Nhận diện tính chịu hạn của lúa bằng dấu phân tử SSR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Giống Cây Trồng Tên đề tài: NHẬN DIỆN TÍNH CHỊU HẠN Ở LÚA BẰNG DẤU PHÂN TỬ SSR Cán hướng dẫn: Ts NGUYỄN LỘC HIỀN Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THANH THẢO MSSV: 3103431 Lớp: TT10Z1A1 Cần Thơ, 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN DI TRUYỀN GIỐNG NÔNG NGHIỆP Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Khoa Học Cây Trồng – Chuyên ngành Công Nghệ Giống Cây Trồng với đề tài: NHẬN DIỆN TÍNH CHỊU HẠN Ở LÚA BẰNG DẤU PHÂN TỬ SSR Do sinh viên Nguyễn Thanh Thảo thực Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp Cần Thơ, ngày… tháng … năm 20… Cán hướng dẫn Ts Nguyễn Lộc Hiền i TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN DI TRUYỀN GIỐNG NÔNG NGHIỆP Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp chấp nhận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Khoa Học Cây Trồng – Chuyên ngành Công Nghệ Giống Cây Trồng với đề tài: NHẬN DIỆN TÍNH CHỊU HẠN Ở LÚA BẰNG DẤU PHÂN TỬ SSR Do sinh viên Nguyễn Thanh Thảo thực báo cáo trước Hội đồng Ý kiến Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp: Luận văn tốt nghiệp đánh giá mức: Cần Thơ, ngày … tháng … năm 20… Hội đồng DUYỆT KHOA Trưởng Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các số liệu, kết trình bày luận văn tốt nghiệp trung thực chưa công bố công trình luận văn trước Tác giả luận văn Nguyễn Thanh Thảo iii QUÁ TRÌNH HỌC TẬP  LÝ LỊCH SƠ LƯỢC Họ tên: Nguyễn Thanh Thảo Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 23/10/1992 Dân tộc: Kinh Nơi sinh: Mỹ Luông – Chợ Mới – An Giang Địa chỉ: SN 432, Tổ 23, Ấp thị I, Thị trấn Mỹ Luông, Huyện Chợ Mới, Tỉnh An Giang Điện thoại: 0937 132 152 Email: thao103431@student.ctu.edu.vn  QUÁ TRÌNH HỌC TẬP - Tiểu học: Thời gian đào tạo: từ năm 1998 đến năm 2003 Trường: Tiểu học A Mỹ Luông Địa chỉ: Thị trấn Mỹ Luông, Huyện Chợ Mới, Tỉnh An Giang - Trung học: Thời gian đào tạo: từ năm 2003 đến năm 2007 Trường: Trung học sở Thị Trấn Mỹ Luông Địa chỉ: Thị trấn Mỹ Luông, Huyện Chợ Mới, Tỉnh An Giang - Trung học phổ thông: Thời gian đào tạo: từ năm 2007 đến năm 2010 Trường: Trung học phổ thông Châu Văn Liêm Địa chỉ: Thị trấn Mỹ Luông, Huyện Chợ Mới, Tỉnh An Giang - Đại học Thời gian đào tạo: từ năm 2010 đến năm 2014 Trường: Đại Học Cần Thơ Địa chỉ: Đường 3/2, Phường Xuân Khánh, Quận Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ Cần Thơ, ngày… tháng … năm 20… Người khai ký tên Nguyễn Thanh Thảo iv LỜI CẢM ƠN Kính dâng Ba, mẹ có cơng sinh thành chăm sóc dạy dỗ khơn lớn thành người Đặc biệt mẹ, đời cực Con ghi nhớ công ơn Hai anh chị hết lòng yêu thương, ủng hộ giúp đỡ tơi mặt Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ts Nguyễn Lộc Hiền Ts Huỳnh Kỳ tận tình hướng dẫn, định hướng tạo điều kiện giúp tơi hồn thành đề tài luận văn Xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cơ trường Đại học Cần Thơ nói chung Thầy Cơ thuộc Khoa Nơng Nghiệp & SHƯD nói riêng dạy dỗ tôi, truyền đạt kiến thức quý báo suốt thời gian đào tạo trường Anh Nguyễn Quốc Chí chị Huỳnh Ngọc Châu tận tình hướng dẫn tơi thực thí nghiệm Phòng thí nghiệm Di truyền – Bộ mơn Di truyền – Giống Nơng Nghiệp, bạn nhóm luận văn bạn thân thiết giúp đỡ cho tơi hồn thành tốt luận văn Các anh chị, bạn học, em đặc biệt tập thể lớp Cơng Nghệ Giống Cây Trồng Khóa 36 ln bên cạnh chia gắn bó với tơi suốt thời gian qua Xin gởi lời chúc sức khỏe thành công đến quý Thầy Cô, anh chị bạn Nguyễn Thanh Thảo v NGUYỄN THANH THẢO, 2013 “Nhận diện tính chịu hạn lúa dấu phân tử SSR” Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Khoa Học Cây Trồng – Chuyên ngành Công Nghệ Giống Cây Trồng, khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ Cán hướng dẫn: Ts Nguyễn Lộc Hiền TĨM LƯỢC Biến đổi khí hậu tồn cầu diễn ngày phức tạp tác động mạnh đến đất nước ta Khô hạn tác động tiêu cực đến sản xuất nông nghiệp nói chung sản xuất lúa nói riêng Việc thiếu nước canh tác lúa làm giảm suất trầm trọng đe dọa đến an ninh lương thực giới Trước tình hình đó, đề tài “Nhận diện tính chịu hạn lúa dấu phân tử SSR” thực với mục tiêu nhận diện giống lúa mang gen chịu hạn có khả chống chịu hạn tốt phù hợp với điều kiện canh tác vùng bị hạn thiếu nước tưới Kết nhận diện gen chịu hạn dấu phân tử SSR RM212, RM302 kết hợp với việc thử hạn nhân tạo giai đoạn nảy mầm giai đoạn mạ dung dịch kaliclorate (KClO3) 12 giống lúa, ta thấy giống lúa Halos 7-2, Halos 74, Halos 7-5, Radư Cudơ có khả chịu hạn tốt sau: nhận diện có mang gen chịu hạn, tỷ lệ nảy mầm dung dịch KClO3 3% lớn 85% tỷ lệ rễ mầm đen nhỏ 15% tỷ lệ rễ mạ đen dung dịch KClO 1% giai đoạn mạ nhỏ 15% Hai giống lúa OM2514 VND9520 biểu tính chịu hạn bước thử hạn nhận diện có mang gen chống chịu hạn liên kết với dấu phân tử sử dụng Các giống lúa nguồn gen vô quý giá phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa chịu hạn tương lai vi MỤC LỤC 1.5.1 Nhận diện gen điều khiển tính chống chịu stress lúa 11 Yusaku Uga, Control of root system architecture by DEEPER ROOTING increases rice yield under drought conditions, Nature Genetics 45, 1097–1102, (2013), 04 August 2013 33 vii DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các quốc gia sản xuất lúa gạo quan trọng giới (triệu tấn) 1.2 Thành phần dinh dưỡng 100 g gạo trắng, gạo lứt nếp 1.3 Vitamin, chất vi lượng lúa, gạo lứt, gạo trắng phó sản phẩm 14% ẩm độ 1.4 Diện tích, suất, sản lượng lúa giới qua năm 1.5 Diện tích, suất sản lượng lúa Việt Nam qua năm 2.1 Danh sách 12 giống chọn làm thí nghiệm 14 2.2 Trình tự mồi dùng thí nghiệm 16 2.3 Chuẩn bị dung dịch mẹ môi trường Yosida 17 2.4 Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng cho lọc hạn 18 3.1 Bảng phân nhóm giống lúa liên kết với dấu phân tử SSR RM212 RM302 22 3.2 Tỷ lệ nảy mầm rễ mầm đen giống lúa xử lý dung dịch kaliclorate giai đoạn nảy mầm (%) 24 3.3 Tỷ lệ rễ mạ đen giống lúa xử lý dung dịch kaliclorate giai đoạn mạ (%) 26 3.4 Chiều dài rễ trước xử lý dung dịch kaliclorate (cm) 27 3.5 Chiều dài rễ sau xử lý dung dịch kaliclorate (cm) 27 3.6 Sự gia tăng chiều dài rễ sau giai đoạn trước sau xử lý dung dịch kaliclorate (cm) 28 3.7 Tổng hợp số chọn lọc 12 giống lúa 30 DANH SÁCH HÌNH viii Hình Tên hình Trang ix Đây phương pháp nhân tạo, đánh giá nhanh khả chịu hạn lúa Khả chịu hạn liên quan đến khả chịu độc giữ nước keo nguyên sinh dùng hóa chất độc để xử lý Nếu keo nguyên sinh bị độc tế bào mơ bị nước, bị hại chứng tỏ có khả chịu hạn Nếu ngược lại, keo nguyên sinh bị nhiễm độc nhiều tế bào mơ bị nước nhiều dẫn đến bị hại chứng tỏ khơng có khả chịu hạn (Vũ Tuyên Hoàng ctv, 1995) - Tỷ lệ phần trăm hạt nảy mầm tính theo cơng thức: Số hạt nảy mầm X 100 % hạt nảy mầm = Tổng số hạt xử lý - Tỷ lệ rễ mầm bị đen (hoặc héo) tính theo cơng thức: Số rễ mầm đen (héo) % rễ mầm đen (héo) = X 100 Tổng số rễ mầm - Tỷ lệ rễ mạ bị đen (hoặc héo) tính theo cơng thức: Số rễ mạ đen (héo) % rễ mạ đen (héo) = X 100 Tổng số rễ mạ CHƯƠNG 19 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ LY TRÍCH DNA DNA sau ly trích từ 12 giống lúa phương pháp CTAB (Doyle and Doyle, 1990) mang kiểm tra gel agarose 1% Kết cho thấy DNA giống lúa băng tương đối tốt (Hình 3.1), nhiên băng DNA có vệt sáng dài giếng Điều chứng tỏ DNA có lẫn RNA với trọng lượng phân tử thấp DNA bị đứt gảy Nguyên nhân q trình ly trích thao tác q chậm Các mẫu DNA đủ chất lượng để thực phản ứng PCR 1011 12 Hình 3.1 Phổ điện di kiểm tra DNA 12 giống lúa (Số thứ tự giống trình bày bảng 2.1) 3.2 NHẬN DIỆN GIỐNG LÚA CHỊU HẠN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR Để nhận diện giống lúa chịu hạn từ 12 giống lúa dấu phân tử SSR cặp mồi RM212, RM302 sử dụng Trong đó, cặp mồi SSR RM212 cho sản phẩm DNA vị trí khoảng 200 bp giống lúa Halos 7-3, Halos 7-6, Halos 7-8, Khang Dân, vị trí 136 bp giống Halos 7-2, Halos 7-4, Halos 7-5, Cudơ, Radư, IR64, OM2514, VND9520 Kết cho thấy (Hình 3.2), giống lúa Halos 7-2, Halos 7-4, Halos 7-5, Cudơ, Radư, IR64, OM2514, VND9520 có DNA xuất băng 136 bp, giống lúa có khả mang gen chịu hạn với kết phù hợp với nghiên cứu McCouch et al (2002), ông cho giống lúa chịu hạn nhận diện cặp mồi RM212 với xuất băng DNA vị trí 136 bp Theo Kanagaja et al (2010) cho thấy dấu phân tử RM212 liên kết với gen liên quan đến tính trạng cuộn gặp điều kiện hạn, đặc tính quan trọng cho giống lúa có khả chịu hạn Từ cở sở ta tiến hành nghiên cứu mức độ liên quan đến mức độ hạn 20 M M 220 220 200 136 75 75 200 136 10 11 12 Hình 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR 12 giống lúa với primer RM212 (M: ladder 1kb, 1: Halos 7-2, 2: Halos 7-3, 3: Halos 7-4, 4: Halos 7-5, 5: Halos 7-6, 6: Halos 7-8, 7: Khang Dân, 8: Cudơ, 9: Radư, 10: IR64, 11: OM2514, 12: VND9520) Đối với dấu phân tử SSR RM302 khuếch đại cho băng DNA vị trí 156 bp thị cho giống lúa có khả chịu hạn (McCouch ctv, 2002) Kết PCR cặp mồi RM302 cho thấy, giống lúa Halos 7-2, Halos 7-4, Halos 7-5, OM2514, VND9520 mang gen chịu hạn khuếch đại vị trí 156 bp Các giống Halos 7-3, Halos 7-6, Halos 7-8, Khang Dân, Cudơ có băng DNA xuất vị trí khoảng 230 bp cho thấy giống không mang gen chịu hạn Riêng giống Radư, IR64 khơng xuất băng, giải thích giống không mang gen chịu hạn mà cặp mồi RM302 bắt cặp (Hình 3.3) 21 M M 230 220 156 230 220 156 75 75 10 11 12 Hình 3.3 Phổ điện di sản phẩm PCR 12 giống lúa với primer RM302 (M: ladder 1kb, 1: Halos 7-2, 2: Halos 7-3, 3: Halos 7-4, 4: Halos 7-5, 5: Halos 7-6, 6: Halos 7-8, 7: Khang Dân, 8: Cudơ, 9: Radư, 10: IR64, 11: OM2514, 12: VND9520 Bảng 3.1 Phân nhóm giống lúa liên kết với dấu phân tử SSR RM212 RM302 Giống RM212(136 bp) RM302 (156 bp) Nhóm Halos 7-2 + + I Halos 7-3 - - IV Halos 7-4 + + I Halos 7-5 + + I Halos 7-6 - - IV Halos 7-8 - - IV Khang Dân - - IV Cudơ + - III Radư + II IR64 + II OM2514 + + I VND9520 + + I Từ kết cho thấy dựa vào dấu phân tử SSR RM212 RM302 giống lúa dùng thí nghiệm chia làm nhóm, nhóm I liên kết với nhóm 22 gen chịu hạn nằm nhiễm sắc thể số (Kanjoo ctv., 2011) thuộc nhóm giống lúa Halos 7-2, Halos 7-4, Halos 7-5, OM2514, VND9520 Nhóm II nhóm mang gen chịu hạn liên quan đến dấu phân tử RM212 dấu phân tử RM302 khơng bắt cặp thuộc nhóm giống lúa Radư, IR64 Nhóm III nhóm lúa mang gen chịu hạn liên kết với dấu phân tử RM212 không liên kết với dấu phân tử RM302, đại diện giống lúa Cudơ Nhóm IV nhóm khơng mang gen chịu hạn thuộc nhóm giống lúa Halos 7-6, Halos 7-8, Khang Dân (Bảng 3.1) 3.3 ĐÁNH GIÁ KHĂ NĂNG CHỊU HẠN TRONG ĐIỀU KIỆN NHÂN TẠO 3.3.1 Kết thử hạn dung dịch kaliclorate giai đoạn nảy mầm Tính chống chịu hạn thực vật có sực tác động đa gen cộng tính theo chế sinh lý chống lại nước chịu nước (Đỗ Thế Hiếu, 2009) Trong nghiên cứu khả chịu hạn lúa việc xác định đánh giá phân loại mức độ chống chịu hạn tiêu cần thiết quan trọng bậc nhất, phương pháp đánh giá khả chịu hạn lúa dung dịch kaliclorate giai đoạn nảy mầm giúp đánh giá khả chống chịu hạn lúa gieo sạ đồng Quan sát khả nảy mầm dung dịch KClO 12 giống lúa (Bảng 3.2) cho thấy nồng độ 0% (đối chứng) tỷ lệ nảy mầm 12 giống lúa làm thí nghiệm 99% cho thấy giống lúa làm thí nghiệm có sức sống cao làm sở để tiến hành thí nghiệm nghiệm thức 1%, 2%, 3% Nghiệm thức 1%, 2% giống lúa có tỷ lệ nảy mầm cao 90% tỷ lệ rễ mầm đen nhỏ 15% , giống lúa thể khả chịu hạn mức độ tốt Tuy nhiên, quan sát đến ngày thứ giống lúa OM2514 VND9520 tỷ lệ nảy mầm nồng độ 1% 71% 77%, nồng độ % 73% 65% Ở nghiệm thức 3% cho thấy giống có tỉ lệ nảy mầm từ 85% trở lên tỷ lệ rễ mầm đen từ 0-15% giống Halos 7-2, Halos 7-4, Halos 7-5, Cudơ, Radư Trong giống Halos 7-5 giống biểu ưu tú có tỉ lệ nảy mầm 100% tỉ lệ rể mầm bị đen 2% Giống lúa Khang Dân có tỷ lệ nảy mầm 77% tỷ lệ rễ mạ bị đen 6%, IR64 (79%, RM Đen: 26%), OM2514 (60%, RM Đen: 0%), VND9520 (65%, RM Đen: 0%), giống có tỷ lệ nảy mầm thấp 85% trình nảy mầm chậm (Hình 3.4) Kết cho thấy giống Halos 7-2, Halos 7-4, Halos 7-5, Cudơ, Radư có tỷ lệ nảy mầm cao (>85%) tỷ lệ rễ mầm đen thấp (85%) tỷ lệ rễ mầm đen thấp (