Các -34- số liệu phổ 13C-NMR PLMC2 trùng với liệu phổ -Sitosterol [8] Kết hợp tài liệu tham khảo [8] cho phép khẳng định PLMC2 -Sitosterol Hợp chất phân lập từ nhiều loài thực vật khác -35- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trong trình thực đề tài thu kết sau: - Đã điều chế 640 gam cặn dịch chiết MeOH (Methanol) Thạch vĩ Khảo sát thành phần hóa học định tính cặn dịch chiết MeOH Thạch vĩ sắc ký lớp mỏng lựa chọn hệ dung môi CH 2Cl2/MeOH để phân tách cặn dịch chiết PLM thành phân đoạn nhỏ F1-F9 - Từ phân đoạn F8 phân tách thành 12 phân đoạn nhỏ F8.1-F8.12 Từ phân đoạn F8 phân lập chất -Sitosterol (PLMC2) - Cấu trúc hợp chất PLMC2 xác định phương pháp phổ hồng ngoại, phương pháp phổ khối lượng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT Kiến nghị - Tiếp tục phân lập chất phân đoạn lại dịch chiết MeOH Thạch vĩ - Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ Thạch vĩ - Bán tổng hợp số hợp chất từ Thạch vĩ khảo sát hoạt tính sinh học chúng -36- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng-Tập 2,NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [2] Bùi Thu Thị Thu Giang (2016), Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết Ethyl Acetate Thạch vĩ ( Pyrrhosia Lingua (Thunb.) Farwell) họ Dương xỉ ( Polypodiaceae) địa bàn tỉnh Phú Thọ, Khóa luận tốt nghiệp đại học - Trường Đại Học Hùng Vương [3] Đỗ Tất Lợi (2011), Những cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Thời Đại [4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [5] Nguyễn Thị Sang (2016), Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết n –Hexane Thạch vĩ ( Pyrrhosia Lingua (Thunb.) Farwell) họ Dương xỉ ( Polypodiaceae) địa bàn tỉnh Phú Thọ, Khóa luận tốt nghiệp đại học - Trường Đại Học Hùng Vương [6] Trần Quốc Sơn, Đặng Văn Liếu (2013), Giáo tình sở hóa học hữu cơ, Tập 1, NXB Đai học sư phạm [7] Đặng Như Tại, Ngô Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ-Tập 1, NXB Giáo dục Việt Nam Tài liệu Tiếng Anh [8] N Kiruthiga and D Sathish Sekar (2014), “Studies on Phytochemicals and Steroid Isolation from n-Hexane Extract of Anisochilus carnosus”, International Journal of Advanced Biotechnology and Research(IJBR), 5(3),pp.337-345 [9] Satyajit D Sarker, Zahid Latif, Alexander I Gray (2006), Natural Products Isolation,pp.7-200 [10] Janice Gorzynski Smith (2008), Organic Chemistry-3rd edition, McGraw-Hil, pp.1138 Giảng viên hướng dẫn Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực ThS Nguyễn Thị Bình n ThS.Nguyễn Thị Nga Hồng Thị Nhung ... ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia Lingua (Thunb.) Farwell) HỌ DƯƠNG... khối phổ kế • Xác định hợp chất chưa biết cách dựa vào khối lượng phân tử hợp chất hay phần tách riêng • Xác định kết cấu chất đồng vị thành phần hợp chất • Xác định cấu trúc hợp chất cách quan... từ hạt nhân số hợp chất thiên nhiên từ thực vật - Ý nghĩa thực tiễn: + Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc thành phần hóa học Thạch vĩ Từ tìm hiểu hoạt tính sinh học chất phân lập + Góp phần