PHƯƠNG PHÁP TEST NHANH SALBUTAMOL TRONG THỰC PHẨM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN TEST NHANH SALBUTAMOL TRONG THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Nhóm sinh viên thực (nhóm 5): Trần Thị Thanh Thảo (B1401437) Trần Thị Thùy Lam (B1408672) Võ Thị Phương Thảo (B1401549) Đỗ Hữu Nghĩa (B1401521) MỤC LỤC I II Đặt vấn đề …………………………………… trang Tổng quan Salbutamol ……………………………………… trang Định nghĩa Salbutamol ………………………………………… trang Tác dụng Salbutamol người động vật ………………….trang Tác hại Salbutamol ………………………………………… trang III Một số phương pháp nhận biết Salbutamol ………………………trang Nhận biết cảm quang ……………………………………….trang Nhận biết phương pháp đại ……………………………trang ♦ Phương pháp Elisa ……………………… …………………….trang ♦ Phương pháp xác định quang phổ Salbutamol sulphate mẫu phản ứng màu azo…………………………………………………… trang ♦ Phương pháp sắc ký lỏng ghép lần khối phổ ( LC-MS/MS)… trang 12 ♦ Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ ( GC/MS)………………trang 14 IV Kết luận kiến nghị……………………………………………… trang 14 V Tài liệu tham khảo………………………………………………… trang 15 I Đặt vấn đề Trong giai đoạn nay, vấn đề hóa chất thực phẩm mối quan tâm nhiều người, đáng báo động tình trạng lạm dụng chất kích thích tăng trưởng chăn ni Hóa chất sử dụng cho mục đích kích thích tăng trọng phổ biến phải kể đến Clenbuterol Salbutamol Các nhà chăn nuôi bổ sung Clenbuterol Salbutamol vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm kích thích tăng trọng, tăng tỷ lệ nạc, giảm mỡ thu nhiều lợi nhuận chất lại gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng Vậy Salbutamol chất gì, có tác dụng sao? II Tổng quan Salbutamol II.1 Định nghĩa Salbutamol: • Salbutamol thuốc dùng cho người với tên biệt dược albuterol, ibuterol,… thuộc nhóm β-agonist (thụ thể beta) • Salbutamol thường có dạng bột tinh thể màu trắng, tan nước, tan cồn (ethanol) chloroform, bền ánh sáng • Sabutamol thụ thể β2 (thụ thể beta 2) tác dụng nhanh tạo Epinephrine Sabutamol bán lần thị trường vào năm 1968, Allen Hanburys tên thương phẩm Ventolin • Cơng thức phân tử: C13H21O3N • Khối lượng phân tử: 239,152 đvC • Công thức cấu tạo: Tên gọi: (RS)-4-[2-(tert-butylamino)-1-hydroxyethyl]-2-(hydroxymethyl) phenol II.2 Tác dụng Clenbuterol Salbutamol người vật ni: • Trong lĩnh vực dược phẩm β-agonist nhóm chất sử dụng nhiều điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình Salbutamol Clenbuterol • Trong chăn nuôi, dược liệu đưa vào thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ da, tăng cơ, tăng trọng thú vật ni • Clenbuterol Salbutamol tích lũy thực phẩm thịt làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,… II.3 Tác hại Salbutamol: - Tại Châu Âu Châu Mỹ, loại hóa chất bị cấm sử dụng Ở Việt Nam, loại dược liệu thuộc nhóm β-agonist có Clenbuterol Salbutamol xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn ( Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 Bộ NN & PTNT) - Mặc dù chất bị phận người dân sử dụng chăn ni Vì vậy, vấn đề nghiên cứu áp dụng phương pháp tiên tiến để phân tích xác định, đánh giá dư lượng chất kích thích tăng trưởng nói chung Clenbuterol, Salbutamol nói riêng cần thiết III MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NHẬN BIẾT THỊT CÓ SALBUTAMOL Nhận biết cảm quan đặc điểm nhận biết thịt siêu nạc có hóa chất : Xem lớp mỡ bên da miếng thịt, lớp mỡ mỏng lỏng lẻo nên tránh Thơng thường lợn siêu nạc có lớp mỡ mỏng dày đến cm thịt lợn bình thường 1.5- 2cm Về màu sắc: Thịt lợn chứa chất độc Ractophamine Clenbuterol thường có màu đỏ tươi khác thường, sáng bóng Thái miếng thịt dày 2-3 ngón tay, thấy thịt mềm, khơng đứng thẳng bàn thịt nhiễm chất tăng trọng Quan sát xem chỗ liên kết phần nạc mỡ, thấy tách rời rõ rệt, đồng thời có nước dịch màu vàng rỉ ra, chắn thịt siêu nạc Nhận biết phương pháp đại: 2.1 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) + Phương pháp sử dụng rộng rãi để xác định chất dư lượng thuốc trừ sâu, độc tố nấm mốc (Skeritt, 1998) Nguyên lý ELISA xác định Clenbuterol Salbutamol dựa nguyên lý phản ứng kháng thể - kháng nguyên + Phương pháp ELISA thường áp dụng để chế tạo test kit nhanh Salbutamol thị trường ngày  Nguyên lý ELISA: Kháng nguyên cố định bề mặt giếng phân tích Kháng nguyên tự (Salbutamol mẫu) kháng nguyên cố định cạnh tranh để bám vào kháng thể Lượng kháng nguyên tự nhiều lượng kháng thể bị kháng nguyên cố định giữ lại Sau rửa trơi chất dư, dùng lượng kháng thể thứ có đánh dấu enzyme immunoassay để phát lượng kháng thể ban đầu bị giữ lại phản ứng tạo màu phép đo cường độ màu bước sóng 450nm cường độ màu tỷ lệ nghịch với nồng độ Salbutamol mẫu Từ suy ra, lượng kháng nguyên tự (Salbutamol mẫu)  Kĩ thuật nhạy đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp Giới hạn phát phương pháp 0.1 ppb  Quy trình đơn giản sau: Kháng thể chính- sơ cấp (chưa đánh dấu) ủ với kháng nguyên mẫu Phức hợp kháng thể- kháng nguyên sau thêm vào đĩa 96 giếng phủ trước kháng nguyên tương tự Kháng thể không bám bị loại bỏ thông qua bước rửa đĩa (Càng nhiều kháng nguyên mẫu, kháng thể liên kết với kháng nguyên giếng, gọi "cạnh tranh".) Các kháng thể thứ cấp gắn enzym mà đặc hiệu với kháng thể sơ cấp thêm vào Phản ứng tạo màu nguyên lý xảy ta cho thêm chất TMB vào, enzyme thủy phân chất thành chất có màu Sự xuất màu chứng tỏ xảy phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên Dung dịch chất TMB: dung dịch làm sẵn của3,3′,5,5′– tetramethylbenzidine (TMB), chất đo màu hòa tan cho HRP enzyme (horseradish peroxidase) Trong có mặt HRP, TMB peroxide lưu trữ dung dịch chất phản ứng tạo sản phẩm phụ có màu xanh lục Cường độ màu tỉ lệ thuận với lượng HRP phản ứng – tương đương với lượng chất đích quy trình ELISA tối ưu  Ưu điểm phương pháp ELISA cạnh tranh: • Độ đặc hiệu cao, sử dụng hai kháng thể nên kháng nguyên chất phân tích giữ phát • Thích hợp cho mẫu phức tạp, kháng ngun khơng đòi hỏi tinh trước tiến hành phản ứng • Tính linh hoạt độ nhạy cao • Phát lượng kháng nguyên - kháng nguyên tín hiệu mạnh  Nhược điểm phương pháp ELISA cạnh tranh: • Thời gian thực xét nghiệm ELISA cho lơ xét nghiệm: 1- • Qui trình thực phức tạp  Ứng dụng phương pháp Elisa • Các test kit Salbutamol thị trường ngày đa số ứng dụng phương pháp ELISA (phương pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh) • Dưới số test kit nhanh Salbutamol: MỘT SỐ BỘ KIT SALBUTAMOL ELISA  Bộ test kit Salbutamol cơng ty Thời Đại Xanh, có giới hạn phát :3ppb, 10ppb, thời gian thử nghiệm: 5-10 phút  SALBUTAMOL ELISA KIT • Giới hạn phát hiện: + Mô thịt 0,4ppb/0,2ppb + Nước tiểu: 0,1ppb + Thức ăn chăn nuôi: 5ppb + Giới hạn phát hiện: + Mô thịt 0,1ppb + Nước tiểu: 0,05ppb + Thức ăn chăn nuôi: 1ppb + Độ nhạy : 0,05 ppb Cách đọc kết quả: Âm tính (nước tiểu heo nhỏ 5ppb Salbutamol): T line C line nhìn thấy Dương tính (nước tiểu heo 5ppb Salbutamol): C line nhìn thấy 2.2 Phương pháp xác định quang phổ Salbutamol sulphate mẫu phản ứng màu azo: a) Một phương pháp so màu đơn giản nhạy phát triển cho việc xác định Salbutamol dung dịch nước Phương pháp dựa hình thành loại thuốc nhuộm azo màu vàng điazo hóa 2,4dichloroaniline, theo sau phản ứng ghép đôi azo sản phẩm tạo Salbutamol Độ hấp thụ tối đa thuốc nhuộm azo 447 nm Định luật Beer tìm thấy tuân theo phạm vi nồng độ 2,5-20 µg / ml với phạm vi hấp thụ mol khoảng (4000-7265) Lmol-1cm-1  Chất phản ứng: Một dung dịch chuẩn Salbutamol sulfate 100 μg ml -1 điều chế hòa tan 0,01 gm Salbutamol sulfate với nước cất đến 100ml 2-4 dicloro anilin (98% nguyên chất) điều chế hòa tan 0,01 gm 2-4 dicloro anilin 10ml ethanol ngun chất sau pha lỗng với nước cất đến 100ml Natri nitrite ( 99,8% nguyên chất) Natri hydroxyt (98% nguyên chất) 1M HCl  Phương pháp chung: 0,5 ml dung dịch Salbutamol chuẩn100μg ml-1 0,5ml dung dịch 1M NaOH thêm vào 0,5 ml 2,4-dicloro anilin 0,5 ml dung dịch 1% natri nitrit 0,5 ml HCl 1M trộn vào cho thêm nước cất đến vạch 10 ml bình định mức lắc phút, việc lắc ướp đá lạnh phút, sau phút màu vàng phát hoàn toàn đo độ hấp thụ thực chiều dài bước sóng 447 nm, ngược lại dung dịch trắng tạo khơng có Salbutamol  Cơ chế phản ứng phương pháp: Salbutamol tạo sản phẩm màu sau kết hợp với ion điazo hóa 2,4dicloro anilin ưa điện tử diện mơi trường kiềm Cơ chế sau giải thích cho phản ứng: Phương pháp có độ xác cao, áp dụng thành công mẫu dược phẩm b) Phương pháp quang phổ đề xuất cho việc xác định dược phẩm có chứa nhóm phenol Salbutamol sulphate (SLB) , ritodrine hydrochloride (RTD),… dược phẩm có vòng thơm dapsone hydrochloride (DAP), sulfamethoxazole (SFM),…Phương pháp dựa kết hợp N,N-diethyl-p- 10 phenylenediamine sulphate với dược phẩm có chứa chất KClO tạo sản phẩm màu xanh (tại µmax = 670nm) sản phẩm màu đỏ (tại µmax = 550nm)   Các hóa chất chất phản ứng thí nghiệm: Dung dịch chuẩn Salbutamol sulphate ( 0,1 mg.mL-1) pha nước Dung dịch N,N-diethyl-p-phenylenediamine sulphate (0,5 mg.mL-1 ) Dung dịch KIO4 (4 mg.mL-1) pha nước Cơ chế phản ứng: Đầu tiên q trình oxy hóa N,N-diethyl-p-phenylenediamine sulphate (PADMA) KIO4 diễn ra, sản phẩm q trình oxy hóa kết hợp với dược phẩm có chứa Salbutamol sulphate tạo sản phẩm màu xanh (tại µmax = 670nm) sản phẩm màu đỏ (tại µmax = 550nm) Độ tin cậy hiệu suất phương pháp dao động khoảng 99.5 ± 0.1% đến 99.9 ± 0.3 % Giới hạn phát hiện: 0.14, 0.21, 0.51, 0.44, 0.33 0.37 μg mL –1  Phương pháp áp dụng cho việc định lượng loại thuốc thu từ thị trường c) Một phương pháp quang phổ đơn giản, nhanh nhạy cho việc xác định Salbutamol sulphate dung dịch nước chế phẩm dược phẩm phát thử nghiệm Phương pháp dựa phản ứng kết hợp hợp chất với điazo hóa 4-aminoacetophenone (DAAPH) môi trường kiềm tạo thành dung dịch thuốc nhuộm có màu vàng cam đậm Độ hấp thụ tối đa thuốc nhuộm 463 nm 11   Chất phản ứng: Dung dịch gốc Salbutamol sulphate (1000 μg mL-1) Dung dịch Diazotized 4-aminoacetophenone (3×10-3M ) Dung dịch axit Hydrochloric (0.8M) Dung dịch Sodium hydroxide (0.1M) Cơ chế phản ứng Khi dung dịch loãng SBS trộn với thuốc thử DAAPH mơi trường kiềm, hình thành thuốc nhộm màu vàng cam xuất lập tức, trở nên ổn định sau 20 phút Cơ chế sau giải thích cho phản ứng: Kết phương pháp có độ xác cao, độ nhạy 0,0212 (μg.cm-2), giới hạn phát 0.414 (μg.mL-1) Vì phương pháp áp dụng việc xác định lượng SBS mẫu dược phẩm dung dịch nước 2.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép lần khối phổ ( LC-MS/MS) 12  Hầu hết phương pháp phân tích sắc ký dùng phát định lượng Salbutamol Clenbuterol trãi qua ba giai đoạn sau: Chiết chất phân tích khỏi mẫu (mẫu nguyên liệu) Làm mẫu, loại tạp chất khỏi dịch chiết làm giàu chất phân tích Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định lượng chất phân tích  Nguyên tắc: Dư lượng Clenbuterol, Salbutamol Ractopamine tự thịt bò, thịt heo chiết từ mẫu hỗn hợp axetonitrile isopropanol Sử dụng muối natri clorit, natri sunphat magie sunphate để tủa protein loại nước có dịch chiết mẫu Dịch chiết làm bay dung mơi đến khơ, phần cặn hòa tan dung dịch nước chứa 10% Axetonitril, làm n-hexan đưa vào phân tích kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS-MS) để xác định định lượng Clenbutarol, Salbutamol Ractopamine có mẫu  Thuốc thử Trong tiêu chuẩn này, sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích nước cất hai lần khử ion • Chuẩn Salbutamol sunphat (SAL.SUL), ≥ 99 %; • Nội chuẩn Salbutamol D3 (SAL D3), ≥ 98%; • Axetonitril (ACN), loại dùng cho LC-MS; • Nước, loại dùng cho LC-MS; • Metanol (MeOH), loại dùng cho LC-MS; • Isopropanol (IPA), loại dùng cho HPLC; • n-Hexan, loại dùng cho phân tích; • Natri clorit (NaCl), loại dùng cho phân tích; • Natri sunphat (Na2SO4), loại dùng cho phân tích; • Magiê sunphat (MgSO4) khan; 13 • Axit formic, độ tinh khiết tối thiểu 99 %; • Khí argon, tinh khiết 99,9%; • Khí nitơ, tinh khiết 99,9%  Phương pháp cung cấp giới hạn phát (LOD) 0,5ppb; giới hạn định lượng (LOQ) 1,5ppb Hiệu suất thu hồi phương pháp: - Đối với Salbutamol: 61,3% - 67,3% - Đối với Clenbuterol :62,7% - 84,2% Ưu điểm phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để phát định lượng Salbutamol Clenbuterol kết xác, độ tin cậy cao Tuy nhiên quy trình thực phức tạp, kĩ thuật cao nên cung cấp cho thị trường lĩnh vực test nhanh 2.4 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS  Xác định hàm lượng Salbutamol Clenbuterol nước tiểu động vật kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ Phương pháp xác nhận theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 2002/657/EC Hiệu suất thu hồi phương pháp 65%-88% Giới hạn phát Salbutamol 0,11ppb cho thức ăn gia súc; 0,07ppb cho thịt heo gan heo  Quy trình thực hiện: Mẫu pha loãng với 10ml dung dịch đệm phosphate (pH=7) ly tâm 4000 rpm 10 phút nhiệt đọ phòng Tồn dung dịch mẫu làm kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) Hoạt hóa cột SPE NARC-2 ml ethanol, 2ml nước cuối với 2ml đệm phosphate Cho dung dịch mẫu qua cột, rửa cột với 1ml dung dịch acid acetic, 6ml methanol hút chân khơng phút, sau rửa giải 5ml acetate acetyl với amoniac (4%) Dung dịch mẫu thổi khơ khí nitơ 45°C Mẫu hòa tan lại 300µ methanol lắc mạnh Sau đó, dung dịch cho vào vial 20 µ BSTFA ( N,O-bis (trimethylsilyl trifluoroacetamide)) chứa 1% TMCS (trimethylchlorosilane) đun nóng 65°C 1,5 Cuối cùng, cho vào vial 2ml để phân tích GC-MS 14  Ưu điểm phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS giống phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS kết xác, độ tin cậy cao IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Hiện phương pháp ELISA ứng dụng rộng rãi để tạo test kit nhanh phát Salbutamol Clenbuterol thị trường Còn phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ phương pháp lựa chọn nhiều phòng thí nghiệm với độ xác cao Đối với Salbutamol Clenbuterol, hai hợp chất thuộc nhóm kích thích tăng trưởng sử dụng chăn nuôi Dư lượng chúng sản phẩm chế biến ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Vì người tiêu dùng nên cẩn trọng sử dụng sản phẩm không rõ nguồn gốc, nên lựa chọn thực phẩm quan chức kiểm tra, đảm bảo an toàn, vệ sinh thực phẩm V TÀI LIỆU THAM KHẢO • TCVN : 2014 (Xuất lần 1): Thực phẩm - Xác định dư lượng β2-AGONIST thịt gia súc –phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ • Luận văn ĐH: Khảo sát dư lượng β-agonist (Clenbuterol Salbutamol) thịt gà thịt heo thị trường thành phố Cần Thơ/ Lê Thị Hồng Búp; 2013 • Luận văn ĐH: Theo dõi tiết Salbutamol gà/ Huỳnh Thị Hạnh Ngân; 2013 • Luận án : Đánh giá hàm lượng β-agonist (Clenbuterol Salbutamol) thức ăn gia súc dư lượng thịt gia súc kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ/Nguyễn Thị Thu Thủy/ Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên • Và số tài liệu tham khảo khác 15 ... …………………………………… trang Tổng quan Salbutamol ……………………………………… trang Định nghĩa Salbutamol ………………………………………… trang Tác dụng Salbutamol người động vật ………………….trang Tác hại Salbutamol …………………………………………... lại gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng Vậy Salbutamol chất gì, có tác dụng sao? II Tổng quan Salbutamol II.1 Định nghĩa Salbutamol: • Salbutamol thuốc dùng cho người với tên biệt dược... kit Salbutamol thị trường ngày đa số ứng dụng phương pháp ELISA (phương pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh) • Dưới số test kit nhanh Salbutamol: MỘT SỐ BỘ KIT SALBUTAMOL ELISA  Bộ test kit Salbutamol