Chất chống oxy hóa giúp làm giảm tỷ lệ mắc các bệnh thoái hóa như viêm khớp, xơ cứng động mạch, ung thư, bệnh tim, viêm và rối loạn chức năng não. Ngoài ra, chất chống oxy hóa đã được báo cáo để làm chậm lão hóa (Feskanich et al, 2000; Gordon, Năm 1996; Halliwell, 1996). Ngày nay, nhu cầu của các chất chống oxy hóa đang gia tăng đáng kể. Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, một nghiên cứu được thực hiện để tìm ra các thông số tốt nhất cho khai thác hợp chất chống oxy hóa từ ổi. Có nhiều phương pháp chiết xuất hoạt chất từ dược liệu đạt hiệu suất cao, trong đó chiết xuất có hỗ trợ siêu âm là một phương pháp được nghiên cứu để chiết Vitamin C từ cây Ổi (Psidium guajava L. Họ Sim (Myrtaceae)).
Trang 1ĐẶC VẤN ĐỀ
Trong cơ thể con người, thường xuyên diễn ra nhiều sinh hoạt hoặc xây dựng hoặc huỷ hoại Có những chất tưởng như là thực phẩm chính của tế bào nhưng đồng thời cũng lại làm hại tế bào Có những phân tử gây ra tổn thương thì cũng có những chất đề kháng lại hành động phá phách này Gốc tự do, oxygen và chất chống oxy hóa là một thí dụ Những phân tử này có liên hệ với nhau và ảnh hưởng tới cơ thể con người rất nhiều, nhất là ở giai đoạn cuối của cuộc đời
Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác Sự oxi hóa là loại phản ứng hóa học trong
đó electron được chuyển sang chất oxi hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng Để làm vậy người ta hay dùng các chất khử (như thiol hay polyphenol) làm chất chống oxi hóa
Dù phản ứng oxi hóa thuộc loại cơ bản trong đời sống nhưng có thể ngăn chận nó, chẳng hạn động thực vật duy trì hệ thống rất nhiều loại chất chống oxi hóa như glutathione, vitamin C, vitamin E, enzyme catalase, superoxide dismutase, Axít citric, v.v Chất chống oxi hóa yếu hay còn gọi là chất ức chế có thể phá hủy tế bào
Chất chống oxy hóa giúp làm giảm tỷ lệ mắc các bệnh thoái hóa như viêm khớp, xơ cứng động mạch, ung thư, bệnh tim, viêm và rối loạn chức năng não Ngoài ra, chất chống oxy hóa đã được báo cáo để làm chậm lão hóa (Feskanich et
al, 2000; Gordon, Năm 1996; Halliwell, 1996) Ngày nay, nhu cầu của các chất chống oxy hóa đang gia tăng đáng kể Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, một nghiên cứu được thực hiện để tìm ra các thông số tốt nhất cho khai thác hợp chất chống oxy hóa từ ổi
Có nhiều phương pháp chiết xuất hoạt chất từ dược liệu đạt hiệu suất cao, trong đó chiết xuất có hổ trợ siêu âm là một phương pháp được nghiên cứu để
chiết Vitamin C từ cây Ổi (Psidium guajava L Họ Sim (Myrtaceae)).
Mục đích của nghiên cứu này là so sánh hiệu suất và thời gian chiết của 3 phương pháp Siêu âm trực tiếp (DUE), Siêu âm gián tiếp ( IUE) và Soxhlet Extraction (SOX)
A PHẦN TỔNG QUAN
I Tổng quan về Cây Ổi
Trang 2Tên Khoa Học: Psidium guajava L họ Sim (Myrtaceae)
Tên khác: Phan thạch lựu, thu quả, kê thỉ quả, phan nhẫm, bạt tử, lãm bạt… Tên đồng nghĩa: Psidum guajava var pyriferum L.,
Psidum guajava var pomiferum L
Tên nước ngoài: Common guava (Anh), goyavier (Pháp).
Giới (regnum): Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Phân Lớp: Rosidae
Bộ (ordo): Myrtales
Họ (familia): Myrtaceae
Chi (genus): Psidium L.
1 Mô tả cây:
Cây gỗ nhỏ, cao từ 3-6 m Thân non màu
xanh, tiết diện vuông, có 4 cánh uốn lượn màu
xanh do cuống lá kéo dài; thân già màu nâu
xám, tiết diện tròn, có lớp vỏ mỏng trơn nhẵn
bong ra thành từng mảng Nhiều lông mịn ở
thân non, lá và các bộ phận của hoa Lá đơn,
mọc đối, không có lá kèm Phiến lá hình bầu
dục, gốc thuôn tròn, đầu có lông gai hoặc lõm,
dài 11-16 cm, rộng 5-7 m, mặt trên màu xanh
đậm hơn mặt dưới Bìa phiến nguyên, ở lá non
có đường viền màu hồng tía kéo dài đến tận
cuống lá Gân lá hình lông chim, gân giữa nổi
rõ ở mặt dưới, 14-17 cặp gân phụ Cuống lá
màu xanh, hình trụ dài 1-1,3 cm, có rãnh cạn ở
mặt trên Hoa to, màu trắng, mọc riêng lẻ ở nách lá, đều, lưỡng tính, mẫu 5 Lá bắc là lá thường, lá bắc con dạng vẩy dài 3-4 mm, màu xanh hơi nâu Cuống hoa dài 1,4-2,6 cm, màu xanh Đế hoa hình chén dài 0,8-1,2 cm, màu xanh Đài hoa dính thành ống nguyên, khi hoa nở tách ra thành 4-5 thùy không đều, màu xanh ở mặt ngoài, mặt trong màu trắng, tiền khai van Cánh hoa 5, gần đều, rời, màu
Trang 3trắng mỏng, dễ rụng khi hoa nở, phiến hình bầu dục khum ở đỉnh, dài 1,4-1,6 cm, rộng 0,6-0,8 cm, mặt ngoài có nhiều lông mịn, có 3-5 gân, móng nhỏ cong có lông mịn màu vàng, tiền khai năm điểm Bộ nhị: nhiều rời, không đều, đính thành nhiều vòng trên đế hoa; chỉ nhị dạng sợi dẹt màu trắng, gốc màu vàng nhạt, dài
7-14 mm, có lông; bao phấn màu vàng 2 ô, nứt dọc hướng trong, đính đáy; hạt phấn rời, nhỏ, hình tam giác tù ở đầu dài 17-20 µm, màu vàng nâu có 3 lỗ Lá noãn 5, dính, bầu dưới 5 ô, mỗi ô nhiều noãn, đính noãn trung trụ Vòi nhụy 1, dạng sợi màu trắng hơi phình ở gốc, có nhiều lông mịn, dài 1-1,2 cm Đầu nhụy 1, màu xanh dạng đĩa Quả mọng hình cầu, hình trứng, hay hình quả lê, đường kính 3-8
cm, mang đài tồn tại Hạt nhiều màu vàng nâu hình đa giác
Hoa thức và Hoa đồ:
Trang 42 Đặc điểm giải phẫu:
a Thân
Vi phẫu thân già tròn, thân
non hình chữ nhật có 4 cánh ở 4 góc
Biểu bì 1 lớp tế bào hình chữ nhật,
nhiều lông che chở đơn bào vách rất
dày Mô dày góc 2-3 lớp tế bào hình
đa giác, kích thước không đều Thân
non có nhiều túi tiết ly bào nằm gần
biểu bì Mô mềm vỏ đạo 4-5 lớp tế
bào hình đa giác thuôn dài, hơi bị ép
dẹp, kích thước không đều Trụ bì
2-3 lớp tế bào hình đa giác, hoá mô
cứng thành từng đám hay liên tục thành vòng Tầng bì sinh xuất hiện dưới trụ bì tạo thành lớp bần ở ngoài có thể bị bong rách ở thân già và lục bì ở trong gồm vài lớp tế bào bị ép dẹp, xếp xuyên tâm Hệ thống dẫn kiểu hậu thể liên tục Libe 1 tế bào hình chữ nhật kích thước nhỏ, không đều, vách uốn lượn, xếp thành cụm Libe 2 tế bào hình đa giác, xếp liên tục thành vòng Gỗ 2 nhiều, mạch gỗ gần tròn hoặc đa giác, kích thước không đều; mô mềm gỗ tế bào hình đa giác, vách tẩm chất gỗ, có những vùng mô mềm gỗ có vách dày hơn tạo thành vòng thường chứa rất ít mạch gỗ Gỗ 1 gồm 2-3 mạch, tế bào hình tròn, phân bố tương đối đều; mô mềm gỗ 1 hình đa giác, vách cellulose Libe quanh tủy 4-5 lớp tế bào hình đa giác, vách uốn lượn, xếp thành vòng liên tục Mô mềm tủy đạo, tế bào hình tròn hay bầu dục, kích thước không đều, càng vào trong càng to dần Tinh thể calci oxalat hình khối hoặc hình cầu gai kích thước không đều có nhiều trong mô mềm tủy và libe 2, ít hơn trong mô mềm vỏ
b Lá
Gân giữa: Vi phẫu mặt trên phẳng, mặt dưới lồi nhiều và tròn Biểu bì
1 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều, biểu bì trên nhỏ hơn biểu bì dưới, lớp cutin khá dày, có nhiều lông che chở đơn bào vách rất dày Mô dày góc, 5-6 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều, xếp lộn xộn Mô mềm đạo, nhiều lớp tế bào hình đa giác hoặc gần tròn, kích thước to Hệ thống dẫn hình cung có thể nối với 1-2 cung nhỏ hơn ở mỗi bên Gỗ ở trên libe ở dưới Gỗ, tế bào hình đa giác, kích thước không đều, xếp lộn xộn; mô mềm gỗ, tế bào hình đa giác nhỏ, vách tẩm chất gỗ, vài lớp phía dưới tế bào vách cellulose; libe, tế bào hình đa giác, vách uốn lượn, xếp lộn xộn; libe trong, 4-5 lớp tế bào hình đa giác, xếp thành cung liên tục phía trên gỗ Mô dày góc 8-9 lớp tế bào hình đa giác góc tròn,
Trang 5xếp liên tục quanh bó dẫn Sợi vách dày, xếp rải rác ngoài vòng mô dày Túi tiết ly bào ở gần biểu bì của gân giữa và thịt lá Tinh thể calci oxalat hình khối và hình cầu gai trong mô mềm và libe
c Phiến lá
Tế bào biểu bì trên hình chữ nhật, cutin mỏng Tế bào biểu bì dưới kích thước gần bằng tế bào biểu bì trên, lỗ khí nhiều và nhô cao hơn biểu bì Hạ bì 2-3 lớp tế bào hình chữ nhật, hóa mô dày góc Mô giậu, 2-3 lớp tế bào thuôn có khoảng 3-4 tế bào dưới mỗi tế bào hạ bì Mô mềm đạo 3-4 lớp, tế bào hình đa giác hay chữ nhật, chứa đầy lục lạp Tinh thể calci oxalat hình cầu gai có nhiều trong
mô dày và mô mềm
d Cuống lá
Vi phẫu có mặt trên lõm dạng hình chữ V, mặt dưới lồi tròn Biểu bì tế bào hình chữ nhật có lớp cutin khá dày, có nhiều lông che chở đơn bào vách rất dày Mô dày góc 4-5 lớp xếp lộn xộn, hình dạng thay đổi Nhiều túi tiết ly bào nằm gần biểu bì Mô mềm tế bào hình đa giác, kích thước không đều, có nhiều tinh thể calci oxalat hình khối và hình cầu gai Vài tế bào mô cứng hình đa giác trong mô mềm phía trên cung libe gỗ Hệ thống dẫn giống gân giữa lá Mô dày góc bao quanh cung libe gỗ
3 Đặc điểm bột dược liệu:
Bột dược liệu lá non có màu xanh, vị chát, có lẫn sợi, gồm các thành phần
Mảnh biểu bì trên tế bào hình đa giác xếp khít nhau Mảnh biểu bì dưới rất nhiều
lỗ khí kiểu song bào Mảnh mô mềm tế bào hình bầu dục vách mỏng Mảnh mô mềm phiến lá gồm biều bì trên, mô giậu tế bào thuôn, mô mềm đạo Mảnh mạch xoắn Tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình khối Lông che chở đơn bào nhiều, thường cong, vách rất dày
4 Phân bố, sinh học và sinh thái:
Là cây ăn quả phổ biến, được trồng hầu như khắp các địa phương, cả vùng đồng bằng lẫn ở miền núi, trừ vùng cao trên 1500m Cây ưa sáng, sinh trưởng phát triển tốt trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Giới hạn về nhiệt độ
từ 15-45 OC, nhiệt độ tốt nhất cho cây sinh trưởng và cho nhiều quả là từ 23-28 OC; lượng mưa 1000-2000 mm/năm Ổi ra hoa quả nhiều năm Cụm hoa thường xuất hiện trên những cành non mới ra cùng năm Thụ phấn nhờ gió hoặc côn
Trang 6trùng Vòng đời có thể tồn tại 40-60 năm Mùa hoa: tháng 3-4; mùa quả: tháng 8-9
5 Bộ phận dùng: Lá và quả xanh (Folium et Fructus Psidii guajavae)
6 Thành phần hóa học:
Lá ổi chứa tinh dầu (0,31%) trong đó có dl-limonen, β-sitosterol, acid maslinic, acid guajavalic Trong lá ổi non và búp non còn có 7-10% tanin pyrogalic, khoảng 3% nhựa
Cây, quả ổi có pectin, vitamin C
Hạt có tinh dầu hàm lượng cao hơn trong lá Vỏ thân có chứa acid ellagic
7 Tác dụng dược lý - Công dụng:
Thường được dùng trị viêm ruột cấp và mạn, kiết lỵ, trẻ em khó tiêu hóa
Lá tươi còn được dùng khi bị chấn thương bầm dập, vết thương chảy máu và vết loét Lá ổi chữa tiêu chảy và đau bụng đi ngoài Lá, búp ổi non còn được dùng chữa bệnh zona
II Khái niệm về siêu âm (ultrasound):
1 Khái niệm
Siêu âm là một dạng sóng điện từ cao tần (>20 KHz) tai người không nghe được (20 KHz > 1-16 KHz) Tần số: 10.000 KHz (> 10 MHz) dùng trong y học,
20 - 100 KHz sử dụng trong kỹ thuật định vị, 20 - 40 KHz sử dụng để tẩy sạch (nha, kim hoàn)
Siêu âm làm dung môi (tại các hốc ở bề mặt tiếp xúc) bị sủi bọt, đẩy tạp chất ra khỏi bề mặt mẫu Bản chất sóng siêu âm khác với sóng điện từ
Trang 72 Nguyên tắc, cơ chế hoạt động của siêu âm
Khi xuyên qua cơ thể, chỉ một lượng rất nhỏ của sóng siêu âm bị các mô hấp thụ và chuyển thành nhiệt năng Sự tỏa nhiệt này không kéo dài, không làm tăng bề mặt nhiệt độ tại chỗ
Phần lớn năng lượng của sóng siêu âm chuyển thành cơ năng (làm rung)
Sự rung kéo dài sẽ làm vỡ các bọt khí tại chỗ, gây tổn thương tại chỗ, đôi khi nghiêm trọng
Dưới tác dụng của siêu âm: dung môi tại các hốc nhỏ/dược liệu bị sủi bọt, đẩy chất cần chiết ra khỏi dược liệu, chất tan vào trong dung môi (chiết xuất)
3 Ưu điểm:
- Thiết bị tương đối đơn giản, bảo quản và vận hành đơn giản, thiết bị không quá đắt tiền
- Chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi chiết khá đa dạng
-Lượng mẫu: có thể lên đến hàng trăm gam
- Giảm được nhiệt độ và áp suất, ưu điểm này được ưu tiên áp dụng để chiết cho các hoạt chất không bền với nhiệt
- Tăng được khối lượng dịch chiết và rút ngắn được thời gian chiết, và như vậy cũng kéo theo tiết kiệm năng lượng đầu vào Như trong nghiên cứu này, lượng phenolic toàn phần thu được bằng UAE trong thời gian 15 phút cao hơn đáng kể so với chiết bằng SE trong thời gian 60 phút
Trang 84 Nhược điểm:
- Dung môi khó được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậy hiệu lực của nó là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly
- Thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làm mất một lượng dịch chiết hoặc dịch chiết có thể bị nhiễm bẩn
- Sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết
5 Phạm vi ứng dụng của siêu âm
Phạm vi ứng dụng của siêu âm là khá rộng
- Chiết xuất nhiều nhóm hợp chất từ nhiều dược liệu khác nhau đặt biệt
là những chất dùng cho thực phẩm
- Làm sạch bề mặt
- Phá hũy cấu trúc tế bào
- Phân tán
- Nghiền mịn tinh thể
Trang 9Tiến trình nghiền mịn Al(OH)3 dưới kính hiển vi
- Các bọt khí (nếu có) trong dung môi (HPLC) cũng bị phá vỡ (ứng dụng để chuẩn bị dung môi cho HPLC)
B ỨNG DỤNG SIÊU ÂM
1 Tác dụng chống oxy hóa của ổi
Ổi, như trong nhiều loại trái cây và rau quả khác, cũng giàu chất chống oxy hóa giúp giảm tỷ lệ mắc các bệnh thoái hóa như viêm khớp, xơ cứng động mạch, ung thư, bệnh tim, viêm và rối loạn chức năng não Ngoài ra, chất chống oxy hóa
đã được báo cáo để làm chậm lão hóa (Feskanich et al, 2000; Gordon, năm 1996; Halliwell, năm 1996) bên cạnh việc ngăn ngừa hoặc trì hoãn thiệt hại oxy hóa của chất béo, protein và axit nucleic gây ra bởi các phản ứng của Oxy Chúng bao gồm phản ứng của các gốc tự do như superoxide, hydroxyl, peroxyl, alkoxyl, và không phải các gốc tự do như hydrogen peroxide và hypochlorous acid
Họ khử các gốc tự do bắt đầu ức chế và phá vỡ phản ứng dây chuyền, ức
Trang 10hydroperoxide, dập tắt superoxide và oxy singlet (Shi et al, 2001) Trong số các chất chống oxy hóa trong trái cây như là polyphenols và acid ascorbic Các
polyphenol, hầu hết trong số đó là chất flavonoid, được trình bày chủ yếu trong este và các hình thức glycoside (Fleuriet Macheix, 2003) Trong trường hợp của
ổi, miễn phí elagic axit và glycosides của myricetin và apigenin được tìm thấy là
hiện tại (Koo và Mohamed, năm 2001)
2 Mục tiêu
Mục tiêu chính của nghiên cứu là để xác định các thông số điều hành tốt nhất cho việc chiết xuất hợp chất chống oxy hóa từ ổi thông qua phương pháp chiết xuất có hổ trợ siêu âm
3 Loại phương pháp trích ly
Có một số phương pháp khả thi cho mục đích khai thác như gián tiếp siêu
âm khai thác (IUE), Soxhlet khai thác (SOX) và khai thác siêu âm trực tiếp (DO)
3.1 Phương pháp siêu âm trực tiếp
Khai thác trực tiếp siêu âm (DO) được thực hiện bằng cách sử dụng hai cực extractants trong điều kiện tối ưu dành cho: 50 W công suất siêu âm và tổng số 15 phút khai thác thời gian Nó đã được chứng minh rằng việc khai thác các vùng cực
và không phân cực các thành phần bằng kỹ thuật DO với dichloromethan (DCM) diclomethan / methane (DCM) kết quả trong phục hồi tương đương hoặc cao hơn một chút hơn bởi SOX khai thác Những lợi thế đáng kể của DO trên SOX bao gồm các tiết kiệm thời gian khai thác và dung môi vì DO chỉ sử dụng 100ml dung môi so sánh với SOX sử dụng 250-500ml dung môi (Lee et al., 2001) Cả hai IUE
và DO có nhiều hiệu quả để tách các chất hữu cơ khác nhau So với quy ước IUE,
DO có thể được thực hiện trong vòng 15 phút, đó là một lợi thế hơn các phương pháp IUE (Zheng et al, 1997; Cheng et al, 1996; Abas et al, 1995; Marvin et al, 1992) Hơn nữa DO chỉ cần 50 W điện năng
3.2 Soxhlet Extraction
SOX khai thác là một trong các phương pháp tiếp cận lâu đời nhất và được
sử dụng rộng rãi nhất cho thông thường khai thác các mẫu rắn Những lợi thế của phương pháp này là: (a) mẫu là giai đoạn luôn luôn tiếp xúc với dung môi tươi, do
đó nâng cao chuyển của các hợp chất mục tiêu từ ma trận và (b) các hợp chất không bị phân hủy do điều kiện khai thác trung bình Những nhược điểm của kỹ thuật này là lượng nước trong mẫu có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chiết và cần
Trang 11thiết phải có thời gian dài để chiết (thường là 8 giờ hoặc nhiều hơn) (Lee et al., 2001)
3.3 Gián tiếp bằng siêu âm khai thác
Khai thác bằng siêu âm (IUE) có thể được sử dụng cho các mẫu lỏng và rắn, và cho khai thác của một trong hai hợp chất vô cơ hay hữu cơ (Harper et al, 1983) IUE là nhanh chóng, không tốn kém, và hiệu quả thay thế cho các quy trình Soxhlet thông thường (Munoz et sự, 2006) Người ta cho rằng việc sử dụng các IUE cho các mục đích chuẩn bị mẫu hóa phân tích môi trường sẽ trở nên phổ biến hơn, do đơn giản, dễ dàng tốc độ, sử dụng và tăng cường an toàn khi so sánh với khác, nhiều hơn thủ tục chuẩn bị mẫu truyền thống (Ashley, 1998) Siêu âm khai thác có được chứng minh là bằng hoặc hiệu quả hơn SOX khai thác Các ưu điểm chính của phương pháp này là một) khả năng lặp lại của kỹ thuật này; b) ứng dụng của phương pháp một loạt các mẫu có kích thước c) giảm đáng kể thời gian cần thiết để thực hiện cao hiệu quả khai thác, và d) khai thác hiệu quả của các hợp chất hữu cơ cực truyền thống siêu âm kích động, được gọi là hút siêu âm gián tiếp, sử dụng nước như kích động phương tiện giao thông vận tải năng lượng và phục hồi tổng số có thể đạt được trong tương đối ngắn thời gian (thường là 45-60 min) (Lee et al., 2000) Bảng 2.3 cho thấy sự so sánh về lợi thế tương đối của ba phương pháp (Lee et al., 2001)
Bảng 2.3: So sánh những lợi thế tương đối của ba phương pháp.
4 Yếu tố ảnh hưởng đến Hiệu suất trích xuất siêu âm