Chọn tạo giống lúa tính trạng hàm lượng amylose thấp bằng chỉ thị phân tử SSR trên quần thể lai hồi giao tt

Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn giống lúa có hàm lượng amylose thấp trên quần thể lai hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976.. Xuất phát từ những vấn đề đặt ra, nghiên cứu được thực hiện nhằm k

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LAI HỒI GIAO

Cần Thơ, 2018

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: GS.TS Nguyễn Thị Lang

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường

Họp tại: ……… Trường Đại học Cần Thơ)

Vào lúc … giờ … ngày … tháng … năm …

Phản biện 1: ………

Phản biện 2: ………

Phản biện 3 :………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Hồ Văn Được, Nguyễn Thị Lang, Đặng Thị Diễm Kiều, Nguyễn

Thị Thảo Nguyên, Bùi Chí Bửu, 2016 Phân tích hàm lượng amylose và tính trạng nông học của cây lúa trên quần thể lai hồi giao OM5930/OM7347//OM5930 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam 6 (67): 25-30

2 Hồ Văn Được, Nguyễn Thị Lang, Trần Thị Thanh Xà, Nguyễn

Thị Thảo Nguyên, Bùi Chí Bửu, 2016 Nghiên cứu đa dạng hàm lượng amylose và một số tính trạng chính của tập đoàn lúa cao sản và lúa mùa Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam 10 (71): 22 - 26

3 Hồ Văn Được, Nguyễn Thị Lang, Bùi Phước Tâm, Phạm Thị Bé

Tư, 2017 Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn giống lúa có hàm lượng amylose thấp trên quần thể lai hồi giao

OM6976/Jasmine85//OM6976 Tạp chí Khoa học Công Nghệ

Chương I MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực

quan trọng trên thế giới cung cấp nguồn năng lượng chính cho một nửa dân số trên thế giới Trong đó, ở châu Á, hơn 90% sản lượng lúa được sản xuất và tiêu thụ Trước đây, đa số nông dân Việt Nam có thói quen sản xuất giống lúa ngắn ngày, năng suất cao và dễ canh tác

vì chống chịu sâu bệnh tốt Tuy nhiên, các giống này thường có phẩm chất thấp, cứng cơm và không có mùi thơm Do đó, mặc dù có nhiều đột phá về mặt sản lượng nhưng chất lượng cũng như giá thành sản phẩm chưa cao và thị trường tiêu thụ còn hạn chế Ngày nay, với sự phát triển của xã hội, nhu cầu ăn ngon thay thế dần nhu cầu ăn no, các sản phẩm gạo mềm dẻo, thơm ngày càng được ưa chuộng Chính vì vậy, việc nghiên cứu, lai tạo và phát triển các giống lúa mới ngon dẻo lại thích nghi đa dạng và cho năng suất cao đang là nhu cầu cấp bách của sản xuất lúa gạo trong vùng

Chất lượng gạo là một khái niệm chung bao hàm rất nhiều các đặc tính khác nhau từ các đặc tính vật lý đến sinh hóa và sinh lý Tinh bột và protein là hai thành phần chính trong nội nhũ của hạt, vì vậy nó

là chìa khóa của chất lượng hạt Tinh bột chứa hỗn hợp amylose và

amylopectin (Juliano, 2003; Fitzgerald et al., 2009a; Chen et al.,

2012) Nhiều nghiên cứu cho rằng tính chất mềm dẻo của cơm phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng amylose (AC), nó là kết quả của kiểu

gen và một vài thay đổi của môi trường (Fitzgerald et al., 2009a)

Hàm lượng này được sử dụng như một chỉ số quan trọng để đánh giá

chất lượng cơm (Asghar et al., 2012) Về mặt di truyền, nhiều nghiên

cứu cho rằng tính trạng hàm lượng amylose cao và thấp đều do một

gen duy nhất điều khiển Gen waxy là gen điều khiển tính trạng hàm

lượng amylose trong hạt gạo định vị trên nhiễm sắc thể số 6 Gen trội

A qui định hàm lượng amylose cao và gen đồng hợp lặn aa qui định hàm lượng amylose thấp

Việc phát triển các giống lúa ưu tú mới có năng suất và chất lượng cao là thách thức đối với phương pháp chọn giống truyền thống

Vì vậy cần có những đột phá mới cho công tác chọn tạo giống bằng phương pháp hiện đại Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống (MAS) cho lai hồi giao (MABC) là phương pháp chuyển một gen mục tiêu từ giống cho gen (donor) sang giống nhận gen (recipient) trong khi vẫn giữ lại các đặc tính quan trọng của giống nhận thông qua lai

hồi giao Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép giải mã di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, rút ngắn thời gian chọn tạo, do đó tăng hiệu quả chọn lọc gen trên một đơn vị thời gian (Hospital, 2003) MABC

đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu tạo chọn giống lúa chất

lượng cao trước đây (Hasan et al, 2015; Hồ Văn Được và ctv., 2016a,

2017; Nguyen Thị Lang and Bui Chi Buu, 2004)

Xuất phát từ những vấn đề đặt ra, nghiên cứu được thực hiện nhằm khai thác phương pháp MABC trong lai tạo giống lúa có hàm lượng amylose thấp (≤20%), năng suất cao phù hợp với nhu cầu về giống lúa cũng như điều kiện canh tác của ĐBSCL hiện nay

2 Mục tiêu

2.1 Mục tiêu chung: Nghiên cứu, chọn tạo các dòng/giống lúa

có phẩm chất tốt liên quan đến chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp dựa trên sự kết hợp giữa phương pháp lai hồi giao và chọn giống bằng chỉ thị phân tử

2.2 Mục tiêu cụ thể:

Khai thác gen liên quan đến chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp thông qua đa dạng nguồn vật liệu ban đầu từ bộ lúa mùa địa phương và

bộ lúa cao sản ngắn ngày

Ứng dụng MABC trong chọn lọc các quần thể lai hồi giao thông qua đánh giá kiểu hình và phân tích kiểu gen dựa trên việc xác định

gen waxy trên nhiễm sắc thể số 6 và các gen liên quan năng suất và

thành phần năng suất được đánh dấu trên cá thể cây mẹ

Đánh giá đa dạng di truyền trên quần thể con lai và chọn lọc các

cá thể mang gen mục tiêu mong muốn thông qua xây dựng bản đồ GGT trên các quần thể NILs

Chọn lọc các dòng lúa triển vọng có tính trạng hàm lượng amylose thấp (≤20%) và năng suất cao (từ 7 - 8 tấn/ha vụ Đông xuân và 4 – 5 tấn/ha vụ Hè thu) nhằm phục vụ cho công tác chọn

tạo giống lúa mới

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các giống lúa mùa địa phương thu thập ở các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long và các giống cao sản từ Ngân hàng gen của Bộ môn

Di truyền- Chọn giống, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

4 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Các thí nghiệm được thực hiện tại Viện Lúa ĐBSCL Thời gian thực hiện từ tháng 10/2013 đến tháng 06/2017

Đề tài đã đánh giá và khai thác hiệu quả nguồn vật liệu bố mẹ

mà các nghiên cứu trước đây ở Việt Nam còn nhiều hạn chế

Bên cạnh mục tiêu chọn tạo giống có hàm lượng amylose thấp,

đề tài còn chú ý đến năng suất cao và thời gian sinh trưởng phù hợp Điều này là điều kiện quyết định để các sản phẩm giống lúa có thể ứng dụng và phát triển rộng khi đề tài kết thúc

Kết hợp giữa lai tạo truyền thống, sinh học phân tử và tin sinh học trong nghiên cứu

6 Bố cục của luận án

Luận án dài 166 trang, gồm phần giới thiệu, tổng quan tài liệu, phương pháp nghiên cứu, kết quả thảo luận và phần kết luận và đề nghị và phần phụ lục Luận án có 12 bảng, 33 hình và 156 tài liệu tham khảo

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.1 Đánh giá hàm lượng amylose

Phân tích hàm lượng amylose trên lúa gạo được thực hiện bằng phương pháp sinh hóa của Seko (2003)

Hình 2.1 Phản ứng màu của các giống lúa phân tích hàm lượng

amylose

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn đánh giá hàm lượng amylose trên hạt (IRRI,

1996)

Hàm lượng amylose

(%) Tiêu chuẩn Phân loại

0-2 2-20 20-25

> 25

Rất thấp

Thấp Trung bình Cao

Nếp Gạo dẻo Gạo mềm cơm Gạo cứng cơm

2.2.1.2 Đánh giá các đặc tính nông học, các thành phần năng suất và năng suất

Đánh giá các đặc tính nông học, các thành phần năng suất và năng suất theo QCVN01-55:2011/BNNPTNT

2.2.1.3 Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình

Phân tích kết quả phân nhóm bằng phần mềm NTSYSpc theo (Rohlf, F.J (1992)

2.2.1.4 Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ

❖ Ly trích ADN từ cây lúa:

Phương pháp ly trích ADN thực hiện theo quy trình của IRRI (1996)

❖ Khuếch đại gen mục tiêu thông qua phương pháp PCR-SSR:

Sản phẩm PCR được khuếch đại thông qua microsatellite (SSR)

theo phương pháp của IRRI (1996) và Nguyễn Thị Lang (2002)

2.2.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai

2.2.2.1 Lai tạo lúa trong nhà lưới

- Chọn bố mẹ: Đối với cây mẹ, bông phải trổ khỏi bẹ từ 50-

60% Đối với cây bố, bông lúa trổ vươn ra khỏi bẹ và các hoa lúa nở

để lộ các nhị đực vàng ra bên ngoài vỏ trấu

- Khử đực trên cây mẹ: thời gian khử đực thường vào lúc chiều

mát (khoảng 15 đến 17 giờ) Bông lúa được tách nhẹ nhàng ra khỏi bẹ đòng, sau đó được xử lý bằng cách dùng kéo cắt bỏ các hoa đã nở ở chóp bông (nhị đực đã phơi ra) và những hoa còn non ở cuối bông Các bông lúa đã khử đực được bao bọc lại bằng giấy bóng mờ, không thấm nước, cố định và ghi thông tin lên bao giấy (Hình 2.2)

Hình 2.2 Thao tác khử đực trên cây mẹ (Hồ văn Được, Viện Lúa

ĐBSCL, 2013)

Cách phủ phấn: thời gian phủ phấn lúc có nắng tốt (thường

khoảng 9-10 giờ)

Chăm sóc bông lai: kiểm tra hạt lai sau 3 - 4 ngày phủ phấn

Hình 2.3 Sự thụ phấn và tạo hạt lai (Hồ văn Được, Viện Lúa

Phương sai kiểu gen: σ2 = [(TrMS - EMS) / r]

Phương sai kiểu hình: σ2

= [σ2 + EMS]

Hệ số di truyền: h2

BS = [σ2g / σ2 ] Hiệu quả chọn lọc: GA = i h2

BS (σ2)-1

Trong đó: σ2 : phương sai kiểu gen; σ2: phương sai kiểu hình; TrMS: trung bình bình phương của nghiệm thức; EMS: trung bình bình phương của sai số; r: số lần lặp lại của thí nghiệm; h2

BS: hệ số di truyền theo nghĩa rộng; GA: hiệu quả chọn lọc; i: giá trị chuẩn của cường độ chọn lọc (i(10%)=1,76)

Quần thể F2 nào có giá trị hệ số di truyền càng cao và hiệu quả chọn lọc càng cao thì quần thể đó cho hiệu quả lai tạo và di truyền kiểu gen càng tốt

2.2.3 Nội dung 3: Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng amylose thấp thông qua MAS

Lai tạo và chọn lọc các quần thể lai hồi giao nhờ các chỉ thị

phân tử (BC1F1- BCnF1)

Hình 2.5 Sơ đồ quy tụ gen waxy trên quần thể lai hồi giao thông qua

- Năng suất trung bình đến khá

- Hàm lượng amylose thấp

- Chỉ thị Wx

- Cây BC 1 F 1 dị hợp tử gen waxy

- Đồng hợp tử gen đánh dấu trên cây mẹ

…

- Chỉ thị Wx

- Cây BC 1 F 1 dị hợp tử gen waxy

- Đồng hợp tử gen đánh dấu trên cây mẹ

BC n F 1

- Chỉ thị Wx

- Cây BC 1 F 1 dị hợp tử gen waxy

- Đồng hợp tử tất cả các gen đánh dấu trên cây mẹ

BC n F 2

- Chỉ thị phân tử cho đa hình trên 12 nhiễm sắc thể

- Lập bản đồ GGT đánh giá sự tái tổ hợp gen trên quần thể

- Cây BC 1 F 1 dị hợp tử gen waxy

- Đồng hợp tử gen đánh dấu trên cây mẹ

MAS

BC 3 F 1

- Năng suất cao, ổn định

- Hàm lượng amylose cao

Bước 1: Chọn lọc bố mẹ phù hợp Đánh giá đa hình kiểu gen

giữa giống bố (giống cho gen, donor, DP) và giống mẹ (giống

nhận gen, recipient, RP) đối với gen waxy và các gen được đánh dấu

trên cá thể mẹ (gen tái tổ hợp)

Bước 2: Lai tạo quần thể lai hồi giao Các cá thể F1 được lựa

chọn cho lai hồi giao là các cá thể mang gen waxy dị hợp tử Cây F1

được lai lại với giống mẹ (RP) tạo quần thể BC1F1 Các cá thể BC1F1

được chọn lọc thông qua MAS (dị hợp tử trên gen waxy và đồng hợp

tử trên các gen tái tổ hợp) được cho lai với cây mẹ (RP) để tạo quần thể BC2F1

Bước 3: Chọn lọc dòng thuần các quần thể lai hồi giao Các dòng hồi giao mang gen waxy dị hợp tử và mang gần như toàn bộ nền

di truyền của cây mẹ (các gen tái tổ hợp đồng hợp như cây mẹ đạt khoảng 90%) được cho tự thụ để đạt được quần thể BCnF2 Đối với gen

mục tiêu (waxy), ở thế hệ này, các cá thể thể hiện gần như toàn bộ các

alen và việc chọn lọc gen đích là hiệu quả nhất Các thế hệ của quần thể được cho tự thụ và chọn lọc liên tục cho đến dòng thuần

2.3.4 Nội dung 4: Chọn lọc các quần thể hồi giao BC n F 2 thông qua lập bản đồ GGT

2.3.4.1 Kiểm tra kiểu gen của quần thể con lai trên 12 nhiễm sắc thể dựa trên các chỉ thị phân tử đa hình giữa cây bố và mẹ

Phương pháp ly trích ADN, PCR, kiểm tra sản phẩm PCR được

thực hiện tương tự như phần 2.3.1.4

2.3.4.2 Lập bản đồ GGT đánh giá sự di truyền của quần thể con lai, qua đó chọn lọc các cá thể mang gen mục tiêu mong muốn

Phương pháp GGT do Young and Tanksley đề xuất (1989)

Phương pháp lập bản đồ GGT thông qua các bước như sau:

(1) Lập file dữ liệu trên Excel: mã hóa gen của quần thể với A,

B là kiểu gen đồng hợp tử của cây bố mẹ; H là kiểu gen dị hợp tử; U

là kiểu gen chưa được xác định

(2) Nhập dữ liệu vào cửa sổ GGT: chuyển đổi dữ liệu Excel sang

dữ liệu GGT

(3)Xử lý số liệu trong GGT,

(4) Đăng xuất kết quả

2.2.5 Nội dung 5: Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BC n F 3 2.2.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các cá thể của quần thể BCnF3 được trồng trên ruộng thí nghiệm Chọn dòng triển vọng được bố trí theo kiểu tuần tự, không lặp lại, cấy 1 tép với khoảng cách 20 x 15 cm

2.2.5.2 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen liên quan hàm lượng amylose trên quần thể con lai

Phân tích hàm lượng amylose (%): Phương pháp thực hiện tương tự như phần 2.2.1.1

Phân tích độ trở hồ (cấp): Phân tích độ trở hồ được thực hiện

theo phương pháp của IRRI (1996)

Bảng 2.2 Thang điểm đánh giá nhiệt trở hồ theo tiêu chuẩn của IRRI

1 Hạt gạo còn nguyên Hạt gạo trắng bột Cao

2 Hạt gạo phòng lên Hạt gạo trắng bột,

viền vừa tươm bột Cao

3 Hạt gạo phồng lên, viền

còn nguyên hay rõ nét

Hạt gạo trắng bột, viền nhòe như bong gòn

Cao

4 Hạt gạo phồng lên, viền

còn nguyên và nở rộng Tâm nhòe như bong gòn, viền còn đục Trung bình

5 Hạt rã ra viền hoàn toàn

7 Hạt hòa tan hoàn toàn

và quyền vào nhau Tâm và viền trong suốt Thấp

Phân tích độ bền gel (mm): Phân tích độ bền gel theo phương pháp

của Tang et al (1991)

Bảng 2.3 Phân loại độ bền thể gel theo tiêu chuẩn SES (IRRI, 1996)

Phương pháp đánh giá các thành phần năng suất và năng suất

tương tự như mục 2.2.1.1

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được nhập và lưu trữ bằng chương trình Microsoft Ofice

Excel 2013

Phân tích và thống kê số liệu (ANOVA, DUCAN) bằng

Microsoft Ofice Excel, Cropstat 7.2, STAR

Phân nhóm di truyền sử dụng phần mềm NTSYSpc

Vẽ biểu đồ sử dụng Microsoft Ofice Excel, R-studio

Chọn lọc cá thể của quần thể thông qua phân tích Graphical genotypes 2 (GGT 2.0)

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp

Trong nghiên cứu này, 88 giống lúa mùa và 71 giống lúa cao sản lần lượt được đánh giá hàm lượng amylose, các tính trạng nông học, các thành phần năng suất và năng suất Những giống lúa có đặc tính tốt, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu sẽ được chọn để làm vật liệu lai

3.1.1 Đánh giá hàm lượng amylose trên bộ giống vật liệu lai

Trên bộ giống lúa cao sản, kết quả đánh giá hàm lượng amylose được ghi nhận như sau: 17 giống có hàm lượng amylose thấp (chiếm 24%), 27 giống có hàm lượng amylose trung bình (chiếm 38%) và 27 giống có hàm lượng amylose cao (chiếm 38%) Trong khi đó, đối với

bộ lúa địa phương, 1 giống có hàm lượng amylose rất thấp (3,67%) (chiếm 1,1%), 31 giống có hàm lượng amylose thấp (chiếm 35,2%),

34 giống có hàm lượng amylose trung bình (chiếm 38,7%) và 22 giống có hàm lượng amylose cao (chiếm 25,0%) (Hình 3.1) Kết quả này hợp lý với các thí nghiệm trước đây, thông thường các giống lúa mùa thường có hàm lượng amylose thấp hơn các giống lúa cao sản