Nghiên cứu chọn tạo giống lúa thơm kháng rầy nâu (nilaparvata lugenes stal) bằng dấu phân tử SSR tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 62 42 02 01 NGUYỄN TRÍ YẾN CHI NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA THƠM (Oryza sativa L.) KHÁNG RẦY NÂU (Nilaparvata lugens Stal) BẰNG DẤU PHÂN TỬ SSR Cần Thơ, 2017 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS TRƢƠNG TRỌNG NGÔN Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trƣờng Họp tại:……………………………………, Trƣờng Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Trung tâm Học liệu, Trƣờng Đại học Cần Thơ Thƣ viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC BÀI BÁO ĐÃ CƠNG BỐ Các báo đăng tạp chí: Nguyễn Trí Yến Chi, Trƣơng Trọng Ngơn Khảo sát phân ly tổ hợp lai hồi giao lúa thơm kháng rầy nâu dựa vào đặc tính nơng học dấu phân tử Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam – Số 7(68) Trang 34-39 2016 Nguyen Tri Yen Chi, Truong Trong Ngon Screening of aromatic rice lines by using molecular marker and sensory test Can Tho University Journal of Science Vol Page: 100103 2016 Chƣơng I GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết luận án Việt Nam nƣớc nông nghiệp, phần lớn diện tích đất canh tác trồng lúa Đồng Sông Cửu Long (ĐBSCL) đƣợc xem vựa lúa nƣớc Từ nƣớc phải nhập lƣơng thực vào năm 1980, đến Việt Nam ba quốc gia xuất gạo nhiều giới với sản lƣợng tăng từ 1,99 triệu năm 1995 lên mức 3,48 triệu năm 2000 6,55 triệu vào năm 2015 (Hiệp hội Lƣơng thực Việt Nam, 2015) Mặc dù sản lƣợng có tăng nhƣng thu nhập ngƣời nơng dân lại không tăng, mà kèm theo nguy đất trồng bị suy thối nhiễm mơi trƣờng Việc q trọng đến sản lƣợng dẫn đến chất lƣợng lúa gạo Việt Nam thị trƣờng quốc tế thƣờng thấp số nƣớc khác nhƣ Ấn Độ Thái Lan, đặc biệt có chênh lệch lớn gạo đặc sản gạo cao cấp Nhìn vào thị trƣờng tiêu thụ lúa gạo cần phải đầu tƣ việc nâng cao chất lƣợng gạo, thông qua nhiều đƣờng để rút ngắn đƣợc thời gian cung cấp kịp thời giống cho sản xuất Tuy nhiên, theo nhận định số nhà khoa học, gạo thơm khả nhiễm sâu bệnh cao, đặc biệt rầy nâu, lồi trùng gây hại lớn lúa nƣớc ta nhƣ nƣớc trồng lúa Châu Á Chúng chích hút gây bệnh cháy lúa truyền virus gây bệnh vàng lùn lùn xoắn (Rice ragged stunt virus) làm giảm suất đến 70% làm trắng nhiễm rầy nặng diện tích lớn (Lƣơng Minh Châu ctv., 2006) Bên cạnh đó, độc tính quần thể rầy nâu khác biệt khu vực có tách biệt sinh thái rầy nâu đƣợc xác định thay đổi độc tính Điều tiềm ẩn nguy có nhiều đợt dịch xuất hiện, khó kiểm sốt Cho đến nay, nhà khoa học ghi nhận có bốn loại hình sinh học rầy nâu đƣợc công bố, riêng Đồng Sông Cửu Long, quần thể rầy nâu đƣợc ghi nhận có pha trộn loại hình (Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu, 2011) Các biện pháp dùng để đối phó với dịch rầy nâu sử dụng thuốc diệt rầy, luân canh bón phân hợp lý Mặc dù vậy, thực tế sử dụng thuốc diệt rầy đƣợc nông dân áp dụng nhiều nhất, việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học làm giảm quần thể trùng có ích đồng ruộng, gây cân sinh thái phát triển nòi rầy nâu kháng thuốc Vì vậy, giải pháp lâu dài sử dụng giống kháng Việc sử dụng giống kháng, mặt làm giảm thiệt hại suất, tiết kiệm chi phí phòng trừ, mặt khác hạn chế đƣợc việc dùng thuốc hóa học gây nhiễm mơi trƣờng ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe ngƣời dân Tính bền vững khả kháng rầy nâu giống lúa kháng đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Gallagher et al (1994), Xu et al (2002) xác định giống mang đa gen kháng có tính bền vững cao giống đơn gen kháng Trƣớc đây, trình lai tạo, khả kháng rầy giống lúa đƣợc đánh giá dựa vào biểu kiểu hình phải tiến hành qua nhiều vụ khác Việc làm khơng tốn tiền bạc mà thời gian Ngày nay, với phát triển công nghệ sinh học đặc biệt di truyền phân tử kỹ thuật di truyền tạo điều kiện cho việc ứng dụng phƣơng pháp chọn giống trồng nói chung giống lúa nói riêng cách nhanh chóng hiệu Dấu phân tử đƣợc sử dụng nhƣ công cụ cho lai tạo chọn lọc Gen mong muốn cá thể xác định đƣợc từ hệ sớm, rút ngắn thời gian lai tạo Dựa vào phân tích kiểu gen kiểm sốt tính trạng, nhà chọn giống chọn đƣợc giống mang nhiều tính trạng mong muốn thời điểm Ngồi việc chọn lọc giống lúa có khả kháng rầy nâu suất chất lƣợng gạo mục tiêu quan trọng cần đƣợc quan tâm hàng đầu cơng tác tuyển chọn Những giống lúa có ƣu chất lƣợng gạo nhƣ hàm lƣợng amylose thấp, có mùi thơm, hạt gạo thon dài… giống lúa cần đƣợc khai thác Nhƣ vậy, việc chọn tạo giống lúa vừa thơm, có chất lƣợng cao, vừa kháng rầy nâu giai đoạn đƣợc xem vấn đề cấp bách mang ý nghĩa quan trọng mặt chiến lƣợc Xuất phát từ lý nêu trên, đề tài “ Nghiên cứu chọn tạo giống lúa thơm kháng rầy nâu (Nilaparvata lugenes Stal) dấu phân tử SSR” đƣợc thực 1.2 Mục tiêu Lai tạo chọn lọc hai dòng lúa có triển vọng để phát triển thành giống lúa thơm mang gen kháng rầy nâu, phục vụ cho sản xuất lúa vùng ĐBSCL 1.3 Những đóng góp luận án Nghiên cứu tạo đƣợc sáu tổ hợp lai hồi giao từ hai giống lúa mang gen kháng rầy nâu ba giống lúa thơm Chọn tạo đƣợc dòng lúa mang gen thơm gen kháng rầy nâu bph4 + Bph10, dòng lúa mang gen thơm gen kháng rầy nâu bph4 + Bph18 Kết hợp đánh giá kiểu gen, kiểu hình đặc tính nơng học chọn đƣợc 6/12 dòng lúa có số đặc tính nơng sinh học tốt để khảo nghiệm đồng Kết khảo nghiệm chọn đƣợc hai dòng lúa đáp ứng với mục tiêu chọn tạo đƣợc tiếp tục khảo nghiệm địa điểm khác ĐBSCL thời gian tới Chƣơng III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu Các mẫu giống lúa sử dụng làm vật liệu bao gồm: hai giống lúa mang gen kháng rầy nâu OM4103 OM10043, ba giống lúa mang gen thơm ST5, ST20 VD20, giống TN1 PTB33 làm giống chuẩn nhiễm chuẩn kháng rầy nâu Dấu phân tử BADH2 sử dụng để nhận diện gen thơm đƣợc cung cấp cơng ty CTGen dựa vào tên trình tự mồi đƣợc công bố Bradbury et al (2005) Sáu cặp mồi SSR sử dụng để kiểm tra gen kháng rầy nâu đƣợc cung cấp công ty sinh hóa Phù Sa dựa vào tên trình tự mồi đƣợc công bố Harini et al (2010), Jairin et al (2010), Kumari et al (2010) Jena et al (2005) 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Nội dung 1: Lai tổ hợp lai tạo dòng lúa theo mục tiêu Mục tiêu: Nghiên cứu đƣợc thực với mục tiêu tạo lai có mang gen thơm gen kháng rầy nâu bph4, Bph10 Bph18 Nội dung: Sử dụng dòng, giống lúa thơm ST5, ST20 VD20 (thể nhận) lai với giống mang gen kháng rầy nâu OM4103 OM10043 (thể cho) Sau tạo lai F1 đƣợc lai hồi giao hai lần với giống lúa thơm cho tự thụ phấn qua lần để tạo đƣợc dòng có mang gen thơm gen kháng rầy nâu 3.2.2 Nội dung 2: Sử dụng dấu phân tử để nhận diện gen thơm kháng rầy từ hệ phân ly kết hợp với đánh giá kiểu hình để chọn dòng lúa theo mục tiêu Mục tiêu: Xác định diện gen lặn thơm gen kháng rầy nâu bph4, Bph10, Bph18 từ lai F1 lai hồi giao Nội dung: - Sử dụng dấu phân tử liên kết để chọn lọc cá thể mang kiểu gen thơm gen kháng rầy nâu từ hệ F1 - Đánh giá chọn lọc theo mục tiêu dòng lúa mang kiểu gen thơm kiểu gen kháng rầy nâu 3.2.2.1 Sử dụng dấu phân tử để nhận diện gen thơm kháng rầy nâu Sử dụng dấu phân tử đƣợc báo cáo có liên kết chặt với gen kháng rầy nâu gen thơm lúa để kiểm tra tính đa hình cho việc phân biệt giống lúa thơm, giống lúa nhiễm kháng với rầy nâu hệ F1, BC1, BC2, BC3 a Ly trích ADN Thực qui trình ly trích ADN đƣợc mơ tả Rogers Bendich (1988) (qui trình CTAB) có hiệu chỉnh (Trần Nhân Dũng, 2011) b Phản ứng PCR * Kiểm tra gen kháng rầy nâu Các giống lúa đƣợc kiểm tra gen kháng rầy nâu mồi chuyên biệt cho loại gen kháng Thành phần hóa học cho phản ứng PCR trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất phản ứng PCR với mồi kháng rầy Thành phần Nƣớc cất lần Dung dịch đệm có KCl MgCl2 dNTP Mồi xi Mồi ngƣợc BSA Taq polymerase ADN Tổng cộng Thể tích (µl) 11 2.5 1 0.25 0.25 25 Nồng độ gốc Nồng độ sau 10X 25Mm 0.2mM loại 0.24μM 0.24μM 0.1% 5U/μL 100- 200ng 1X 3mM 0,032mM 0,0096 μM 0,0096 μM 0,001 % 0,05U/ μL 8-16ng * Kiểm tra gen qui định tính trạng mùi thơm Các giống lúa đƣợc kiểm tra tính trạng mùi thơm dựa vào dấu phân tử BADH2 với bốn mồi chuyên biệt EPS, IFAP, INSP, EAP Các thành phần phản ứng lần lƣợt cho vào tuýp PCR với thứ tự liều lƣợng đƣợc trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2: Thành phần hóa chất phản ứng PCR với bốn mồi thơm Thành phần Nƣớc cất lần Dung dịch đệm có KCl dNTP MgCl2 Mồi ESP Mồi EAP Mồi IFAP Mồi INSP BSA Taq polymerase ADN Tổng cộng Thể tích (µl) 2.5 2 2 0.25 0.25 25 Nồng độ gốc Nồng độ sau 10X 0.2mM loại 25mM 0.24μM 0.24μM 0.24μM 0.24μM 0.1% 5U/μL 100- 200ng 1X 0.032Mm 3mM 0.0192 μM 0.0192 μM 0.0192 μM 0.0192 μM 0.001% 0.05U/ μL 8-16ng Sản phẩm phản ứng PCR đƣợc kiểm tra gel điện di agarose 1,5% có bổ sung 2,0l/100ml thuốc nhuộm Safe View với hiệu điện 50V/60 phút dung dịch TE 1,0X Sau chụp hình gel máy BIORAD UV 2000 c Xử lý số liệu - Kiểm định phân ly kiểu gen quần thể F2 phép kiểm định Chi bình phƣơng (χ2) - Số liệu đánh giá dòng đƣợc xử lý phần mềm Excel 3.2.2.2 Đánh giá kiểu hình a Bố trí thí nghiệm Các dòng lúa lai đƣợc gieo không nhắc lại Đối chứng giống lúa bố mẹ thơm kháng rầy nâu Phân đƣợc bón theo cơng thức 90-40-30 (kg N, P O , K O/ha) đƣợc chia thành lần bón (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) b Đánh giá tiêu: Dựa theo tiêu chuẩn “đánh giá nguồn gen lúa” IRRI (2014 - tái lần 5) Mỗi giống/ dòng lúa chọn ngẫu nhiên 10 bụi để đánh giá tiêu: thời gian sinh trƣởng, chiều cao cây, thành phần suất suất 3.2.3 Nội dung 3: Khảo nghiệm dòng lúa lai ưu tú điều kiện đồng ruộng Mục tiêu: Chọn đƣợc dòng lai có số đặc tính nơng sinh học tốt, mang gen thơm gen kháng rầy nâu Nội dung: - Đánh giá mùi thơm dòng lai ƣu tú cảm quan, - Đánh giá khả kháng rầy nâu điều kiện nhân tạo, - Trồng thử nghiệm dòng lai Long Phú – Sóc Trăng để đánh giá chọn lọc theo mục tiêu dòng lúa mang kiểu gen thơm gen kháng rầy nâu 3.2.3.1 Bố trí thí nghiệm: Các dòng lai đƣợc bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên lần lặp lại, diện tích lơ m2 lần lập lại, giống lúa bố mẹ (ST5, ST20, VD20, OM4103, OM10043) giống lúa đối chứng 3.2.3.2 Ghi nhận tiêu: a Đánh giá chọn lọc kiểu hình: Kiểu hình dòng lai đƣợc đánh giá chọn lọc theo mục tiêu: thời gian sinh trƣởng ngắn ngày (90-105 ngày), có mùi thơm, suất từ - tấn/ha, hàm lƣợng amylose thấp (< 20%), có phản ứng kháng kháng với rầy nâu (cấp 1- 5) điều kiện nhà lƣới b Đánh giá chất lƣợng gạo: Lúa sau thu hoạch đƣợc đánh giá chất lƣợng gạo thơng qua tiêu: hình dạng hạt, tỷ lệ gạo nguyên, tỷ lệ bạc bụng, mùi thơm, hàm lƣợng amylose * Hình dạng hạt: chọn ngẫu nhiên 10 hạt cho lặp lại, dùng thƣớc đo chiều dài chiều rộng hạt (mm) sau tính tỷ lệ dài/rộng Phân loại hình dạng hạt theo tiêu chuẩn FAO: Thon dài: > 3mm, Bầu: – 3mm, Tròn: < 2mm * Tỷ lệ bạc bụng: chọn ngẫu nhiên 100 hạt gạo nguyên cho lần lặp lại, quan sát tính tỷ lệ hạt đục, phân nhóm theo IRRI (2014): khơng bạc bụng: 0%, bạc bụng: 20% * Tỷ lệ gạo nguyên: xay xác 200g mẫu hạt độ ẩm 14% lặp lại, cân khối lƣợng gạo nguyên thu đƣợc Tỷ lệ gạo ngun đƣợc tính theo cơng thức: * Mùi thơm đƣợc đánh giá cảm quan theo phƣơng pháp Jewel et al (2011) Mƣời hạt gạo dòng đƣợc bốc vỏ nghiền thành bột cho vào ống nghiệm Thêm 10ml KOH 1,7%, đậy kín ống nghiệm sau để nhiệt độ phòng vòng 60 phút Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần cho dòng Mùi thơm đƣợc đánh giá cảm quan theo mức: – không thơm, – thơm nhẹ, – thơm vừa, – thơm (Jewel et al., 2011) * Hàm lƣợng amylose đƣợc phân tích theo phƣơng pháp Graham (2002) đƣợc phân loại theo IRRI (1996) theo tỷ lệ: 0-2%: nhóm nếp, 3-10%: thấp (gạo dẻo), 11-19%: thấp (gạo dẻo), 20-25%: trung bình (mềm cơm), >25%: cao (cứng cơm) * Khả chống chịu sâu bệnh điều kiện đồng ruộng nhƣ: sâu lá, rầy nâu bệnh đạo ôn theo thang điểm IRRI (1996) 3.2.3.3 Đánh giá khả kháng rầy nâu điều kiện nhân tạo Các dòng lai có triển vọng hệ BC3F4 đƣợc kiểm tra khả kháng rầy nâu phƣơng pháp hộp mạ theo phƣơng pháp IRRI (1996) có hiệu chỉnh: Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với lần lặp lại Dùng kẹp cấy hạt lúa vừa nảy mầm cho vào khay bùn mịn có phân lơ, kẻ hàng Theo chiều ngang khay bùn chia làm lô, lô gồm 10 hàng cách 2,0cm cho lặp lại giống Theo chiều dài khay lặp lại hàng gồm 10 hạt/lô với số hàng tổng số giống thử nghiệm cộng giống chuẩn nhiễm TN1 giống chuẩn kháng PTB33, tối thiểu hàng cách 2,0cm Khay bùn đƣợc đậy kín để giúp mầm lúa phát triển đạt chiều cao 2,0cm, cho khay vào hộp mạ Khi mạ đƣợc 2-3 mầm (khoảng 7-10 ngày sau gieo) tiến hành thả rầy tuổi 1- với mật độ 4- con/cây theo dõi đánh giá * Chỉ tiêu theo dõi: Khi tất giống chuẩn nhiễm (TN1) vừa chết hết rầy gây hại, tiến hành đánh giá tính kháng giống/dòng thử nghiệm Đếm số lƣợng lúa bị rầy nâu gây hại mức độ bị thiệt hại tất lơ thí nghiệm theo thang đánh giá Standard Evaluation Stem for Rice (IRRI, 2002) Đánh giá gây hại rầy nâu theo thang điểm chín cấp IRRI (1996): - Cấp (Rất kháng): Cây phát triển bình thƣờng, khơng bị hại - Cấp (Hơi kháng): Rất bị thiệt hại - Cấp (Hơi kháng): Lá thứ hầu hết bị vàng phần (nhƣớm vàng) - Cấp (Hơi nhiễm): Vàng lùn rõ rệt, 10- 25 % số héo hay chết, lại còi cọc phát triển - Cấp (Nhiễm): Trên 50 % héo (hoặc chết) - Cấp (Rất nhiễm): 100 % chết 3.2.3.4 Xử lý số liệu Dùng phần mềm SPSS 18.0 để xử lý số liệu thu thập với đặc số thống kê nhƣ: phân tích phƣơng sai, so sánh kiểm định dòng lai Sử dụng phần mềm Excel để phân tích số liệu q trình đánh giá chọn dòng Chƣơng IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết lai tạo tổ hợp lai chọn giống lúa thơm kháng rầy nâu Công việc lai tạo để tạo dòng mang gen mục tiêu đƣợc thực từ tháng năm 2013 đến tháng năm 2015 nhà lƣới Viện Nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, trƣờng Đại học Cần Thơ Hai giống mang gen kháng rầy nâu OM4103 OM10043 đƣợc sử dụng làm vật liệu cho gen kháng Đây hai giống có khả kháng vừa với nguồn rầy nâu ĐBSCL với cấp kháng từ cấp 3-5 theo kết nghiên cứu đề tài khoa học công nghệ cấp sƣu tập, đánh giá bảo tồn nguồn gen lúa kháng rầy nâu nhằm phục vụ công tác lai tạo Trần Nhân Dũng ctv (2012) Ba giống lúa thơm ST5, ST20, VD20 làm vật liệu nhận gen kháng Đây ba giống lúa thơm có chất lƣợng cao đƣợc Hiệp hội Lƣơng thực Việt Nam (VAF) khuyến cáo đƣa vào sản xuất ĐBSCL, nhƣng lại có nhƣợc điểm nhiễm nặng với rầy nâu Do đó, nghiên cứu tiến hành lai tạo để chuyển gen kháng rầy nâu vào giống lúa thơm Tổng cộng có tổ hợp lai đƣợc thực qua lần lai tạo hạt lai F1, BC1, BC2 BC3 Hạt lai F1 BC1 đƣợc tạo vụ Hè Thu 2013 Đông Xuân 2014 Hạt lai BC2 BC3 đƣợc tạo vụ Hè Thu 2014 Đông Xuân 2015 Số đƣợc chọn cho tổ hợp lai 10 bông, trổ khỏi bẹ khoảng 60%, sau tiến hành bỏ hoa bên trên, bên dƣới hoa xấu, dị dạng cho để lại 20 hoa để khử đực thụ phấn Nhƣ tổ hợp lai có 200 hạt lai đƣợc tạo hệ F1, BC1, BC2 BC3 Qua lần lai tạo thu đƣợc 2.573 cá thể Ở Gen kháng bph4 đƣợc nhận diện hai dấu phân tử RM225 RM586 Kết kiểm định tỷ lệ phân ly kiểu gen quần thể hồi giao BC1F1 sáu tổ hợp lai bảng 4.4 cho thấy lai có tỷ lệ phân ly gần theo tỷ lệ 1:1 với giá trị χ2 phép kiểm định dao động từ 0,27 đến 3,5 nhỏ giá trị χ2 tra bảng (3,84) Nhƣ vậy, tỷ lệ phân ly kiểu gen dòng lai đƣợc nhận diện hai dấu phân tử gần với tỷ lệ phân ly theo lý thuyết quy luật di truyền Mendel Trên quần thể lai BC2 số cá thể mang kiểu gen dị hợp dao động từ 11 đến 13 cá thể sáu tổ hợp lai sử dụng dấu phân tử RM225 để kiểm tra Dấu phân tử RM586 nhận diện đƣợc – 13 cá thể lai mang kiểu gen dị hợp Có 71/180 lai đƣợc nhận diện có mang gen kháng rầy nâu bph4 trạng thái dị hợp dấu phân tử RM225, 63/180 lai dị hợp đƣợc nhận diện dấu phân tử RM586 Trên quần thể lai BC3, dƣới hỗ trợ dấu phân tử RM225 nhận diện đƣợc 64/180 lai mang kiểu gen kháng trạng thái dị hợp tử, 56/180 lai dị hợp tử đƣợc xác định dấu phân tử RM586 4.2.3.2 Nhận diện gen kháng rầy nâu Bph10 giống bố mẹ lai hồi giao BC1, BC2 BC3 Đối với gen Bph10, nghiên cứu sử dụng dấu phân tử RM17 RM260 để nhận diện diện gen kháng Kết phổ diện điện di gel hình 4.7 cho thấy thực phản ứng PCR sử dụng cặp mồi RM17 đoạn ADN đƣợc khuếch đại có kích thƣớc khoảng 180 - 195 bp thể với kiểu gen kháng (OM4103) nhiễm (ST5, ST20 VD20), có đa hình giống cho nhận gen kháng Sản phẩm PCR ba giống lúa thơm ST5, ST20 VD20 (giống mẹ, nhận gen kháng) khuếch đại băng với kích thƣớc 180bp, giống lúa kháng rầy nâu OM4103 (giống bố, cho gen kháng) khuếch đại băng với kích thƣớc 195bp Trong 11 cá thể BC1F1 đƣợc phân tích, có dòng (6, 7, 8, 12 14) cho kiểu gen dị hợp (sản phẩm PCR có băng) Nhƣ vậy, gen kháng rầy nâu đƣợc chuyển vào giống lúa thơm, dòng đƣợc chọn để lai hồi giao lại với giống lúa thơm để tạo dòng lúa thơm mang gen kháng rầy nâu Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi RM17 bố mẹ lai hồi giao MK– thang chuẩn 100bp, 1-ST5, 2-ST20, 3-VD20, 4-OM4103, 5-OM10043, 6-16: lai hồi giao Dấu phân tử RM260 đƣợc sử dụng để nhận diện gen Bph10 để gia tăng tính xác trình xác dịnh gen kháng quần thể lai hồi giao Từ kết 12 phân tích hình gel 4.8 cho thấy đoạn ADN thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 110125bp Những giống mang gen kháng rầy nâu (OM4103) liên kết với gen Bph10 thể gel với băng khoảng 110 bp giống không mang gen kháng rầy nâu (ST5, ST20 VD20) thể gel với băng 125 bp Trong 10 dòng BC1F1 đƣợc chọn để khảo sát có dòng mang kiểu gen dị hợp (6, 7, 10 13) khuếch đại băng giống thơm giống kháng rầy, dòng mang gen kháng Những dòng đƣợc chọn để lai hồi giao hệ Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi RM260 bố mẹ lai hồi giao MK– thang chuẩn 100bp, 1-ST5, 2-ST20, 3-VD20, 4-OM4103, 5-15: lai hồi giao Sử dụng phƣơng pháp kiểm định "Chi bình phƣơng" (χ2) để kiểm định kiểu gen kháng rầy nâu Bph10 đƣợc xác định hai dấu phân tử RM17 RM260 phân ly quần thể BC1 Kết Bảng 4.6 cho thấy tỷ lệ phân ly lai hồi giao gần theo tỷ lệ 1:1 với giá trị χ2 phép kiểm định dao động từ 0,27 đến 3,5 nhỏ giá trị χ2 tra bảng (3,84) Nhƣ vậy, hai dấu phân tử đƣợc sử dụng để nhận diện gen kháng có độ tin cậy cao Bảng 4.6: Tỷ lệ phân ly kiểu gen kháng Bph10 hệ BC1F1 ba tổ hợp lai đƣợc nhận diện hai dấu phân tử RM17 RM260 STT Tên tổ hợp lai Dấu phân tử RM17 RM260 RM17 ST20 x OM4103 RM260 RM17 VD20 x OM4103 RM260 χ2 bảng (df =1, p = 0,05) = 3,84 ST5 x OM4103 Số đánh giá 20 20 11 11 18 18 Kiểu gen kháng rầy Giá trị χ2 Nhiễm Dị hợp kháng 11 0,05 12 0,45 0,36 1,45 11 0,5 12 1,39 Probability 0,90