Thông tin tài liệu
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã ngành: 42 02 01 CAO THỊ TÀI NGUYÊN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DẠNG BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Y Ở NAM GIỚI KHÁM VÔ SINH TẠI BỆNH VIỆN PHỤ SẢN THÀNH PHỐ CẦN THƠ Cần Thơ, 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:…………………………………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Cao Thị Tài Nguyên, Nguyễn Trung Kiên, Vũ Thị Nhuận, Nguyễn Chung Viêng, Trịnh Thị Bích Liên (2017), “Nghiên cứu bước đầu áp dụng kỹ thuật QF-PCR chẩn đoán kiểu đoạn nhỏ vùng AZFc NST Y nam giới vơ sinh”, Tạp chí Y Học Việt Nam Tháng - Số 2, tr 245-249 Cao Thị Tài Nguyên, Trịnh Thị Bích Liên, Nguyễn Trung Kiên, Vũ Thị Nhuận, Nguyễn Phan Vinh, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Trịnh Minh Thiết, Phan Thị Nhan (2017), “Đặc điểm hormon FSH, LH testosteron nam giới vơ sinh có mật độ tinh trùng ≤5x106/ML tinh dịch”, Tạp chí Y Học Thực hành 5(1043), tr 178-181 Cao Thi Tai Nguyen, Nguyen Trung Kien, Vu Thi Nhuan, Nguyen Chung Vieng, Trinh Minh Thiet, Nguyen Phan Vinh, Nguyen Thi Bich Ngoc, Cao Luong Binh, Trinh Thi Bich Lien (2017), “An infertility SRY-negative 46,XX male detected by quantitative fluorescent polymerase chain reaction”, Journal of clinical case reports 7:1013, doi: 10.4172/21657920.10001013 Cao Thị Tài Nguyên, Nguyễn Trung Kiên, Trịnh Thị Bích Liên, Vũ Thị Nhuận, Nguyễn Chung Viêng, Nguyễn Đắc Khoa, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Trịnh Minh Thiết, Cao Lương Bình, Nguyễn Phan Vinh, Nguyễn Văn Khuôn (2018), “Sử dụng kỹ thuật QF-PCR chẩn đoán số nguyên nhân di truyền thường gặp nam giới vơ sinh”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 16(2), tr.241-252 Chương GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Có nhiều ngun nhân gây vơ sinh nam giới, nguyên nhân di truyền chiếm từ 4-38% Hiện nay, nguyên nhân di truyền thường gặp nam giới vô sinh hội chứng Klinefelter đoạn AZF Tại Việt Nam, tỷ lệ nguyên nhân khoảng 23% nam giới có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch Tỷ lệ nam giới vô sinh bị đoạn AZF Việt Nam khoảng 5-12,8% Có loại đoạn AZF AZFa, AZFb AZFc Nam giới bị đoạn AZFc có nhờ vào kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (tỷ lệ thành công khoảng 70%), đoạn khác khó có Viện Hàn Lâm Nam học Châu Âu/Mạng lưới kiểm định chất lượng Di truyền phân tử Châu Âu khuyến cáo nam giới có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch nên thực xét nghiệm tìm nguyên nhân di truyền trước sử dụng kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (Krausz et al., 2014) Kỹ thuật QF-PCR với nhiều ưu điểm thời gian trả kết nhanh, giá thành rẻ, độ xác cao nên nhiều tác giả đề xuất áp dụng kỹ thuật chẩn đốn tìm ngun nhân di truyền nam giới vơ sinh Trên sở đó, luận án “Nghiên cứu số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới khám vô sinh Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ” thực 1.2 Mục tiêu đề tài (1) Xây dựng kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR để phát số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch (2) Xác định tỷ lệ số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới khám vơ sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch quy trình kỹ thuật QF-PCR xây dựng kiểm định (3) Mô tả đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới khám vơ sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch 1.3 Ý nghĩa luận án 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Cung cấp liệu khoa học tỷ lệ số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y, đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố, số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới khám vơ sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch - Làm tiền đề cho nghiên cứu 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu có ý nghĩa lớn việc hỗ trợ chẩn đốn, tư vấn điều trị vơ sinh hiệu tốn cho bệnh nhân Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ nói riêng khu vực Đồng sơng Cửu Long nói chung 1.4 Tính luận án - Nghiên cứu xây dựng tối ưu hóa thành cơng quy trình kỹ thuật QF-PCR với 14 dấu di truyền dùng để phát số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới khám vô sinh - Nghiên cứu Rozen et al (2012) cơng trình công bố tỷ lệ phần đoạn AZFc kiểu gr/gr b2/b3 người Việt Nam Bên cạnh kiểu phần đoạn AZFc trên, nghiên cứu ghi nhận dạng phần đoạn AZFc đoạn sY1191-sY1192, sY1291, gen DAZ - gen CDY1 gen CDY1 - Nghiên cứu ghi nhận đa hình chiều dài đoạn gen khuếch đại dấu di truyền sY1291, dao động từ 507-527 bp Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương vô sinh trình sinh tinh 2.1.1 Một số khái niệm vô sinh vô sinh nam Khoảng 80-85% cặp vợ chồng có thai tự nhiên sau năm chung sống, có 15-20% cặp vợ chồng gặp vấn đề khả sinh sản hay gọi vô sinh (Ayensu-Coker et al., 2007; Jungwirth et al., 2012) Một cặp vợ chồng hay đôi nam nữ gọi vô sinh họ giao hợp thường xuyên không sử dụng biện pháp tránh thai sau 12 tháng mà khơng có (WHO, 2000) Vơ sinh nam tình trạng cặp vợ chồng cặp nam nữ khơng có thai sau năm sinh hoạt tình dục bình thường khơng dùng biện pháp tránh thai nguyên nhân từ nam giới (Jungwirth et al., 2012) 2.1.2 Đại cương trình sinh tinh Các tế bào mầm sinh dục nguyên thủy tham gia vào trình sinh tinh trải qua giai đoạn phân bào nguyên phân, giảm phân biệt hóa để tạo thành tinh trùng trưởng thành (Oliveira Alves, 2015) Nam giới có khả sinh sản bình thường ngày tạo > 40x106 tinh trùng (Cheng Mruk, 2013) Quá trình sinh tinh điều hịa hormon FSH (FSH - Follicle-stimulating hormon), LH (LH - Luteinizing hormon) testosteron (Verhoeven et al., 2010; Rato et al., 2012) Bên cạnh đó, trình cịn điều hịa số yếu tố khác nhiệt độ, dạng oxi hoạt động ROS (ROS - Reactive oxygen species) hàng rào chống oxi hóa tinh hồn (Oliveira Alves, 2015) Xét nghiệm nồng độ hormon FSH, LH testosteron xét nghiệm cần thiết quan trọng giúp tìm nguyên nhân cách điều trị cho nam giới vô sinh nội tiết (Hotaling Walsh, 2009) 2.2 Tinh dịch đồ số yếu tố liên quan đến vô sinh nam 2.2.1 Tinh dịch đồ Hiện nay, phòng xét nghiệm tinh dịch đồ đánh giá kết dựa hướng dẫn WHO (2010) 2.2.2 Một số yếu tố liên quan đến vô sinh nam Một số yếu tố liên quan đến vô sinh nam xác định tuổi, số khối thể BMI (BMI - Body mass index), tiền sử gia đình vơ sinh, số thói quen (hút thuốc, uống rượu, vận động), mơi trường độc hại, nghề tiếp xúc với chất độc hại, nhiệt độ cao, mặc quần lót chật, xơng (Cavallini Beretta, 2015) 2.3 Nhiễm sắc thể Y số bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới vô sinh 2.3.1 Nhiễm sắc thể Y người Nhiễm sắc thể Y dài khoảng 60 Mb, gồm vùng vùng giả nhiễm sắc thể thường chiếm 5% vùng không kết hợp chiếm 95% (Jangravi et al., 2013) Vùng khơng kết hợp gồm có vùng đồng nhiễm sắc vùng dị nhiễm sắc (Hình 2.1) Hình 2.1 Cấu trúc nhiễm sắc thể Y (Kandeel et al., 2007) 2.3.2 Một số dấu di truyền nhiễm sắc thể Y Trên vùng đồng nhiễm sắc nhiễm sắc thể Y chứa khoảng 1287 vị trí trình tự đánh dấu STS (Sequence tagged site), 992 STS có trình tự đơn 285 STS trình tự lặp (Lange et al., 2008) Hiện nay, đa số nghiên cứu sử dụng dấu di truyền (sY84, sY86, sY127, sY134, sY254 sY255) để phát đoạn AZFa, AZFb AZFc (Krausz et al., 2014) Ngoài ra, Rozen et al (2012) sử dụng số dấu di truyền sY1189, sY1191, sY1192 sY1291 để phát phần đoạn AZFc Trên sở đó, nghiên cứu sử dụng dấu di truyền sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255, sY1191, sY1192 sY1291 Ngoài ra, để phát số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y, nghiên cứu sử dụng thêm dấu di truyền AMEL, TAF9B, DAZ, CDY, SRY Như vậy, luận án sử dụng 14 dấu di truyền Tất trình tự mồi dấu di truyền kiểm tra ngân hàng sở liệu NCBI (Phiên GRCh38.p7) để phát vị trí đoạn sản phẩm PCR Ở Hình 2.2 thể sản phẩm PCR khuếch đại 13 dấu di truyền nhiễm sắc thể Y, ngoại trừ TAF9B (khuếch đại đoạn gen nhiễm sắc thể NST X) Hình 2.2 Vị trí sản phẩm đoạn ADN khuếch đại cặp mồi 13 dấu di truyền nhiễm sắc thể Y 2.3.3 Bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới vô sinh Các nguyên nhân di truyền chiếm khoảng 30% gồm có rối loạn đơn gen, bất thường di truyền tế bào loại bất thường đoạn AZF nhiễm sắc thể Y (Aston Conrad, 2013) 2.4 Một số kỹ thuật dùng để phát nguyên nhân di truyền nam giới vô sinh Hiện nay, bên cạnh kỹ thuật di truyền tế bào người ta dùng nhiều kỹ thuật phân tử để phát bất thường nhiễm sắc thể Y kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang (FISH), PCR đa mồi, Realtime PCR, khuếch đại đầu dò phụ thuộc ghép nối (MLPA) QF-PCR 2.5 Tình hình nghiên cứu số nguyên nhân vô sinh nam giới 2.5.1 Trên giới Nhiều nghiên cứu cho thấy hội chứng Klinefelter đoạn AZF nguyên nhân di truyền thường gặp nam giới khám vơ sinh có số lượng < 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch (Cavkaytar et al., 2012; Choi et al., 2013; Zhang et al., 2013b) Tỷ lệ đoạn AZF từ 4-38% (Mafra et al., 2011; Cavkaytar et al., 2012; Fu et al., 2012; Choi et al., 2013; Ambulkar et al., 2013; Nasasse et al., 2015) 2.5.2 Ở Việt Nam Tỷ lệ đoạn AZF từ 5-12,8%; đoạn AZFc lưu hành phổ biến (Nguyễn Minh Hà, 2011; Nguyễn Thị Việt Hà, 2012; Nguyễn Đức Nhự, 2015) Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Sơ đồ 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 3.2 Đối tượng nghiên cứu Nam giới khám vô sinh Khoa Hiếm muộn Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch theo tiêu chuẩn WHO (2010) Tiêu chuẩn loại trừ: bệnh nhân lấy tinh dịch cách thủ dâm không đồng ý tham gia nghiên cứu Bên cạnh đó, loại trừ nam giới thắt, cắt ống dẫn tinh, lấy mẫu nhà, làm rơi vãi tinh dịch lấy mẫu 3.3 Cỡ mẫu - Áp dụng cơng thức tính cỡ mẫu ước lượng cho tỷ lệ n Z12 / p.(1 p) d2 Trong đó: n: cỡ mẫu tối thiểu cần thiết Z1-/2 = 1,96 với hệ số tin cậy mong muốn 95% p: tỷ lệ nam giới có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch bị đoạn AZF nhiễm sắc thể Y Dựa nghiên cứu Nguyễn Minh Hà (2011) với p = 12,8%, luận án chọn p = 0,128 d: sai số cho phép, chọn d = 0,037 Thay vào cơng thức tính n = 313 Như vậy, cỡ mẫu nghiên cứu tối thiểu 313 nam giới khám vơ sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch Trong thực tế, luận án nghiên cứu 322 trường hợp 3.4 Phương pháp chọn mẫu Chọn mẫu thuận tiện không xác xuất 3.5 Thời gian địa điểm 3.5.1 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 11/2014 đến tháng 3/2017 3.5.2 Địa điểm nghiên cứu - Thu nhận mẫu tinh dịch đồ thực xét nghiệm tinh dịch đồ Khoa Hiếm muộn, Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ - Xét nghiệm nồng độ hormon FSH, LH, testosteron, ly trích ADN, kỹ thuật QF-PCR giải trình tự thực Khoa xét nghiệm - Di truyền học, Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ - Gửi mẫu máu, mẫu ADN đến phòng xét nghiệm kỹ thuật cao ISOLABO địa 101/26 Nguyễn Chí Thanh, Phường 9, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh để kiểm định kết QF-PCR 3.6 Thiết bị, dụng cụ hóa chất - Nghiên cứu sử dụng hóa chất trang thiết bị để xét nghiệm tinh dịch đồ, nội tiết tố, di truyền (kỹ thuật QF-PCR) giải trình tự -14 đoạn mồi (mồi ngược) mồi đánh dấu huỳnh quang (mồi xuôi) dấu di truyền trình bày Bảng 3.1A vị trí sau: 507 bp 512 bp 523 bp 527 bp + Mất phần đoạn AZFb kiểu gen CDY2 xuất peak CDY2/CDY1 0:2; peak lại xuất nam giới bình thường + Mất phần đoạn AZFc kiểu gr/gr: xuất peak DAZ/DAZL 2:2 (DAZ bị giảm ½); CDY2/CDY1 2:1 (mất CDY1), khơng có peak sản phẩm PCR huỳnh quang sY1291 peak lại giống nam giới bình thường + Mất phần đoạn AZFc kiểu b2/b3: xuất peak DAZ/DAZL 2:2 (DAZ bị giảm ½); CDY2/CDY1 2:1 (mất CDY1), khơng có peak sản phẩm PCR huỳnh quang sY1191 sY1192; peak khác giống nam giới bình thường + Mất phần đoạn AZFc kiểu gen DAZ: xuất peak DAZ/DAZL 2:2; peak khác giống nam giới bình thường + Mất phần đoạn AZFc kiểu gen CDY1: xuất peak CDY2/CDY1 2:1; peak lại giống nam giới bình thường + Mất phần đoạn AZFc kiểu gen DAZ gen CDY1: peak DAZ/DAZL 2:2 CDY2/CDY1 2:1; peak cịn lại xuất nam giới bình thường + Mất phần đoạn AZFc kiểu sY1191-sY1192: khơng có peak dấu di truyền sY1191 sY1192; peak khác xuất nam giới khơng có bất thường nhiễm sắc thể Y + Mất phần đoạn AZFc kiểu sY1291: xuất peak giống nam giới bình thường, ngoại trừ sY1291 khơng xuất peak vị trí 507 bp, 512 bp, 523 bp, 527 bp + Mất hồn tồn đoạn AZFc (b2/b4): khơng có peak sY254, sY255, sY1191, sY1192 sY1291; peak CDY2/CDY 1là 2:0 DAZ/DAZL 0:2; peak khác xuất nam giới bình thường + Mất hồn tồn đoạn AZFbc: kết QF-PCR khơng có peak sY127, sY134, sY254, sY255, sY1191, sY1192, sY1291, CDY2/CDY1, DAZ; peak lại DAZL xuất nam giới khơng có bất thường nhiễm sắc thể Y + Nhân đoạn gen DAZ: xuất peak DAZ/DAZL 6:2 8:2, peak lại giống nam giới bình thường + Hội chứng Klinefelter với nhiễm sắc thể Y bị phần đoạn AZFc kiểu gr/gr: nam giới tăng nhiễm sắc thể X (tỷ lệ peak 12 AMELX/AMELY 2:1 TAF9B3/TAF9BX 2:2) peak khác giống nam giới phần đoạn AZFc kiểu gr/gr + Hội chứng Klinefelter với nhân đoạn gen DAZ: nam giới tăng nhiễm sắc thể X có peak DAZ/DAZL 6:2 8:2 peak khác giống nam giới bình thường + Hội chứng Klinefelter với gen DAZ: nam giới tăng nhiễm sắc thể X peak DAZ/DAZL 2:2 peak khác giống nam giới bình thường 3.3.3 Mô tả đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới khám vơ sinh có ≤ 5x106 tinh trùng /mL tinh dịch - Tư vấn hướng dẫn bệnh nhân lấy mẫu tinh dịch - Đánh giá thông số tinh dịch đồ theo WHO (2010) - Phỏng vấn bệnh nhân theo phiếu điều tra - Thăm khám lâm sàng: đo chiều cao, cân nặng, khám ghi nhận bất thường bìu - Xét nghiệm nội tiết trục tuyến yên-tinh hồn - Phân tích kết Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Xây dựng kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR để phát số dạng bất thường phân tử nhiễm sắc thể Y nam giới khám vơ sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch 4.1.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật QF-PCR 4.1.1.1 Khảo sát điều kiện thực phản ứng QF-PCR Qua thực nghiệm, luận án tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng QF-PCR chia làm set Set gồm có dấu di truyền (sY254, sY255, sY1191, sY1192), set gồm có dấu di truyền (AMEL, CDY, DAZ, TAF9B, SRY) với nhiệt độ gắn mồi 560C Set gồm có dấu di truyền (sY84, sY86, sY127, sY1291, sY134) với nhiệt độ gắn mồi 580C Bên cạnh nhiệt độ gắn mồi, nồng độ cuối thể tích phản ứng QF-PCR tối ưu tương ứng pmol 25 µl Ngồi ra, multiplex PCR 5X mastermix tối ưu phản ứng QFPCR với nồng độ cuối 1X Chu trình nhiệt phản ứng QF-PCR set set sau: 940C - phút, {[940C - 30 giây, 560C - phút, 680C - phút 30 giây], 30 chu kỳ}, 680C - 10 phút, 40C - ∞ 13 Chu trình nhiệt phản ứng QF-PCR set thực tương tự set set 2, khác nhiệt độ gắn mồi 580C Quy trình thực phản ứng QF-PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố Qua so sánh với nghiên cứu cho thấy, khác biệt điều kiện, nhiệt độ gắn mồi chu trình nhiệt phản ứng QF-PCR có lẽ loại hóa chất sử dụng điều kiện thực nghiệm khác 4.1.1.2 Khảo sát điều kiện điện di mao quản sản phẩm PCR huỳnh quang Luận án sử dụng quy trình điện di mao quản: trộn set phản ứng QF-PCR lại vào chung tube Mỗi tube chứa µL Hidi-thang chuẩn/1 tube + 0,5 µL sản phẩm PCR huỳnh quang pha loãng 100 lần đặt vào máy phân tích di truyền ABI 3500 điều kiện điện di theo chương trình Devyser Elucigen Phân tích kết phần mềm Genemarker V2.6.3 4.1.1.3 Kết QF-PCR Với quy trình QF-PCR tối ưu, kết nghiên cứu ghi nhận sản phẩm PCR huỳnh quang khuếch đại dấu di truyền thể peak nhóm màu đánh dấu huỳnh quang màu FAM, VIC NED Nhóm dấu di truyền sử dụng màu FAM gồm có AMEL, sY255, TAF9B (ký hiệu T3), sY127, DAZ, sY254 SRY xuất peak có màu xanh da trời (Hình 4.1) Hình 4.1 Kết QF-PCR nhóm dấu di truyền màu FAM Với quy trình tối ưu, nam giới khơng có bất thường nhiễm sắc thể Y xuất peak kết QF-PCR vị trí sau: AMELX/AMELY 103 bp (nhiễm sắc thể X) 109 bp (nhiễm sắc thể Y) theo tỷ lệ 1:1; sY255 122 bp; TAF9B3/TAF9BX 144 bp (nhiễm sắc thể 3) 148 bp (nhiễm sắc thể X) theo tỷ lệ 2:1; sY127 192 bp; DAZ/DAZL 210 bp (nhiễm sắc thể Y) 214 bp (nhiễm sắc thể 3) theo tỷ lệ 4:2; sY254 380 bp SRY 465 bp (Hình 4.1) Nhóm dấu di truyền sử dụng màu VIC gồm có CDY, sY86, sY1191 sY1291 xuất peak màu xanh (Hình 4.2) 14 Hình 4.2 Kết QF-PCR nhóm dấu di truyền màu VIC với peak sY1291 có kích thước 507 bp Nam giới khơng có bất thường nhiễm sắc thể Y kết QF-PCR xuất peak CDY vị trí 198 bp (AZFb) 204 bp (AZFc) theo tỷ lệ 2:2; sY86 vị trí 316 bp; sY1191 vị trí 385 bp (Hình 4.2) Riêng peak sY1291 xuất vị trí sau: 507 bp, 512 bp, 523 bp 527 bp (Hình 4.3) Điều cho thấy có đa hình chiều dài sản phẩm PCR huỳnh quang đoạn gen Sự đa hình chiều dài đoạn gen phù hợp với nghiên cứu Lin et al (2006) Evguenia et al (2016) Để khẳng định đa hình chiều dài, luận án sử dụng kỹ thuật giải trình tự trình bày chi tiết mục 4.1.2 Hình 4.3 Sự đa hình chiều dài sản phẩm PCR huỳnh quang khuếch đại cặp mồi dấu di truyền sY1291 Kết QF-PCR nhóm dấu di truyền sử dụng màu NED (sY1192, sY134 sY84), sản phẩm PCR huỳnh quang thể peak màu đen (Hình 4.4) 15 Hình 4.4 Kết QF-PCR nhóm dấu di truyền sử dụng màu NED Nam giới khơng có bất thường nhiễm sắc thể Y kết QF-PCR nhóm màu xuất peak sY1192 vị trí 255 bp; sY134 vị trí 302 bp; sY84 vị trí 328 bp Bên cạnh peak chính, Hình 4.1, 4.2 4.4 cịn có peak phụ khác Những peak phụ sản phẩm PCR huỳnh quang không đặc hiệu đoạn gen khác Nguyên nhân số cặp mồi dấu di truyền khuếch đại sản phẩm với kích thước > 600 bp khơng đặc hiệu nên kích thước xuất sản phẩm phụ ngắn (NCBI, phiên GRCh38.p7) 4.1.2 Kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR 4.1.2.1 So sánh kết nghiên cứu với liệu NCBI (Phiên GRCh38.p7) số nghiên cứu giới Kết QF-PCR ghi nhận kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang chia làm nhóm bằng, ngắn dài kích thước sản phẩm PCR tham khảo (kích thước đoạn gen cơng bố NCBI (Phiên GRCh38.p7) Nhóm có kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang kích thước sản phẩm PCR tham khảo gồm có sY84, sY254, sY1191 sY1192 Nhóm có kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang ngắn khoảng 2-5 bp so với kích thước PCR tham khảo (SRY, sY86, sY127, sY255, CDY2/CDY1, AMELX/AMELY, TAF9B3/TAF9BX DAZ/DAZL) Nhóm có kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang dài kích thước sản phẩm PCR tham khảo (sY134) Ngồi nhóm trên, kết nghiên cứu ghi nhận sY1291 có kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang ngắn từ 4-20 nucleotid (507 bp, 512 bp, 523 bp) với kích thước sản phẩm PCR tham khảo (527 bp) So sánh với nghiên cứu Plaseska et al (2011), kết có phù hợp kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang nhóm nhóm Ở nhóm 2, tác giả ghi nhận kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang SRY 243 bp, ngắn nucleotid so với kích thước gen mong đợi 248 bp Sở dĩ có khác nghiên cứu sử dụng trình tự đoạn mồi khác Kết phù hợp với nghiên cứu Plaseska et al (2011) 16 Papoulidis et al (2012) 103 bp 109 bp Một nghiên cứu khác Fodor et al (2007) Majumder et al (2015) ghi nhận kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang đoạn gen 104 bp 110 bp Như vậy, kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang ngắn từ 2-3 bp so với kích thước sản phẩm PCR tham khảo điều kiện phản ứng QF-PCR không giống Điều hoàn toàn phù hợp với khuyến cáo hãng kit Devyser dùng phát đoạn AZF Như vậy, vị trí peak sản phẩm PCR huỳnh quang bằng, ngắn dài kích thước nucleotid tham khảo phù hợp với nhiều nghiên cứu giới Kết luận án ghi nhận đa số sản phẩm PCR huỳnh quang ngắn dài 2-5 bp so với sản phẩm PCR tham khảo; ngoại trừ đoạn gen thể đa hình chiều dài (ngắn 4-20 bp) khuếch đại dấu di truyền sY1291 4.1.2.2 So sánh với mẫu chứng dương Nghiên cứu thực xét nghiệm số mẫu chứng dương (ADN nam giới bị đoạn AZFc hội chứng Klinefelter) kỹ thuật QFPCR Kết ghi nhận hoàn toàn giống với mẫu chứng dương 4.1.2.3 Gửi mẫu kiểm chứng Kết kiểm định mẫu máu phương pháp nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi cho thấy nam giới tăng nhiễm sắc thể X, karyotype 47,XXY, giống với kết QF-PCR Ngoài ra, luận án chọn ngẫu nhiên mẫu ADN (1 mẫu ADN khơng có bất thường nhiễm sắc thể Y, mẫu ADN bị đoạn hoàn toàn AZFbc mẫu ADN bị đoạn hoàn tồn AZFc) gửi kiểm định Phịng xét nghiệm kỹ thuật cao ISOLABO kit Devyser cho kết tương tự 4.1.2.4 Giải trình tự để xác định đa hình chiều dài sản phẩm PCR huỳnh quang khuếch đại dấu di truyền sY1291 Thực giải trình tự đoạn gen khuếch đại cặp mồi sY1291 lặp lặp lại 10 lần tháng, kết ghi nhận trình tự nucleotid mẫu tương đồng khoảng 400 bp so với trình tự nucleotid tham khảo (tương đồng khoảng 77%) (Hình 4.5A, B) 17 Hình 4.5A Độ tương đồng trình tự nucleotid tham khảo (REF) mẫu (SA100) với kích thước đoạn gen khuếch đại 527 bp (Bioedit) Hình 4.5B Độ tương đồng trình tự nucleotid tham khảo (REF) trình mẫu (SA207) với kích thước đoạn gen 507 bp (Bioedit) 18 Sự tương đồng trình tự nucleotid đạt khoảng 77% tất mẫu ghi nhận đoạn ADN khuếch đại mồi xuôi hay mồi ngược bắt đầu xuất trình tự nhiễu sau trình tự lặp đơn nucleotid T Theo y văn, đoạn ADN có trình tự lặp đơn nucleotid phản ứng PCR làm cho enzym polymerase tổng hợp sợi tự thêm vào làm loại nucleotid lặp đoạn làm nhiễu trình tự sau đoạn lặp đơn nucleotid (Jinks-Robertson, 2002) Như vậy, kết giải trình tự cho thấy đa hình chiều dài sản phẩm PCR huỳnh quang khuếch đại cặp mồi dấu di truyền sY1291 với kích thước 507 bp, 512 bp, 523 bp 527 bp khác số lần lặp nucleotid T Trên sở đó, quy trình kỹ thuật QF-PCR với 14 dấu di truyền để phát số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y có độ xác cao đáng tin cậy 4.2 Xác định tỷ lệ số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới khám vơ sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch quy trình kỹ thuật QF-PCR xây dựng kiểm định Kết nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể Y đối tượng nghiên cứu 35,1% (Hình 4.6), cao số nghiên cứu ngồi nước (4-24%) Hình 4.6 Tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể Y đối tượng nghiên cứu 19 Có dạng bất thường nhiễm sắc thể Y, đoạn AZF chiếm tỷ lệ cao (83,18%), thấp nhân đoạn gen DAZ (13,27%) hội chứng Klinefelter có bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể Y chiếm 3,55% Không giống nghiên cứu chúng tôi, đa số nghiên cứu ghi nhận bất thường karyotype đoạn AZF Sự khác biệt phương pháp nghiên cứu số lượng dấu di truyền khác Có dạng đoạn AZF; phần đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao (80,85%), thấp hoàn toàn đoạn AZFc chiếm 9,57%; hoàn toàn đoạn AZFbc chiếm 6,38%; thấp phần đoạn AZFb chiếm 3,2% Kết nghiên cứu tương tự với nhiều nghiên cứu khác giới (45-98%) (Choi et al., 2013; Zhang et al., 2013b; Fadlalla et al., 2014; Gallego et al., 2014; Bichile et al., 2016; Zhu et al., 2016; Asadi et al., 2017) So sánh với nghiên cứu nước cho thấy tỷ lệ đoạn AZFc chiếm cao (Nguyễn Minh Hà, 2011; Nguyễn Thị Việt Hà, 2012; Nguyễn Đức Nhự, 2015) Kết nghiên cứu công bố năm 20112012 70 nam giới khám vô sinh Bệnh viện Từ Dũ cho thấy đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao 11,4% đoạn AZFb 1,43% (Nguyễn Minh Hà, 2011) Một nghiên cứu khác Nguyễn Thị Việt Hà (2012) cho thấy đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao 4,4%, thấp AZFa chiếm 2,4%, AZFb AZFabc chiếm tỷ lệ thấp 0,4% Năm 2015, nghiên cứu Nguyễn Đức Nhự phát đoạn AZFc AZFcd chiếm tỷ lệ cao 26,53% (13/49 trường hợp), thấp AZFbcd chiếm 8/49 trường hợp (16,33%), AZFd chiếm 7/49 trường hợp (14,29%), AZFabcd AZFbc chiếm 3/49 trường hợp (6,12%), AZFb chiếm 2/49 trường hợp (4,08%) Trong kiểu phần đoạn AZFc, kết ghi nhận có kiểu đoạn gồm: gr/gr, b2/b3, gen DAZ, gen CDY1, gen DAZ gen CDY1, đoạn sY1191-sY1192 đoạn sY1291 Một số đột biến phần đoạn AZFc so với nghiên cứu giới đoạn sY1291, đoạn sY1191-1192, gen DAZ, gen DAZ gen CDY1 Sỡ dĩ, kết nghiên cứu khác biệt với nhiều nghiên cứu giới hầu hết nghiên cứu dựa vào vắng mặt sản phẩm PCR khuếch đại cặp mồi dấu di truyền sY1291, sY1191, sY1192 để xác định đoạn kiểu gr/gr, b2/b3 b1/b3 Trong theo y văn cho thấy, đoạn kiểu gr/gr, b2/b3 hay b1/b3 có liên quan đến gen DAZ gen CDY 20 Mất đoạn gr/gr chiếm tỷ lệ cao (31,6%), thấp gen DAZ (21,1%), đoạn sY1191-sY1192 (14,5%), đoạn sY1291 (10,5%), gen DAZ - gen CDY1 (9,2%), đoạn kiểu b2/b3 (7,9%), thấp gen CDY1 (5,2%) Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu giới (Rozen et al., 2012; Sen et al., 2015; Olesen et al., 2017) Sau đoạn AZF, nhân đoạn gen DAZ nguyên nhân di truyền phổ biến thứ Ở nam giới khơng có bất thường nhiễm sắc thể Y, DAZ/DAZL xuất peak theo tỷ lệ 4:2 Tuy nhiên, kết luận án ghi nhận 15/113 (13,27%) trường hợp nam giới có peak DAZ/DAZL xuất với tỷ lệ 6:2 (Hình 4.7) 8:2 (Hình 4.8) Hình 4.7 Kết QF-PCR mẫu A236 với tỷ lệ peak DAZ/DAZL 6:2 vị trí 210 bp 214 bp Hình 4.8 Kết QF-PCR mẫu A174 với tỷ lệ peak DAZ/DAZL 8:2 vị trí 210 bp 214 bp Nhân đoạn gen DAZ Lu et al (2013); Saito et al (2015); Vaszko et al (2016) Alimardanian et al (2016) ghi nhận Ngoài ra, nghiên cứu ghi nhận dạng bất thường số lượng nhiễm sắc thể X kết hợp với bất thường nhiễm sắc thể Y Cụ thể nam giới bình thường tỷ lệ AMELX/AMELY 1:1 TAF9B3/TAF9BX 2:1, 21 nam giới có bất thường số lượng nhiễm sắc thể giới tính X tỷ lệ 2:1 2:2 (Hình 4.9A 4.9B) Hình 4.9A Nam giới bình thường có tỷ lệ peak AMELX/AMELY TAF9B3/TAF9BX tương ứng 1:1 2:1 mẫu A95 Hình 4.9B Nam giới tăng nhiễm sắc thể X với tỷ lệ peak AMELX/AMELY TAF9B3/TAF9BX 2:1 2:2 mẫu A97 Bốn trường hợp tăng nhiễm sắc thể X có bất thường nhiễm sắc thể Y: phần đoạn AZFc kiểu gr/gr (1 trường hợp), nhân đoạn gen DAZ (2 trường hợp) gen DAZ (1 trường hợp) Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Mitra et al (2006), Hadjkacem-Loukil et al (2009), Ceylan et al (2010) Li et al (2015) 4.3 Mô tả đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch 4.3.1 Đặc điểm chung số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y 4.3.1.1 Đặc điểm tuổi liên quan với bất thường nhiễm sắc thể Y Tuổi trung bình 31,62±5,53, phù hợp với nhiều nghiên cứu Nhóm tuổi 30-34 chiếm tỷ lệ cao (31,1%) Nghiên cứu chưa tìm thấy mối liên quan tuổi với bất thường nhiễm sắc thể Y 4.3.1.2 Đặc điểm nghề liên quan với bất thường nhiễm sắc thể Y Nông dân chiếm tỷ lệ cao 30,1%, khác với nghiên cứu trước (cán viên chức chiếm tỷ lệ cao nhất) Nam giới tiếp xúc với hóa chất, thuốc trừ sâu nguy bất thường nhiễm sắc thể Y cao gấp 1,64 lần (p > 0,05) 22 4.3.1.3 Đặc điểm phân loại vô sinh nguyên phát thứ phát Tỷ lệ vô sinh nguyên phát 91,3%, cao nghiên cứu Nguyễn Quốc Tuấn (2011), Võ Xuân Đào (2014) Masoumi (2015) Điều có lẽ đối tượng nghiên cứu có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch 4.3.1.4 Đặc điểm thời gian vơ sinh Thời gian vơ sinh trung bình 3,74±3,25 năm, phù hợp với nghiên cứu Vũ Minh Ngọc (2009) Phạm Chí Kơng ctv (2011) Thời gian vơ sinh nhóm 1-2 năm chiếm tỷ lệ cao (48,1%), phù hợp với nghiên cứu Radwan et al (2016) Nguyễn Xuân Bái (2010) 4.3.1.5 Đặc điểm thói quen thời gian sử dụng điện thoại di động Thói quen để điện thoại di động túi quần vào ban ngày chiếm 90,7% để giường ngủ vào ban đêm chiếm 83,9% Thời gian sử dụng điện thoại di động trung bình 8,764,28 năm Nhóm sử dụng điện thoại di động 6-10 năm chiếm tỷ lệ cao (44,7%), phù hợp với nghiên cứu Radwan et al (2016) 4.3.1.6 Đặc điểm tiền sử quai bị Có 42/322 (13,0%) trường hợp với tiền sử quai bị, phù hợp với nghiên cứu Radwan et al (2016) 4.3.1.7 Đặc điểm BMI liên quan với bất thường nhiễm sắc thể Y BMI bình thường chiếm tỷ lệ cao (52,8%) thấp nhóm gầy (3,1%), phù hợp với nghiên cứu Wang et al (2017) Ngoài ra, nghiên cứu chưa ghi nhận mối liên quan BMI với bất thường nhiễm sắc thể Y 4.3.1.8 Đặc điểm thể tích tinh hồn Thể tích tinh hồn trung bình 9,972,72 mL, thấp nghiên cứu Nguyễn Đức Nhự (2015) Thể tích tinh hồn 6-10 mL chiếm tỷ lệ cao (67,4%), khác biệt với Nguyễn Đức Nhự (2015) Điều có lẽ cỡ mẫu địa điểm nghiên cứu khác 4.3.1.9 Đặc điểm bìu liên quan giãn tĩnh mạch thừng tinh với bất thường nhiễm sắc thể Y Tỷ lệ nam giới có bất thường bìu 10,8%, phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Đức Nhự (2015) Kích thước tinh hồn bên khơng giãn tĩnh mạch thừng tinh chiếm tỷ lệ cao (37,1%), phù hợp với nghiên cứu Phạm Chí Kơng ctv (2011), Olesen et al (2016) Suganya et al (2016) Kết chưa tìm thấy mối liên quan giãn tĩnh mạch thừng tinh với bất thường nhiễm sắc thể Y 23 4.3.2 Đặc điểm tinh dịch đồ 4.3.2.1 Đặc điểm thông số tinh dịch a pH tinh dịch pH trung bình 7,51±0,46, tương tự nghiên cứu Nguyễn Xuân Bái (2010), Trần Thị Thu Trang ctv (2014) Trần Đức Long (2016) b Thể tích tinh dịch Nhóm tích tinh dịch bình thường chiếm 78,9%, phù hợp với nghiên cứu Trần Thị Hòa ctv (2008), Khan et al (2012), Nguyễn Đức Nhự (2015) Thể tích tinh dịch trung bình 2,85±1,85 mL, phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Xuân Bái (2010), Lê Hoàng Anh ctv (2012) Ugwa (2015) 4.3.2.2 Đặc điểm thông số tinh trùng a Mật độ tinh trùng Nam giới vô tinh 28,9%, thấp so với nghiên cứu trước Sự khác biệt nam giới vô tinh thường Thành phố Hồ Chí Minh để khám điều trị Ngồi ra, mật độ tinh trùng trung bình 2,52x106±1,75x106 tinh trùng/mL tinh dịch, cao nghiên cứu Song et al., (2010), thấp Milardi et al (2012) Sự khác biệt có lẽ cỡ mẫu dân số nghiên cứu khác b Các thơng số cịn lại tinh trùng Tổng số tinh trùng, khả di động tiến tới tinh trùng, hình dạng tinh trùng bình thường tỷ lệ sống tinh trùng phần lớn bất thường Cụ thể, có 0,4% trường hợp đạt giá trị bình thường tổng số tinh trùng 1,3% bình thường khả di động tiến tới 4.3.3 Đặc điểm nội tiết trục tuyến yên-tinh hoàn liên quan bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ hormon 4.3.3.1 Đặc điểm nồng độ hormon FSH liên quan bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ hormon FSH Nhóm có nồng độ hormon FSH bình thường chiếm tỷ lệ cao (68,0%), phù hợp với nghiên cứu Hoàng Thị Thu Hương ctv (2008) Ngoài ra, nồng độ hormon FSH trung bình 10,55±10,64 mIU/mL, thấp nghiên cứu Evangelini et al (2016) Những nam giới bất thường nhiễm sắc thể Y có nguy bất thường nồng độ hormon FSH cao gấp 1,43 lần Tuy nhiên, mối liên quan chưa có ý nghĩa thống kê với p > 0,05; phù hợp với Choi et al (2013) 24 4.3.3.2 Đặc điểm nồng độ hormon LH liên quan bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ hormon LH Nhóm có nồng độ hormon LH bình thường chiếm tỷ lệ cao (92,9%), phù hợp với nghiên cứu Hoàng Thị Thu Hương ctv (2008) Ngoài ra, kết ghi nhận nồng độ hormon LH trung bình 8,59±6,97 mIU/mL, phù hợp với nghiên cứu Evangelini et al (2016) Nam giới có bất thường nhiễm sắc thể Y có nguy bất thường nồng độ hormon LH gấp 1,2 lần Tuy nhiên khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 4.3.3.3 Đặc điểm nồng độ hormon testosteron liên quan bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ hormon testosteron Nồng độ testosteron bình thường chiếm tỷ lệ cao (83,5%), phù hợp với nghiên cứu Hoàng Thị Thu Hương ctv (2008); cao so với nghiên cứu Nguyễn Xuân Bái (2010) Jimoh et al (2012) Điều cỡ mẫu khác Nồng độ testosteron trung bình 4,05±1,88 ng/mL Nghiên cứu chưa ghi nhận mối liên quan có ý nghĩa thống kê bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ testosteron (p > 0,05) 4.3.3.4 Đặc điểm phân loại kết xét nghiệm nội tiết Có 41,3% (133/322 trường hợp) có bất thường nội tiết, phù hợp với nghiên cứu Emokpae et al (2007) Nhóm nam giới có nội tiết bình thường chiếm tỷ lệ cao (58,69%), phù hợp với nghiên cứu Ishikawa et al (2004) Trong 133 trường hợp có bất thường nội tiết, tổn thương tế bào mầm nguyên phát chiếm tỷ lệ cao 44,3% (59/133 trường hợp), phù hợp với nghiên cứu Phạm Chí Kơng (2012) Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Nghiên cứu xây dựng tối ưu thành công quy trình kỹ thuật QF-PCR với 14 dấu di truyền có độ tin cậy cao Tỷ lệ nam giới khám vơ sinh có bất thường nhiễm sắc thể Y 35,1% (113/322 trường hợp) gồm: đoạn AZF, nhân đoạn gen DAZ hội chứng Klinefelter có bất thường nhiễm sắc thể Y Mất phần đoạn AZFc lưu hành phổ biến chiếm 80,9% (76/94 trường hợp) 25 Nghiên cứu ghi nhận số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y đoạn sY1191-sY1192, đoạn sY1291, gen DAZ - gen CDY1 gen CDY1 Đặc điểm tinh dịch đồ ghi nhận pH thể tích tinh dịch trung bình tương ứng 7,51±0,46 2,85±1,85 mL Nam giới vô tinh chiếm 28,9% Mật độ tinh trùng trung bình 2,52x106±1,75x106 tinh trùng/mL tinh dịch Nồng độ hormon FSH, LH testosteron bình thường chiếm tỷ lệ cao, tương ứng 68%, 92,85% 83,54% Ngoài ra, tỷ lệ bất thường nội tiết 41,3% (133/322 trường hợp); tổn thương tế bào mầm nguyên phát gặp nhiều 44,3% (59/133 trường hợp) Nghiên cứu chưa ghi nhận mối liên quan có ý nghĩa thống kê bất thường nhiễm sắc thể Y với số đặc điểm chung nồng độ hormon FSH, LH testosterone đối tượng nghiên cứu 5.2 Kiến nghị Áp dụng quy trình xét nghiệm QF-PCR kiểm định vào phát số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y cho nhóm nam giới khám vơ sinh Ngồi ra, cần nghiên cứu bổ sung thêm số dấu di truyền vào quy trình xét nghiệm QF-PCR kiểm định để phát thêm số dạng bất thường số lượng nhiễm sắc thể giới tính Căn vào dấu di truyền sY1291, DAZ CDY để xác định phần đoạn AZFc kiểu gr/gr Bất thường nội tiết chiếm tỷ lệ cao, bác sĩ nên định cho nhóm bệnh nhân làm xét nghiệm nồng độ hormon FSH, LH testosteron để điều trị kịp thời cho trường hợp vô sinh nội tiết Cần nghiên cứu thêm để tối ưu quy trình giải trình tự chứa đoạn lặp đơn nucleotid 26 ... Beretta, 2015) 2.3 Nhiễm sắc thể Y số bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới vô sinh 2.3.1 Nhiễm sắc thể Y người Nhiễm sắc thể Y dài khoảng 60 Mb, gồm vùng vùng giả nhiễm sắc thể thường chiếm 5% vùng... giới khám vô sinh Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ? ?? thực 1.2 Mục tiêu đề tài (1) X? ?y dựng kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR để phát số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y nam giới khám vơ sinh. .. nhiễm sắc thể Y Chỉ dấu di truyền sY84-F sY84-R sY86-F sY86-R sY127-F sY127-R sY134-F sY134-R sY254-F sY254-R sY255-F sY255-R sY1191-F sY1191-R sY1192-F sY1192-R sY1291-F sY1291-R SRY-F SRY-R CDY-F
Ngày đăng: 01/10/2018, 11:23
Xem thêm:
