Nghiên cứu phát triển phương pháp LC MS MS phân tích CHLOTETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE và TETRACYCLINE trong thực phẩm trên địa bàn thành phố hạ long

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thốngAssociation of Official Analytical Chemists CTC Kháng sinh Chlotetracycline DAD Detetctor bán dẫn sử dụng mảng dio

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Hoàng Thị Phượng

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS PHÂN TÍCH CHLOTETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE VÀ TETRACYCLINE TRONG THỰC PHẨM TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẠ LONG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Hoàng Thị Phượng

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS PHÂN TÍCH CHLOTETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE VÀ TETRACYCLINE TRONG THỰC PHẨM TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẠ LONG

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS Nguyễn Văn Ri PGS.TS Tạ Thị Thảo

HÀ NỘI – 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đó

Hà Nội, ngày 28 tháng 2 năm 2018

Tác giả

Hoàng Thị Phượng

Lời cảm ơn

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới BS.CK2 Ninh Văn Chủ – Giám đốc Trung tâm Y tế dự phòng, Sở Y tế tỉnh Quảng Ninh và TS.Vũ Quyết Thắng -PGĐ Trung tâm Y tế dự phòng, Sở Y tế tỉnh Quảng Ninh đã tạo mọi điều kiện và nguồn lực để tôi hoàn thành luận văn này

Xin gửi lời trân trọng cảm tới PGS TS Tạ Thị Thảo cùng các thầy cô khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiê ̣n , giúp đỡ tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu, thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và thầy cô lớp Cao học khóa 2015- 2017 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Hà nội, ngày 21 tháng 12 năm 2017

Hoàng Thị Phƣợng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về kháng sinh nhóm Tetracycline 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Tính chất lý hóa của nhóm tetracycline 3

1.2 Các phương pháp chuẩn bị mẫu thực phẩm phân tích tetracycline 7

1.2.1 Phương pháp chiết tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thực phẩm 7

1.2.1.1 Phương pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ lực cơ học 7

1.2.1.2 Phương pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ áp suất (PLE) 7

1.2.2 Các phương pháp làm sạch dịch chiết mẫu 8

1.2.2.1 Phương pháp chiết pha rắn (SPE) 8

1.2.2.2 Phương pháp chiết lỏng lỏng 9

1.3.Các phương pháp phân tích kháng sinh tetracycline 9

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng 9

1.3.1.1 Phương pháp sắc kí lỏng ghép nối detector Diode array ( LC/DAD) 9

1.3.1.2 Phương pháp sắc kí lỏng ghép nối detector huỳnh quang (LC/FL) 10

1.3.1.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép nối detector khối phổ (LC-MS/MS) 10

1.3.2 Phương pháp điện di mao quản 11

1.3.3 Phương pháp sử dụng kit elisa 12

CHƯƠNG 2 - THỰC NGHIỆM 14

2.1 Hóa chất và thiết bị 14

2.1.1 Hóa chất 14

2.1.2 Thiết bị 15

2.1.3 Dụng cụ 16

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Nội dung 17

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.2.1 Lấy mẫu, bảo quản mẫu 17

2.2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu 18

2.2.2.3 Phương pháp phân tích 19

2.2.2.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích 23

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1.Tối ưu hóa các điều kiện phân tích các tetracycline trên hệ thống sắc kí lỏng khối phổ LC/MS-MS 26

3.1.1.Nghiên cứu tối ưu hóa các thông số của detector MS/MS 26

3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện của sắc kí lỏng 30

3.2 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình xử lý mẫu 33

3.2.1 Chiết tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu: 33

3.2.1.1 Lựa chọn dung môi chiết chất phân tích 33

3.2.1.2 Lựa chọn pH 36

3.2.2.Tối ưu hóa quá trình làm sạch mẫu 37

3.3 Các kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 42

3.3.1 Giới hạn phát hiện của thiết bị 42

3.3.2 Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) 43

3.3.4 Phương trình hồi qui tuyến tính 45

3.3.5 Độ chính xác của phương pháp 49

3.3.6.Đánh giá kết quả phân tích mẫu so sánh liên phòng 51

3.3.7 Độ đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp 51

3.3.8 Độ ổn định của phương pháp 53

3.3.9 Độ không đảm bảo đo 53

3.4 Phân tích mẫu thực tế 55

KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thống(Association of Official

Analytical Chemists)

CTC Kháng sinh Chlotetracycline

DAD Detetctor bán dẫn sử dụng mảng diode (DiodeArray Detector)

HPLC Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

IDL Giới hạn phát hiện của thiết bị (Identify detection limit)

MDL Giới hạn phát hiện (Minimum detection limit)

MQL Giới hạn định lượng (Maximum quantitation limit)

MRL Giới hạn tối đa cho phép (Maximum Residue Limit)

MS Detectơ khối phổ (Mass Spectrometry)

OTC Kháng sinh Oxytetracycline

PLE Chiết lỏng hỗ trợ áp suất (Pressure liquid extraction)

R Hiệu suất thu hồi (Recovery)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Devitation)

SD Độ lệch chuẩn (Standard Devitation)

TC Kháng sinh Tetracycline

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

tR Thời gian lưu (Rettention time)

WHO Tổ chức y tế thế giới (World Helth Organization)

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1Thông tin về nhóm tetracycline 6Bảng 2.1Thông số phân tích được cài đặt trong phần mềm phân tích của hệ MS/MS 19Bảng 2.2 Các điều kiện phân tích cho hệ thống sắc kí lỏng 22Bảng 3.1 Kết quả tối ưu hóa của MS/MS 26

Bảng 3.2 Cơ chế phân mảnh cho tetracycline, oxytetracycline và chlotetracycline 27

Bảng 3.3 Chương trình Gradient dung môi đã tối ưu 30 Bảng 3.4 Độ thu hồi và lặp lại khi chiết bằng đệm McILvaine EDTA và acetonitril

33Bảng 3.5 Độ thu hồi và lặp lại của mẫu trắng thêm chuẩn khi chiết bằng đệm

McILvaine ở các pH 3-4-5-6 36Bảng 3.6 Hiệu suất thu hồi khi thay đổi các điều kiện chiết pha rắn SPE 37Bảng 3.7Tỷ số S/N đối với từng chất (TC,OTC,CTC) ở từng nồng độ chuẩn (lặp lại

10 lần) 42Bảng 3.8 Kết quả tính S/N đối với từng chất (TC,OTC,CTC) ở từng nồng độ mẫu thêm chuẩn 43Bảng 3.9 : Độ lặp lại, thu hồi của phương pháp tại nồng độ MQL =5,0 µg/kg đối với từng chất (TC,OTC,CTC) 44Bảng 3.10 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ TC,OTC và CTC 45Bảng 3.11Độ chệch các điểm chuẩn của đường chuẩn xác định tetracycline 46Bảng 3.12 Độ chệch các điểm chuẩn của đường chuẩn xác định oxytetracycline 47Bảng 3.13 Độ chệch các điểm chuẩn của đường chuẩn xác định chlotetracycline 48Bảng 3.14 Độ lặp lại, thu hồi của phương pháp tại nồng độ 20 µg/kg, n=12 đối với từng chất (TC,OTC và CTC) 49Bảng 3.15 Độ lặp lại, thu hồi của phương pháp tại nồng độ 50 µg/kg, n=12đối với từng chất (TC, OTC, CTC) 50

Bảng 3.16 Kết quảphân tích 3 chất TC,OTC và CTC trong mẫu chuẩn so sánh 51

Bảng 3.17 Áp suất bơm và diện tích peak so sánh giữa lần bơm đầu tiên và lần bơm thứ 1000 53

Bảng 3.18 Tính độ không đảm bảo đo 54

Bảng 3.19 Kết quả phân tích các mẫu thủy sản 57

Bảng 3.20 Kết quả phân tích các mẫu thịt 60

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Mô hình phương pháp chiết hỗ trợ áp suất 8

Hình 1.2 Miêu tả 3 loại phản ứng Elisa 12

Hình 3.1 Phổ khối của tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline ở nồng độ 20 ppb 28

Hình 3.2Mảnh phổ của tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline ở nồng độ 20 ppb 29

Hình 3.3 Phổ khối của chương trình gradient chưa tối ưu 31

Hình 3.4 Phổ đồ của chương trình gradient đã tối ưu 32

Hình 3.5 Kết quả chiết mẫu bằng acetonitrile 34

Hình 3.6 Kết quả chiết mẫu bằng đệm McILvaine - EDTA 35

Hình 3.7 Đường chuẩn xác định tetracycline 46

Hình 3.8 Đường chuẩn xác định oxytetracycline 47

Hình 3.9 Đường chuẩn xác định CTC 48

Hình 3.10 Phổ khối TC, OTC và CTC của mẫu trắng 52

Hình 3.11 Phổ khối CTC của mẫu trắng thêm chuẩn ở 10 ppb 52

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đã trở thành vấn đề chung được toàn xã hội quan tâm Nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên quan giữa bệnh tật và thực phẩm mất an toàn Có rất nhiều nguyên nhân và nguy cơ, trong đó kể đến việc nuôi, trồng, vận chuyển, chế biến và bảo quản không đúng qui trình, qui cách Thêm vào đó là việc cố ý tạo ra sản phẩm không an toàn của không ít các nhà kinh doanh thực phẩm

vì chạy theo lợi nhuận kinh tế

Một trong các vấn đề nóng hiện nay chính là tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm thực phẩm Nguyên nhân dẫn đến việc tồn dư kháng sinh là việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi để phòng chống bệnh tật cho vật nuôi, kích thích sinh trưởng cũng như dùng làm chất bảo quản, giúp thực phẩm tươi lâu

Khi người tiêu dùng sử dụng những thực phẩm chứa tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng giới hạn cho phép sẽ dẫn đến hậu quả khôn lường Phản ứng xảy ra tức thời

là một số kháng sinh gây dị ứng đối với một số người, phản ứng lâu dài sẽ là sự kháng thuốc của vi sinh vật đối với các loại kháng sinh Trên thế giới đã có những

ca bác sĩ không thể cứu được bệnh nhân vì bệnh nhiễm khuẩn do kháng tất cả các loại kháng sinh hiện có

Tại Việt Nam, việc sử dụng kháng sinh trong bảo quản thực phẩm bị cấm tuyệt đối Theo thông tư 10/2016 kí ngày 1/6/2016 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn thì có 24 loại hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong chăn nuôi thủy sản như Chloramphenicol, Nitrofuran, Enrofloxacin, Ciprofloxacin… và 16 loại hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh động vật trên cạn như Chloramphenicol, Furazolidon và dẫn xuất của nhóm Nitrofuran, Dimetridazole, Metronidazole, Dipterex Ciprofloxacin, Ofloxacin….Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (NN&PTNT), Thông tư 06/2016 kí ngày 31/5/2016 cũng quy định 15 loại hóa chất, kháng sinh được phép sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm với mục đích kích thích sinh trưởng, bao gồm: Bambermycins, BMD (Bacitracin Methylnene-Disalicylate), Chlortetracyline, Colistin sulphate, Enramycin… nhưng sẽ bị cấm sử dụng bắt đầu từ 31/12/2017

2

Trong số đó, tetracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất Hiện cókhoảng gần 10 tetracycline tự nhiên nhưng trên thực tế chỉ sử dụng 4 loại là chlortetracycline, tetracycline, oxytetracycline và demechlocycline dưới dạng thuốc

và các chế phẩm bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Tại Việt Nam chỉ sử dụng phổ biến

3 loại kháng sinh Tetracycline, Oxytetracycline và Chlortetracycline

Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “nghiên cứu phát triển phương pháp

LC-MS/MS phân tích chlortetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long” với mục tiêu là :xây dựng phương pháp xác định

hàm lượng chlotetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm và áp dụng để phân tích thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long

3

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về kháng sinh nhóm Tetracycline

1.1.1 Giới thiệu chung

Các tetracycline được phát hiện rất sớm, từ năm 1948, là kháng sinh phổ rộng đầu tiên ức chế hầu hết các vi khuẩn gram âm, gram dương và Ricketsisa… nên được sử dụng rộng rãi cho đến những năm 80 của thế kỉ XX, nhất là ở các nước đang phát triển Hiện nay, các kháng sinh tự nhiên của nhóm này như tetracycline,

chlortetracycline, oxytetracycline chủ yếu được sử dụng trong chăn nuôi để điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm và được phối hợp bổ sung với vitamin B12 vào thức ăn trong chăn nuôi có tác dụng kích thích tăng trọng Các kháng sinh nhóm tetracyclines bán tổng hợp được dùng rộng rãi hơn để điều trị các bệnh nhiễm trùng như bệnh đau mắt hột, mắt đỏ, viêm giác mạc, viêm phế quản, viêm tiết niệu do lậu cầu và đặc biệt để điều trị các bệnh dịch hạch [2]

Các tetracycline đều dễ bị kháng thuốc, ở Việt Nam có 92,9 % Salmonella typhi, 41,4% H influenza, 87,8% Klebsiella pnuemoniae kháng lại thuốc tetracyclin… Cơ chế tác dụng của các tetracyclin là phong tỏa hoạt động của nhiều ezym tham gia vào các quá trình trao đổi chất, ức chế quá trình tổng hợp protein của

vi khuẩn Khi kháng thuốc: vị trí gắn của tetracycline trên ribosom bị biến đổi do đó tetracycline không gắn được vào ribosom và mất đi tác dụng Các đại diện tiêu biểu cho nhóm bao gồm các chất sau: Tetracycline, Oxytetracycline,

Chlortetracycline,Minocyclin, Doxycyclin [2]

1.1.2 Tính chất lý hóa của nhóm tetracycline

Các tetracycline tồn tại dạng tinh thể màu vàng sáng, tan kém trong nước, 1g /2500 mL nước, hoặc 50 mL cồn Tan tốt trong dung dịch kiềm và axit, đặc biệt

4

không tan trong dung môi chloroform và ether Nhóm tetracycline bền vững với axit nên dùng để uống được nhưng do có nhiều tác dụng phụ, đặc biệt là tạo phức canxi bền vững làm cho răng bị ố vàng nên bị cấm dùng cho trẻ em dưới 10 tuổi Tetracycline có tính chất lưỡng tính, do trong phân tử của chúng chứa nhóm dimethylamino có khả năng tạo muối với canxi, các nhóm hydroxyl có khả năng tạo muối với kiềm hoặc với các ion Ca2+, Mg2+ (tạo tetracyclinate) Bên cạnh đó, tetracycline không bền vững với các tác nhân oxy hóa ngay cả với oxy trong không khí, bị phân hủy bởi ánh sáng

Trong dung dịch kiềm, tetracycline dễ bị oxy hóa thành dẫn chất có màu thẫm Do cấu trúc hydronaphtaxenic mà tetracycline dễ bị đồng phân hóa trong dung dịch pH từ 2,0 đến 6,0 tạo ra các epitetracycline không có tác dụng kháng sinh Hiện tượng đồng phân hóa xảy ra nhanh hơn ở tetracycline và chlotetracycline Trong môi trường kiềm hay quá axit (pH lớn hơn 9 hay pH nhỏ hơn 1) các tetracycline bị khử hoạt tính do tạo thành các dẫn chất anhydro và isotetracycline.Trong môi trường axit loãng, tetracycline bị mất nước để tạo thành anhydrotetracycline Anhydrotetracycline bị phân hủy và lacton hóa tiếp tục để tạo thành apoterramycine

Apoterramycine

Trong môi trường kiềm nhẹ, carbon vị trí 11a của tetracycline, được biến đổi

thành isotetracycline

Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+, Be 2+, Al 3+, phosphate, citrates, salicylat, p-hydroxybenzoat,

anion saccharin, caffiene, urê, thiourea, polivinylpyrolidone, albumin huyết thanh,

lipoprotein, globulins, và RNA

Các thông tin chung về nhóm tetracycline đƣa ra trong bảng 1.1

11a

6

Bảng 1.1Thông tin về nhóm tetracycline

Tetracycline Oxytetracycline Chlotetracycline

Danh pháp

quốc tế

(4S,4aS,5aS,6S,12aR)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-

carboxamide

tetrahydrotetracene-2-(Dimethylamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12aoctahydro-

4-3,5,6,10,12,12a - hexahydroxy-6methyl-1,11-dioxo-2-

naphthacenecaboxami

de

7-chloro-4-

(4S,4aS,5aS,6S,12aR)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide

7

1.2 Các phương pháp chuẩn bị mẫu thực phẩm phân tích tetracycline

1.2.1 Phương pháp chiết tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thực phẩm

1.2.1.1 Phương pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ lực cơ học

Chiết lỏng rắn là quá trình dung môi thẩm thấu vào nền mẫu rắn, dựa vào khả năng hòa tan của dung môi với chất phân tích kết hợp lực lắc, rung siêu âm chất phân tích được tách ra khỏi nền mẫu rắn hòa tan trong dung môi

Tetracycline được chiết ra khỏi mẫu thực phẩm (thịt, thủy sản, trứng, sữa, mật ong )

bằng dung dịch đệm McILvaine - EDTA pH 4± 0,05 theo các tiêu chuẩn của Việt Nam

[10], [11], [12], tiêu chuẩn quốc tế [18], [19]và có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng đệm này [23], [26], [41], [48], [50], [51], [56], [52], [62] cho kết quả về độ lặp lại rất tốt, ở khoảng nồng độ từ 1 – 200 µg/kg hệ số biến thiên CV nhỏ hơn 8,9%

Ngoài ra, sử dụng một số dung dịch chiết khác hỗn hợp Acetonitril + nước để chiết mẫu thịt [23], [47],[61], dung dịch muối succinate điều chỉnh pH 4 để chiết mẫu trứng, sữa, thịt [23], [31] đưa ra các két quả hệ số biến thiên CV nhỏ hơn 11,2 % đối với khoảng nồng độ từ 20 – 1200 µg/kg Tuy nhiên không có thông tin về hiệu suất thu hồi của quá trình chiết mẫu của tất cả các tiêu chuẩn và công trình nghiên cứu

1.2.1.2 Phương pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ áp suất (PLE)

Dựa trên nguyên tắc nhiệt độ sôi của dung môi được tăng lên dưới áp suất cao,

độ nhớt dung môi và sức căng bề mặt giảm, khả năng hòa tan của chất phân tích tăng làm suy yếu liên kết giữa chất phân tích với nền mẫu Do áp suất cao cho phép các dung môi thâm nhập sâu hơn vào nền mẫu, tạo thuận lợi cho việc chiết các chất phân tích ra khỏi nền mẫu, làm quá trình chiết nhanh hơn và độ thu hồi tốt hơn

(xem Hình 1.1)

8

Hình 1.1 Mô hình phương pháp chiết hỗ trợ áp suất

Trong phương pháp này, mẫu được nghiền nhỏ, trộn với tinh thể EDTA sau đó được đưa vào hệ thống chiết PLE, dung môi được chọn là acetonitril[43], [69]methanol điều chỉnh pH =4 [40] Phương pháp cho hiệu suất thu hồi rất tốt trong khoảng 95 – 99,8% với khoảng nồng độ 20 – 500 µg/kg

1.2.2 Các phương pháp làm sạch dịch chiết mẫu

1.2.2.1 Phương pháp chiết pha rắn (SPE)

Chiết pha rắn là quá trình phân bố của chất phân tích giữa 2 pha, trong đó lúc đầu chất phân tích tồn tại trong pha lỏng (pha nước hoặc pha hữu cơ) còn chất chiết (pha tĩnh) ở dạng rắn, là các hạt silica trung tính, nhôm oxit, hay hạt sislica bị ankyl hóa nhóm -OH bằng nhóm carbon mạch thẳng - C2, -C4, -C8, -C18… hay nhân phenyl Khi xử lý mẫu, dịch chiết được đưa lên cột chiết SPE, nhóm chất cần phân tích được giữ lại trên cột, các chất khác không tương tác đi ra khỏi cột cùng dung môi Chất phân tích được rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi thích hợp

Các phương pháp tiêu chuẩn của Việt Nam[10], [11], [12], tiêu chuẩn quốc tế [18], [19] sử dụng cột chiết SPE C18 để làm sạch tạp chất sau khi chất phân tích được chiết ra khỏi nền mẫu Bên cạnh đó, có một số công trình nghiên cứu đã được công bố

Dung môi

Bơm

Lò Van chiết Van tĩnh Bình thu

Van thanh trùng

Nitrogen

(100-180 0 C) (1500-2000 psi)

1.2.2.2 Phương pháp chiết lỏng lỏng

Dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích vào 2 pha dung môi không trộn lẫn,

hệ số phân bố Kd là yếu tố quyết định đến hiệu quả của quá trình chiết, bên cạnh đó nhiệt độ, pH cũng rất quan trọng đối với quá trình chiết

Chất phân tích sau khi được chiết rắn lỏng ra khỏi nền mẫu, được làm sạch bằng phương pháp chiết lỏng lỏng, mục đích chủ yếu là loại bỏ các tạp chất không tan trong dung môi hữu cơ Các dung môi chiết sử dụng là n.hexane, chloroform [32]

và acetonitrile [42], hỗn hợp methanol+diclomethan [41] Phương pháp này rất hiệu quả đối với những nền mẫu nhiều chất béo, tuy nhiên hiệu suất thu hồi không cao trong khoảng 75 – 82%

1.3.Các phương pháp phân tích kháng sinh tetracycline

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng

Nguyên tắc: Dựa vào ái lực của 2 pha rắn và lỏng đối với chất phân tích mà xảy ra quá trình hấp thụ và nhả hấp liên tiếp giữa pha rắn và pha lỏng trên các đĩa lý thuyết mà các chất phân tích được tách ra khỏi nhau và tách ra khỏi nền mẫu

Trong phương pháp này, sử dụng 3 loại detector để phát hiện Tetracycline

1.3.1.1 Phương pháp sắc kí lỏng ghép nối detector Diode array ( LC/DAD)

Tetracycline giống như các hợp chấy hữu cơ khác, trong phân tử chứa các vòng thơm, các nối đôi và nối đôi liên hợp, chứa các nhóm chức như nhóm amin, halogen, OH… do vậy chúng có khả năng hấp thụ bước sóng vùng UV- Vis sử dụng detector DAD để phát hiện các chất nhóm tetracycline

10

Tiêu chuẩn Việt Nam [10], [11], [12] và một số công trình nghiên cứu [39], [51], [62], sử dụng cột C18 để tách chất, hệ dung môi pha động là acetonitril và axit oxalic 0,01M Bước sóng hấp phụ chọn là 360 nm

Theo tiêu chuẩn quốc tế [18], [19] và một số nghiên cứu [30], [44], [56], [66], [69] sử dụng cột C18 để tách chất, hệ dung môi pha động là acetonitrile, methanol

và axit oxalic 0,01M Bước sóng hấp phụ chọn là 350 nm

Các kết quả công bố hiệu suất thu hồi tốt trong khoảng (80 – 95%) tuy nhiên giới hạn phát hiện của phương pháp khá cao khoảng 20 µg/kg

1.3.1.2 Phương pháp sắc kí lỏng ghép nối detector huỳnh quang (LC/FL)

Các tetracycline có khả năng phát huỳnh quang khi được kích thích bởi sóng điện từ có bước sóng phù hợp Vì vậy sử dụng detector huỳnh quang để phát hiện tetracycline cho kết quả rất đặc hiệu Một số công trình nghiên cứu sử dụng cột tách C8,pha động là methanol+nước, bước sóng kích thích 370 /390nm, bước sóng huỳnh quang 450/512nm [22], [51] Các kết quả công bố hiệu suất thu hồi của phương pháp rất tốt trong khoảng 87 – 95 %, giới hạn phát hiện khoảng 5 µg/kg

1.3.1.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép nối detector khối phổ (LC-MS/MS)

Trong phép đo khối phổ, chất phân tích được ion hóa mềm trong buồng ion hóa tạo ra mảnh ion phân tử, qua tứ cực Q1 lọc và chọn mảnh khối, được phân mảnh tạo ra các ion con qua bát cực Q2, lọc và chọn mảnh khối phù hợp qua tứ cực Q3 Theo yêu cầu của EC/657/2002 [20] để xác nhận một chất trong phương pháp sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS cần xác định được một ion mẹ và 2 ion con đặc trưng cho chất phân tích và mảnh ion con có cường độ cao nhất được dung để định lượng chất phân tích

Tetracycline được xác định rất tốt bằng phương pháp phân tích LC-MS/MS,

sử dụng cột C18 và pha động bao gồm Methanol chứa 0,1% axit formic và nước cất deion chứa 0,1% axit formic [23], [34], [48], [52], [58], [68] và pha động gồm acetonitril chứa 0,1% axit formic và nước cất deion chứa 0,1% axit formic [24],

11

[28], [50], [60], [61] Phương pháp phân tích này cho hiệu suất thu hồi tốt 78 – 103% với khoảng nồng độ từ 5- 100 µg/kg, giới hạn phát hiện thấp khoảng 1 µg/kg, đặc biệt có thể phân biệt các đồng phân quang học dạng epi của nhóm TCs khi sử dụng hệ dung dịch pha động phù hợp

1.3.2 Phương pháp điện di mao quản

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đường kính 25 - 100 µm ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều ( 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ điện trường E điều khiển sự tách của các chất Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao

Kĩ thuật điện di mao quản mới được phát triển những năm trở lại đây, có thời gian phân tích nhanh, tốn ít dung môi và hóa chất Việc xác định kháng sinh tetracycline trong thực phẩm hiện nay vẫn đang được nghiên cứu và có khả năng ứng dụng cao Hơn nữa phương pháp này vận hành đơn giản, có tính ứng dụng cao khi mang ra hiện trường

Nhược điểm của phương pháp là: thời gian di chuyển của mẫu giữa các lần phân tích không giống nhau, do vậy tính ổn định của phương pháp chưa cao hay độ lặp lại kém Những năm gần đây người ta đã cố gắng khắc phục và hoàn thiện dần những nhược điểm của phương pháp này

Theo nghiên cứu [41], detector UV được kết nối với hệ thống điện di, ống mao quản có chiều dài 57 cm và đường kính 75µm, sử dụng phương pháp tiêm mẫu thủy động với áp suất 3,45kPa Nhiệt độ cột mao quản duy trì ở 220C, điện thế đặt là 20kV Dung dịch điện giải có thành phần acid Boric 20mM, monosodium phosphate 10 mM và điều chỉnh pH=2,7 bằng acid phosphoric đặc

12

1.3.3 Phương pháp sử dụng kit elisa

Phương pháp Elisa (Enzym linked immunosorbent assay) là kĩ thuật thực hiện

trên đĩa 96 giếng hoặc 384 giếng để phát hiện và định lượng peptide, protein, kháng thể và các phân tử sinh học Nguyên tắc của phương pháp là một kháng nguyên được cố định trên bề mặt đĩa sẽ tạo phức với kháng thể đặc hiệu liên kết với một enzym Phân tích kết quả bằng tín hiệu phát ra khi cơ chất enzym được giải phóng

và phát tín hiệu huỳnh quang

Các phương pháp Elisa chủ yếu gồm 3 loại Elisa trực tiếp, Elisa gián tiếp và phương pháp Elisa “Sandwich” Hình 1.2 mô tả 3 phương pháp

Hình 1.2 Miêu tả 3 loại phản ứng Elisa

Phương pháp Elisa trực tiếp: Sử dụng một kháng thể có gắn cơ chất enzym

sẽ liên kết trực tiếp với kháng nguyên trên bề mặt đĩa phản ứng Khi phản ứng bắt cặp xảy ra sẽ giải phóng cơ chất phát tín hiệu huỳnh quang

Phương pháp Elisa gián tiếp: Một kháng thể thứ cấp sẽ được bổ sung và bắt

cặp đặc hiệu với kháng thể sơ cấp đã bắt cặp với kháng nguyên Kháng thể sơ cấp

có gắn cơ chất sẽ phát tín hiệu khuếch đại khi xảy ra phản ứng bắt cặp kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu

Phương pháp Elisa “Sandwich”: Một kháng thể gắn sẽ được sử dụng để gắn

kháng thể sơ cấp, tiếp theo kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất enzym được bổ sung

để bắt cặp với kháng thể thứ cấp trong phản ứng Tín hiệu khuếch đại thu được khi

13

có sự bắt cặp kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu [33], [40], [60] Các kết quả công

bố cho giới hạn phát hiện rất thấp khoảng 4 µg/kg đối với mẫu thịt, thủy sản và khoảng 2 µg/kg đối với mật ong và sữa

Kết luận phần tổng quan

Qua nghiên cứu kết quả các bài báo quốc tế, các tiêu chuẩn phân tích tetracycline của Việt Nam, AOAC , chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết rắn lỏng kết hợp kỹ thuật lắc để tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thịt và thủy sản, sử dụng dung môi chiết là đệm McILvaine – EDTA pH 4, khử tạp chất bằng dun dịch axit trichloacetic, làm giầu và làm sạch mẫu bằng chiết pha rắn SPE sử dụng cột C18 và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ (LC/MS-MS)

Chất chuẩn nhóm tetracycline dạng bột khan bao gồm: tetracycline, oxytetracycline và chlotetracycline với độ tinh khiết 99,99% của hãng Sigma Aldrich – Đức

Dung dịch chuẩn gốc riêng biệt oxytetracycline, tetracycline, clotetracycline Cân trên cân phân tích (độ đọc 0,01 mg) khoảng 10 mg mỗi chất chuẩn vào 3 bình định mức dung tích 10 mL Hoà tan và định mức đến vạch bằng methanol Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -20 0C trong 1 tháng

Hỗn hợp dung dịch chuẩn trung gian, 1 μg/mL mỗi chất: được pha hai tuần một lần trong methanol từ dung dịch chuẩn gốc, bảo quản sau khi sử dụng ở 40C

Hỗn hợp dung dịch chuẩn làm việc(5,10,20,40,60,80,100 ng/mL) được pha mới hàng ngày trong methanol từ các dung dịch chuẩn trung gian

Dung dịch đệm McIlvaine pH ( 4  0,05): Cân 28,40 g Na2HPO4 khan hoà tan bằng nước cất vào bình định mức 1 lít rồi định mức tới vạch, lắc đều hỗn hợp Cân 21,00 g axit citricmonohydrat hoà tan bằng nước cất vào bình định mức 1 lít khác,

và định mức tới vạch, lắc kỹ Trộn 1 lít axit citric ở trên với 625 ml dung dịch

Na2HPO4 Điều chỉnh pH bằng 4  0,05 dùng máy đo pH, dung dịch này sử dụng được trong 2 tuần

15

Dung dịch đệm McIlvaine –EDTA: Cân 60,00 g Na2EDTA.2H2O thêm vào 1,625 lít đệm McIlvaine và trộn hỗn hợp tới khi tan hết Dung dịch này sử dụng được trong 2 tuần

Dung dịch axit trichloacetic ( TCA) 1,0 g/ml: Cân 50,00 g axit trichloacetic

vào cốc thủy tinh có mỏ 100ml, thêm nước cất 2 lần cho tan hết Chuyển vào bình định mức 50 ml và định mức tới vạch

Dung môi pha động: Hút 1,0 mL axit formic trộn với 1 lit acetonitrile loại đặc biệt tinh khiết dành cho MS/MS, sau đó siêu âm khoảng 15 phút để đuổi hết bọt khí, thu được dung môi kênh B Tiếp tục thêm 1,0 mL axit formic vào 1 lít nước cất deion đã được lọc qua bộ lọc sử dụng màng lọc 0,45µm, siêu âm 15 phút đuổi hết bọt khí, thu được dung môi kênh A

2.1.2 Thiết bị

Hệ thống sắc lỏng ghép nối 2 lần khối phổ (LC/MS-MS) model 8040 của hãng Shimadzu - Nhật bản, hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao có khả năng tăng áp suất tối đa 300psi, có buồng điều nhiệt cột lên tới 1000C, hệ thống bơm mẫu tự động với

2 khay đựng mẫu 60 vị trí, 2 bơm dung môi áp suất cao, tự động loại khí Hệ thống khối phổ sử dụng bộ ion hóa điện hóa, điện áp tối đa của bộ ion hóa +5kV - (-5kV), nhiệt độ tối đa buồng ion hóa 5000C, điện áp tối đa cho 2 tứ cực là 50 V, điện áp tối

đa cho bát cực bắn phá ion là 300V Có khả năng phát hiện các mảnh khối (m/z) từ 10-2000, độ phân giải 1000u/giây, độ nhạy đối với chuẩn resrpine hàm lượng 1pg, m/z 609,3>195 có S/N>1000 Tốc độ quét 15.000 u/giây, thời gian quét đổi từ ion

âm sang ion dương là 15 ms

-Thiết bị li tâm của hãng Hettich- Đức có tốc độ xoay vòng tối đa là 5000 vòng/phút;

-Máy siêu âm S100 Elmasonic của hãng ELMA- Đức, tần số siêu âm 37000 Hz, công suất siêu âm là 600W, có khả năng gia nhiệt đến 1500C

16

-Máy đồng nhất mẫu Votex của hãng velp của nước Ý, tốc độ lắc dao động đến

2500 rpm với hai chế độ hoạt động là liên tục và tiếp xúc START/STOP;

-Cân phân tích RX 150 hãng Mettler Toledo (có độ đọc của cân 0,01 mg) - Thụy Sĩ -Cân phân tích PA 213 hãng Ohaus(có độ đọc của cân 0,001 g) - Thụy Sĩ

-Máy đồng nhất mẫu IKA 150 hãng velp - Ý

-Máy lắc tròn 3016 hãng GFL - Đức

-Máy khuấy từ gia nhiệt ARE hãng Velp - Ý

-Máy đo pH 2020 hãng Hanna - Mỹ, độ chính xác 0,01 đơn vị pH

-Bộ lọc nước và dung môi có gắn bơm hút chân khônghãng Sigma Aldrich - Đức -Bộ chiết pha rắn SPE có gắn bơm hút chân không của hãng Shimazhu -Nhật bản 2.1.3 Dụng cụ

Pipet chia vạch: 1, 2, 5, 10, 20 ml thủy tinh loại A

Bình định mức: 5, 10, 50, 100 ml thủy tinh loại A

Ống đong dung tích 50 ,100, 200 ml

Ống fancol 50 mL, 15 mL

Cột chiết pha rắn C18 hãng Agilent Mỹ

Pipet tự động pasteur loại P 20-100 µl, P 100-1000 µl; P5 - 20 µl

Vial loại 2 ml dành cho bơm mẫu tự động của sắc kí lỏng

Cốc thủy tinh có mỏ loại 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000mL, phễu, giấy lọc

Màng nilon lọc nước và dung môi hữu cơ kích thước 0,45µm

Filter lọc mẫu kích thước 0,45 µm

Bơm kim tiêm thể tích 3mL (loại dùng một lần)

17

Cột táchInertsustain C18 hãng GL scientific – Nhật bản, kích thước hạt 3µm, đường kính cột 2,1mm, chiều dài: 150 mm

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xây dựng phương pháp xác định đồng thời dư lượng 3 kháng sinh tetracycline, oxytetracycline và chlotetracycline trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép 2 lần khối phổ (LC/MS-MS) từ

đó áp dụng khảo sát dư lượng kháng sinh nhóm tetracycline trong thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long

Để đạt được mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu các vấn đề sau:

-Xây dựng qui trình phân tích

+Khảo sát lựa chọn các điều kiện tối ưu của detecto khối phổ (MS)

+Khảo sát lựa chọn các điều kiện tối ưu của hệ thống sắc kí lỏng (LC)

+Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp theo ISO 17025 :2005 [7], hướng dẫn tính độ không đảm bảo đo [17], và hướng dẫn xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp theo EC/657/2002 [20]

-Ứng dụng phương pháp xây dựng được trong phân tích mẫu xác định dư lượng kháng sinh tetracycline trong thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Lấy mẫu, bảo quản mẫu

Mẫu được lấy theo qui định trong thông tư 14/2011/TT-BYT - Hướng dẫn chung về lấy mẫu thực phẩm phục vụ thanh tra, kiểm tra chất lượng, vệ sinh an toàn thực phẩm Mẫu thịt và các sản phẩm thịt lấy theo TCVN 4833-1: 2002 [9] và mẫu thủy sản lấy theo TCVN 5276: 1990 [8]

18

2.2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

Mẫu phân tích được lấy về phòng thí nghiệm sau khi mã hóa, được chia thành

2 phần, một phần lưu giữ trong tủ lạnh âm sâu (-200C) một phần để phân tích Tiền xử lý mẫu: Đối với các mẫu thủy sản như tôm, cá, mực, hàu sữa… bóc hết vỏ, mai, ruột, vẩy, xương chỉ lấy phần thịt ăn được, đối với mâu thịt chỉ lấy phần thịt nạc bỏ hết mỡ và bì Sau đó đồng nhất toàn bộ lượng thịt thu được bằng máy đồng nhất mẫu và phân tích ngay, nếu không phải được bảo quản trong bể lạnh (-200C)

-Chuẩn bị mẫu:

+Chuẩn bị mẫu phân tích: mẫu sau khi được đồng nhất cân những lượng bằng nhau (5 gam ) vào ống fancol 50 mL, thường mỗi mẫu phân tích lặp lại 3 lần và kèm một mẫu thêm chuẩn

+ Chuẩn bị mẫu trắng: là mẫu giống như mẫu phân tích nhưng không có thành phần tetracycline

Mẫu trắng thịt: lựa chọn thịt của công ty Lebio

Mẫu trắng thủy sản: lựa chọn các sản phẩm thủy sản trong siêu thị Vinmex.Các mẫu trắng gửi song song tại 2 phòng thí nghiệm đã đạt ISO 17025 về chỉ tiêu phân tích nhóm tetracycline là trung tâm phân tích nông sản vùng 1 và viện kiểm nghiệm quốc gia đều cho kết quả là không phát hiện Mẫu trắng được xử lý giống như mẫu phân tích

- Mẫu trắng thêm chuẩn: Cân trên cân phân tích vào 7 ống fancol một lượng (5 gam ) mẫu trắng vào mỗi ống, sau đó thêm 2 mL từng dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng

độ (5,10,20,40,60,80,100 µg/L) vào lần lượt từng ống để xây dựng đường chuẩn làm việc, sau đó lắc bằng máy lắc tròn 1 phút để chuẩn phân bố đều vào trong mẫu, sau đó để yên trong 30 phút để chuẩn có thời gian thẩm thấu vào trong mẫu

Làm sạch và làm giầu mẫu:Trước tiên cần hoạt hoá cột lần lượt bằng 3 ml MeOH loại tinh khiết phân tích, 3 ml nước cất deion, 3mL đệm Mc llvaine EDTA, sau đó nạp mẫu qua cột, tốc độ chảy không quá 2 ml/phút Khi toàn bộ lượng mẫu

đã được nạp xong, loại bỏ tạp chất bằng 3 ml nước cất.Hút khô 1 phút bằng máy hút chân không, sau đó ly tâm tách nước ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút Cuối cùng rửa giải bằng 2 ml dung môi MeOH loại đặc biệt tinh khiết dùng cho MS/MS, tốc độ rửa giải không quá 2mL/phút, lọc qua màng 0,45 µm rồi bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

2.2.2.3 Phương pháp phân tích

-Các thông số của hệ MS/MS

Lựa chọn phương pháp ion hóa điện hóa (ESI), các thông số nhiệt độ buồng ion hóa, điện thế cho bộ phận kết nối giữa sắc kí lỏng và khối phổ được tối ưu bằng chương trình turning với chất chuẩn là reserpine, một số thông số khác như tốc độ khí dẫn mẫu, khí làm khô, áp suất chân không, áp suất khí bắn phá được tối ưu hóa

và cài đặt sẵn trong phần mềm được đưa ra trong bảng 2.1

Bảng 2.1Thông số phân tích được cài đặt trong phần mềm phân tích của hệ MS/MS

20

Khí Nebulzer(khí dẫn mẫu trong bộ ion

hóa) khí nito

Tốc độ 3.0 mL/phút

Khí Drying(khí làm khô mẫu) khí nito Tốc độ 15 mL/phút

Khí CID(khí hỗ trợ bắn phá ion) Áp suất 230 Pa

Điện thế cho interface HV(Bộ phận kết

nối giữa sắc kí lỏng và khối phổ)

(+ 4,5 kV) và (-3,5 kV)

Ống mao quản vận chuyển ion (DL) Nhiệt độ 2500C

Nhiệt độ buồng ion hóa (Heated Block) Nhiệt độ 4000C

Dwell time (số lần quét /giây) 100u/s

Hệ thống chân không :

Chân không sâu sử dụng bơm turbo

Chân không ngoài sử dụng bơm Rotary

Tốc độ hút đối với tứ cực thứ nhất Q1: 40L/s, Q2 bát cực là 260L/s, tứ cực thứ 2 Q3 là 210 l/s

bị ở chế độ full scan (quét toàn dải), chế độ ion dương để tìm các mảnh ion mẹ gồm

mảnh (m/z= 445) của tetracycline, mảnh (m/z = 461) của oxytetracycline và mảnh (m/z = 479) của chlotetracycline Tiếp tục tìm các mảnh ion con, chọn chế độ

Product ion scan (quét các mảnh ion con) lựa chọn thế bắn phá của CE từ thấp

khoảng 10eV đến cao, cho đến khi còn khoảng 10% ion mẹ, lựa chọn CE đó để tiếp

tục chương trìnhAuto MRM(Multiple Reaction Monitoring ) tự động lực chọn các

phản ứng,kết quả là thu được Q1, CE, Q3 tối ưu cho từng mảnh ion con của từng chất phân tích (thường có 3 mảnh ion con đặc trưng )

-Hệ sắc kí lỏng

21 Cần khảo sát chương trình gradient tỉ lệ các dung môi giữa 2 kênh A và B để quá trình tách là tốt nhất, thông số khác đặt theo bảng 2.2

Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 20 ppb để khảo sát chương trình gradient Trước tiên đặt tỉ lệ thể tích ban đầu giữa kênh nước và dung môi là 90:10, sau đó tăng dần tỉ lệ dung môi 5%/1 phút Kết thúc lần phân tích đầu tiên, xác định khoảng thời gian lưu của 3 chất TC, OTC, CTC tương ứng với tỉ lệ dung môi, từ đó thay đổi chương trình gradient, tuy nhiên không thiết lập chương trình quá nhiều bước thay đổi nhằm thiết lập nhanh sự ổn định của áp suất cột, đến khi các chất tách ra hoàn toàn, peak của chất nhọn, cân đối

23

C0: là nồng độ mẫu xác định trên đường chuẩn (µg/L)

m: Khối lượng mẫu cân ban đầu (gam)

Cm: nồng độ tetracycline trong mẫu ban đầu (µg/kg)

V0: là thể tích dung dịch dùng để rửa giải chất phân tích (thường V0 = 2mL) R: Hệ số thu hồi

Công thức tính R:

Từ cách thêm chuẩn trên mẫu (lựa chọn 20µg/L khi xác định trên đường chuẩn)

R = (C0 thêm - C0) X100/20 (%)

C0thêm: là nồng độ mẫu thêm chuẩn xác định trên đường chuẩn (µg/L)

2.2.2.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

-Xác định giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL): phân tích dung dịch chuẩn nồng độ

2 ppb đối với mỗi chất, tính tỉ lệ signal/noise (S/N), nếu S/N <3 cần tăng nồng độ khảo sát, nếu S/N > 3 giảm nồng độ khảo sát cho đến khi S/N xấp xỉ 3, chọn nồng

độ đó là giới hạn phát hiện của thiết bị

-Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL): Thêm chất chuẩn vào mẫu thịt trắng

từ nồng độ bằng nồng độ giới hạn phát hiện của thiết bị, thực hiện quá trình phân tích và tăng dần nồng độ cho đến khi tỉ lệ giữa tín hiệu phân tích trên nhiễu nền (signal/noise) xấp xỉ3, chọn nồng độ đó là giới hạn phát hiện của phương pháp -Giới hạn định lượng của phương pháp (MQL): lựa chọn MQL = 3x MDL Sau đó kiểm tra tính đúng đắn của MQL bằng cách thêm chuẩn trên mẫu thịt trắng ở nồng

độ MQL tính toán độ lặp lại và thu hồi phù hợp với các yêu cầu của phụ lục F (AOAC)

-Khoảng tuyến tính, đường chuẩn: Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng (7 điểm chuẩn) bắt đầu từ MQL Tính toán hệ số tương quan hồi qui sao cho R> 0,995

Độ chệch của các điểm trên đường chuẩn sau khi xây dựng đường chuẩn phải nhỏ hơn 15% và riêng ở nồng độ MQL phải nhỏ hơn 20%

24

-Độ lặp lại: Phân tích mẫu thêm chuẩn lặp lại 12 lần ở 3 khoảng nồng độ MQL, giữa đường chuẩn và cuối đường chuẩn, tính CV và so sánh với bảng F tiêu chuẩn AOAC

-Độ thu hồi: Phân tích mẫu thêm chuẩn lặp lại 12 lần ở 3 khoảng nồng độ MQL, giữa đường chuẩn và cuối đường chuẩn, tính độ thu hồi R(%) và so sánh với bảng F tiêu chuẩn AOAC

-Độ đặc hiệu, chọn lọc của phương pháp: Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu.Sau khi chuẩn bị mẫu trắng và phân tích trên thiết bị sắc kí, ta thêm chất chuẩn nồng độ 10 ppb vào mẫu đã chiết và phân tích mẫu này So sánh sắc kí

đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu, chọn lọc

-Độ ổn định của phương pháp phụ thuộc nhiều vào tuổi thọ của cột phân tích Ta so sánh 2 thông số để nhận định về độ ổn định là áp suất bơm và diện tích peak của chuẩn sau một thời gian sử dụng cột

-Độ không đảm bảo đo: Phương pháp tiếp cận để tính toán độ không đảm bảo đo dựa vào kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp theo hướng dẫn của Eurachem, AGL18 [17] độ không đảm bảo đo bao gồm: độ chụm tổng hợp, độ đúng

và độ tinh khiết của chất chuẩn

Công thức chung để tính độ không đảm bảo đo tổng hợp là:

U= 2

Trong đó:

uc: Độ không đảm bảo đo của độ tinh khiết của chất chuẩn

ur: Độ không đảm bảo đo của độ đúng từ mẫu chuẩn (CRM) hoặc mẫu thêm chuẩn

us: Độ không đảm bảo đo giữa các lần lặp lại

Cách tính các us độ không đảm bảo đo chuẩn như sau:

uc= (100 - độ tinh khiết của chuẩn)/2 đơn vị (%) hoặc (ppb)

25

ur sử dụng mẫu chuẩn CRM:

Tính toán độ thu hồi theo công thức:

usđƣợc tính theo kiểu một nền mẫu và nhiều nồng độ phân tích:

26

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.Tối ưu hóa các điều kiện phân tích các tetracycline trên hệ thống sắc kí lỏng khối phổ LC/MS-MS

3.1.1.Nghiên cứu tối ưu hóa các thông số của detector MS/MS

Tiến hành thay đổi giá trị điện áp đặt Q2 từ 5 – 50 V tăng dần 5V/1 lần quét Trong dải đó lựa chọn một giá trị CE, cho kết quả peak ion nhọn và cân đối, tín hiệu tốt nhất Tiếp tục khảo sát xung quanh giá trị CE thu được tăng /giảm 1V/1 lần quét 4 lần tăng và 4 lần giảm đồng thời kết hợp quét điện thế Q1 và Q3 từ 5 – 50 V, 1V/1 lần quét Chọn giá trị CE, Q1, Q3 cho kết quả tín hiệu tốt nhất là giá trị tối ưu Kết quả tối ưu hóa cho hệ MS/MS gồm năng lượng bắn phá của bát cực Q2 kí hiệu (CE) và năng lượng cho tức cực Q1 và Q3 thể hiện qua bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả tối ưu hóa của MS/MS

Chất phân tích Ion mẹ Ion con CE (V) Q1(V) Q3(V)

Theo kết quả phổ khối của cả 3 chất khảo sát bằng các chất chuẩn hỗn hợp nồng độ

20 ppb cho mỗi chất (Hình 3.1; Hình 3.2) nhận thấy, cường độ mảnh phổ cao hơn ở mảnh [M+H -H2O - NH3], do vậy lựa chọn mảnh [M+H -H2O - NH3] làm ion định lượng và mảnh [M+H - H2O]làm ion định danh

28 Hình 3.1 Phổ khối của tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline ở nồng độ

20 ppb

29 Hình 3.2Mảnh phổ của tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline ở nồng độ

20 ppb