“Chọn tạo giống lúa tính trạng hàm lượng amylose thấp bằng chỉ thị phân tử SSR trên quần thể lai hồi giao

1.1 Đặt vấn đề Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực quan trọng trên thế giới cung cấp nguồn năng lượng chính cho một nửa dân số trên thế giới. Trong đó, ở châu Á, hơn 90% sản lượng lúa được sản xuất và tiêu thụ. Trước đây, đa số nông dân Việt Nam có thói quen sản xuất giống lúa ngắn ngày, năng suất cao và dễ canh tác vì chống chịu sâu bệnh tốt. Tuy nhiên, các giống này thường có phẩm chất thấp, cứng cơm và không có mùi thơm. Do đó, mặc dù có nhiều đột phá về mặt sản lượng nhưng chất lượng cũng như giá thành sản phẩm chưa cao và thị trường tiêu thụ còn hạn chế. Ngày nay, với sự phát triển của xã hội, nhu cầu ăn ngon thay thế dần nhu cầu ăn no, các sản phẩm gạo mềm dẻo, thơm ngày càng được ưa chuộng. Chính vì vậy, việc nghiên cứu, lai tạo và phát triển các giống lúa mới ngon dẻo lại thích nghi đa dạng và cho năng suất cao đang là nhu cầu cấp bách của sản xuất lúa gạo trong vùng. Chất lượng gạo là một khái niệm chung bao hàm rất nhiều các đặc tính khác nhau từ các đặc tính vật lý đến sinh hóa và sinh lý. Tinh bột và prôtêin là hai thành phần chính trong nội nhũ của hạt, vì vậy nó là chìa khóa của chất lượng hạt. Tinh bột (polysacarit carbohydrate) chứa hỗn hợp amylose và amylopectin (Juliano, 2003; Fitzgerald et al., 2009a; Chen et al., 2012). Nhiều nghiên cứu cho rằng tính chất mềm dẻo của cơm phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng amylose (AC), nó là kết quả của kiểu gen và một vài thay đổi của môi trường (Fitzgerald et al., 2009a). Hàm lượng này được sử dụng như một chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng cơm (Asghar et al., 2012). Hàm lượng amylose thấp đặc trưng cho tính mềm, dẻo và bóng của hạt cơm. Ngược lại hàm lượng amylose cao làm cho gạo hấp thụ nhiều nước hơn và do đó làm tăng tính trương nước của hạt gạo, dẫn đến khô, xốp và cứng khi nguội lại. (Fitzgerald et al., 2009a; Patindol et al., 2010). Về mặt di truyền, nhiều nghiên cứu cho rằng tính trạng hàm lượng amylose cao và thấp đều do một gen duy nhất điều khiển. Gen waxy là gen điều khiển tính trạng hàm lượng amylose trong hạt gạo định vị trên nhiễm sắc thể số 6. Gen trội A qui định hàm lượng amylose cao và gen đồng hợp lặn aa qui định hàm lượng amylose thấp. Hạt mang gen dị hợp tử có hàm lượng amylose trung bình nhưng không ổn định. Nếu cần hạt có hàm lượng amylose trung bình thì bố hoặc mẹ phải có hàm lượng amylose từ thấp đến trung bình (Denyer et al., 2001; Nakamura and Yuki, 1992). Việc phát triển các giống lúa mới có năng suất và chất lượng caolà thách thức đối với phương pháp chọn giống truyền thống. Vì vậy cần có những đột phá mới cho công tác chọn tạo giống bằng phương pháp hiện đại. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống (MAS) cho lai hồi giao (MABC) là phương pháp chuyển một gen mục tiêu từ giống cho gen (donor) sang giống nhận gen (recipient) trong khi vẫn giữ lại các đặc tính quan trọng của giống nhận thông qua lai hồi giao. Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép giải mã di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, rút ngắn thời gian chọn tạo, do đó tăng hiệu quả chọn lọc gen trên một đơn vị thời gian (Hospital, 2003). MABC đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu tạo chọn giống lúa chất lượng cao trước đây (Hasan et al, 2015; Hồ Văn Được và ctv., 2016a, 2017; Nguyen Thị Lang and Bui Chi Buu, 2004). Xuất phát từ những vấn đề đặt ra, nghiên cứu được thực hiện nhằm khai thác phương pháp MABC trong lai tạo giống lúa có hàm lượng amylose thấp (≤20%), năng suất cao phù hợp với nhu cầu về giống lúa cũng như điều kiện canh tác của ĐBSCL hiện nay. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu, chọn tạo các dòng/giống lúa có phẩm chất tốt liên quan đến chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp dựa trên sự kết hợp giữa phương pháp lai hồi giao và chọn giống bằng chỉ thị phân tử. 1.2.2 Mục tiêu nghiên cứu cụ thể Khai thác gen liên quan đến chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp thông qua đa dạng nguồn vật liệu ban đầu từ bộ lúa địa phương và bộ lúa cao sản ngắn ngày. Ứng dụng MABC trong chọn lọc các quần thể lai hồi giao thông qua đánh giá kiểu hình và phân tích kiểu gen dựa trên việc xác định gen waxy trên nhiễm sắc thể số 6 và các gen liên quan năng suất và thành phần năng suất được đánh dấu trên cá thể cây mẹ. Đánh giá đa dạng di truyền trên quần thể con lai và chọn lọc các cá thể mang gen mục tiêu mong muốn thông qua xây dựng bản đồ GGT trên các quần thể NILs.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HỒ VĂN ĐƯỢC

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA HÀM LƯỢNG AMYLOSE THẤP BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRÊN QUẦN THỂ LAI HỒI GIAO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 9 42 02 01

CẦN THƠ, 2018

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN……… i

LỜI CẢM ƠN……… ii

TÓM TẮT……… iii

SUMMARY……… v

MỤC LỤC……… vii

DANH SÁCH BẢNG……… xii

DANH SÁCH HÌNH……… xiii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT……… xvi

Chương 1: GIỚI THIỆU……… 1

1.1 Đặt vấn đề ……… 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu ……… 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát ……… 2

1.2.2 Mục tiêu nghiên cứu cụ thể ……… 2

1.3 Nội dung nghiên cứu ……… 3

1.3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp………

3 1.3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai………… 3

1.3.3 Nội dung 3: Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng amylose thấp thông qua MAS……… 3

1.3.4 Nội dung 4: Chọn lọc các quần thể hồi giao BC n F 2 thông qua lập bản đồ GGT……… 3

1.3.5 Nội dung 5: Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BC n F 3 ……… 3

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ……… 4

1.4.1 Ý nghĩa khoa học ……… 4

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn ……… 4

1.5 Tính khoa học của đề tài ……… 4

1.6 Những đóng góp mới của đề tài ……… 5

1.7 Tính ứng dụng của đề tài ……… 5

1.8 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ……… 5

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……… 6

2.1 Các chỉ tiêu phẩm chất của hạt gạo ……… 6

2.1.1 Hàm lượng amylose (AC) ……… 6

2.1.2 Độ bền gel (GC) ……… 7

2.1.3 Độ trở hồ (GT) ……… 8

2.2 Sơ lược về hàm lượng amylose ……… 9

2.2.1 Sự hình thành tinh bột ở cây lúa ……… 9

2.2.2 Amylose và amylopectin……… ……… 9

2.2.3 Cơ sở di truyền tính trạng hàm lượng amylose ……… 11

2.3 Phương pháp lai hồi giao trong chọn tạo giống lúa……… 14

2.3.1 Một số khái niệm trong phương pháp lai hồi giao ……… 14

2.3.2 Ưu điểm của phương pháp lai hồi giao ……… 16

2.3.3 Ưu điểm của phương pháp lai hồi giao ……… 16

2.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa ……… 17

2.4.1 Sơ lược về phương pháp chọn lọc bằng chỉ thị phân tử ………… 17

2.4.2 Một số thành tựu của chỉ thị SSR trong chọn giống lúa ……… 18

2.5 Chọn tạo giống bằng phương pháp lai hồi giao kết hợp với chỉ thị phân tử……… 19

2.5.1 Các giả thuyết mô hình MAS ……… 19

2.5.2 Điều kiện để ứng dụng MAS ……… 20

2.5.3 Đối với các tính kháng sinh học 22

2.5.4 Đối với các tính kháng phi sinh học 23

2.5.5 Đối với các đặc tính nông học 23

2.6 Các kết quả nghiên cứu giống phẩm chất cao trong và ngoài nước 23

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 26

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ……… 26

3.2 Vật liệu nghiên cứu ……… 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu ……… 27

3.3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp ……… 27

3.3.1.1 Đánh giá hàm lượng amylose ……… 27

3.3.1.2 Đánh giá các đặc tính nông học, các thành phần năng suất và năng suất 27 3.3.1.3 Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình ……… 28

3.3.1.4 Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ ……… 29

3.3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai ……… 31

3.3.2.1 Lai tạo lúa trong nhà lưới ……… 31

3.3.2.2 Đánh giá hiệu quả chọn lọc tính trạng mục tiêu dựa trên các quần thể lai F 2 ……… 33

3.3.3 Nội dung 3: Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng amylose thấp thông qua MAS ……… 33

3.3.4 Nội dung 4: Chọn lọc các quần thể hồi giao BCnF2 thông qua lập bản đồ GGT ……… 35

3.3.4.1 Kiểm tra kiểu gen của quần thể con lai trên 12 nhiễm sắc thể dựa trên các chỉ thị phân tử đa hình giữa cây bố và mẹ ……… 35

3.3.4.2 Lập bản đồ GGT đánh giá sự di truyền của quần thể con lai, qua đó chọn lọc các cá thể mang gen mục tiêu mong muốn ………

35 3.3.5 Nội dung 5: Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BCnF3 ………

36 3.3.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm ……… 36

3.3.5.2 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen liên quan hàm lượng amylose trên quần thể con lai ……… 37

3.3.5.3 Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất để chọn lọc các dòng con lai ưu tú vừa có hàm lượng amylose thấp vừa có năng suất cao……… 40

3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 40

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 41

4.1 Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp ……… 41

4.1.1 Đánh giá hàm lượng amylose trên bộ giống vật liệu lai ……… 41

4.1.2 Đánh giá đặc tính nông học trên bộ giống lúa vật liệu lai ………… 42

4.1.3 Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất trên bộ giống lúa vật liệu lai ……… 43

4.1.4 Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình của bộ giống lúa vật liệu lai……… 44

4.1.5 Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ ……… 48

4.2 Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai ……… 51

4.2.1Tạo các quần thể F 1 ……… 51

4.2.2 Đánh giá hiệu quả chọn lọc tính trạng mục tiêu dựa trên các quần thể lai F 2 ……… 51

4.3 Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng amylose thấp thông qua MAS……… 56

4.3.1 Kết quả lai tạo quần thể hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 ………… 56

4.3.2 Kết quả lai tạo quần thể hồi giao OM6976/KDML//OM6976 … 64

4.3.3 Kết quả lai tạo quần thể hồi giao OM5930/OM7347//OM5930 ……… 67

4.4 Chọn lọc các quần thể hồi giao BC4F2 thông qua lập bản đồ GGT………… 69

4.4.1 Chọn lọc các cá thể BC4F2 của quần thể lai hồi giao OM6976/ Jasmine85// OM6976 ……… 69

4.4.2 Chọn lọc các cá thể BC4F2 của quần thể lai hồi giao OM6976/ KDML105// OM6976 ……… 71

4.4.3 Chọn lọc các cá thể BC4F2 của quần thể lai hồi giao OM5930/ OM7347// OM5930 ……… 72

4.5 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose thấp và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BC4F3 ……… 75

4.5.1 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose thấp và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp OM6976/Jasmine85//OM6976……… 75

4.5.2 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp

OM6976/KDML105//OM6976……… 79

4.5.3 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp OM5930/OM7347//OM5930……… 84

4.6 Thảo luận……… 88

Chuơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……… 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96

PHỤ LỤC……… 109

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Sự hiểu biết về Haplotype trong gạo dựa trên các đột biến gen Waxy…… 13

Bảng 2.2 Sự tương quan giữa số thế hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng triển vọng (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1……… 21

Bảng 3.1: Các chỉ thị phân tử liên kết các gen liên quan đến năng suất và thành phần năng suất trên các giống lúa bố mẹ 26 Bảng 3.2 Thành phần dung dịch đệm ly trích ADN và TE buffer (pH = 8) ………… 30

Bảng 3.3 Các thành phần của gel polyacrylamide và agarose được sử dụng…… 31

Bảng 3.4 Thang điểm đánh giá nhiệt trở hồ theo tiêu chuẩn của IRRI 38

Bảng 3.5 Phân loại độ bền thể gel theo tiêu chuẩn SES (IRRI, 1996) ……… 39

Bảng 4.1 Kết quả đánh giá đa hình các chỉ thị phân tử liên kết các gen liên quan đến năng suất và thành phần năng suất trên các giống lúa bố mẹ……… 50

Bảng 4.2 Số lượng các cá thể F1 của các quần thể lai được tạo ra……… 51

Bảng 4.3 Các thông số di truyền và hiệu quả chọn lọc của các tổ hợp lai ……… 55

Bảng 4.4 Số lượng cá thể chọn lọc qua các thế hệ F1 đến BC4F1 57

Bảng 4.5 Số lượng cá thể chọn lọc qua các thế hệ F1 đến BC4F1 ……… 66

Bảng 4.6 Số lượng cá thể chọn lọc qua các thế hệ F1 đến BC4F1 ……… 68

Bảng 4.7 Phẩm chất các dòng BC4F3 củ a quần thể OM6976/Jasmine85//OM6976 trong vu ̣Đông Xuân 2016-2017 ………

76 Bảng 4.8 Năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC4F3 trong vụ Đông Xuân 2016-2017 ……… 78

Bảng 4.9 Phẩm chất các dòng BC4F3 củ a quần thể OM6976/KDML105//OM6976 trong vu ̣Đông Xuân 2016-2017 ………

80 Bảng 4.10 Năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC4F3 trong vụ Đông Xuân 2016-2017 ……… 83

Bảng 4.11 Phẩm chất các dòng BC4F3 củ a quần thể OM5930/OM7347//OM5930 trong vu ̣Đông Xuân 2016-2017………

85 Bảng 4.12 Năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC4F3 trong vụ Đông Xuân 2016-2017 ……… 87

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu trúc của (a) amylose và (b) amylopectin (Liu, 2005) ……… 10 Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp lai hồi giao ……… 15 Hình 2.3 Giá trị trung bình của gen phục hồi qua từng thế hệ hồi giao ……… 15 Hình 3.1 Phân tích hàm lượng amylose bằng phương pháp sinh hóa và trên

máy đo quang phổ ………

27 Hình 3.2 Thao tác khử đực trên cây mẹ ……… 32 Hình 3.3 Sự thụ phấn và tạo hạt lai ……… 32

Hình 3.4 Sơ đồ quy tụ gen waxy trên quần thể lai hồi giao thông qua MAS 34 Hình 3.5 Phân tích GGT trên quần thể lai ở cây lúa……… 36 Hình 3.6 Sơ đồ bố trí các dòng lúa hồi giao trên ruộng thí nghiệm chọn

Hình 4.4: Phân nhóm di truyền các giống lúa cao sản trong bộ vật liệu lai (Ghi

Hình 4.5: Phân nhóm di truyền các giống lúa địa phương trong bộ vật liệu lai

(Ghi chú: NS: năng suất; AC: hàm lượng amylose)………

47 Hình 4.6: Sản phẩm PCR của các giống lúa bố mẹ với chỉ thị Wx trên gel

Hình 4.7: Kết quả đa hình của các giống bố mẹ với các chỉ thị cho gen liên

quan đến các thành phần năng suất và năng suất trên gel agarose 3% 50 Hình 4.8 Sự biến động của hàm lượng amylose trên con lai của các quần

Hình 4.9: Sự biến động của năng suất trên con lai của các quần thể lai hồi

Hình 4.10: Sơ đồ chọn tạo quần thể OM6976/Jasmine85//OM6976 thông qua MAS……….…………

56 Hình 4.11: Kết quả kiểu gen F1 của một số cá thể thuộc quần thể

Hình 4.12: Kết quả kiểu gen BC1F1 của quần thể lai hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx ……… 58 Hình 4.13: Kết quả kiểu gen BC1F1 của quần thể lai hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 và RM257………

59 Hình 4.14: Kết quả kiểu gen BC2F1 của quần thể lai hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx……… 60 Hình 4.15: Kết quả kiểu gen BC2F1 của quần thể lai hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 và RM257………

60 Hình 4.16: Kết quả kiểu gen BC3F1 của quần thể lai hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx ……… 61 Hình 4.17: Kết quả kiểu gen BC3F1 của quần thể lai hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 và RM257………

62 Hình 4.18: Kết quả kiểu gen BC4F1 của quần thể lai hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx ……… 63 Hình 4.19: Kết quả kiểu gen BC4F1 của quần thể lai hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 và RM257………

64 Hình 4.20 Sơ đồ chọn tạo quần thể OM6976/KDML105//OM6976 thông qua MAS 65

Hình 4.21 Sơ đồ chọn tạo quần thể OM5930/OM7347//OM5930 thông qua

Hình 4.22 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao 69

Hình 4.23 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao OM6976/ Jasmine85// OM6976 trên 12 nhiễm sắc thể ……… 70 Hình 4.24 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao OM6976/ KDML105// OM6976 trên nhiễm sắc thể số 6……… 71 Hình 4.25 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao OM6976/ KDML105// OM6976 trên 12 nhiễm sắc thể………

72

Hình 4.26 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao OM5930/ OM7347// OM5930 trên nhiễm sắc thể số 6……… 73 Hình 4.27 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao OM5930/ OM7347// OM5930 trên 12 nhiễm sắc thể……… 74 Hình 4.28 Quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp

Hình 4.29 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng BC4F3 của quần thể OM6976/ Jasmine85// OM6976 với chỉ thị Wx trên gel agarose 3%

77 Hình 4.30 Quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp

Hình 4.31 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng BC4F3 của quần thể OM6976/ KDML105// OM6976 với chỉ thị Wx trên gel agarose 3% 82 Hình 4.32 Quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp

Hình 4.33 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng BC4F3 của quần thể OM5930/OM7347//OM5930 với chỉ thị Wx trên gel agarose 3% 86

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

DNA Axcid Deoxyribonucleic Axit Đề-ôxy-ribô-nuclêôtit

dCAPS Derived Cleaved Amplified

Polymorphic Sequence

Chuỗi đa hình nhân bản được cắt hạn chế

GBSS Granule-bound Starch Synthase Enzyme xúc tác tổng hợp tinh bột

GGT2 Graphical Genotypes 2 Đồ họa kiểu gen 2

GT Gelatinization Temperature Độ trở hồ, nhiệt hóa hồ

INQR International Network for Quality Rice Mạng lưới quốc tế nghiên cứu lúa

chất lượng IRRI International Rice Research Institute Viện nghiên cứu lúa Quốc Tế MABC Marker-Assisted Backcrossing Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

trong lai hồi giao MAS Marker Assisted Selection Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử NILs Near-isogenic-lines Các dòng đẳng gen

NTSYSpc Numerical Taxonomy System Hệ thống phân nhóm bằng số PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen

QTL Quantitative Trait Loci Di truyền tính trạng số lượng

SES Standard Evaluation System for Rice Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá trên

lúa SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotide đơn

SSR Simple Sequence Repeat Trình tự lặp lại đơn giản

SSS Soluble Stach Synthase Enzyme xúc tác tổng hợp tinh bột

hòa tan

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực quan trọng

trên thế giới cung cấp nguồn năng lượng chính cho một nửa dân số trên thế giới Trong đó, ở châu Á, hơn 90% sản lượng lúa được sản xuất và tiêu thụ Trước đây, đa số nông dân Việt Nam có thói quen sản xuất giống lúa ngắn ngày, năng suất cao và dễ canh tác vì chống chịu sâu bệnh tốt Tuy nhiên, các giống này thường có phẩm chất thấp, cứng cơm và không có mùi thơm Do đó, mặc dù có nhiều đột phá về mặt sản lượng nhưng chất lượng cũng như giá thành sản phẩm chưa cao và thị trường tiêu thụ còn hạn chế Ngày nay, với sự phát triển của xã hội, nhu cầu ăn ngon thay thế dần nhu cầu ăn no, các sản phẩm gạo mềm dẻo, thơm ngày càng được ưa chuộng Chính vì vậy, việc nghiên cứu, lai tạo và phát triển các giống lúa mới ngon dẻo lại thích nghi đa dạng và cho năng suất cao đang là nhu cầu cấp bách của sản xuất lúa gạo trong vùng

Chất lượng gạo là một khái niệm chung bao hàm rất nhiều các đặc tính khác nhau từ các đặc tính vật lý đến sinh hóa và sinh lý Tinh bột và prôtêin là hai thành phần chính trong nội nhũ của hạt, vì vậy nó là chìa khóa của chất lượng hạt Tinh bột (polysacarit carbohydrate) chứa hỗn hợp amylose và

amylopectin (Juliano, 2003; Fitzgerald et al., 2009a; Chen et al., 2012) Nhiều

nghiên cứu cho rằng tính chất mềm dẻo của cơm phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng amylose (AC), nó là kết quả của kiểu gen và một vài thay đổi của môi

trường (Fitzgerald et al., 2009a) Hàm lượng này được sử dụng như một chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng cơm (Asghar et al., 2012) Hàm lượng

amylose thấp đặc trưng cho tính mềm, dẻo và bóng của hạt cơm Ngược lại hàm lượng amylose cao làm cho gạo hấp thụ nhiều nước hơn và do đó làm tăng tính trương nước của hạt gạo, dẫn đến khô, xốp và cứng khi nguội lại

(Fitzgerald et al., 2009a; Patindol et al., 2010) Về mặt di truyền, nhiều nghiên

cứu cho rằng tính trạng hàm lượng amylose cao và thấp đều do một gen duy

nhất điều khiển Gen waxy là gen điều khiển tính trạng hàm lượng amylose

trong hạt gạo định vị trên nhiễm sắc thể số 6 Gen trội A qui định hàm lượng amylose cao và gen đồng hợp lặn aa qui định hàm lượng amylose thấp Hạt mang gen dị hợp tử có hàm lượng amylose trung bình nhưng không ổn định Nếu cần hạt có hàm lượng amylose trung bình thì bố hoặc mẹ phải có hàm

lượng amylose từ thấp đến trung bình (Denyer et al., 2001; Nakamura and

Yuki, 1992) Việc phát triển các giống lúa mới có năng suất và chất lượng cao

là thách thức đối với phương pháp chọn giống truyền thống Vì vậy cần có những đột phá mới cho công tác chọn tạo giống bằng phương pháp hiện đại Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống (MAS) cho lai hồi giao (MABC) là phương pháp chuyển một gen mục tiêu từ giống cho gen (donor) sang giống nhận gen (recipient) trong khi vẫn giữ lại các đặc tính quan trọng của giống nhận thông qua lai hồi giao Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép giải mã

di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, rút ngắn thời gian chọn tạo, do đó tăng hiệu quả chọn lọc gen trên một đơn vị thời gian (Hospital, 2003) MABC đã được

sử dụng trong nhiều nghiên cứu tạo chọn giống lúa chất lượng cao trước đây

(Hasan et al, 2015; Hồ Văn Được và ctv., 2016a, 2017; Nguyen Thị Lang and

Bui Chi Buu, 2004)

Xuất phát từ những vấn đề đặt ra, nghiên cứu được thực hiện nhằm khai thác phương pháp MABC trong lai tạo giống lúa có hàm lượng amylose thấp (≤20%), năng suất cao phù hợp với nhu cầu về giống lúa cũng như điều kiện canh tác của ĐBSCL hiện nay

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu, chọn tạo các dòng/giống lúa có phẩm chất tốt liên quan đến chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp dựa trên sự kết hợp giữa phương pháp lai hồi giao và chọn giống bằng chỉ thị phân tử

1.2.2 Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

Khai thác gen liên quan đến chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp thông qua

đa dạng nguồn vật liệu ban đầu từ bộ lúa địa phương và bộ lúa cao sản ngắn

ngày

Ứng dụng MABC trong chọn lọc các quần thể lai hồi giao thông qua

đánh giá kiểu hình và phân tích kiểu gen dựa trên việc xác định gen waxy

trên nhiễm sắc thể số 6 và các gen liên quan năng suất và thành phần năng

suất được đánh dấu trên cá thể cây mẹ

Đánh giá đa dạng di truyền trên quần thể con lai và chọn lọc các cá thể mang gen mục tiêu mong muốn thông qua xây dựng bản đồ GGT trên các

quần thể NILs

Chọn lọc các dòng lúa triển vọng có tính trạng hàm lượng amylose thấp (≤20%) và năng suất cao (từ 7 - 8 tấn/ha vụ Đông xuân và 4 – 5 tấn/ha vụ Hè thu) nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa mới

1.3 Nội dung nghiên cứu

1.3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp

Đánh giá hàm lượng amylose trên bộ giống vật liệu lai Đánh giá đặc tính nông học trên bộ giống lúa vật liệu lai

Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất trên bộ giống lúa vật liệu lai

Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình của bộ giống lúa vật liệu lai

Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ

1.3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai

1.3.5 Nội dung 5: Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose

và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BC n F 3

Đánh giá kiểu hình và kiểu gen liên quan hàm lượng amylose trên quần thể con lai

Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất để chọn lọc các dòng con lai triển vọng vừa có hàm lượng amylose thấp vừa có năng suất cao

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Khai thác nguồn gen một cách hiệu quả thông qua đa dạng nguồn vật liệu

lai bố mẹ từ lúa địa phương và lúa cao sản

Nghiên cứu, chọn tạo các giống/dòng lúa có phẩm chất tốt và năng suất

cao kết hợp chọn giống truyền thống với phương pháp hiện đại bằng chỉ thị

phân tử nhằm khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống, rút

ngắn thời gian lai tạo và nâng cao hiệu quả chọn lọc

Những thành công bước đầu trong quy tụ gen hàm lượng amylose thấp

sử dụng chỉ thị phân tử ở lúa sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi trong công

tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ đối với chỉ tiêu hàm lượng amylose

mà còn đối với nhiều đặc tính nông học quý khác

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Ứng dụng các thành tựu mới của khoa học hiện đại vào trong chọn giống

nhằm khai thác triệt để nguồn gen, nâng cao hiệu quả chọn tạo, rút ngắn thời

gian và tăng hiệu suất chọn lọc cũng như hiệu quả kinh tế

Đề tài chọn ra được các dòng lúa triển vọng có hàm lượng amylose thấp

để bổ sung vào cơ cấu giống phẩm chất cao nhằm phục vụ cho nhu cầu tiêu

thụ nội địa và nâng cao khả năng cạnh tranh với các nước trên thế giới về xuất

khẩu gạo

Các nội dung nghiên cứu trong đề tài có thể ứng dụng cho công tác chọn

giống hiện nay Sản phẩm từ đề tài là nguồn vật liệu và phương pháp của đề

tài là nguồn tư liệu cho các công trình nghiên cứu tiếp theo Ngoài ra, đề tài

còn góp phần phục vụ trong các công tác nghiên cứu và giảng dạy

1.5 Tính khoa học của đề tài

Ứng dụng các kỹ thuật hiện đại để bổ sung cũng như giải quyết các hạn

chế cho phương pháp lai tạo giống truyền thống

Kế thừa các nghiên cứu trước trong việc lựa chọn vật liệu lai và chỉ thị

phân tử

Ứng dụng sinh học phân tử và tin sinh học để phân tích và đánh giá các

dữ liệu của đề tài

Các dòng lúa được chọn tạo trong đề tài là kết quả khoa học có khả năng

ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và sản xuất giống lúa phẩm chất cao ở

vùng ĐBSCL

1.6 Những đóng góp mới của đề tài

Đề tài đã đánh giá và khai thác hiệu quả nguồn vật liệu bố mẹ mà các

nghiên cứu trước đây ở Việt Nam còn nhiều hạn chế

Bên cạnh mục tiêu chọn tạo giống có hàm lượng amylose thấp, đề tài còn chú ý đến năng suất cao và thời gian sinh trưởng phù hợp Điều này là điều kiện quyết định để các sản phẩm giống lúa có thể ứng dụng và phát triển rộng khi đề tài kết thúc

Kết hợp giữa lai tạo truyền thống, sinh học phân tử và tin sinh học trong nghiên cứu

1.7 Tính ứng dụng của đề tài

Đề tài được thực hiện thông qua phương pháp lai tạo truyền thống kết hợp phương pháp chọn lọc hiện đại bằng chỉ thị phân tử Thông qua kết quả đề tài cũng cho thấy tính hiệu quả của việc ứng dụng các kỹ thuật mới vào chọn tạo giống truyền thống

Sản phẩm giống lúa của đề tài góp phần bổ sung vào cơ cấu giống phẩm chất cao hiện nay cho vùng đồng bằng Sông Cửu Long, phục vụ sản xuất và xuất khẩu của vùng Ngoài ra, sản phẩm đề tài còn là nguồn vật liệu về giống

và chỉ thị phân tử cho các chương trình lai tạo giống kế tiếp

Đề tài cung cấp một chương trình chọn tạo giống hiệu quả, mang giá trị tham khảo cao

1.8 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các giống lúa địa phương thu thập ở các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long

và các giống cao sản từ Ngân hàng gen của Bộ môn Di truyền- Chọn giống, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

Phòng phân tích phẩm chất, Phòng Sinh học phân tử, Nhà lưới, Ruộng thí nghiệm của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Các chỉ tiêu phẩm chất của hạt gạo

Đối với lúa gạo, chất lượng nấu nướng được người tiêu dùng quan tâm nhất Các loại gạo cho cơm ngon phải mềm xốp, hạt cơm nấu ít trương nở và

có mùi vị đặc trưng Tính chất mềm xốp của cơm phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng amylose/amylopectin trong thành phần tinh bột của hạt gạo Trong công tác chọn tạo giống phẩm chất, các phương pháp xác định hàm lượng amylose trong nội nhũ gạo đã được ứng dụng rộng rãi và cho độ tin cậy cao (Juliano, 1971) Bên cạnh đó, độ bền gel liên quan đến độ mềm dẻo của cơm khi để nguội và độ trở hồ liên quan đến thời gian nấu cơm Hai chỉ tiêu này tương quan với hàm lượng amylose đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trước đây Trong một số trường hợp, các nhà chọn giống có thể dựa vào cách thử độ trở hồ đơn giản để ước lượng hàm lượng amylose Vì vậy, hai chỉ tiêu này được thực hiện để kiểm chứng cho hàm lượng amylose của hạt gạo

2.1.1 Hàm lượng amylose (AC)

Hàm lượng amylose được coi là một trong những chỉ số quan trọng nhất quyết định phẩm chất gạo Với những giống lúa cho gạo có hàm lượng amylose cao thường lâu chín, cơm khô và cứng khi để nguội Gạo có hàm lượng amylose thấp hoặc rất thấp thường dính không tơi cơm, trong khi đó gạo có hàm lượng amylose trung bình thường tơi cơm, và không cứng khi để nguội nên được người tiêu dùng ưa chuộng

Dựa vào hàm lượng amylose hiện diện trong gạo, các giống lúa được phân ra thành hai nhóm phẩm chất: waxy (hàm lượng amylose 1-2%) và nonwaxy (hàm lượng amylose > 2%) Đối với nhóm nonwaxy, hàm lượng amylose thấp khi AC ≤ 20%, hàm lượng amylose trung bình khi AC = 20-25%

và hàm lượng amylose cao khi AC > 25% Các giống Basmati có nguồn gốc từ

Ấn Độ và Pakistan hầu hết là giống có hàm lượng amylose trung bình Trong khi đó, phần lớn gạo có nguồn gốc từ Việt Nam, Thái Lan, Myanmar và tiểu

lục địa Ấn Độ có hàm lượng amylose cao (Trương Bá Thảo, 2006; Frei et al.,

2003; Coffman and Juliano, 1987) Hàm lượng amylose trong gạo dao động từ 15-35% Phần lớn các quốc gia trồng lúa thích loại gạo có hàm lượng amylose

trung bình, ngoài trừ các giống japonica có hàm lượng amylose thấp (Nguyễn

Ngọc Đệ, 2008) Hàm lượng amylose có thể thay đổi giữa các giống do môi

trường và yếu tố di truyền (Chen et al., 2007; 2012) Một số nghiên cứu đã chỉ

ra rằng sự tương tác giữa kiểu gen và nhiệt độ môi trường xung quanh ảnh

hưởng đến hàm lượng amylose trong hạt gạo (Nkori Kibanda and Luzi-kihupi,

2007; Patindol et al., 2015) Bên cạnh hai yếu tố trên, hàm lượng amylose cũng

bị ảnh hưởng bởi độ dài của ngày (Lin et al., 2005) Vì vậy, trong cùng một địa điểm canh tác, hàm lượng amylose của cùng một giống thay đổi theo từng mùa

vụ Ahmed et al (2015) cho rằng hàm lượng amylose bị ảnh hưởng bởi nhiệt

độ môi trường xung quanh và nó giảm khi nhiệt độ môi trường ngày càng tăng Các nghiên cứu đã chỉ ra một số enzyme chủ yếu tham gia tổng hợp tinh bột: ADP glucophosphate synthetase (AGPase) hoạt hoá glucose 1

phosphate thành ADP glucose (Pressis et al., 1991) Granule – bound starch

synthase (GBSS) gắn các ADP – glucose vào đoạn mồi bắt đầu từ đầu không khử bằng liên kết 1-4 glycozid Enzym SBE cắt chuỗi liên kết 1-4 glucan và tạo liên kết α – (1-6) glucan tạo nên các phân tử amylopectin (Okagaki wessler, 1988) Soluble starch synthase (SSS) cũng có tác động đến sự tạo mạch nhánh Tuy nhiên SBE có vai trò chủ yếu tới sự tổng hợp amylopectin

Enzyme GBSS được mã hoá bởi gen waxy (Okagaki wessler, 1988) Gen

waxy là gen chính quy định chỉ tiêu hàm lượng amylose Gen này được

chứng minh nằm trên nhiễm sắc thể số 6 Trình tự của gene waxy trên giống

O.sativa (Japonica Heng-feng) dài 5499 bp gồm 14 exon, 13 intron (Wang et al., 1990); Trên cơ sở hàm lượng GBSS trong các loài non-waxy, đã tìm thấy

2 alen waxy là Wx a , Wx b lần lượt trên loài phụ indica và japonica, còn ở lúa nếp là alen lặn wx (Sano, 1980) Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng trên locus Wx có ít nhất 3 alen có chức năng khác nhau Wx a , Wx b , wx lần lượt trong

các loài indica, japonica và lúa nếp (Sano, 1984; Zhao et al, 2010; Kumar and

Khush, 1986)

2.1.2 Độ bền thể gel (Gel Consistency)

Độ bền thể gel là một trong những chỉ tiêu quan trọng liên quan đến phẩm chất hạt gạo, quyết định độ mềm dẻo của cơm khi để nguội Mặc dù hàm lượng amylose là yếu tố quyết định hơn chất lượng nấu nướng, nhưng sự khác nhau của độ bền gel cũng góp phần quyết định đến phẩm chất cơm

(Nguyễn Thị Lang, 2005)

Độ bền thể gel được điều khiển bởi đơn gen Một dãy alen ở cùng một

locus, gec a đối với gen điều khiển GC trung bình và gec b đối với gen điều

khiển GC cứng (Cai et al., 1998; Tang et al., 1991) Việc chọn lọc các dòng có

GC như ý muốn nên tiến hành ở thế hệ đầu Theo Tang et al (1991), F2 góp phần đến sự khác nhau trên tổ hợp lai và chịu ảnh hưởng bởi gen chính Chang

et al (1991) nghiên cứu các quần thể F1, F2, F3, BC1 và BC2 và cho rằng độ bền thể gel được kiểm soát bởi đơn gen và có tính trội Nhưng trong một

nghiên cứu khác, Tang et al (2001) cho rằng GC được kiểm soát trên nhiều gen khi phân tích hạt đơn Độ bền thể gel có mối quan hệ trực tiếp với hàm lượng amylose và một số đặc tính khác (Morgante and Olivieri, 1993) Trong cùng một nhóm có hàm lượng amylose giống nhau, giống lúa nào có độ bền

thể gel mềm hơn, sẽ được ưa chuộng hơn (Hirano et al., 1998)

2.1.3 Nhiệt hóa hồ (Gelatinization Temperrature)

Nhiệt hóa hồ (GT) là một tính chất vật lý thể hiện sự biến đổi của tinh bột từ trạng thái này sang trạng thái khác và không hoàn nguyên khi nhiệt độ gia tăng ở ngưỡng xác định Ngưỡng nhiệt độ xác định của độ trở hồ từ 55oC tới 79oC, lúc đó gạo biến thành cơm và không hoàn nguyên Cấu trúc hạt tinh bột là do sự sắp xếp không gian của các sợi amylose và amylopectin hình thành nên Khi có tác dụng của nhiệt độ hoặc hóa chất thì cấu trúc này bị phá

vỡ và làm biến dạng hạt tinh bột, quá trình này được gọi là sự hóa hồ (sự trở hồ)-gelatinization, nhiệt độ cần thiết cho quá trình này diễn ra gọi là nhiệt hóa

hồ (độ trở hồ) (Gelatinization temperature-GT) Theo Jenning et al (1979)

nhiệt hóa hồ là nhiệt độ mà khi đó nước được hấp thụ và hạt tinh bột phồng lên không hoàn nguyên, đồng thời dạng tinh thể biến mất Nhiệt hóa hồ thường từ 55-79oC và được chia thành 3 nhóm chính: nhiệt hóa hồ thấp (dưới

70oC), nhiệt hóa hồ trung bình (70-74oC), nhiệt hóa hồ cao (trên 74oC)

Đặc tính vật lý của cơm có liên quan nhiều tới nhiệt hóa hồ, gạo có nhiệt hóa hồ cao thì ít nở, cần nhiều nước và thời gian nấu chín lâu hơn Do vậy, hạt cơm đỗ lông khi nấu, đồng thời phản ánh độ cứng của hạt tinh bột và phôi nhũ

Độ trở hồ có liên quan một phần với hàm lượng amylose của tinh bột, là yếu tố chính quyết định phẩm chất gạo khi nấu Trong một số trường hợp, các nhà chọn tạo giống có thể dựa vào cách xác định độ trở hồ để ước lượng hàm lượng amylose Tuy nhiên, việc ước lượng này chỉ có thể sử dụng cho giống lúa có hàm lượng amylose thấp vì nó có mối liên quan rõ rệt với độ trở hồ cao, còn giống lúa có hàm lượng amylose trung bình và cao thì đòi hỏi phải phân

tích hàm lượng amylose (Khush and Ikehashi, 1979)

Nhiệt hóa hồ có liên quan một phần với lượng amylose của tinh bột, khi hạt tinh bột được tác động bởi nhiệt độ hoặc hóa chất thì các phân tử tinh bột bị phá vỡ thông qua sự nóng chảy hay còn gọi là nhiệt hóa hồ (Vũ Hiếu

Đông và ctv., 2005) Chen et al (1992) và Kiani et al (2008) cho rằng độ

trở hồ cao trội hoàn toàn so với độ trở hồ thấp Độ trở hồ thấp không liên hệ chặt với hàm lượng amylose cao, thấp hay trung bình Gạo có độ trở hồ cao

có phẩm chất kém (Jennings et al., 1979)

2.2 Sơ lược về hàm lượng amylose

2.2.1 Sự hình thành tinh bột ở cây lúa

Sau khi thụ phấn khoảng 1-2 ngày, tinh bột chưa được tích lũy trong hạt, lúc đó độ pH khoảng 5,5 nhưng khi bắt đầu chín sữa thì độ pH tăng lên trên 6,0 (khoảng pH thích hợp để tích lũy tinh bột) Dưới tác dụng của phosphorylase, khi 1 phân tử glucose -1- phosphate tham gia tạo thành một phân tử tinh bột thì có 1 phân tử acid phosphoric được hình thành Chính glucose-1-phosphate và acid phosphoric tự do quyết định sự cân bằng của phản ứng Kiểm tra bằng phương pháp hóa học ở phôi nhũ nhận thấy: trong khi lượng acid phosphoric tự do trong lớp tinh bột giảm xuống thì lượng acid phosphoric trong phôi và lớp dextrin tăng lên Vì vậy, gia tăng sản lượng phụ thuộc vào cả hai yếu tố: hoạt tính của phosphorylase và khả năng kết hợp của phosphate tự do (Juliano, 1990)

Khi phân tích glucid trong cây lúa hoặc nhựa vận chuyển từ thân, lá về bông, quan sát thấy có sự xuất hiện của saccharose, glucose, maltose nhưng không

có glucose-monophosphate Như vậy, các chất đồng hóa được vận chuyển đến bông rồi mới thực hiện tổng hợp glucose-monophosphate để tạo tinh bột (Sano, 1984) Quá trình này đòi hỏi cung cấp nhiều năng lượng nên ở bông sự

hô hấp diễn ra rất mạnh Phần lớn glucid được tích lũy trong phôi nhũ là do quá trình đồng hóa sau khi trổ hoặc nước được dự trữ từ trong thân, lá Sự tích trữ này do giống hoặc kỹ thuật canh tác quyết định Vì thế, muốn cho quá trình chín diễn ra tốt cần cung cấp lượng acid phosphoric tương ứng lượng glucid trong cây đồng hóa được, tuy nhiên nếu thừa acid photphoric sẽ ảnh

hưởng đến hoạt tính của phosphorylase làm hạn chế sự tạo tinh bột (Heu and Park, 1996; Yamagata et al., 1982)

2.2.2 Amylose và amylopectin

Ở cây lúa, tinh bột chiếm tỉ lệ 90% trong hạt gạo, và được hình thành do polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amylose (chuỗi thẳng 20-30%) và amylopectin (chuỗi phân nhánh 70- 80%) Amylose là loại mạch thẳng, chuỗi dài từ 500-2000 đơn vị glucose, liên kết nhau bởi liên kết α-1,4 với α- D glucopyranosyl (α- D Glcp) Trong không gian nó cuộn lại thành hình xoắn óc

và được giữ bền vững nhờ các liên kết hydro Amylose thường ở dạng kết tinh

có lớp hydrate bao quanh xen kẽ amylose kết tinh không có lớp hydrate Amylose có khối lượng phân tử 50.000 đến 160.000 kDa, do cấu trúc mạch thẳng, amylose có gốc hydroxyl tự do nhiều nên dễ hòa tan trong nước ấm Tuy nhiên, ở dạng tinh thể không bền vững nên khi để yên tinh thể sẽ tách ra Trong hạt tinh bột hoặc trong dung dịch hoặc ở trạng thái hóa amylose thường

có cấu hình mạch giãn, khi thêm tác nhân kết tủa amylose mới chuyển thành dạng xoắn ốc Mỗi vòng xoắn ốc gồm 6 đơn vị glucose Amylopectin có cấu trúc phân nhánh Ở điểm phân nhánh có mạch liên kết α(1-4) glucan và α(1-6) glucan Cấu trúc phân tử của nó gồm một mạch thẳng trung tâm chứa liên kết α(1-4) glucan, từ mạch này phân ra các mạch phụ khoảng vài chục gốc glucose Khối lượng phân tử của amylopectin ước chừng 500.000-1.000.000 kDa, thường phân bố ở mặt ngoài hạt tinh bột Khi đun nóng sẽ làm thay đổi không thuận nghịch cấu trúc phân tử amylose trong quá trình hồ hóa tinh bột Môi trường có ảnh hưởng đến tỉ lệ cân đối giữa amylose và amylopectin trong

nội nhũ hạt (He et al., 1999; Gosht and Govindaswamy, 1972; Kenzei et al., 1983; Jacob et al., 1991)

HÌNH 2.1 Cấu trúc của (a) amylose và (b) amylopectin (Liu, 2005)

Hàm lượng amylose (AC) được coi là chỉ số quan trọng nhất trong việc phân loại các giống lúa (Juliano, 1985) bởi vì nó ảnh hưởng đến cấu trúc và khả năng biến tính của các loại ngũ cốc nấu chín (Champagne et al., 2004) Tùy vào hàm lượng các giống lúa được phân thành các nhóm: cao (> 25%), trung bình (20-25%), thấp (10-19%), rất thấp (3-9%), hoặc sáp (0-2%) (Kenzei and Rutger, 1983) Các giống lúa nếp hầu như không có cấu trúc phân tử amylose, tuy nhiên có một số giống lúa nếp đã được báo cáo là có hàm lượng

amylose rất thấp (Chung et al., 2011; Juliano, 1971; Landers et al., 1991; Sanchez et al., 1988; Varavinit et al., 2003) Một kết quả nghiên cứu gần đây

đã chứng minh các giống gạo nếp có hàm lượng amylose trên 11% (Fitzgerald

et al., 2009a) Các báo cáo cũng đã chỉ ra sự hiện diện của amylose trong phôi

nhũ của hạt nếp non dựa trên các phản ứng màu với iốt (Badenhuizen, 1956;

Juliano et al., 1987)

2.2.3 Cơ sở di truyền tính trạng hàm lượng amylose

Hàm lượng amylose được xem là tính trạng có ý nghĩa quyết định cho

phẩm chất mềm dẻo của hạt gạo (Bao et al., 2002) Gen “waxy” (Wx) là gen

điều khiển chỉ tiêu hàm lượng amylose định vị trên nhiễm sắc thể số 6 và được

cho là gen trội không hoàn toàn (Tsai, 1974; Echt and Schwartz, 1981; Ainsworth et al., 1983; Sano, 1984) Hàm lượng amylose có trong phôi nhũ

của hạt, phôi nhũ chứa hai kiểu tinh bột là: GBSS (granule-bound starch synthase) và soluble stach synthase (SSS), hai hợp chất này được tác động chặt chẽ với nhau bởi enzyme của tinh bột để tổng hợp amylopectin Enzyme

GBSS được mã hóa bởi gen waxy, trong đó GBSS I (granule bound starch

synthease I) liên quan đến tổng hợp amylose, trong khi đó, enzyme SSS lại có

vai trò chủ yếu trong việc tổng hợp amylopectin (Kuipers et al., 1994) Một số nghiên cứu khác cho thấy trong hạt tinh bột ngoài sự tổng hợp của enzyme

GBSSI còn có sự tham gia của các enzyme khác (Cao et al., 1999) Người ta

sử dụng microsatellite để xác định ba gen: “wx gene granule”, “bound starch synthase I” và “SSE” – gen mã hoá men tổng hợp tinh bột Bao (2002) and He

(1999) đã tìm thấy hàm lượng amylose được kiểm soát bởi gen chính định vị

trên nhiễm sắc thể số 5 và 6 với gen waxy và các alen chính giải thích biến

thiên di truyền 91,1%

Nghiên cứu của Gosh A and Govindaswamy (1972) and Heu (1996) cho

rằng tính trạng hàm lượng amylose cao có tính trội không hoàn toàn so với hàm lượng amylose thấp, do một gen điều khiển hay gen phụ có tính chất cải tiến Hàm lượng amylose do một gen kiểm soát, trội hoàn toàn so với gen

kiểm soát hàm lượng amylose thấp Tuy nhiên, trong tổ hợp lai giữa lúa indica

có hàm lượng amylose thấp và lúa nếp thì tính di truyền amylose được kiểm

soát bởi gen số lượng Tính dẻo được kiểm soát bởi gen lặn wx nên nội nhũ của hạt nếp chỉ chứa amylopectin với kiểu 3n = wxwxwx, ngược lại ở gạo tẻ bao gồm cả amylose và amylopectin được kiểm soát bởi gen trội Wx (Sano et

al., 1991), (Satoh et al., 1994) Hoạt động tính trội của alen Wx không bị ảnh

hưởng do thay đổi hàm lượng amylose của cây bố, nhưng alen trội Wx ảnh hưởng đến hàm lượng amylose trong nội nhũ (Heu and Park, 1996) Theo

nghiên cứu của Zhang (1996) về tính di truyền hàm lượng amylose của 7 cha

mẹ có màu vỏ cám đen, nâu, đỏ, trắng có hàm lượng amylose từ 0,93 đến 30,13% Kết quả chỉ ra ảnh hưởng cộng trội đóng vai trò quan trọng trong tính

di truyền của hàm lượng amylose

Xu (1997) chứng minh khi lai giữa 4 giống lúa japonica và 5 giống lúa

indica, kết quả xác định được tính di truyền của hàm lượng amylose là tính

cộng Hay theo nghiên cứu của Cao (1999) về tính di truyền hàm lượng

amylose giữa indica và japonica đã xác định là do gen trội tác dụng cộng tính

Theo Khush (1979) phôi nhũ của hạt gạo có 3n, trong đó 2n do mẹ và n

do bố Vì có sự khác nhau về alen nên nó xảy ra hiệu ứng tích lũy về lượng

của amylose Hàm lượng amylose của con lai F1 gia tăng theo sự gia tăng số gen của bố (mẹ) có hàm lượng amylose cao hơn, mặc dù sự gia tăng này không phải lúc nào cũng tuyến tính Phân tích từng hạt riêng biệt ở quần thể

F2, thấy rằng sự phân ly hàm lượng tùy thuộc vào sự tích lũy gen điều khiển hàm lượng amylose rất cao hoặc rất thấp) cho thấy rất rõ vai trò của đa gen hoặc hiện tượng gen phụ bổ sung (Khush and Ikehashi, 1979)

Nghiên cứu của Khush (1979) cho biết chọn lọc đối với đặc tính hàm lượng amylose nên được tiến hành ở các thế hệ sau sẽ tạo hiệu quả tốt hơn, chọn lọc con lai đang phân ly có hàm lượng amylose trung bình sẽ không có hiệu quả bởi vì ảnh hưởng tích lũy về hàm lượng amylose sẽ xảy ra ở các thế

hệ sau Môi trường gây sự biến động lớn đến hàm lượng amylose, hàm lượng amylose có thể biến đổi khoảng 6% từ nơi này đến nơi khác hay từ vụ này

sang vụ khác, đặc biệt là nhiệt độ trong thời gian lúa vào chắc (McCouch et al,

1997)

Yanagisawa et al (2003) đã dùng kỹ thuật SNP (single nucleotide

polymorphism) và dCAPS (derived cleaved polymorphic sequence marker)

đối với gen Wx-D1 Đây là tính trạng waxy trong lúa mì, nó thể hiện Wx-D1 protein theo kết quả phân tích “immunoblot” Điều này có thể giúp cho việc

chọn lựa chỉ thị phân tử để tìm thấy các alen đột biến trong các dòng phân ly (Gu, 1992) Hơn nữa, điểm đột biến trong gen có thể làm cho thay đổi hình dạng Phương pháp SNP mở ra triển vọng mới, giúp cho nhà chọn giống nghiên cứu nhanh các alen

Theo nghiên cứu của Asaoka (1985) về trồng lúa trong điều kiện kiểm soát nhiệt độ đã xác định hàm lượng amylose trong tinh bột nội nhũ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ môi trường Nhiệt độ môi trường cao sẽ làm giảm hàm lượng amylose trong tinh bột nội nhũ

Gen điều khiển sự dao động hàm lượng amylose ae (amylose extender) được xác định trên nhiễm thể số 2 (Kaushik and Khush, 1991) Thành tựu có ý nghĩa trong nghiên cứu di truyền phân tử về phẩm chất cơm có thể được ghi nhận qua công trình: bản đồ liên kết gen hệ enzyme III của tinh bột trong hạt gạo trên nhiễm thể số 2, với hai chỉ thị kế cận CDO 718 và RG 157

Gen waxy (Wx) thể hiện hiện sự đa hình với các alen khác nhau Các chức năng của alen Wx a và Wx b thể hiện bởi một sự thay đổi tại nối đầu 5' của

intron 1, phân biệt hàm lượng amylose thấp, trung bình và cao (Hirano et al., 1998; Wang et al., 1995) Sano (1984) chỉ ra rằng trên locus Wx có ít nhất ba alen có chức năng khác nhau Wx a , Wx b , wx lần lượt trong các loài indica,

japonica và lúa nếp Khi so sánh giữa hai alen Wx , Sano (1986) cũng

cho rằng Wx a tăng cường hoạt động của GBSS, do đó làm tăng hàm lượng

amylose trong nội nhũ hạt hơn so với Wx b So sánh trình tự Wx b và Wx a cho thấy có sự thay thế một nu G bởi T tại vị trí cắt nối intron 1 (trình tự cắt nối

từ đầu 5’ của intron 1 của Wx a là AGGTATA, của Wx b là AGTTATA) Kết quả làm giảm hàm lượng mRNA thành thục dẫn đến giảm GBSS tạo thành,

từ đó giảm hàm lượng amylose (Sano, 1984; Hirano, 1998) Sự đột biến G →

T ở vị trí cắt của intron 1 gây ra sự sao chép không hiệu quả (Bligh et al., 1998; Cai et al., 1998; Isshiki et al., 1998) Tuy nhiên, hai alen này không đủ

để giải thích sự biến đổi liên tục của các loại gen amylose “waxy” Một SNP (single nucleotide polymorphism) ở exon 6 (A → C), Wx in, có liên quan với

amylose trung gian (Chen et al., 2008; Larkin and Park, 2003; Mikami et al., 2008) Một biến thể khác là Wx op (hoặc Wx hp), mang cùng một SNP trong vị trí

cắt intron 1 với Wx a và một SNP (A → G) trên exon 4 (Liu et al., 2009; Mikami et al., 1999) Hơn nữa, chấm dứt sớm việc dịch mã gây ra bởi một sự trùng lặp 23bp trong exon 2 của Wx gây ra một sự thay đổi trong khung đọc, điều này dẫn đến một bộ ba kết thúc và một kiểu hình waxy (Mikami et al., 2008; Wanchana et al., 2003)

Bảng 2.1: Sự hiểu biết về Haplotype (các dạng hình khác nhau) của amylose trong

gạo dựa trên các đột biến gen Waxy

Haplotype Intron 1 Exon 223-p Exon 4 Exon 6 Kiểu hình

Phân tích QTL kiểm soát hàm lượng amylose cho thấy vùng giả định

nằm trên nhiễm sắc thể số 5 và 6 với gen waxy và các alen khác, giải thích

biến thiên kiểu hình 91,1% trong quãng giữa hai marker RG573-C624

Yanagisawa et al (2003) đã dùng kỹ thuật SNP và dCAPS (derived cleaved amplified polymorphic sequence) tìm kiếm gen Wx-D1 trong lúa và lúa mì mã hóa protein wx-D1 thông qua phân tích immuno blot Hàm lượng amylose còn

chịu ảnh hưởng của tương tác: tính cộng x tính cộng, và tương tác trội x trội,

trong phân tích epistasis Nguyễn Thị Lang et al (2004) đã tìm thấy AC được

kiểm soát bởi gen chính định vị trên nhiễm sắc thể số 5 và 6 liên kết với chỉ thị RM42 (nhiễm sắc thể số 5) và Wx (nhiễm sắc thể số 6)

2.3 Phương pháp lai hồi giao trong chọn tạo giống lúa

2.3.1 Một số khái niệm trong phương pháp lai hồi giao

Lai hồi giao là phương pháp thường được sử dụng phổ biến nhất để chuyển một gen hoặc một tính trạng mong muốn nào đó vào một giống để chuyển thành giống ưu tú Con lai F1 sau khi được tạo ra sẽ lai lại nhiều lần

với bố hoặc mẹ gọi là phép lai hồi giao

Phương pháp lai hồi giao được khởi xướng bởi Harlan và Pope vào năm

1922 Sau đó, nó được sử dụng rộng rãi trong việc chọn tạo giống cây trồng ở

nhiều loài cây khác nhau (Stoskof et al.,1993) Phương pháp này được thực

hiện trong trường hợp muốn du nhập một gene mục tiêu quan trọng nào đó từ nguồn vật liệu cho (là giống cây bản địa, loài hoang dại có quan hệ gần gũi)

vào giống cây trồng (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007; Bao et al.,

2002)

Tổ hợp lai bao gồm nguồn vật liệu cho (donor) thường được sử dụng làm

bố và nguồn giống cây trồng có nhiều tính trạng ưu việt, chỉ thiếu một vài gene điều khiển tính trạng mục tiêu thường được sử dụng làm mẹ; thuật ngữ

chuyên môn gọi là giống tái tục (recurrent)

Theo Allard (1960) and Reyes (2000) thì kiểu gen của con lai có thể giống với cây tái tục khoảng 99,2% sau 6 lần hồi giao Tuy nhiên, các con lai

ở thế hệ BC2 và BC3 (BackCrosses) có sự chênh lệch về kiểu gen với nhau trong suốt quá trình lai, giúp các nhà chọn giống có cơ hội chọn được những dòng mong muốn Trong hầu hết các trường hợp, giống tái tục được sử dụng trong lai hồi giao có phần lớn các tính trạng mong muốn nhưng chỉ thiếu một

vài tính trạng nào đó (Hasan et al., 2015) Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu

cũng cho rằng có 3 yếu tố chính quyết định đến sự thành công của một chươngtrình chọn giống hồi giao là chọn lựa giống làm giống tái tục, phương pháp hiệu quả để chọn lọc các tính trạng mục tiêu và số lần lai hồi giao (Acquaah, 2007)

tổ hợp lai mà cha mẹ xa nhau về khoảng cách di truyền là rất cao khi lai giữa

nhóm hoang dại với nhóm trồng hoặc giữa nhóm indica và japonica (Bùi Chí

Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007)

HÌNH 2.3 Giá trị trung bình của gen phục hồi qua từng thế hệ hồi giao

2.3.2 Ưu điểm của phương pháp lai hồi giao

Về mặt di truyền, phương pháp lai hồi giao tạo ra sự kiểm soát di truyền tối đa trong quá trình cải tiến giống cây trồng Không có một phương pháp chọn giống nào mà nhà chọn giống có thể dự đoán trước kiến tạo di truyền của dòng cây trồng mới Nhà chọn giống cũng có thể lặp lại tiến trình lai hồi giao nếu cần thiết để một lần nữa phát triển giống tái tục

Giống được phát triển bằng phương pháp lai hồi giao không cần trắc nghiệm ngoài đồng trên diện rộng Việc đánh giá chủ yếu dựa vào tính trạng mục tiêu của giống cho có kết hợp được trong giống tái tục hay không

Phương pháp lai hồi giao không bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường trong sự thể hiện tính trạng Nó có thể được thể hiện để tạo ra quần thể trong mùa nghịch hoặc bất cứ ở địa điểm nào Hệ số di truyền của tính trạng mục tiêu không quá quan trọng đặc biệt khi việc chọn lọc tính trạng của giống tái tục chưa thật sự hoàn chỉnh

Phương pháp này cho chúng ta giải pháp lý tưởng để sử dụng những nguồn gen chưa được thích nghi, chưa có tính chất cải tiến những nguồn gen tiềm ẩn kháng stress, gen cho chất lượng nông sản tốt, hoặc năng suất cao

2.3.3 Nhược điểm của phương pháp lai hồi giao

Nhìn chung, phương pháp lai hồi giao được xem như một phương pháp

có tính chất bảo thủ về mặt di truyền, vì nó không tạo ra một năng suất đột phá mới Nó mất nhiều thời gian từ (6-7 năm) để gắn thêm một hoặc một vài tính trạng có lợi cho giống cây trồng

Vì khuyết điểm này, người ta đã cố gắng tìm kiếm một phương pháp mới

để khắc phục yếu điểm thời gian, nhờ chỉ thị phân tử Những phát triển trong nghiên cứu chỉ thị phân tử gần đây đã mở rộng hướng sử dụng nguồn gen từ loài hoang dại để cải tiến giống cây trồng Một phối hợp đặc biệt của hồi giao nhờ bản đồ QTL đối với các gen điều khiển tính trạng số lượng đã được công

bố với thuật ngữ chuyên môn là “Advanced Backcross QTL Analysis” (phân tích QTL trên quần thể hồi giao cải tiến) đã được ứng dụng trên cà chua, nhằm chuyển tính trạng số lượng “tổng chất rắn hòa tan” (total soluble solids) vào giống cà chua thương phẩm (Tanksley and Nelson, 1996) Đây là phương pháp có một tiềm năng lớn để bổ sung cho phương pháp chọn tạo giống thông thường khác và được kỳ vọng là một trong những phương pháp có tính chất tiếp cận với những phương pháp hiện đại trong thời điểm hiện nay

2.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa

Phương pháp lai hồi giao là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong chọn tạo giống lúa để chuyển gen mục tiêu từ cây cho sang cây nhận Mục đích chính

của phương pháp này là giảm số lượng gen của cây cho trong con lai (Xi et al.,

2008) Các nước Nam Á và Đông Nam Á đã ứng dụng thành công phương pháp tạo giống này để cải tiến khả năng kháng đạo ôn của các giống lúa như

KDML105, Basmati và Manawthukha (Joseph et al.,2004; Toojinda et al.,

2005) Cùng thời gian đó, phương pháp tiếp cận hồi giao mới cũng được thiết lập bằng việc ứng dụng dấu phân tử Sự kết hợp này đã tạo ra nhiều thuận lợi

hơn trong việc lai tạo giống và báo cáo đầu tiên trên cây lúa bởi Chen et al.,

(2000)

2.4.1 Sơ lược về phương pháp chọn lọc bằng chỉ thị phân tử

Việc sử dụng các chỉ thị phân tử ADN cho mục tiêu chọn lọc trong các

chương trình chọn giống được đề cập đầu tiên bởi Sorensen and Robertson

(1961) Với sự phát triển của công nghệ sinh học thì việc chọn giống cây trồng cũng đã có cuộc cách mạng lớn, hầu hết các phương pháp chọn lọc không thể thực hiện được bằng việc dựa trên kiểu hình thì có thể sử dụng các chỉ thị phân

tử liên kết với các gen quy định tính trạng đó Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử có lợi thế rất lớn vì nhiều đặc tính cây trồng không thể đánh giá được ở điều kiện ngoài đồng (Giora and Lavi, 2012) Bên cạnh đó, việc chọn lọc bằng chỉ thị phân tử có thể thực hiện ở giai đoạn sớm (khi cây còn nhỏ), giúp rút ngắn thời gian chọn lọc, công sức và chi phí thực hiện Tuy nhiên, ở một vài tính trạng thì việc chọn lọc kiểu hình sẽ hiệu quả và tiết kiệm chi phí hơn là sử dụng chỉ thị phân tử Các nhà chọn giống đặc biệt quan tâm đến các tính trạng quan trọng như chống chịu với điều kiện bất lợi từ môi trường cũng như các tính

trạng nông học

Có gần 100 gen chức năng và tính đa hình đã được xác định dưới điều kiện tự nhiên ở mức độ sinh lý và phát triển của cây Ở nhiều loài cây trồng, các gen này quy định cho một số tính trạng như thời gian nảy mầm và ra hoa, kiểu hình và cấu trúc của hạt và trái, cũng như các tính trạng năng suất và chất

lượng (Blanco et al., 2009) Chín gen tác động quy định đến sự khác nhau trong thời gian ra hoa của cây Arabidopsis đã được phân lặp và một số có ảnh hưởng chính như FRI, FRL1, FRL2 và FLC Ngược lại, sự phân tích thời gian

ra hoa ở cây bắp không cho thấy có QTL ảnh hưởng chính đến tính trạng này

Thay vào đó, các QTL chỉ có ảnh hưởng nhỏ đã được nhận định bởi Buckler et

al, (2009) Bên cạnh đó, Blanco et al (2003) cũng cho thấy rằng DOG1 cảm

ứng cho sự nảy mầm của hạt và biểu hiện trong suốt quá trình phát triển của

hạt

2.4.2 Một số thành tựu của chỉ thị SSR trong chọn giống lúa

SSR (Simple Sequence Repeat): Sự lặp lại trình tự đơn giản, là những trình tự đặc biệt của ADN mà có chứa sự lặp lại nối tiếp từ 2-6 base Các đoạn ADN này sau đó được tách ra trên gel polyacryramide hoặc agarose và hiển thị nhờ phản ứng nhuộm Bạc (Ag) hoặc Ethydium Bromide sau đó chụp hình bằng tia UV Chiều dài các đoạn ADN trên điện di khoảng 100-200bp Các đoạn mồi (primer) được thiết kế cho phản ứng PCR dựa trên chuỗi mà ở hai đầu của các “vệ tinh” Thể đa hình chiều dài các chuỗi mã đơn giản lặp lại (SSLPs) được xác định dựa trên sự khác biệt về số lượng các đơn vị lặp lại tại

vị trí mà chỉ thị đo định vị (Jacob et al., 1991; Jennings et al., 1979; McCouch

et al., 1997) và cung cấp một nguồn đánh dấu sự khác biệt ngay trên vật chất

di truyền

Chỉ thị SSR rất phong phú và phân bố rộng trong genome cây lúa vì thế chúng được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền giữa các giống (McCouch

et al., 1997; Lang et al., 2001b; Lang et al., 2002b)

Bản đồ di truyền SSR trên genome cây lúa được thiết kế với các SSR marker được viết tắt là RM (Rice Microsatellite) ở Mỹ và OSR ở Nhật Sự phong phú về số lượng các chỉ thị SSR với các trình tự lặp lại phát triển trên những phần mã hoá và không mã hoá của genome cây lúa (Wu and Tanksley,

1993; Panaud et al., 1995, 1996; Akagi et al., 1996; Chen et al., 1997; Temnykh et al., 2000) giúp cho việc khảo sát sự hiện diện và khác biệt các chuỗi mã đơn giản lặp lại trên toàn bộ genome ngày càng hoàn hảo Cho et al

(2000) xác định tỉ lệ đa hình tìm thấy nhờ các marker từ genome cao hơn rất nhiều các chỉ thị từ ESTs (83,8% so với 54,0%) Về các trình tự lặp lại, mức

độ đa dạng di truyền cao nhất tìm thấy ở chỉ thị khuyếch đại chuỗi mã GA trong khi hầu hết các chỉ thị khuyếch đại chuỗi mã CCG hoặc CAG không tìm thấy sự khác biệt Ở lúa đã phát hiện các nhóm GA, GT, CAT, CTT (Liu,

cM phủ trên nhiễm sắc thể số 1 và 109,3 cM phủ trên nhiễm sắc thể số 11 Quần thể con lai của tổ hợp Tequing/OM1706 sử dụng 28 chỉ thị SSR với tổng chiều dài 95,4 cM phủ trên nhiễm sắc thể số 6

Cũng với chỉ thị vi vệ tinh, bản đồ gen mùi thơm được xây dựng nhờ marker RG28F-R liên kết trên nhiễm sắc thể số 8 thông qua phân tích BC1F1,

F1, F2, BC1F2 các tổ hợp lai IR/64/Jasmine, IR64/DS20 (Lang và Bửu, 2002b;

Nguyễn Thị Lang và ctv, 2004; Akagi et al., 1996; Lang và Bửu, 2002c)

2.5 Chọn tạo giống bằng phương pháp lai hồi giao kết hợp với chỉ thị phân tử

Phương pháp lai hồi giao có sự hỗ trợ của dấu phân tử (Marker – Assisted Backcross Method – MABC) là một trong những phương pháp chính xác và hiệu quả để bảo tồn các đặc tính quan trọng của giống bố mẹ Trong phương pháp này, một dấu phân tử được sử dụng dựa trên đặc tính hình thái, sinh hóa hoặc dựa trên sự biến đổi của ADN/ARN để gián tiếp chọn lọc những kiểu gen hoặc những tính trạng mà nhà chọn giống quan tâm (ví dụ như tính kháng bệnh, khả năng chịu đựng với những điều kiện bất lợi của môi trường…) Nguyên tắc của MABC là tích hợp gen mục tiêu đã xác định được vị trí trên nhiễm sắc thể từ giống cho khi lai lại với bố mẹ Có ba yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của MABC là: số lượng cá thể của quần thể hồi giao, khoảng cách của dấu phân tử với mục tiêu và số lượng dấu phân tử được sử dụng trong quá trình

chọn lọc (Neelam et al., 2016) MABC giúp các nhà chọn giống xác định được chính xác sự hiện diện của gen mục tiêu trên các dòng hồi giao (Mohammad et

al., 2015) Điều này sẽ giúp cải thiện giống lúa, giúp các giống này có thể

chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như lũ lụt hay kháng được với sâu bệnh Như vậy, MABC nên được sử dụng để cải thiện chất lượng và gia

tăng năng suất lúa (Neelam et al., 2016)

2.5.1 Các giả thuyết mô hình MAS

Trong những năm gần đây, một vài mô hình MAS đã được các nhà khoa học đưa ra và được phân tích cặn kẽ Theo một số mô hình, chỉ cần tiến hành lai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể chọn lọc có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế Hơn thế nữa, Frisch (1999) đã đưa ra chiến lược “chọn lọc hai giai đoạn” để áp dụng trong trường hợp chưa biết các thông tin về bản đồ liên kết của các chỉ thị phân tử

Theo Robert Koebner (2003) những tính toán dựa trên cơ sở máy tính để so sánh các chiến lược chọn lọc 2 bước, 3 bước và 4 bước (stage) về tỷ

lệ kiểu gen bố mẹ phục hồi (recurrent parent genotype-RPG) cho thấy: Với

chiến lược lấy mẫu 4 bước và quần thể từ 50-100 cá thể, tỷ lệ kiểu gen giống

bố mẹ (RPG) có thể đạt 96% với độ tin cậy 90% Trong khi chọn giống truyền thống phải cần tới 6 thế hệ và với rủi ro lớn hơn

Việc tăng số lượng chỉ thị để đánh giá kiểu gen ở mỗi thế hệ có rất ít tác dụng Khi ngưỡng 1 chỉ thị/20 cM đạt được, việc thêm chỉ thị nữa là không cần thiết (ngoại trừ các chỉ thị xung quanh locus quan tâm) Điều đó cho thấy, việc lấy mẫu quần thể lớn hơn với ít chỉ thị hơn có tác dụng hơn việc làm ngược lại Collard và Mackill (1998) đưa ra khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử (Marker assisted selection - MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặt với locus mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị ADN (ADN markers) có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy

Theo Mackill et al (2006) MAS ứng dụng trong chọn tạo giống lúa có

những ưu điểm nổi bật là: đặc biệt với những tính trạng khó đánh giá thanh lọc dựa trên kiểu hình; tiết kiệm thời gian và nguồn lực trong quá trình chọn lọc; rất quan trọng với một số tính trạng như chất lượng hạt; có thể chọn lọc sớm, trước khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3; không bị ảnh hưởng của môi trường; và có thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp và chọn lọc từng cây

Chọn tạo giống lúa ứng dụng chỉ thị phân tử gồm đánh giá nguồn vật liệu di truyền trước khi thực hiện một chương trình chọn giống

Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của mình

2.5.2 Điều kiện để ứng dụng MAS

Theo Francia (2005) sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS phụ thuộc vào các yếu tố: bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các vùng tương đồng để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm; mối liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen kháng hay các QTLs;

sự tái tổ hợp thích hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen; khả năng đánh giá một số lượng lớn cá thể trong một thời gian và giá thành hiệu quả

Có 2 kiểu chỉ thị có thể ứng dụng trong MAS: (1) chỉ thị phân tử được định vị ngay trong phạm vi gen quan tâm Đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm thấy loại chỉ thị này; (2) nhóm chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng với gen quan tâm Mối quan hệ này tìm thấy khi gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau Chọn lọc dựa trên chỉ thị này gọi là LD- MAS (linkage disequilibrium -MAS)

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các

chương trình chọn giống với các ưu điểm sau: khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ

sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang); khả năng sàng lọc những dấu hiệu

mà việc đánh giá các đặc tính này khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc); khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của nhiều vị trí trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế

hệ sau; khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian,

do vậy mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví

dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau Trong trường hợp này, các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt được kết quả Nhưng nếu áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt

Bảng 2.2: Sự tương quan giữa số thế hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng triển vọng (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1

Số thế hệ backcross (n) Tỷ lệ kiểu gen của dòng nhận gen

Nguyên lý của phương pháp MABC là chuyển một QTL/gen từ dòng

cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc sự hội nhập của dòng cho

thông qua phần còn lại của hệ gen (Thomson et al., 2010; Septiningsih et al., 2009; Singh et al., 2011) Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát

di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cường nền di truyền qua mỗi thế hệ

Ưu điểm chính của phương pháp MABC là: (1) Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với locus gen đích; (2) Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây

bố mẹ tái tổ hợp; (3) Tiến gần đến locus quan tâm trên bản đồ liên kết; (4) Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm Hiệu quả

của các sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng (Singh et al., 2011; Sarkar et al., 2009) Ngoài ra, thông qua phương pháp này, tốc độ của

quá trình chọn lọc được đẩy nhanh lên gấp đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế hệ BC2 hoặc BC3 là đạt kết quả tương đương với BC6 theo phương pháp thông thường

Chọn giống hồi giao nhờ chỉ thị phân tử còn giúp khắc phục được những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ loại bỏ được các tác động gây nhiễu do các tương tác trong cùng một alen hay giữa các alen gây ra Những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng cách phân tích kiểu hình Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt

2.5.3 Đối với các tính kháng sinh học

Bằng phương pháp lai hồi giao kết hợp với chỉ thị phân tử đã giúp tạo ra

2 dòng lúa Pusa1602 và Pusa1603 có khả năng kháng bệnh đạo ôn bằng việc

chuyển gen Piz-5 và Piz-54 từ dòng C101A51 và Tetep vào giống PRR78 (là giống nhiễm đạo ôn) (Singh et al., 2012) Qua phân tích bộ gen cho thấy bộ

gen của Pusa1602 và Pusa1603 giống với cây tái tục lần lượt là 89,01 và 87,88% Không chỉ có bệnh đạo ôn mà các nhà nghiên cứu còn xác định được

gen kháng bệnh cháy bìa lá vi khuẩn là Xa23 từ loài O Rufipogon và đưa các

giống lúa khác thông qua lai hồi giao Các con lai được chọn lọc bằng cách sử

dụng dấu phân tử SSR (RM206) (Pan et al., 2003) Hơn thế nữa, ba gen kháng

bệnh cháy bìa lá vi khuẩn từ 2 giống lúa NSIC Rc142 và NSIC Rc154 cũng

được đưa vào giống lúa IR64 (Toenniessen et al., 2003)

Đối với khả năng kháng rầy nâu, gen kháng bph3 được chuyển từ giống

cho Rathu Heenati vào giống lúa Khao Daw Mali 105 (là giống nổi tiếng nhất

tại Thái Lan) (Jairin et al., 2009) Trong nghiên cứu này, các con lai BC3F2

được chọn lọc bằng 2 dấu phân tử SSR là RM589 và RM190 là 2 mồi liên kết

chặt với bph3 và Wx-RH Ngay cả 2 giống lúa thuộc 2 nhóm khác nhau như

japonica và indica cũng có thể thực hiện được như chuyển gen kháng rầy bhp18 từ giống IR65482-7-216-1-2 (nhóm indica) cho các giống japonica

(Suh et al., 2011)

2.5.4 Đối với các tính kháng phi sinh học

Ở Việt Nam, Saltol QTL có được từ giống có khả năng chịu mặn cao

FL478 đã được đưa vào các giống lúa cao sản thông qua phương pháp lai hồi

giao kết hợp dấu phân tử (Huyen et al., 2012) Các thế hệ con lai được chọn

lọc nhờ vào các mồi liên kết với gen kháng mặn như AP3206, RM3412 và

RM10793, Con lai của giống lúa Bacthom 7 được nhận Saltol QTL từ giống

FL478 sau khi hồi giao 3 thế hệ và có bộ gen tương đồng với giống tái tục

Bacthom 7 trên 96% (Vu và ctv., 2012) Hasan et al (2015) nhận định rằng có

thể phát triển các giống lúa có khả năng chống chịu mặn cho vùng ven biển Đồng bằng sông Cửu Long bằng phương pháp lai hồi giao kết hợp với dấu phân tử

2.5.5 Đối với các đặc tính nông học

Bên cạnh đó, các tính trạng về phẩm chất gạo nấu cũng được chú trọng đến Việc sử dụng các dấu phân tử để xác định gen mã hóa cho mùi thơm của

giống lúa Basmati được nghiên cứu đầu tiên bởi (Ahn et al., 1992) Bằng việc

sử dụng dấu phân tử này có thể nhận biết các giống lúa có mùi thơm và giống không có mùi thơm Sự kết hợp giữa hồi giao và dấu phân tử cũng được các nhà khoa học cho là công cụ hữu hiệu để cải tiến tính trạng mùi thơm của các giống lúa Giống Pusa Basmati 1 và các dòng khác của giống PRR78 đã được cải tiến bằng việc chuyển tính trạng mùi thơm từ giống Basmati 370 vào giống

PRR78 (Yi et al., 2009; Singh et al., 2011; Begum et al., 2015)

2.5.6 Các kết quả nghiên cứu giống phẩm chất cao trong và ngoài nước

Cho et al (2009) thuộc Viện nghiên cứu quốc gia về khoa học cây trồng

(NICS), Hàn Quốc nghiên cứu QTL các tính trạng số lượng liên quan đến phẩm chất cơm của giống lúa ôn đới Đó là tính trạng độ bóng hạt (glossiness),

độ dính của cơm (stickiness), độ cứng (hardness) Hai quần thể RIL từ tổ hợp lai Suweon365 x Chucheongbyeo (S/C) và Ilpumbyeo x Moroberekan (I/M) được sử dụng Ba vùng chứa những QTL điều khiển tính trạng nhiệt hóa hồ, hàm lượng amylose và hàm lương protein trong quần thể S/C RIL được xác định trên nhiễm sắc thể số 6, đó là RM589-RM253, trên NST số 7 với RM8261-RM3555, và trên NST số 8 với RM5556-RM547 Trên nhiễm sắc thể

số 8 còn có 2 QTLs điều khiển tính trạng vị ngon và tất cả giá trị của cơm Mỗi QTL giải thích 8,6% đến 26,1% biến thiên kiểu hình của các alen giống

Chucheongbyeo Ba vùng chứa những QTL quy định độ sáng bóng, độ dính dẽo, độ cứng trên quần thể I/M RIL được xác định tại RM60-RM523 trên NST

số 3, RM5558-RM5642 trên NST số 5, và RM540-RM253 trên NST 6 QTL quy định hàm lượng amylose trên NST số 3 giải thích được 10,9% đến 15,7% biến thiên kiểu hình các alen của giống Ilpumbyeo Mỗi QTL trên NST

số 6 giải thích được 8,4% đến 37,4% biến thiên kiểu hình của alen thuộc giống Ilpumbyeo

Xu et al (1995) cho rằng hàm lượng amylose có thể liên quan ảnh hưởng bởi tam bội thể của phôi nhũ He et al (1998) tạo ra quần thể F2 và thiết lập

bản đồ QTL kiểm soát chất lượng lúa gạo Ngoài ra, He et al (1999) đã tìm

thấy AC được kiểm soát bởi gen chính định vị trên NST số 5 và 6 với gen

waxy và các alen chính giải thích biến thiên di truyền 91,1% Đó là 2 chỉ thị

RG573, C624 định vị trên nhiễm sắc thể số 5 và Wx trên nhiễm sắc thể số 6

Ở Việt Nam, các nhà khoa học tập trung cải tiến giống lúa thông qua nhiều con đường: phương pháp lai cổ truyền, phương pháp thu thập giống địa phương để chọn dòng thuần, phương pháp nhập nội Gần đây, công nghệ sinh học phát triển, genome cây lúa được phân tích, cho phép việc chuyển gen ngoại lai vào để cải thiện các giống lúa Nhiều giống lúa mới được cải thiện và đưa vào hoạt động tốt tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long trong nhiều năm qua; trong đó có những giống được phát triển thông qua MAS (chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử) như OM4495, OM4498, OM4900, OM6162, OM6161, OM6600 (Nguyễn Thị Lang, 2005b)

Có 48% giống lúa thuộc nhóm có hàm lượng amylose cao (AC>25%), 37% giống lúa có hàm lượng amylose trung bình (AC: 21-25%), 11% là nhóm lúa có hàm lượng amylose thấp (20-10%) Chỉ có 4% giống lúa thuộc nhóm giống lúa có hàm lượng amylose rất thấp trong đó có giống nếp Tuy nhiên, trong phân tích các giống nếp địa phương tại Đồng Bằng Sông Cửu Long cho thấy hàm lượng amylose biến động từ 9,3% đến 25,68% Điều này chứng tỏ rằng các giống nếp địa phương có phần khô và cứng cơm Nguyên nhân này còn tùy thuộc vào vùng đất và điều kiện bón phân, nghĩa là biến động với môi trường rất cao và do nhiều năm giống không được chọn lại, sự lẫn tạp và thụ

phấn chéo làm cây tạp giao ở trạng thái dị hợp tử (Wx wx wx), gần với lúa tẻ hơn lúa nếp (wx wx wx) (Nguyễn Thị Lang và ctv., 2005)

Viện Nghiên Cứu Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã ứng dụng công nghệ sinh học (chỉ thị phân tử, nuôi cấy túi phấn) kết hợp với khảo nghiệm đồng ruộng để chọn tạo giống lúa ngắn ngày, năng suất cao, chất lượng gạo tốt như OM1490, OM2517, OM3536, OM2717, OM2718, OM3405, OM4495,

OM4498, OM2514, đã được ứng dụng rộng rãi ở vùng sản xuất ngập lũ Đồng bằng sông Cửu Long

Kết quả chọn tạo giống lúa OM7347 được thực hiện theo phương pháp lai cổ truyền từ cặp lai KDML105/BL thực hiện từ năm 2005 bằng phương pháp lai hồi giao ở thế hệ con lai BC2F2 chọn lọc bằng chỉ thị phân tử Mục đích kết hợp ba gen: năng suất cao, mùi thơm, hàm lượng amylose thấp và kháng bênh bac lá OM7347 là dòng lúa mới được chọn tạo trên cơ sở kết hợp phương pháp truyền thống và công nghệ sinh học OM7347 kết hợp được đặc tính quý: chịu phèn, gạo dẻo, thơm của me ̣KDML105 và bố BL là giống lúa mang gen kháng bênh bac lá Giống lúa OM7347 đã được đánh giá khảo nghiệm qua nhiều vụ đạt năng suất cao, chất lượng gạo tốt, thơm nhẹ, chống chịu bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá

Chiến lược chọn tạo giống lúa có phẩm chất tốt liên quan tới hạt dài, hàm lượng amylose thấp (~20%), ít bạc bụng là ưu tiên số một, kế đến mùi thơm, hàm lượng dinh dưỡng cũng là một mục tiêu cần quan tâm (Nguyễn Thị Lang

và ctv., 2005) Phương pháp chọn tạo giống truyền thống vẫn còn nguyên giá

trị của nó trong tiến trình chọn giống lúa theo mục tiêu chiến lược Tuy nhiên,

nó cần kết hợp với các phương pháp hiện đại để thúc đẩy hiệu quả tốt hơn Việc khai thác các tính trạng quan trọng này đòi hỏi có sự tham gia của di truyền số lượng (đa dạng hóa nguồn bất dục đực) và di truyền tế bào và di truyền phân tử (đánh dấu gen mục tiêu của tính trạng)

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long Thời gian thực hiện từ tháng 10/2013 đến tháng 06/2017

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Giống lúa: 88 giống lúa địa phương thu thập từ các tỉnh ĐBSCL và 71 giống lúa cao sản được thu thập từ ngân hàng gen của Bộ môn Di truyền-Chọn giống, Viện Lúa ĐBSCL (Phụ lục 1) Trong đó, các giống làm bố có hàm lượng amylose thấp bao gồm OM7347, Jasmine85, Khao Dawk Mali105 (KDML105); các giống làm mẹ có năng suất cao nhưng hàm lượng amylose cao bao gồm OM6976, OM5930 và OM6073 (Phụ lục 2)

Dụng cụ, thiết bị, hóa chất: dụng cụ, thiết bị, hóa chất dùng trong phòng sinh học phân tử, phòng phân tích phẩm chất (Phụ lục 3)

Chỉ thị phân tử: 40 chỉ thị phân tử dùng trong việc đánh giá đa dạng nguồn gen bố mẹ; 27 chỉ thị sử dụng lập bảng đồ GGT (Phụ lục 4)

Bảng 3.1: Các chỉ thị phân tử liên kết các gen liên quan đến năng suất và thành phần năng suất trên các giống lúa bố mẹ

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp

3.3.1.1 Đánh giá hàm lượng amylose

Phân tích hàm lượng amylose trên lúa gạo được thực hiện bằng phương pháp sinh hóa của Seko (2003) Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại Hạt lúa được bóc vỏ, xát trắng, nghiền nhỏ Lấy 100 mg bột đã nghiền, bổ sung vào 1 ml Ethanol 95% và 9 ml NaOH 1N Đun sôi ở 100oC trong 10 phút và định mức cho đủ 100 ml Lấy 5 ml dung dịch hoà tan, cho thêm 1 ml

CH3COOH 1M và 2 ml dung dịch iodine Định mức cho đủ 100 ml, giữ ấm ở

30oC trong thời gian 20 phút Mẫu dung dịch được đo ở bước sóng 620nm trên máy đo quang phổ và đọc giá trị Đối chiếu bảng quy đổi để tìm ra hàm lượng amylose Phân nhóm hàm lượng amylose theo tiêu chuẩn SES của IRRI (1996)

Bảng 3.1: Tiêu chuẩn đánh giá hàm lượng amylose trên hạt (IRRI, 1996)

0-2 2-20 20-25

> 25

Rất thấp Thấp Trung bình Cao

Nếp Gạo dẻo Gạo mềm cơm Gạo cứng cơm

Áp dụng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh tác và

sử dụng (khảo nghiệm VCU) của giống lúa (QCVN 01-55: 2011/BNNPTNT)

do Bộ Nông nghiệp và PTNT ban hành ngày 05 tháng 7 năm 2011

Thời gian sinh trưởng (ngày): được tính từ lúc hạt nảy mầm đến khi bông lúa chín khoảng 80%

Chiều cao cây (cm): được đo từ mặt đất đến đỉnh bông cao nhất (không

kể râu hạt), ghi nhận lúc thu hoạch lúa

Chiều dài bông (cm): được đo từ cổ bông đến chóp bông, ghi nhận lúc thu hoạch lúa

Số bông/bụi (bông): [P/số bụi thu thập]; Số hạt chắc/bông (hạt): [(f/v) x (W+w)/P];

Tỷ lệ hạt lép/bông (%): [(Số hạt lép/bông)/(Tổng số hạt/bông)x100] Khối lượng 1000 hạt (g) [(W/f) x 1000];

Năng suất (tấn/ha) được qui về 14% ẩm độ

Trong đó: P là tổng số bông đếm được trên các bụi lúa đã chọn làm mẫu,

f: Tổng số hạt chắc/bông cái, W: Khối lượng hạt chắc trên tất cả bông lúa, v: khối lượng tổng số hạt chắc, w: khối lượng 1000 hạt lấy ra từ bông cái

3.3.1.3 Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình

Phân tích kết quả phân nhóm bằng phần mềm NTSYSpc, là chương trình phần mềm do (Rohlf, F.J (1992) thiết kế dùng để tìm kiếm và thành lập kiến trúc những dữ liệu có nhiều biến NTSYS (Numercial Taxonomy System) là

hệ thống phân loại số trong nghiên cứu đa dạng quần thể ở mức độ ADN Số liệu này sẽ được sử dụng để xây dựng ma trận tương đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix) Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và được xây dựng trên công thức toán học của Nei M and LiW (1979): [Sxy = 2 xy / (x + y)] Trong đó: xy: số băng giữa hai mẫu, x: số băng của mẫu x, y: Số băng của mẫu y, Sxy: Hệ số tương đồng giữa 2 mẫu x và y Từ Sxy ta tính được khoảng cách di truyền giữa x và y: [Dxy = 1 – Sxy]

Trên cơ sở toán học này, các nhà toán học đã xây dựng các phần mềm WINDIST và NTSYS cho máy tính Chương trình WINDIST tạo ra ma trận tương đồng từ bộ dữ liệu nhập sẵn Chương trình NTSYSpc tạo ra sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Nguyễn Thị Lang, 2001) Hiện nay 2 chương trình WINDIST và NTSYS được gộp lại thành chương trình package – NTSYSpc để tiện dụng hơn

Phần mềm NTSYSpc được sử dụng để phân tích quan hệ di truyền dựa trên số liệu kiểu hình giữa các mẫu giống lúa trong nghiên cứu này Kết quả đánh giá các tính trạng hàm lượng amylose và năng suất thực tế trên đồng ruộng của các giống được thu thập Số liệu này được sử dụng để xây dựng ma trận tương đồng Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích Phần mềm NTSYSpc cho phép chuyển hóa các

đồ hình cây (còn gọi là cây tiến hóa), các mẫu có hệ số tương đồng tương đương nhau sẽ được xếp vào một nhóm Dựa vào biểu đồ hình cây này có thể đánh giá mức độ đa dạng và tương quan di truyền giữa các mẫu giống nghiên cứu

3.3.1.4 Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ

Ly trích ADN từ cây lúa:

Phương pháp ly trích ADN thực hiện theo quy trình của IRRI (1996)

Mẫu lá lúa tươi, còn non (2-3 cm) thu được nghiền bằng cối và chày Sau

đó, 400 μl dung dịch ly trích ADN (ADN extraction buffer) (Bảng 3.2) được cho vào mẫu lá nghiền Các mẫu mô lá được nghiền đến khi dung dịch mẫu chuyển sang có màu xanh lá cây (tế bào bị phá vỡ và phóng thích ra diệp lục) Dung dịch mẫu tiếp tục được thêm vào 400 μl ADN extraction buffer, trộn và lắc đều Sau đó, 400 μl dung dịch mẫu này được hút và chuyển sang một tube 1,5 ml đã được ghi nhãn tên giống 800μl dung dịch chloroform:isoamyl alcohol (24:1) vào tube mẫu, trộn và lắc đều, sau đó ly tâm với 12.000 vòng trong 3 phút Các tube mẫu sau ly tâm sẽ phân thành hai lớp riêng biệt, phần dung dịch phía trên (supernatant) được lấy và chuyển sang một tube khác có cùng thể tích Mẫu được thêm vào 800 μl ethanol (100%, trữ lạnh), trộn kỹ bằng máy lắc và tiếp tục ly tâm với tốc độ 13.000 vòng trong 5 phút Dung dịch mẫu lúc này xuất hiện phần kết tủa (pellet) bên dưới tube Thu phần kết tủa và rửa bằng ethanol (70%) Phần kết tủa là phần ADN tổng số được phơi khô ở nhiệt độ phần (~25-30oC) Hòa tan ADN vào 50μl TE buffer (Bảng 3.2)

và trữ ở nhiệt độ -20oC cho đến khi sử dụng